NGHIÊN CỨU KĨ THUẬT CHUYỂN GENE GUS VÀO PHÔI HẠT CHÍN CỦA CÂY THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KĨ THUẬT CHUYỂN GENE GUS VÀO
PHÔI HẠT CHÍN CỦA CÂY THÔNG NHỰA
(Pinus merkusii) THÔNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: VÕ THÀNH TÍN

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU KĨ THUẬT CHUYỂN GENE GUS VÀO
PHÔI HẠT CHÍN CỦA CÂY THÔNG NHỰA
(Pinus merkusii) THÔNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. VƯƠNG ĐÌNH TUẤN

VÕ THÀNH TÍN

Tháng 10/2008


LỜI CẢM ƠN

Con xin thành kính gửi lời tri ân đến Ông Bà, Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục,
cho con ăn học như ngày hôm nay, cùng những người thân trong gia đình đã luôn tạo
mọi điều kiện, giúp đỡ, động viên mọi mặt trong suốt quá trình học tập tại trường và
thực hiện đề tài này.
Trong quá trình thực hiện luận văn, mặc dù gặp rất nhiều khó khăn từ quá trình
tìm kiếm tài liệu, thực hiện đề tài, đến việc bắt tay vào viết luận văn tốt nghiệp,
nhưng em đã hoàn thành luận văn này một cách tốt đẹp.
Hoàn thành luận văn tốt nghiệp:
- Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ
Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô
đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời
gian học tại trường.
- Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Vương Đình Tuấn, Phân Viện
Nghiên Cứu Khoa Học Lâm Nghiệp Nam Bộ, đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình
chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt
thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.

- Em xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Xuân Cường, chị Trần Thị Thanh
Hương, chị Nguyễn Lê Huyền Thanh, cùng các anh chị, cô chú ở Phân Viện
Nghiên Cứu Khoa Học Lâm Nghiệp Nam Bộ, và Trung Tâm Công Nghệ Sinh
Học TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ, đóng góp nhiều kinh nghiệm quý báu,
tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn này
- Cuối cùng, xin cám ơn các bạn lớp DH04SH, cùng những người bạn thân đã
luôn ủng hộ, động viên tôi trong những lúc khó khăn nhất.
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2008
Sinh viên
Võ Thành Tín

iii


TÓM TẮT
Võ Thành Tín, trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ chí Minh, tháng 10/2008.
“Nghiên cứu kĩ thuật chuyển gene GUS vào phôi hạt chín của cây thông nhựa
(Pinus merkusii) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”. Tại Phân Viện
Nghiên Cứu Khoa Học Lâm Nghiệp Nam Bộ và Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học TP.
Hồ Chí Minh..
Giáo viên hướng dẫn: TS. Vương Đình Tuấn.
Thời gian thực hiện từ tháng 3 đến tháng 9 năm 2008.
Thông nhựa (Pinus merkusii) được trồng phổ biến ở Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng
Bình…trên những vùng lập địa cằn cỗi, nghèo dinh dưỡng. Thông nhựa được trồng
với mục đích chính là thu hoạch nhựa phục vụ một số ngành công nghiệp. Bên cạnh
đó, gỗ của chúng còn được sử dụng làm nguyên liệu trong xây dựng và sản xuất đồ
gia dụng. Thông nhựa đã thu lại một nguồn thu nhập đáng kể cho những vùng có điều
kiện canh tác khó khăn. Tuy nhiên, trong những năm vừa qua, hàng ngàn hecta thông
nhựa bị tàn phá nghiêm trọng bởi dịch sâu róm ở các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng
Bình…gây thiệt hại rất lớn về kinh tế cho những người trồng và xã hội ở những địa

phương trên. Vì thế việc phát triển giống thông mới có khả năng chống chịu sâu róm
cao nói riêng và sâu bệnh nói chung là một nhu cầu bức xúc của sản xuất. Kĩ thuật lai
tạo truyền thống là phương pháp chủ yếu để tạo giống cây lâm nghiệp đang được sử
dụng.. Tuy nhiên kĩ thuật này yêu cầu thời gian dài, tốn hiều công sức. Trong những
năm gần đây, sự phát triển của công nghệ gene, trong đó kĩ thuật chuyển gene nhằm
đưa gene kháng sâu vào cây trồng tạo nên giống cây trồng mới mang tính chống chịu
cao sẽ góp phần rút ngắn thời gian tạo giống mới, đặc biệt là đối với cây lâm nghiệp.
Để góp phần xây dựng kĩ thuật chuyển gen Bt tạo giống thông mới, vì thế đề tài trên
đã được triển khai thực hiện.
Kết quả: Bước đầu tìm được ngưỡng kháng sinh thích hợp cho việc chọn lọc dòng
chuyển gene ổn định ( 25 mg/l) trên hai dòng 31 và 54.
- Một số yếu tố khác cho việc chuyển gene có hiệu quả:
+ Mật độ OD600 = 0,6, thời gian lây nhiễm thích hợp cho biểu hiện GUS là 30
phút, nồng độ AS 100 µM/l là phù hợp.
iv


SUMMARY
Appentice student: Vo Thanh Tin, Nong Lam University. 10/2008. “Study on
transformation of GUS gene into P. merkusii maturation

zygotic embryos by

Agrobacterium tumefaciens-mediated”. Practical place: Forestry Science SubInstitute of South of Vietnam and Biotech center Ho Chi Minh city.
Scientific instrutor: Dr. Vuong Dinh Tuan.
Practical period: from March to Septemper, 2008.
Pinus merkusii is widely grown in middle of Viet Nam. The species is mainly
grown for extraction of resin that supplies for several industries. Beside resin product,
timber of P. merkusii can be used to produce furnitures, in construction ect…P.
merkusii is one of the high value forest trees which bring a good income to growers.

However, in recent year, thousand hectare P. merkusii were severely damaged by an
epidemic Dendrolimus Punctatus insect in several provines such as Quang Binh,
Nghe An…Such an attack has caused severe losses economy of growers.
Development of new varieties of Pine resistant to Dendrolimus Punctatus is an urgent
requirement of growers. Traditional breeding a method currently carried out requires
time, labours consumed. In order to assist to reduce these shortcoming. Recent,
progresses of molecular biology techniques in which gene transformation that could
generate new elites of tree carrying genes of interest (eg. insect resistance) will help
to reduce time required for a new varietal development In order develop a gene
transformation technique for generation of P. merkusii resistant to D. Punctatus
insect, a pieces of work entitled “study on transformation of GUS gene into P.
merkusii maturation zygotic embryos” is carried out.
Preliminary outputs: + Suitable concentration of kanamycinfor stable selection (25
mg/l) of the 31 and 54 lines.
+ Several other factors such as density of Agrobacterium
(OD600 = 0,6) co-cultivation time (30 min) in DCR medium supplemented with 100
µM/l AS one suitable for obtaining GUS expression on the embryos.

v


MỤC LỤC
ĐỀ MỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................. iii
TÓM TẮT........................................................................................................................ iv
SUMMARY...................................................................................................................... v
MỤC LỤC ....................................................................................................................... vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. x
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ...................................................................... xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................... xii
Chương 1.MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1.Đặt vấn đề................................................................................................................... 1
1.2.Mục tiêu đề tài ............................................................................................................ 2
1.3.Giới hạn đề tài ............................................................................................................ 2
Chương 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................ 3
2.1. Giới thiệu chung về cây thông nhựa.......................................................................... 3
2.1.1. Phân loại, nguồn gốc, phân bố............................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm sinh học .................................................................................................. 3
2.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây thông nhựa............................................. 4
2.2. Các phương pháp chuyển gene vào thực vật ............................................................. 4
2.2.1. Phương pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ............................. 5
2.2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ................................................. 5
2.2.1.2. Ti-plamid ............................................................................................................. 6
2.2.1.3. Cơ chế lây nhiễm ................................................................................................. 7
2.3. Các hệ thống vector dùng trong chuyển gene ........................................................... 9
2.3.1. Hệ thống vector liên hợp (cointergrated vector) .................................................... 9
2.3.2. Hệ thống vector nhị thể (Binary vector)................................................................. 9
vi


2.4. Sử dụng gene chỉ thị ở các tế bào thực vật biến nạp ............................................... 10
2.5. Những nghiên cứu chuyển gene ở cây có quả hình nón trên thế giới .................... 12
2.5.1. Giới thiệu chung ................................................................................................... 12
2.5.2. Những ứng dụng của kĩ thuật chuyển gene trong công nghệ sinh học cây trồng. 13
2.5.3. Chuyển gene ở cây có quả hình nón thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ............ 13
2.5.3.1. Các bước chính của quá trình chuyển T-DNA vào bộ gene thực vật................ 13
2.5.3.2. Sự biểu hiện tạm thời và ổn định....................................................................... 13

2.5.3.3. Tái sinh cây trồng chuyển gene ......................................................................... 16
2.5.3.4. Biểu hiện gene ................................................................................................... 17
Chương 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... 19
3.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 19
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 19
3.3. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................. 19
3.3.1.Vật liệu thực vật .................................................................................................... 19
3.3.2. Các chủng vi khuẩn A.tumefaciens ...................................................................... 19
3.4. Hóa chất và thiết bị.................................................................................................. 21
3.4.1. Hóa chất................................................................................................................ 21
3.4.2. Thiết bị................................................................................................................. 21
3.5. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 22
3.6. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 22
3.6.1. Bố trí thí nghiệm................................................................................................... 22
3.6.2. Các bước tiến hành ............................................................................................... 22
3.7. Khảo sát ngưỡng chọn lọc của kháng sinh kanamycin trên phôi hạt chín của hai
dòng thông nhựa 31, và 54 ............................................................................................. 23

vii


3.8. Nghiên cứu kĩ thuật chuyển gen GUS vào phôi hạt chín của hai dòng thông nhựa
31 54 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens; và phân tích sản phẩm chuyển gen. ............ 23
3.8.1. Cách tiến hành ...................................................................................................... 23
3.8.2. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens....................................................... 24
3.8.2.1. Cấy trải vi khuẩn trên môi trường LB .............................................................. 24
3.8.2.2. Nuôi lỏng tạo dịch huyền phù vi khuẩn ............................................................ 24
3.9. Chuyển nạp gene vào phôi hạt chín......................................................................... 25
3.10. Loại bỏ vi khuẩn bám bên ngoài .......................................................................... 25
3.11. Phân tích dòng transgenic...................................................................................... 26

3.12. Chọn lọc những tế bào đã được biến nạp .............................................................. 26
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................... 28
4.1. Khảo sát ngưỡng chọn lọc của kháng sinh kanamycin trên phôi hạt chín của hai
dòng thông nhựa 31, và 54 ............................................................................................. 28
4.1.1. Ngưỡng chọn lọc của kanamycin trên hai dòng thông nhựa 31 và 54 ................. 28
4.1.2. Màu sắc và hình thái của phôi .............................................................................. 29
4.2. Nghiên cứu kĩ thuật chuyển gen GUS vào phôi hạt chín của hai dòng thông nhựa
31 và 54; và phân tích sản phẩm chuyển gene ............................................................... 30
4.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của mật độ OD vi khuẩn và thời gian nhiễm lên
khả năng biểu hiện GUS ở hai dòng 31, 54.................................................................... 30
4.2.2. Kết quả khảo sát khả năng biểu hiện GUS trên hai dòng 31 và 54. .................... 35
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 37
5.1. Kết luận.................................................................................................................... 37
5.2. Đề nghị .................................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 38
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AS:

Acetosyringone

ATPase:

Adenosine triphosphatase

BA:

6-Benzyl Adenin

Bp:

Base pair

Ctv:

Cộng tác viên

DCR:

Gupta và Durzan, 1985

DNA:

Deoxyribonucleic acid

DMSO:

Dimethyl sulphoxide

ĐHST:

Điều hòa sinh trưởng

ESM:

Embryonal suspensor masses

Kb:

Kilobases

LB:

Luria or Lenox broth

MLV:

Medium Litvay

OD:

Optical density

T-DNA:

Transferring DNA

Ti plasmid:

Tumor inducing plasmid

µg:

Microgam

µl:

Microlite

µM:

Micromol/lite

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2.1. Một khối u hình thành trên cây chân nam (Euonymus); và trên cây táo.
(A. L. Jones và R. L. Forster. 2003) .................................................................................... 6
Hình 2.2. Quá trình chuyển sợi đơn T-DNA vào tế bào thực vật (Valentine 2003) .......... 8
Hình 2.3. Quá trình cài nhập T-DNA vào bộ gen của tế bào cây (Valentine 2003) ........... 9
Hình 3.1. Vector pCAMBIA nằm trong chung vi khuẩn Agrobacterium C58. ................ 19
Hình 3.2. Vector pPTN289 nằm trong chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA101 ............ 20
Hình 4.1. Màu sắc và hình thái của phôi trên môi trường DCR có bổ sung kanamycin
ở các nồng độ 0 mg/l, 25 mg/l và 40 mg/l sau sáu tuần nuôi cấy...................................... 29
Hình 4.2. Biểu hiện GUS ở phôi hạt chín thông nhựa sau một tuần nuôi cấy. ................. 30
Hình 4.3 : A: Phôi nhiễm khuẩn sau 30 phút. B: phôi sau hai ngày đồng nuôi cấy.
D: phôi sau hơn một tuần nuôi cấy.......... 31

C: phôi sau khi rửa cefatoxime 500 mg/l.

Hình 4.4. Các phôi đều bị nhiễm và chết sau một tuần nuôi cấy ...................................... 32
Hình 4.5. Hình ảnh nhuộm GUS phôi hạt chín loài Pinus radiata .................................... 33
Hình 4.6 Kết quả thí nghiệm nhuộm GUS trên phôi hạt chín của Tang, 2001 ................. 33
Hình 4.7. Kết quả thí nghiệm nhuộm GUS của P.M.W. Drake ........................................ 34

Hình 4.8. Kết quả thí nghiệm nhuộm GUS của Tuấn. 2008 ............................................. 34
Biểu đồ 4.1. Ngưỡng gây chết của kanamycin trên hai dòng thông nhựa 31 và 54.......... 28

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các hệ thống gene đánh dấu chọn lọc và gene đánh dấu tế bào thực vật ......... 11
Bảng 2.2. Chuyển gene ở cây có quả hình nón thông qua Agrobacterium ...................... 14
Bảng 4.1. Kết quả tỷ lệ sống của phôi hạt chín (%) của hai dòng thông nhựa 31, và 54
trên môi trường DCR có bổ sung kháng sinh kanamycin sau thời gian sáu tuần. ........... 28
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ OD vi khuẩn và thời gian nhiễm
lên khả năng biểu hiện GUS ở hai dòng 31, 54................................................................. 30
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát khả năng biểu hiện GUS trên hai dòng 31, 54. .................... 35

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Thông nhựa (Pinus merkusii) là một trong những cây lâm nghiệp quan trọng
và có giá trị kinh tế tương đối cao. Người ta sử dụng gỗ của nó với nhiều mục đích
khác nhau: làm vật liệu xây dựng, đóng tàu xe, làm nhà, nguyên liệu giấy, củi…Bên
cạnh đó người ta còn sử dụng nó để chiết xuất tinh dầu, nhựa, hương liệu và dược
liệu. Các sản phẩm này đều có giá trị sử dụng và kinh tế rất cao.
Ở Việt Nam có sáu loài thông. Thông nhựa (thông hai lá) là cây phân bố tự
nhiên và trồng nhiều nhất. Thông nhựa có khả năng sinh trưởng tương đối nhanh, sau

mười lăm năm được thu hoạch.
Thông nhựa thích nghi với nhiều loại đất, đặc biệt là chịu được những điều
kiện nghèo dinh dưỡng. Vì vậy thông nhựa còn được trồng với mục đích phủ xanh
đồi núi trọc, chống xói mòn, cải tạo đất, đồng thời làm trong sạch môi trường.
Trong những năm gần đây, thông nhựa bị tàn phá nặng nề bởi dịch sâu róm ở
các tỉnh: Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình…Gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát
triển và sản lượng nhựa của các cơ sở sản xuất.
Để góp phần khôi phục năng suất, chất lượng của thông nhựa, việc tạo ra
giống thông nhựa có khả năng sinh trưởng tốt, và chống chịu sâu róm là một nhu cầu
bức xúc của sản xuất.
Hiện nay, các phương pháp chọn giống cây lâm nghiệp nói chung và cây thông
nhựa nói riêng là kĩ thuật lai tạo truyền thống. Tuy nhiên, kĩ thuật này yêu cầu thời
gian dài, tốn nhiều công sức để có thể phát triển nguồn giống mới.
Những tiến bộ công nghệ sinh học trong thập niên vừa qua đã góp phần quan
trọng trong việc cải tạo giống cây nông nghiệp: lúa, lúa mì, đậu tương, bắp, bông
vải…(Jame, C.2005).

1


Trong lâm nghiệp, việc phát triển giống cây dương (Populus) có hàm lượng
lignin thấp và sinh trưởng nhanh đã được công bố ở Trung Quốc (Vincent L. Chiang
và ctv. 2003). Những kết quả này đã góp phần cải thiện năng suất, chất lượng cây
trồng một cách đáng kể. Tuy nhiên, đối với thông nhựa hiện vẫn chưa bất kỳ kết quả
nào công bố về việc cải thiện giống thông có tính kháng cao đối với sâu bệnh.
Trong các phương pháp chuyển gen vào thực vật thì phương pháp chuyển gen
qua Agrobacterium tumefaciens được đánh giá là mang lại hiệu quả cao và nhiều ưu
điểm. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “nghiên cứu kĩ thuật chuyển
gen GUS vào phôi hạt chín của cây thông nhựa (Pinus merkusii) thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens”-bước chuẩn bị cho việc nghiên cứu và xây dựng quy

trình chuyển gen kháng sâu róm vào cây thông nhựa.
1.2. Mục tiêu đề tài
Xây dựng kĩ thuật chuyển gen GUS vào phôi hạt chín của cây thông nhựa
(Pinus merkusii) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
1.3. Giới hạn đề tài
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn, nên đề tài chỉ tiến hành khảo sát ngưỡng
chọn lọc của kanamycin, và biểu hiện GUS tạm thời trên phôi hạt chín ở hai dòng 31
và 54 của cây thông nhựa. Chưa có điều kiện thanh lọc, tái sinh phôi đã được chuyển
gen.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về cây thông nhựa
2.1.1. Phân loại, nguồn gốc, phân bố
Thông nhựa (Pinus merkusii) là một chi thực vật thuộc:
Họ pinaceae
Bộ pinales
Lớp pinopsida
Ngành pinophyta
Thông thuộc chi Pinus có hơn trăm loài, phát sinh nguyên thủy từ vùng Viễn
Đông (Xiberi-Nga). Ở Việt Nam có sáu loài thông. Cây thông hai lá hoặc thông nhựa
là cây phân bố tự nhiên và được trồng phổ biến nhất.
Ở các tỉnh phía Bắc, thông được trồng nhiều nhất ở Quảng Ninh, ước tính
hàng vạn hecta chạy suốt từ đông sang tây, sau đến Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng
Bình và cũng được trồng nhiều ở một số tỉnh miền núi và trung du. Ở phía Nam, cây
mọc tập trung với diện tích lớn nhất ở hai tỉnh Kom Tum và Lâm Đồng. Ở đây có

những rừng thông rộng hàng ngàn hecta, có nhiều cây to hàng trăm tuổi.
2.1.2. Đặc điểm sinh học
Thông nhựa là cây to, cao 25-30 m, tán lá sum xuê, thân thẳng, vỏ dày màu
nâu đỏ nhạt, nứt nẻ thành những rảnh sâu. Lá mọc rất xít nhau, xếp từng đôi một ở
đầu cành, hình kim, đầu nhọn, bao giờ cũng xanh tươi. Hoa là những khối hình nón,
gần như không cuống. Nón đơn tính cùng gốc; nón đực thường ở đầu cành, có hai
bao phấn; nón cái cấu tạo bởi những vảy úp vào nhau, mỗi vảy mang hai nõn; hạt
hình trái xoan, hơi dẹt, có cánh mỏng. Nhiều loài thông khác nhau cũng được sử dụng
như thông ba lá, thông năm lá, thông đuôi ngựa.

3


Thông có thể trồng được trên nhiều loài đất, kể cả đất cát ven biển cũng như
đất đã bị rửa trôi nhiều, trơ sỏi đá.
Thường trồng thông sau mười lăm năm mới bắt đầu khai thác nhựa. Cây thông
cho nhựa nhiều nhất vào năm sáu mươi tuổi, sau đó lượng nhựa giảm dần. Thời gian
lấy nhựa từ tháng ba đến tháng mười. Muốn giữ cây sống lâu, cứ sau mỗi năm lấy
nhựa lại nghỉ một năm. Mỗi cây thông một năm cho 700 g tinh dầu và 2 kg tùng
hương (colophan) (Vũ Văn Dũng 1996)
2.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây thông nhựa
Thông nhựa trồng chủ yếu trồng đề lấy nhựa, ngoài ra còn có thể lấy gỗ để
phục vụ xây dựng, sản xuất đóng đồ dùng gia dụng. Thông còn được chọn làm cây
tiên phong trồng rừng ở những nơi đất khô cằn.
Người ta trồng thông để phủ xanh đồi núi trọc, chắn gió và cát, chống xói mòn
và cải tạo đất, đồng thời làm không khí trong lành, tạo một vùng tiểu khí hậu dịu mát,
ôn hòa, có lợi cho người bệnh trong việc điều dưỡng, phục hồi sức khỏe.
2.2. Các phương pháp chuyển gene vào thực vật
Có nhiều phương pháp chuyển gene mới vào tế bào thực vật nhưng có thể chia
làm hai nhóm phương pháp chính:

– Phương pháp chuyển gen gián tiếp: Gen được chuyển vào tế bào thực vật
thông qua một sinh vật trung gian thường là vi khuẩn hoặc virus.
– Phương pháp chuyển gen trực tiếp: Gen được chuyển trực tiếp vào tế bào
thực vật thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định mà không cần
phải nhờ các sinh vật trung gian. Hiện tại có các phương pháp cơ bản sau:
+ Chuyển gen trực tiếp bằng hóa chất.
+ Chuyển gen bằng xung điện.
+ Chuyển gen bằng vi tiêm.
+ Chuyển gen qua ống phấn.
+ Chuyển gen bằng súng bắn gen.

4


2.2.1. Phương pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Chuyển gene là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng
DNA tái tổ hợp vào bộ gen của sinh vật khác. Với những thành tựu của kỹ thuật di
truyền và sinh học phân tử ở thời điểm hiện nay đã mở ra những triển vọng đối với
chuyển gen ở thực vật bậc cao, nhằm tạo ra những cây trồng mang một số tính trạng
di truyền mới như kháng thuốc trừ sâu, côn trùng, thuốc diệt cỏ, virus… Phát kiến về
việc vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có khả năng chuyển gene mong muốn vào
bộ gene cây trồng đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng
nhất của công nghệ sinh học thực vật (Broothaerts và ctv. 2005)
2.2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Giống Agrobacterium được chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây
bệnh và kí chủ.
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di
động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium
(Deacon và ctv. 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có
5-11 lông roi, phát triển tối ưu ở 29oC trong môi trường có bổ sung mangan và

succinate như là nguồn cacbon duy nhất (Domer 1999).
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh khối u trên cây (chủ yếu là
cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào cây. Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens dạng vòng có kích thước là 2,6 Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid
lớn có kích thước 200 - 800 kb (Gelvin 2003), chính plamid này (Ti plasmid) là
nguyên nhân gây ra khối u khi cây bị nhiễm vi khuẩn. Hầu hết các gen gây khối u đều
nằm trên Ti plasmid (Deacon và ctv. 2005).

5


Hình 2.1. Một khối u hình thành trên cây chân nam (Euonymus); và trên cây táo.
(A. L. Jones và R. L. Forster. 2003)
Khi cây bị thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm
nhập vào cây qua vết thương đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một
trong số đó là Ti-plasmid. Ti-plasmid mang các gen xác định kí chủ và triệu chứng
khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn không mang Ti-plasmid là những vi khuẩn không
độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây (Zambryski và J.Shell. 1989). Khi
xâm nhiễm vào cây một phần gen trên Ti-plasmid sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho
các tế bào phát triển bất thường và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi
khuẩn sẽ sử dụng chất này như một nguồn cacbon và nitơ (Hansen và ctv. 1994;
Sheng và Citovsky 1996).
2.2.1.2. Ti-plamid
+ Ti plasmid là một DNA dạng vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn
và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn.
+ Trên Ti plasmid, T-DNA được giới hạn bởi bờ phải và bờ trái, nó mang
các gene chịu trách nhiệm là hình khối u và tổng hợp các amino acid hiếm
như octopine, napoline… và được gọi chung là opine. Ngoài T-DNA, Ti

6

2.2.1.3. Cơ chế lây nhiễm
Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề
mặt rễ cây. Ở đây, vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dưỡng do mô rễ tạo ra.
Vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác
nhau. Trong đều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thương
nhờ các tín hiệu hoá học. Đều này có được là do đáp ứng giải phóng đường và các
thành phần phổ biến khác trong rễ. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang Ti plasmid
sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thương (hợp chất
phenolic) như acetosyringone. Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng độ thấp (10-7
M). Bởi vậy, một trong những chức năng của Ti plasmid là mã hoá các thụ thể nhận
biết các chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và giúp vi
khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương. Acetosyringone đóng vai trò quan trọng
trong quá trình xâm nhiễm. Ở nồng độ cao (10-5 – 10-4M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen
vir trên Ti plasmid (Valentine 2000).
Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển quá trình tạo sợi đơn T-DNA.
Quá trình tạo sợi đơn T-DNA được thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein
VirD1 và VirD2 thực hiện. Sau đó protein VirD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo
thành phức hợp T-DNA. Phức hợp T-DNA-VirD2 cùng với protein VirE2 được
chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp được mã hoá bởi các gen
virB. Cùng với một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi
khuẩn sẽ tiếp tục đưa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Valentine 2003)

7


Hình 2.2. Quá trình chuyển sợi đơn T-DNA vào tế bào thực vật (Valentine
2003 )
Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây không theo

một quy luật tái tổ hợp nào cả, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương
đồng với DNA của cây và gắn vào. Sau đó nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi
tương đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối
phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA
cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây được hoàn thành và
cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự tái tổ hợp của TDNA hoàn thành. Cuối cùng, sau khi sự liên kết hoàn thành, các gen trên T-DNA
hoạt động tổng hợp các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Valentine 2003).

8


Hình 2.3. Quá trình cài nhập T-DNA vào bộ gen của tế bào cây
(Valentine 2003)
2.3. Các hệ thống vector dùng trong chuyển gene
2.3.1. Hệ thống vector liên hợp (cointergrated vector)
Vector liên hợp dựa trên sự tái tổ hợp của hai plasmid. Một vector liên hợp
gồm có:
Vị trí để ghép các gen quan tâm, thường vị trí này có nguồn gốc từ plasmid
của vi khuẩn E.coli. Gen chỉ thị kháng kháng sinh giúp cho chọn lọc trong vi khuẩn
E.coli, Agrobacterium và gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật. Như vậy
vector liên hợp được hình thành phần từ: một plasmid mang trình tự DNA mong
muốn và plasmid kia có chứa vùng gen vir và vùng bờ lặp lại của T-DNA. Sau tái tổ
hợp, một vector liên hợp được tạo ra và dùng cho chuyển gen vào thực vật (Nguyễn
Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2006).
2.3.2. Hệ thống vector nhị thể (Binary vector)
Vector nhị thể là hệ thống dùng hai plasmid riêng biệt: Một cung cấp T-DNA
đã mất độc tính gây khối u, plasmid kia là Ti plasmid có khả năng thâm nhập vào tế
bào thực vật (mang các gen vir). Plasmid thứ nhất mang gen chọn lọc ở thực vật và
gen sẽ được ghép vào bộ gen thực vật. Khi plasmid này được đưa vào chủng
Agrobacterium có chứa Ti plasmid, những sản phẩm mang gen vir có thể đưa T-DNA

vào tế bào thực vật, mặc dù T-DNA nằm trên phân tử DNA khác. (Nguyễn Văn Vụ,
Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2006).

9


2.4. Sử dụng gene chỉ thị ở các tế bào thực vật biến nạp
Khả năng phát hiện DNA ngoại lai đã được cài nhập vào DNA bộ gene thực
vật và từ đó có thể xác định được tế bào đã biến nạp là một vấn đề hết sức quan trọng.
Hơn nữa, trong các nghiên cứu, các tín hiệu điều hòa phiên mã thực vật và chức năng
của các tín hiệu này ở các mô thực vật nhất định (như rễ, lá và hoa) thường rất quan
trọng đối với việc định lượng mức biểu hiện của một gene với một sản phẩm nhất
định. Sự định lượng và các ứng dụng khác đòi hỏi việc sử dụng các gen chỉ thị, nó
cho phép chọn lọc các tế bào biến nạp, hoặc mã hóa các hoạt tính có thể được thử
nghiệm. Đối với mục đích này, một số các gene khác nhau đã được thử nghiệm làm
gene chỉ thị về sự biến nạp, bao gồm các gene có thể được như các gene đánh dấu
chọn lọc trội và các gene mà protein của chúng cho phản ứng dễ phát hiện đối với
một thử nghiệm đặc hiệu (bảng 2.1). Rất nhiều trong số các gene chỉ thị này là từ vi
khuẩn và được bổ sung thêm các đoạn điều hòa đặc hiệu thực vật để biểu hiện ở các
tế bào thực vật. Chọn lọc gene đánh dấu trội là cách trực tiếp để thu nhận các tế bào
biến nạp trong môi trường. Ví dụ, khi có kháng sinh kanamycin, chỉ các tế bào thực
vật có gene neomycin phosphatransferase hoạt động là có thể sinh trưởng.
Các kết quả mong đợi của một thí nghiệm cụ thể thường chỉ ra gene đánh dấu
nào sẽ được dùng. Rõ ràng khi biểu hiện một gene chỉ thị ảnh hưởng đến chức năng
bình thường của cây, thì nó không thể được dùng. Hơn nữa, sự có mặt của một số
gene chỉ thị và sản phẩm của nó có thể làm hư hại sản phẩm thương mại. Trong bối
cảnh đó, tốt nhất là loại bỏ gene chỉ thị khi biến nạp với những tính trạng mong muốn
được chọn lọc, đặc biệt là ở cây trồng. Một sản phẩm của gene chỉ thị như β-Dglucuronidase có thể phát hiện in situ ở các mô thực vật nguyên vẹn. Một trong
những hệ phổ biến nhất là gene β-D-glucuronidase (GUS) của E. coli. Gene GUS mã
hóa một enzyme bền thường không có ở thực vật và xúc tác phân giài nhiều loại β-Dglucuronic. Hoạt tính của GUS trong mô thực vật biến nạp có thể được xác định bằng

sự có mặt của màu xanh được tạo thành sau khi thủy phân cơ chất không màu acid 5bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronic.

10


Bảng 2.1. Các hệ thống gene đánh dấu chọn lọc và gene đánh dấu tế bào thực vật
Hoạt tính enzyme

Gene đánh dấu chọn lọc Gene chỉ thị

Neomycin phosphotrsferase

Có

Có

Hygromycin phosphotrsferase

Có

Có

Chloramphenicol acetyltransferase

Có

Có

Nopoline synthase

Có

Có

Octopine synthase

Không

Có

Β-Glucuronidase

Không

Có

Streptomycin phosphotransferase

Không

Có

Kháng bleomycin

Có

Không

Luciferase đom đóm

Không

Có

Luciferase vi khuẩn

Không

Có

Metallothionein II

Có

Có

Β-Galactosidase

Không

Có

Protein phát huỳnh quang xanh lá

Không

Có

cây
Theo Walden và Schell, Eur. J. Biochem. 192:563-576, 1999, và Gruber, Crosby,

trang 89-119.
Hoặc hoạt tính GUS ở dịch chiết cây có thể định lượng và xét nghiệm với độ
nhạy cao bởi phân tích đo huỳnh quang liên quan đến sự thủy phân cơ chất 4methylumbelliferyl β-D-glucuronic để tạo thành sản phẩm phát huỳnh quang
(Bernard R.Glick và Jack J. Pasternak. 2007)

11


2.5. Những nghiên cứu chuyển gene ở cây có quả hình nón trên thế giới
2.5.1. Giới thiệu chung
Kể từ khi cây trồng chuyển gen thành công đầu tiên vào năm 1987 (Fillatti và
ctv.1987), sự chuyển gen ổn định đã được phát triển ở nhiều loại cây rừng và được
sử dụng để chuyển những gen quy định những tính trạng quan trọng vào loài cây có
quả hình nón (conifers) có tính chất thương mại hóa như: kháng thuốc trừ sâu, côn
trùng, virus… (Birch 1997; Herschbach và Kopriva 2002). Tuy nhiên, những loài
biến đổi gen mới chỉ được báo cáo cách đây hơn mười năm (Huang và ctv. 1991) và
giới hạn ở một vài loài (Ellis và ctv.1993; Charest và ctv. 1996; Walter và ctv. 1998,
1999; Tang và ctv. 2001; Gound và ctv. 2002). Phương pháp sử dụng Agrobacterium
để chuyển gene là phương pháp hiệu quả nhất để chuyển DNA vào bộ gene của nhiều
loài (Smith và Hood 1995). Nhiều dòng vi khuẩn Agrobacterium có khả năng gây
nhiễm, kết quả là nó làm phát sinh khối u trong một số loài có quả hình nón đã được
định danh từ năm 1986 (Clapham và Ekberg 1986; Sederoff và ctv. 1986; Morris và
ctv. 1989; Stomp và ctv. 1990). Tuy nhiên, chỉ có một vài báo cáo về sự tái sinh của
loài cây có quả hình nón được chuyển gen ổn định bằng Agrobacterium (Huang và
ctv. 1991; Levee và ctv. 1997, 1999; Wenck và ctv. 1999; Newton và ctv. 2001; Tang
và ctv. 2001; Gound và ctv. 2002). Chuyển gen ở loài picea glauca đạt được bằng
phương pháp bắn gene vào năm 1993 (Ellis và ctv. 1993), và kể từ đó chỉ có vài loài
chuyển gene ổn định thành công do chưa xây dựng được hệ thống tái sinh (Ellis và
ctv. 1993; Charest và ctv. 1996; Walter và ctv. 1998, 1999; Clapham và ctv. 2000).
Hiện tại thành công trong trình tái sinh cây thông qua somatic embryogenesis ở cây

có quả hình nón đã cung cấp những cơ hội tuyệt vời để tạo ra những giống cây
chuyển gene, và nó sẽ dẫn đầu trong việc áp dụng vào cây trồng công nghiệp (Sutton
2002).
Hiện tại có rất nhiều kết quả công bố về thành công trong chuyển gene ở
những loài cây có quả hình nón. Tuy nhiên, hầu hết những gene được sử dụng là
những gene chỉ thị, hay gene kháng thuốc trừ sâu, thuốc cỏ nhằm thiết lập một mô
hình hệ thống chuyển gene, và rất ít báo cáo về kết quả tạo ra một kiểu hình mới hoặc
chống chịu với nhiều loại stress (Walter và ctv. 2002).

12


2.5.2. Những ứng dụng của kĩ thuật chuyển gene trong công nghệ sinh học cây
trồng
– Những ứng dụng của công nghệ kĩ thuật sinh học thực vật gồm:
+ Biến đổi hình thái của cây.
+ Gia tăng tính kháng côn trùng và kháng thuốc trừ sâu, thuốc cỏ.
+ Gia tăng tính chịu đựng các stress vô sinh.
+ Giảm hàm lượng lignin và chất tổng hợp, kháng thuốc trừ sâu và côn trùng
đã được nghiên cứu rất rộng rãi trong những loài thực vật bật cao (Comai
và ctv. 1985; Bowler và ctv. 1991; Baucher và ctv.1996; Pena và Seguin
2001; Strauss và ctv. 2001; Herschbach và Kopriva 2002).
2.5.3. Chuyển gene ở cây có quả hình nón thông qua vi khuẩn Agrobacterium
2.5.3.1. Các bước chính của quá trình chuyển T-DNA vào bộ gene thực vật
Theo Sheng và Citovsky (1996), quá trình chuyển gene lạ từ vi khuẩn
Agrobacterium vào những tế bào thực vật bao gồm những bước cần thiết sau:
+ Tăng sinh khối vi khuẩn.
+ Kích thích hệ thống độc tính của vi khuẩn.
+ Quá trình tạo mạch đơn T-DNA.
+ Sự kết bám của vi khuẩn.

+ Sự tái sinh của phức hệ chuyển T-DNA.
+ Chuyển T-DNA và gắn vào nhân tế bào thực vật.
+ Tái tổ hợp T-DNA vào bộ gen tế bào thực vật.
2.5.3.2. Sự biểu hiện tạm thời và ổn định
Phương pháp chuyển gene

gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens hoặc trực tiếp đã được sử dụng cho hơn 120 loài và ít nhất là 33 họ bao
gồm những cây nông nghiêp có giá trị kinh tế chính như: rau xanh, vật liệu trang trí, y
dược, cây ăn quả và những cây lấy cỏ (Birch 1997). Hơn thế nữa, hiệu quả của
phương pháp chuyển gene gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens đã được
13


thiết lập chủ yếu trên cây hai lá mầm. Tuy nhiên, phương pháp chuyển gene gián tiếp
thông qua Agrobacterium tumefaciens được áp dụng trên 25 loài có quả hình nón bao
gồm: Abies, Larix, Libocedrus, Picea, Pinus, Pseudotsuga, Tsuga (bảng 2.2).
Bảng 2.2. Chuyển gene ở cây có quả hình nón thông qua Agrobacterium.
Loài

Các dòng vi khuẩn
Agrobacterium

Các plasmid vector

Biểu hiện
gene

A.t.

Abies
C58/pV3304/pV3851/p
Mụn cây
nordmannia C58/pV3304/pV3851/
V2298
pV2298
na
A.t.
A136(pTiEU6)/K27/B
Khối u
A. procera A136(pTiEU6)/K27/B
3.73/K41
3.73/K41
A.t.
L.
kaempferi× C58/pMp90/pMrKE7 p35S-nptII-p19s-nptII Ổn định
L. decidua 0Km
A.t. EHA105, A.t.
pWWS006
Ổn định
Picea abies
LBA4404, GV3101

Clapham
và Ekberg
1986
Morris và
ctv. 1989
Levee và
ctv. 1997

Wenck và
ctv. 1999
Klimaszew
ska và ctv.
2001

pBIV

Ổn định

P.
A.t. A281/W2/73
engelmanni

pEND4 K/pLUX2

Khối u

P. glauca

A.t. A281/W2/73

pEND4 K/pLUX2

Khối u

P. glauca

A.t. EHA105, A.t.
LBA4404, A.t.

GV3101

pBI121

Ổn định

Le và ctv.
2001

P. glauca

A.t. C58/pMP90

pBIV

Ổn định

Klimaszew
ska và ctv.
2001

P. abies

A.t. C58/pMP90

Các tác giả

P. mariana A.t. C58/pMP90

pBIV

Ổn định

P. sitchensis A.t. A281/W2/73

pEND4 K/pLUX2

Khối u

P. contorta A.r. LBA9402

pHRGPnt3-GUS

Ổn định

P. elliottii

A.t.

A281/542/C58/M2/73/ Khối u
14

Ellis và
ctv. 1989
Ellis và
ctv. 1989

Klimaszew
ska và ctv.
2001

Ellis và
ctv. 1989
Lindroth
và ctv.
1989
Stomp và