PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN PHÂN HỦY HỆ THỐNG QUORUM SENSING TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ CÁ CHẼM (Lates calcarifer Bloch)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN PHÂN HỦY HỆ
THỐNG QUORUM SENSING TRÊN TÔM SÚ (Penaeus
monodon) VÀ CÁ CHẼM (Lates calcarifer Bloch)

Họ và tên sinh viên: DƯƠNG THỊ THU VẤN
Ngành: Nuôi Trồng Thuỷ Sản Chuyên gành Ngư Y
Niên khóa: 2004 – 2008

Tháng 10/2008


PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN PHÂN HỦY HỆ THỐNG
QUORUM SENSING TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ CÁ CHẼM
(Lates calcarifer Bloch)

Tác giả

DƯƠNG THỊ THU VẤN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng Kỹ sư Thủy Sản
chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn:
TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH
ThS. ĐINH THẾ NHÂN

Tháng 10 năm 2008
i


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp là kết quả của sự học tập và rèn luyện qua bốn năm học
đại học. Để có được kết quả này, ngoài sự cố gắng học tập của bản thân còn có sự chỉ
bảo hết sức to lớn của quý thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô trong
Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh nói chung và các thầy cô trong Khoa
Thủy sản nói riêng, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Bệnh đã giảng dạy và truyền
đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu.
Em cũng xin chân thành cám ơn Cô TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, là người đã tận
tình hướng dẫn giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Do kiến thức của em còn hạn chế, không thể tránh khỏi những sai sót nên em
rất mong các thầy cô thông cảm và chỉ dẫn thêm cho em.
Em xin chân thành cảm ơn !
TP. Hồ Chí Minh, ngày 22/09/2008
Sinh viên thực hiện
DƯƠNG THỊ THU VẤN

ii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Phân lập và định danh vi khuẩn phân hủy hệ thống quorum
sensing trên tôm sú (Penaeus monodon) và cá chẽm (Lates calcarifer Bloch)” được
tiến hành tại Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản
II, thời gian từ ngày 05/05/2008 đến ngày 31/08/2008. Các quần thể vi sinh vật thu
thập từ hệ tiêu hóa tôm sú (tôm post giai đoạn PL15), tôm thương phẩm và cá chẽm

hương (giai đoạn 30 ngày tuổi), được nuôi trong hỗn hợp ba loại phân tử AHLs: N –
butyryl - homoserine lactone (phân tử tín hiệu của V. harveyi); N – hexanoyl –
homoserine lactone; N – octanoyl homoserine lactone. Sau mỗi chu kỳ, mật độ vi
khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang và phương pháp đếm trên
đĩa môi trường Marine Agar (MA).
Qua sáu đợt nuôi cấy, chúng tôi đã thu và giữ được 78 mẫu vi khuẩn. Trong đó
có 48 vi khuẩn gram âm và 30 vi khuẩn gram dương có khả năng phát triển trong môi
trường chứa phân tử AHL. Vi khuẩn gram dương chủ yếu gồm các dạng đơn cầu
khuẩn như: Micrococcus, tụ cầu khuẩn như Staphylococcus; trực khuẩn dài dạng
Bacillus. Vi khuẩn gram âm chủ yếu là trực khuẩn ngắn. Không thấy xuất hiện phẩy
khuẩn Vibrio spp.
Chúng tôi đã tiến hành định danh các trực khuẩn gram âm và thu được kết quả
như sau: Xanthomonas maltophilia (100%); Flavimonas oryzihabitans (81,9%);
Yersinia aldovae (58,25%); Weeksellsa viroca (72,89%); Sphingomonas paucimobilis
(100%); Enterobacter cloacae (100%); Chryseomonas luteola (100%); Cedecea neteri
(70,42%); Serratia marcescens biogroup 1 (100%).

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa

i

Cảm tạ

ii

Tóm tắt

iii

Mục lục

iv

Danh sách các hình

vi

Danh sách các bảng

vii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1

1.1 Đặt Vấn Đề

1

1.2 Mục Tiêu

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1 Những Bước Tiếp Cận Trong Việc Phòng Bệnh Trong Nuôi Trồng Thủy Sản

3

2.1.1 Giữ vệ sinh trại giống

3

2.1.2 Sử dụng kháng sinh, chất diệt khuẩn

4

2.1.3. Sử dụng chế phẩm vi sinh (probiotic)

7

2.2 Probiotic Trong Nuôi Trồng Thủy Sản

7

2.2.1 Định nghĩa

7

2.2.2 Cơ chế tác động

10

2.2.2.1 Sản xuất hợp chất ức chế

10

2.2.2.2 Sự cạnh tranh hóa chất hoặc năng lượng có sẵn

11

2.2.2.3 Cạnh tranh sắt

12

2.2.2.4 Cạnh tranh vị trí bám

13

2.2.2.5 Tăng cường đáp ứng miễn dịch

14

2.2.2.6 Cải thiện chất lượng nước

14

2.2.2.7 Tác dụng của nước xanh

14

2.2.2.8 Đóng góp về mặt dinh dưỡng

15

2.2.2.9 Tác động lên hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh

15

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

23

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu

23
iv


3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu

23

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu

23

3.3.1 Phương pháp thu mẫu vi sinh vật

23

3.3.2 Quy trình phân lập

24

3.3.3 Phương pháp nhuộm gram

27

3.3.3.1 Hóa chất

27

3.3.3.2 Quy trình nhuộm gram

27

3.3.4 Phương pháp định danh

27

3.3.4.1 Vật liệu và thuốc thử

27

3.3.4.2 Quy trình định danh

28

3.3.5 Phương pháp đếm khuẩn lạc

29

3.3.6 Phương pháp đo mật độ quang (OD)

29

3.3.7 Phương pháp đo pH.

29

3.3.8 Phương pháp xử lý số liệu

29

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

30

4.1 Sự phát triển của các hỗn Hợp Vi Khuẩn Trong Quá Trình Phân Lập

30

4.1.1 Mật độ vi khuẩn xác định bằng mật độ quang

30

4.1.2 Mật độ vi khuẩn trên Marine Agar (MA)

32

4.3 Đặc Điểm Hình Thái Khuẩn Lạc Và Vi Khuẩn

35

4.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

35

4.3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn

41

4.4 Kết Quả Định Danh

42

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

45

5.1 Kết Luận

45

5.2 Đề Nghị

45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

46

PHỤ LỤC

48

v


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Quorum sensing trên vi khuẩn Vibrio harveyi

18

Hình 2.2. Sơ đồ phân hủy quorum sensing của vi khuẩn

18

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn phân hủy phân tử AHL

25

Hình 3. 2: Các bình erlen và đĩa thạch trước khi ủ và đặt trong tủ ấm lắc

26

Hình 3.3: Các erlen được đặt trong tủ ấm lắc.

26

Hình 3. 4: Kết quả kiểm tra LCD và di động của trực khuẩn gram âm đợt 6

28

Hình 4.1 Mật độ vi khuẩn qua các chu kỳ thông qua đo mật độ quang

30

Hình 4.2 Mật độ vi khuẩn trên MA qua các chu kỳ.

32

Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc mọc trên MA

35

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 Mật độ quang (logCFU/ml) trung bình của các nghiệm thức.

31

Bảng 4.3 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 1)

36

Bảng 4.4 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 2)

37

Bảng 4.5 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 3)

38

Bảng 4.6 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 4)

39

Bảng 4.7 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 5)

40

Bảng 4.8 Hình thái khuẩn lạc mọc trên Marine Agar qua các chu kỳ (đợt 6)

41

Bảng 4.9 Kết quả định danh vi khuẩn

43

Bảng 1 Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 1

14

Bảng 2: Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 2

14

Bảng 3 Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 3

14

Bảng 4 Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 4

15

Bảng 5 Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 5

15

Bảng 6 Mật độ vi khuẩn trên môi trường Marine Agar (MA) đợt 6

16

vii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt Vấn Đề
Theo FAO (2007), 40% sản phẩm thủy sản trên thế giới có nguồn gốc từ nuôi
trồng thủy sản. Đó là kết quả của việc khai thác quá mức mọi nguồn nước và đáp ứng
nhu cầu tăng tiêu thụ hải sản tăng của con người. Ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản
là vấn đề dịch bệnh. Dịch bệnh tiềm ẩn nguy cơ mất đi nguồn giống tự nhiên và gây tỉ
lệ chết cao trong quá trình sản xuất giống, chủ yếu là do Vibrio spp. và Aeromonas
spp.
Bên cạnh đó, thuốc kháng sinh và chất sát trùng mang lại hiệu quả điều trị và
phòng bệnh nhưng chúng đã gây ra hàng loạt dòng vi khuẩn kháng lại kháng sinh, làm
hư hại hệ vi sinh vật tự nhiên trong môi trường nước, có khả năng truyền gen kháng
kháng sinh cho những vi khuẩn có liên quan đến sức khỏe con người, đặc biệt sử dụng

nhiều ở những vùng nuôi theo quy mô công nghiệp. Trước tình hình này, một số nước
như Mỹ và các quốc gia Châu Âu đã ban hành lệnh cấm sử dụng một số kháng sinh
trong nông nghiệp cũng như trong thủy sản và hạn chế lưu truyền thông qua các chỉ
tiêu chất lượng sản phẩm nhập khẩu từ các nước. Tuy nhiên một số kháng sinh bị cấm
sử dụng vẫn thấy xuất hiện trong các sản phẩm ở Châu Á như Việt Nam, Thái Lan,
Malaysia.
Cùng với kháng sinh, vaccin cũng khá hiệu quả trong quá trình hỗ trợ phòng
bệnh. Một ví dụ cho thấy hiệu quả của vaccin là nền công nghiệp cá hồi của Nauy đã
tăng gấp 10 lần từ 5500 tấn lên 55000 tấn khi sử dụng vaccin vào trong nuôi trồng. Sử
dụng vaccin hạn chế ở một số đối tượng có giá trị kinh tế cao và có khả năng gây được
đáp ứng miễn dịch của vật chủ, nhưng trên tôm sú thì không có được khả năng này.
Do đó, việc tìm ra chất thay thế khắc phục những nhược điểm của kháng sinh
cũng như vaccin đang đặt ra yêu cầu cho các nhà nghiên cứu và probiotic là một lĩnh
vực mang lại nhiều hứa hẹn.

1


Xuất phát từ thực trạng trên, được sự chấp nhận của khoa Thủy sản Trường Đại
học Nông Lâm, Phòng Sinh Học Thực Nghiệm – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy
Sản II chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn phân hủy
hệ thống quorum sensing trên tôm sú (Penaeus monodon) và cá chẽm (Lates
calcarife)”
1.2 Mục Tiêu
Phân lập và định danh vi khuẩn phân hủy quorum sensing trên tôm sú (Penaeus
monodon) và cá chẽm (Lates calcarife) nhằm tìm kiếm vi khuẩn probiotic có khả năng
phân hủy phân tử tín hiệu Acyl Homoserin Lactone (AHL) được tiết ra từ vi khuẩn
Vibrio spp. gây bệnh.

2

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Những Bước Tiếp Cận Trong Việc Phòng Bệnh Trong Nuôi Trồng Thủy Sản
Theo Bùi Quang Tề (2003), công tác phòng bệnh cho động vật thủy sản cần
phải sử dụng các biện pháp tổng hợp như: cải tạo và vệ sinh môi trường, tiêu diệt
nguồn gốc gây bệnh và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể chủ yếu thông qua quản lí
con giống và môi trường nuôi. Những sinh vật sống dưới nước không được thừa
hưởng vi khuẩn có lợi ban đầu do cơ thể mẹ đẻ trứng vô trùng vào môi trường nước,
điều này cho phép những vi khuẩn từ môi trường xung quanh bám vào bề mặt trứng và
ấu trùng, do chúng không có một hệ tiêu hóa được phát triển đầy đủ và không có quần
thể vi sinh vật bảo vệ trong ống tiêu hóa, trên mang hoặc trên da (Cahill et al. 1990,
Hagiwara et al. 1994, Ringø et al. 1999). Đây là điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn bám
vào bề mặt cơ thể để gây bệnh (Wilson và Horne 1986; Bruno 1988). Tôm cá sống
trong môi trường nước rất dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: nhiệt độ, độ trong, độ
mặn, O2, pH, NH3, NO2,…Các yếu tố này thay đổi làm tôm bị stress và dễ mắc bệnh
(Bùi Quang Tề, 2003). Nếu oxy hòa tan thấp hơn 2mg/lít tôm cá bị stress rất nặng có
thể nhiễm vi khuẩn gây bệnh cơ hội. Nếu DO duy trì dưới 1mg/lít trong một khoảng
thời gian hầu như cá bị chết (Tucker, 1985).
2.1.1 Giữ vệ sinh trại giống
Công tác vệ sinh trại, bể, đường ống và các dụng cụ khác trước mỗi đợt sản
xuất giống phải đặc biệt quan tâm để bảo đảm các loại mầm bệnh không lan truyền từ
đợt sản xuất này sang đợt sản xuất khác. Các loại vi khuẩn, vi rút, nấm, bào tử nhỏ và
nguyên sinh động vật có khả năng sống sót và sinh sôi nảy nở rất nhanh từ những mầm
rất nhỏ còn rơi rớt lại trong thành bể nuôi, bể chứa nước, các dụng cụ, đường ống
nước, ống khí…Sát trùng và sử dụng dụng cụ riêng cho từng bể; vệ sinh tay chân khi
vào trại. Trại sản xuất giống phải được thiết kế hợp lí với các khu vực riêng biệt cho
các hoạt động sản xuất khác nhau và ngăn cách tối đa các khu vực bằng rào chắn và
3

kiểm soát cẩn thận việc giữa các khu cũng như hạn chế người ra vào. Mỗi bể nên có
riêng một bộ dụng cụ và nên kiểm soát chặt chẽ việc sát trùng tay chân trước khi vào
trại. Ngoài ra, giữ vệ sinh cơ thể tôm cá bố mẹ và trứng thu được đóng vai trò rất quan
trọng trong vấn đề phòng bệnh. Mỗi cá thể bố mẹ phải được xét nghiệm các loại mầm
bệnh trước khi mang về trại và được nuôi dưỡng riêng rẽ. Đối với tôm sú, cố gắng cho
đẻ mỗi con một bể để đánh giá lượng trứng của từng con và hạn chế mầm bệnh cũng
như thực hiện nghiêm chỉnh trình tự các bước rửa và tẩy trùng cho trứng và nauplius.
Theo kinh nghiệm trong các trại thực hiện thử nghiệm BMP ở Việt Nam cho thấy đã
loại trừ được vi khuẩn gây hại Vibrio sp., giảm thiểu vi rút đốm trắng và MBV trong
cả đàn nauplius. Các hóa chất sử dụng xử lý nước và sát trùng khi thao tác trên cơ thể
bố mẹ, trứng, thức ăn artemia, luân trùng, tảo và ấu trùng cũng đóng vai trò không nhỏ
trong việc phòng bệnh (Chanratchakool et al., 2005)
2.1.2 Sử dụng kháng sinh, chất diệt khuẩn
Theo Nguyễn Như Pho (2007), kháng sinh là những chất hữu cơ có nguồn gốc
sinh học, bán tổng hợp hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc giết chết
mầm bệnh trên cơ sở kết hợp với một điểm tiếp nhận (receptor) trong quá trình biến
dưỡng, dẫn đến sự ngưng trệ quá trình sống của vi khuẩn bên trong cơ thể, vì vây
kháng sinh dùng để điều trị trên cơ thể đã bị nhiễm trùng. Việc kiềm chế bệnh do vi
khuẩn theo thông lệ là dựa vào kháng sinh (Cabello, 200).
Tế bào động vật đa bào, tế bào virus không có các receptor kết hợp với kháng
sinh. Dựa vào tính chất diệt khuẩn mà có thể chia kháng sinh làm hai loại là kháng
sinh sát khuẩn và kháng sinh tĩnh khuẩn. Kháng sinh sát khuẩn có tác dụng diệt khuẩn,
thích hợp để sử dụng trong các bệnh nhiễm trùng cấp tính, cơ thể không tham gia
chống bệnh nên bệnh dễ tái phát sau khi ngưng kháng sinh. Kháng sinh tĩnh khuẩn làm
ngưng sự phát triển của vi khuẩn, bạch cầu và đại thực bào tham gia diệt khuẩn có
nghĩa là cơ thể cùng tham gia diệt khuẩn với kháng sinh nhờ đó bệnh khó tái phát sau
khi ngưng kháng sinh, thích hợp đối với các bệnh có diễn tiến chậm, các trường hợp
phòng bệnh. Liều phòng bệnh cũng phải có tác dụng diệt khuẩn và liều điều trị thường

cao hơn nhiều so với liều phòng bệnh.
Ngày nay người ta lạm dụng kháng sinh như là một phương pháp phòng ngừa
bệnh. Điều này đã dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh đối với một số loài vi khuẩn
4


và dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thủy sản. Để ngăn cản vấn đề trên, hướng phát
triển sắp tới là giảm lượng kháng sinh sử dụng, chỉ dùng kháng sinh cho mục đích điều
trị. Tuy nhiên việc sử dụng những hợp chất này thường xuyên, thậm chí sử dụng khi
mầm bệnh không biểu hiện rõ ràng, dẫn đến việc phát triển nhanh chóng những dòng
vi khuẩn kháng kháng sinh (Karunasagar et al., 1994; Teo et al., 2000; Teo et al.,
2002; Cabello, 2006) (theo Kesarcodi – Watson, 2007)
Thuốc khử trùng (disinfectants) là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn
hoặc các vi sinh vật nhiễm khác. Khác với kháng sinh, những chất khử trùng phá hủy
nguyên sinh chất của vi khuẩn và luôn cả vật chủ nên chỉ dùng cho những đồ vật vô
sinh
Thuốc sát trùng (antiseptics) là những chất có tác dụng ức chế sự sinh trưởng và
sinh sản của vi sinh vật hoặc giết chết vi khuẩn ở một nồng độ mà không làm ảnh
hưởng đến mô bào vật chủ. Do đó thuốc sát trùng được sử dụng cho các mô nhiễm
khuẩn để ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật.
Ranh giới giữa chất sát trùng và chất khử trùng cũng không rõ rệt, một hóa chất có thể
là chất sát trùng hoặc chất khử trùng tùy theo nồng độ sử dụng và các điều kiện áp
dụng
Cơ chế tác dụng của các chất diệt khuẩn trên là tác động lên thành tế bào làm
thay đổi tính cực hoặc phân giải thành tế bào, tác động lên màng bào tương làm hủy
tính thấm của màng tế bào làm cho nước khuếch tán vào bên trong làm vỡ tế bào, tác
động lên nguyên sinh chất của tế bào làm đông đặc nguyên sinh chất hoặc ức chế
chuỗi hô hấp bằng cách tách cặp sự oxy hóa và phosphoryl hóa.
Người ta sử dụng các chất sát khuẩn trên nhằm mục đích khử trùng nguồn nước
ao lắng, phòng ngừa sự phát sinh các bệnh do vi rus, vi khuẩn, nguyên sinh động vật

và nấm, dùng xử lí nguồn nước khi tôm cá mắc bệnh hay người ta dùng chất sát trùng
để ức chế sự phát triển của tảo khi mật độ quá dày đặc.
Tuy nhiên khi sử dụng thuốc sát trùng người ta phải chấp nhận các tác hại của
thuốc đối với môi trường ao nuôi. Diệt tất cả các vi sinh vật có lợi trong nước là nguồn
thức ăn tự nhiên cho tôm cá, diệt mái nhà che chở cho tôm cá là tảo, làm ức chế quá
trình phân giải chất hữu cơ trong ao nuôi, từ đó làm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe tôm
cá, nếu sử dụng thường xuyên có thể gây chậm lớn, giảm khả năng sinh sản.
5


Theo OIE (2001), ba giai đoạn sát trùng có thể có trong trại ương nhằm mục
đích phòng bệnh gồm những xử lý ban đầu như sử dụng lưới lọc kích thước 1µm và
0,2 µm hoặc dùng hóa chất để sát trùng, kế đến là xử lí trang thiết bị trong khu vực
nuôi đặc biệt là toàn bộ quy trình và xử lí nguồn nước xả để bảo vệ môi trường.
(Nguyễn Như Pho, 2007)
2.1.3. Sử dụng chất kích thích miễn dịch, vaccine
Trong nuôi trồng thủy sản, chất gây đáp ứng miễn dịch chủ yếu được sử dụng
là

ß - glucan và mannan. Chúng có nguồn gốc từ vách tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae. ß - glucan là đại phân tử, khi vào tế bào được xem như là
một ngoại vật, bị tế bào đại thực bào tấn công, làm chuyển dạng tế bào đại thực bào
sang dạng hoạt động mạnh và gia tăng số lượng tế bào đại thực bào. Mannan che lấp
những vị trí vi khuẩn gây bệnh xâm nhập trên màng tế bào thành ruột, làm vi khuẩn
không bám vào được. Đồng thời kết hợp với vi khuẩn có lợi làm tăng số lượng vi
khuẩn có lợi và ngăn cản vi khuẩn có hại xâm nhập (Nguyễn Hữu Thịnh, 2006)
Tiêm ngừa bằng vaccin là một cách làm hiệu quả để hạn chế đến mức thấp nhất
những rủi ro do bệnh tật trên cá nuôi và giá trị của những sản phẩm thu được. Vaccin
kích thích hệ miễn dịch của cá sản suất ra kháng thể bảo bệ cá khỏi bệnh. Một lần

được tiếp xúc với vaccin, hệ miễn dịch của cá hoạt động sản xuất ra kháng thể để liên
kết với mầm bệnh là vi khuẩn và phân hủy nó. Đáp ứng được học hỏi này có nghĩa là
hệ thống miễn dịch đã được học cách làm thế nào để bảo vệ chính nó từ kháng nguyên
hay tạo thành những kháng thể đặc hiệu. Khi dịch bệnh bùng phát những kháng thể
này sẽ giúp bảo vệ cá thoát khỏi sự nhiễm bệnh. Vaccin không phải là rào chắn vĩnh
cửu, dư lượng tồn đọng có thể bị phá hủy nếu như các yếu tố rủi ro khác không được
xem xét. (Ohene et al.,2007)
Có ba phương pháp chung để sử dụng vaccin là ngâm tắm, tiêm và cho ăn.
Những phương pháp này thay đổi theo từng giai đoạn phát triển của nhiều loài cá, cách
sử dụng, giá trị của vật nuôi, tình trạng sức khỏe của cá, tỉ lệ sống, liều đối chứng, số
lượng phòng thí nghiệm có liên quan và thời gian duy trì sự bảo vệ. Quyết định
phương pháp sử dụng dựa trên sự kết hợp thực tế và rủi ro quan sát được, tuổi của cá
(Hugh, 1995). Nhìn chung người ta nhận thấy rằng vaccin dạng tiêm thì bảo vệ hiệu
quả hơn so với vaccin dạng ngâm tắm và trộn vào thức ăn, vì chúng cho phép liều
6


kiểm soát lớn hơn với hiệu quả thu được và thời gian bảo vệ dài hơn.Tuy nhiên vaccin
dạng tiêm thì đắt hơn và sử dụng nhiều sức lao động chuyên sâu, và có thể nguy hiểm
đến cá nếu không quản lý và chăm sóc cẩn thận. Vaccin dạng tiêm gây ra sự bám dính
vào cơ thể cá. Những sự bám dính này đặt ra yêu cầu cho đáp ứng miễn dịch. Nhưng
chúng không ảnh hưởng đến sức sống của cá hoặc ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa
thức ăn. Tuy nhiên sẽ làm giảm giá trị của sản phẩm (FAO, 2005).
2.1.4. Sử dụng chế phẩm vi sinh (probiotic)
Theo Nguyễn Hữu Phúc (2003), các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nuôi
trồng thủy sản nhằm đối kháng hoặc cạnh tranh thức ăn với vi sinh vật gây bệnh và cải
thiện chất lượng môi trường. Gồm những vi sinh vật sống như các vi khuẩn thuộc
giống Bacillus, Lactobacillus, Saccharomyces,…người ta thường trộn vào thức ăn
hoặc qua thức ăn tự nhiên như Artemia, Rotifer. Vi khuẩn nhóm Bacillus và
Streptococcus sử dụng các chất hữu cơ như thức ăn thừa, phân ở đáy ao hình thành

sinh khối vi khuẩn có lợi với số lượng lớn, chiếm ưu thế trong hệ vi sinh đáy ao, ức
chế các vi khuẩn lên men thối sinh H2S (H2S > 0,03 mg/lít làm thối nước ao). Nhóm vi
khuẩn Nitrosomonas, Nitrobacter chuyển hoá nhóm NH3 từ sự phân giải Protein trong
phân và thức ăn thừa thành Nitrat làm nguồn dinh dưỡng cho các phiêu sinh và tảo,
giúp giảm khí NH3 trong ao.
Việc sử dụng Probiotic trong nuôi trồng thủy sản nhằm mục đích ổn định chất
lượng nước đáy ao, hạn chế sự phát triển quá mức của vi khuẩn có hại, phân giải thức
ăn, chất hữu cơ tích tụ đáy ao, phân giải khí độc tạo thành từ nền đáy và cải thiện hệ
tiêu hoá. Từ đó, giảm nhu cầu thay nước cho ao nuôi, ổn định và duy trì sự phát triển
của tảo, tăng sự phát triển của phiêu sinh động và làm giảm thiểu sự biến động pH
trong môi trường nuôi.
2.2 Probiotic Trong Nuôi Trồng Thủy Sản
2.2.1 Định nghĩa
Thuật ngữ Probiotic, hiểu đơn giản là sự sống. Có nguồn gốc từ Hy Lạp với hai
thành phần “pro” và “bio” (Gismondo et al., 1999). Fuller (1989) định nghĩa
“Probiotic là thức ăn bổ sung chứa vi sinh vật sống có tác động có lợi trên vật chủ
bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột”. Ngày nay định nghĩa này vẫn
được tham khảo rộng rãi. Căn cứ vào ứng dụng của probiotic hiện nay và cơ sở khoa
7


học về cơ chế tác động cho thấy rằng những thành phần vi sinh vật không chỉ tác động
theo cách thức có lợi, và lợi ích này không chỉ giới hạn trong đường ruột (Salminen et
al., 1999). Probiotic là một lĩnh vực nhiều hấp dẫn và được nghiên cứu trong 30 năm
qua. Ý tưởng ban đầu có thể được hình thành bởi Metchnikoff vào đầu thập niên
1900s. Ông đưa ra giả thuyết là sức khỏe con người có thể được cải thiện thông qua
việc ăn vào sản phẩm sữa được lên men. Tác động của probiotic được biết đến lần đầu
tiên thông qua quá trình biến đổi trong hệ tiêu hóa như sản xuất chất đối kháng chống
lại mầm bệnh, giúp phát triển hệ thống miễn dịch, cung cấp những lợi ích về mặt dinh
dưỡng, hỗ trợ cho hàng rào chất nhày đường ruột (Vaughan et al., 2002).

Khi phân lập probiotic dùng cho nuôi trồng thủy sản điều quan trọng là xem xét
sự khác nhau cơ bản với probiotic sử dụng cho động vật trên cạn. Động vật thủy sản có
mối quan hệ gần gũi với môi trường xung quanh. Mầm bệnh nguy hiểm có thể tồn tại
tự do trong môi trường nước chung quanh và tăng trưởng độc lập với vật chủ (Hansen
và Olafsen, 1999; Verschuere et al., 2000), được động vật thủy sản ăn vào liên tục
thông qua quá trình điều tiết thẩm thấu và bắt mồi. Từ đó cho thấy tác động của môi
trường xung quanh và thức ăn lên tình trạng vi sinh vật trong cơ thể. Bên cạnh đó, ấu
trùng có khả năng duy trì hệ vi sinh vật đặc hiệu bên trong động vật thủy sản vào bất
kỳ thời gian cho phép. Khả năng này thì không phù hợp với ấu trùng hai mảnh vỏ do
thời gian tồn lưu vi khuẩn trong ấu trùng hai mảnh vỏ khá ngắn để hình thành hệ vi
khuẩn khác với môi trường nước xung quanh (Jorquera et al., 2001). Dựa trên mối
quan hệ phức tạp mà một sinh vật nước có với môi trường xung quanh, định nghĩa
probiotic dùng cho nuôi thủy sản cần được thay đổi. Verschuere (2000) đã đề nghị một
định nghĩa bổ sung có kế thừa với định nghĩa của Fuller “Probiotic là chất bổ trợ vi
khuẩn sống có tác động có lợi trên vật chủ thông qua tác động làm thay đổi hệ vi
khuẩn của môi trường xung quanh hoặc hệ vi khuẩn liên quan đến vật chủ, đảm bảo
việc cải thiện chất lượng thức ăn hoặc làm tăng giá trị dinh dưỡng của nó, nâng cao
đáp ứng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc cải thiện chất lượng nước”. Xuất phát từ
yêu cầu probiotic phải chứa vi khuẩn sống, định nghĩa này khá dài dể mô tả probiotic.
Ngày nay không phải chỉ có vi sinh vật sống mới là probiotic mà còn có chuỗi
peptidoglycan và lipopolysaccharide cũng là probiotic bằng khả năng gây đáp ứng
miễn dịch. Vì thế hai tác giả Irianto và Austin (2002) cho ra đời một định nghĩa mới
8


ngắn hơn và không yêu cầu đối với vi sinh vật sống “probiotic là một phần hay toàn bộ
vi sinh vật có ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe của vật chủ”. Định nghĩa sau này phù
hợp với điều mà Salminen (1999) đưa ra. Mặc dù ngày nay vẫn còn một vài tranh luận
về probiotic cho nuôi thủy sản, tất cả định nghĩa trên khác với định nghĩa của Fuller ở
chỗ là probiotic không nhất thiết phải hoạt động trong ống tiêu hóa. Do đó các cơ chế

tác động như sự cạnh tranh dinh dưỡng và sản xuất chất ức chế có thể xuất hiện trong
môi trường nước nuôi.
Ngày nay probiotic cũng khá phổ biến trong thực phẩm chức năng cải thiện sức
khỏe cho con người nhằm mục đích điều trị, phòng bệnh, và chất bổ trợ tăng trưởng
(Mombelli và Gismondo, 2000; Ouwehand et al., 2002; Sullivan và Nord, 2002; Senok
et al., 2005). Cụ thể, vi khuẩn sinh acid lactic (lactic acid bacteria (LAB)) được sử
dụng một cách rộng rãi trong nghiên cứu cho con người và đề nghị nghiên cứu cho
động vật trên cạn. LAB được biết là cũng có mặt trong đường tiêu hóa của cá khỏe
mạnh (Ringø và Gatesoupe, 1998; Hagi et al., 2004). Sự thật là LAB có nguồn gốc cư
trú tự nhiên trong ống tiêu hóa của con người với khả năng chịu đựng môi trường acid
và mật của ống tiêu hóa. LAB cũng có chức năng biến đổi đường lactose thành acid
lactic do đó làm giảm pH của ống tiêu hóa và ngăn cản một cách tự nhiên sự bám dính
của nhiều vi khuẩn (Mombelli và Gismondo, 2000; Klewicki và Klewicka, 2004). Hai
nhóm vi khuẩn được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất là lactobacilli và
bifidobacteria (Corcoran et al., 2004; Ross et al., 2005; Senok et al., 2005). (Theo
Ohene et al., 2007)

Probiotic được nghiên cứu thông thường nhất là hình thức bào tử Bacillus spp.
và nấm men. Bacillus spp. có khả năng bám dính, sản xuất bacteriocin và gây kích
thích miễn dịch (Cherif et al., 2001; Cladera – Olivera et al., 2004; Duc et al., 2004;
Barbosa et al., 2005). Nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng gây kích thích
miễn dịch và sản xuất ra các hợp chất ức chế (Castagliuolo et al., 1999; Dahan et al.,
2003; Van der Kühle et al., 2005). (Theo Ohene et al., 2007)
Nhiều cơ chế phức tạp tồn tại bên trong probiotic có thể có lợi, những cơ chế
này có thể hoạt động đơn lẽ hoặc nằm trong sự liên kết với những probiotic đơn giản
khác. Những cơ chế này bao gồm: ức chế mầm bệnh thông qua việc sản xuất hợp chất
ức chế, cạnh tranh vị trí bám, cạnh tranh về mặt dinh dưỡng, thay thế hoạt động của
9

enzyme của mầm bệnh, sản xuất chất gây kích thích miễn dịch và những tác động có
lợi về mặt dinh dưỡng cũng như cải thiện khả năng tiêu hóa thức ăn và sử dụng thức ăn
(Fuller, 1989; Fooks et al., 1999; Bomba et al., 2002). (Theo Ohene et al., 2007)
2.2.2 Cơ chế tác động
Mặc dù nhiều công bố về probiotic trong nuôi trồng thủy sản nổi lên trong thời
suốt thời gian qua, nhưng các phương pháp nghiên cứu dường như còn theo kinh
nghiệm và mọi sự tranh cãi thường tập trung vào cơ chế tác động một cách chi tiết. Cơ
chế tác động chính xác của probiotic hiếm khi được làm sáng tỏ hoàn toàn. Những cơ
chế tác động của probiotic gồm có: khả năng bám dính trên biểu mô ruột, sản suất hợp
chất ức chế, cạnh tranh hợp chất hoặc năng lượng có sẵn, cạnh tranh vị trí bám, tăng
cường đáp ứng miễn dịch, cải thiện chất lượng nước, tương tác với tảo, nguồn dinh
dưỡng đa - vi lượng và đóng góp hệ enzym cho quá trình tiêu hóa. (Theo Ohene et al.,
2007)

2.2.2.1 Sản xuất hợp chất ức chế
Quần thể vi sinh vật tiết ra các chất hóa học có tác dụng diệt khuẩn hoặc kiềm
hãm sự phát triển lên quần thể vi sinh vật khác, nhằm cạnh tranh hóa chất hoặc năng
lượng có thể, làm thay đổi mối quan hệ cân bằng trong quần xã. Sự xuất hiện vi khuẩn
sản xuất chất ức chế trong đường ruột của vật chủ hoặc trên bề mặt da hoặc trong môi
trường nuôi được xem như là một hàng rào bảo vệ hiệu quả chống lại những vi khuẩn
gây bệnh cơ hội.
Nhìn chung, tác dụng kháng khuẩn của vi khuẩn là do những yếu tố sau: sản
xuất kháng sinh, bacteriocin, siderophore, lysozyme, protease, H2O2, acid hữu cơ, NH3
và diacetyl.
Vi khuẩn sinh acid lactic sản xuất bacteriocin ức chế lên quá trình tăng trưởng
của vi sinh vật khác. Có nhiều báo cáo về hoạt động ức chế của vi khuẩn sinh acid
lactic thông qua bacteriocin, hầu hết không loại trừ sự ức chế trên vi khuẩn gram
dương. Tuy nhiên, gần như tất cả vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản là gram âm
(Verstraete at al., 2000).
Kháng sinh được đề nghị đóng một vai trò trong mối quan hệ hội sinh, có thể

xuất hiện giữa nhiều loài vi khuẩn. Nair et al (1979) cho biết phần lớn vi khuẩn nước
mặn sản xuất ra enzyme bacteriolytic chống lại V. parahaemolyticus. Imada et al.
10


(1985) đã phân lập và kiểm tra đặc tính của chủng Alteromonas sp. B – 10 – 31 ,
chủng này sản xuất chất ức chế kiềm protease (alkaline protease inhibitor) được gọi là
monastatin. Trong một kiểm chứng in vitro, monastatin được tinh sạch và cô đặc đã
chứng tỏ có hoạt động ức chế chống lại protease của Aeromonas hydrophila và một
thiol protease của V. anguillarum, cả hai vi khuẩn này đều gây bệnh trên cá. (Theo
Verschuere et al., 2000)

Nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn trong môi trường nước sản suất chất ức
chế chống lại mầm bệnh đã biết in vitro. Tuy nhiên, không có nghiên cứu nào chứng
minh có sự sản xuất hợp chất ức chế in vivo cũng như mối liên quan của chúng đến
môi trường sinh thái.
Sản xuất hợp chất ức chế in vitro thường được xem xét ở những loài vi khuẩn
được lựa chọn với mục đích làm probiotic nhưng không có một nghiên cứu nào được
công bố nhằm mục đích cho thấy rõ ràng hợp chất ức chế là nguyên nhân của hoạt
động probiotic in vivo của nhiều chủng. Từ đó, những nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh
vực này được đặt ra. Ở thực vật, sự sản xuất hợp chất ức chế do những loài
Pseudomonas spp. phát huỳnh quang được công nhận như là một yếu tố quan trọng
trong việc ngăn ngừa khả năng gây bệnh của những chủng này. (Theo Verschuere et
al., 2000)

2.2.2.2 Sự cạnh tranh hóa chất hoặc năng lượng có sẵn
Sự cạnh tranh hóa chất hoặc năng lượng có thể giải thích rõ lý do tại sao những
quần thể vi sinh vật khác nhau có thể sống chung trong cùng một hệ sinh thái. Về mặt
lý thuyết, dường như sự cạnh tranh chất dinh dưỡng sẽ có hiệu quả trong đường ruột
của động vật hữu nhũ, nhưng bằng chứng xuất hiện chúng trên người và những động

vật trên cạn thì không đủ sức thuyết phục. Sự cạnh tranh dinh dưỡng theo lý thuyết có
thể đóng một vai trò hết sức quan trọng trong sự hình thành hệ vi sinh vật đường ruột
hoặc hệ vi sinh vật của môi trường nước nuôi thủy sản. Nhưng đến nay vẫn chưa có
những nghiên cứu bao hàm toàn diện về vấn đề này. Từ đó cho thấy, sự ứng dụng
thành công nguyên lý cạnh tranh vào thực tế thì không dễ dàng. (Theo Verschuere et
al., 2000)

Sự điều hòa hệ sinh thái vi sinh vật trong môi trường nuôi thủy sản nhìn chung
bị chi phối bởi những sinh vật dị dưỡng tiêu thụ chất hữu cơ như cacbon và các nguồn
11


năng lượng. Rico – Mora et al. (1998) đã lựa chọn một chủng vi khuẩn có khả năng
hoạt hóa sự tăng trưởng trong môi trường nghèo chất hữu cơ, và đưa nó vào môi
trường nuôi tảo khuê, ở đó vi khuẩn này kềm chế số lượng chủng Vibrio alginolyticus
thêm vào, điều này có thể là do nó có khả năng cạnh tranh với V. alginoliticus do có
khả năng tận thu các dịch tiết từ tảo khuê.
Verschuere et al. (1999) đã chọn lọc nhiều chủng vi khuẩn có ảnh hưởng tích
cực trên sức sống và tăng trưởng của ấu trùng Artemia. Khi kiểm tra chất đối kháng
trong phòng thí nghiệm thì xác định không có hóa chất ức chế ngoại bào nào có liên
quan đến hoạt động bảo vệ của những chủng này chống lại Vibrio proteolyticus
CW8T2, nhưng những chủng vi khuẩn sống đó lại có khả năng bảo vệ Artemia chống
lại mầm bệnh. Điều này cho thấy rằng những chủng vi khuẩn chọn lọc đưa vào có khả
năng bảo vệ là cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng có sẵn với vi khuẩn gây
bệnh.
2.2.2.3. Cạnh tranh sắt
Hầu như tất cả vi sinh vật đều cần đến sắt để tăng trưởng (Reid, 1993).
Siderophores là tác nhân bắt lấy sắt một cách đặc hiệu (Neilands, 1981), có trọng
lượng phân tử thấp (<1,500) có thể hòa tan kết tủa sắt và làm cho sắt trở thành có sẵn
cho vi sinh vật sử dụng. Ý nghĩa về mặt sinh thái của siderophores là khả năng tìm đến

những sinh vật chết trong môi trường để ăn những chất dinh dưỡng cần thiết. Vi khuẩn
gây bệnh thường chiếm ưu thế là do chúng có thể cạnh tranh ion sắt trong điều kiện
môi trường dịch mô bào, dịch cơ thể của vật chủ (Wooldridge, 1993). (Theo
Verschuere et al., 2000)

Sự thiếu hụt sắt trong khẩu phần ăn của cá chẽm mới nở không gây thiệt hại
trên sức sống cũng như sự tăng trưởng của ấu trùng nhưng có ý nghĩa giới hạn vật
mang vi khuẩn trên ấu trùng và làm tăng mật độ vi sinh vật (Gatesoupe, 1997). Nhu
cầu sắt của vi khuẩn gây bệnh khá cao. Trong một mẫu kiểm tra với vi khuẩn Vibrio
anguillarum, tỉ lệ chết của cá hồi gia tăng một cách rõ nét với chế độ ăn có chứa sắt
(Gatesoupe, 1997; Rørvik, 1991). Tất cả những quan sát trên đều biểu thị tầm quan
trọng và vai trò sinh học của ion sắt trong sự hình thành hệ vi sinh vật trên vật nuôi
thủy sản.

12


Vi khuẩn vô hại sản suất siderophore được sử dụng làm probiotic không chỉ để
cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh (mà đặc tính gây bệnh được biết là do sự sản suất
siderophore và cạnh tranh ion sắt), mà còn cạnh tranh với tất cả vi sinh vật cần đến ion
sắt hòa tan. Tác động tích cực của vi khuẩn probiotic sản xuất siderophore được mô tả
rất rõ trong nghiên cứu của Gatesoupe, 1997, trong đó bổ sung vi khuẩn sản xuất
siderophore vào luân trùng làm gia tăng sức đề kháng của cá hồi khi được gây nhiễm
với vi khuẩn gây bệnh Vibrio P.
Pybus et al. (1994) đã kiểm tra 30 chủng V. anguillarum được xem như là
probiotic tiềm năng chống lại vi khuẩn gây bệnh trên cá hồi V. ordalii bằng những mẩu
kiểm tra chất đối kháng được làm chậm lại (deferred- antagonism test). Chỉ có một
chủng V. anguillarum VL4335 ức chế chủng V. ordalii in vitro, và tác dụng này bị
chặn lại khi cho thêm muối sắt vào trong môi truờng, cho thấy sự ức chế quá trình tăng
trưởng có liên quan mật thiết với ion sắt. Khi sử dụng phương pháp “chrome- azurol

sulfat” để đo lường sự sản xuất siderophore, chủng V. anguillarum VL4335 sản xuất
giá trị siderophore cao có ý nghĩa hơn các chủng V. anguillarum khác.
Smith và Davey (1993) đã công bố rằng chủng Pseudomonas huỳnh quang
F19/3 có khả năng ức chế sự tăng trưởng của chủng Aeromonas salmonicida trong môi
trường nuôi và sự ức chế này là do cạnh tranh sắt tự do. Chủng F19/3 cũng có khả
năng bài xuất Aeromonas salmonicida ra khỏi cá hồi Thái Bình Dương (Salmo salar)
trước giai đoạn biến thái, bị nhiễm bệnh do stress.
Do đó, phát hiện sự sản xuất siderophore in vitro không có ý nghĩa quyết định
mà việc chúng sản xuất một số lượng lớn siderophore in vivo để có tác dụng kiểm soát
sinh học mới thật sự có ý nghĩa. Tương tự với việc sản suất hợp chất ức chế, sự cạnh
tranh hóa chất hoặc năng lượng chủ yếu là sắt tự do hay siderophore là một trong
những cơ chế tác động của probiotic còn tùy thuộc vào từng hoàn cảnh.
2.2.2.4 Cạnh tranh vị trí bám
Một cơ chế tích cực để ngăn ngừa quá trình định cư của mầm bệnh là sự cạnh
tranh vị trí bám trong ruột hoặc trên bề mặt biểu mô. Điều này cho thấy rằng khả năng
bám dính vào chất nhày đường ruột và bề mặt vách tế bào thì rất cần thiết để vi khuẩn
hình thành số lượng cần thiết trong ống tiêu hóa của cá (Onarheim, 1990). Sự cạnh
tranh những thụ thể bám dính với mầm bệnh có thể là tác động probiotic đầu tiên khi
13


vi khuẩn bám vào bề mặt biểu mô trong suốt giai đoạn đầu của sự gây nhiểm (Montes,
1993).
Sự bám dính có thể đặc hiệu dựa trên vị trí bám trên bề mặt vi khuẩn và phân tử
tiếp nhận trên tế bào biểu mô hoặc không đặc hiệu dựa vào các yếu tố lý hóa học
(Salminen, 1996).
2.2.2.5 Tăng cường đáp ứng miễn dịch
Chất kích thích miễn dịch là những chất hóa học hoạt hóa hệ thống miễn dịch
của động vật và kích thích cơ thể phản kháng nhiều hơn khi bị nhiễm do vi rút, vi
khuẩn, nấm hay kí sinh trùng (Raa, 1996). Ấu trùng cá, tôm và những động vật không

xương sống khác có hệ thống miễn dịch ít phát triển hơn cá trưởng thành và chủ yếu là
dựa vào đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu (Söderhall, 1998).
Vi khuẩn probiotic được bổ sung vào thức ăn có thể làm tăng tính đối kháng khi
đường ruột động vật máu nóng bị nhiễm (Holzapfel, 1998). Trong nuôi thủy sản có
một số chủng vi khuẩn hoạt động như chất gây đáp ứng miễn dịch, nhưng chỉ có
những thành phần tế bào đặc hiệu hoặc không đặc hiệu được sử dụng (Sakai, 1999).
Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa rõ có hay không vi khuẩn probiotic tác động gây đáp ứng
miễn dịch trên những loài thủy sản được nuôi, nhưng cơ chế tác động này không thể
loại trừ (Verschuere, 2000)
2.2.2.6 Cải thiện chất lượng nước
Trong nhiều nghiên cứu, chất lượng nước được cải thiện trong suốt quá trình bổ
sung probiotic, đặc biệt là Bacillus spp. Bacillus là vi khuẩn gram dương có hiệu quả
trong việc phân giải hợp chất hữu cơ trở về CO2 hơn là vi khuẩn gram âm, có thể
chuyển hóa một tỉ lệ rất lớn cacbon hữu cơ để tạo sinh khối vi khuẩn hoặc bùn
(Stanier, 1963). Đó là lý do để duy trì mức độ cao vi khuẩn gram dương trong ao nuôi
thương phẩm, người nông dân có thể hạn chế đến mức thấp nhất sự tích lũy hợp chất
cacbon hữu cơ trong suốt chu trình nuôi trong khi vẫn duy trì tính ổn định của tảo,
thông qua việc tăng cường sản xuất CO2 (Scura, 1995). (trích dẫn bởi Verschuere et al.,
2000)

2.2.2.7 Tác dụng của nước xanh
Vi tảo có tác dụng lên thành phần vi khuẩn của môi trường nước nuôi và lên sự
sống sót và tăng trưởng của ấu trùng cá, vừa là tác nhân kháng khuẩn, vừa là yếu tố
14


dinh dưỡng. Bổ sung tảo vào môi trường có thể đóng góp vào sự thành lập hệ vi khuẩn
đường ruột có lợi (Reitan et al., 1997), tỉ lệ sống cá chẽm được nâng cao khi bổ sung
tảo Isochrysis galbana vào nước nuôi do vi tảo kích thích enzyme tiêu hóa ở tuyến tụy
và đường ruột. Ngoài ra, tảo vô trùng Tetraselmis suecica cũng ức chế được in vivo

Vibrio sp. trên tôm thẻ chân trắng Ấn Độ Fenneropenaeus indicus (Regunathan và
Wesley, 2004).
2.2.2.8 Đóng góp về mặt dinh dưỡng
Hệ vi sinh vật đường ruột đóng vai trò quan trọng trong sự dinh dưỡng của vật
chủ thông qua cải thiện sự tăng trưởng và khả năng tiêu hóa của vật chủ (Burr et al.,
2005) như rotifer và ấu trùng hai mảnh vỏ. Riquelme et al. và Verschuere et al. đã
đánh giá ảnh hưởng của 11 chủng vi khuẩn ức chế mầm bệnh V. anguillarum (in vitro)
lên sức sống của ấu trùng sò điệp Chile, chỉ có hai chủng Vibrio 11 và 334 thể hiện tác
dụng bảo vệ ấu trùng sò điệp, trong khi những chủng khác cho kết quả tỉ lệ chết khá
cao. Khi kiểm tra in vivo, Vibrio 11 có tác động bảo vệ chống lại mầm bệnh Vibrio
anguillarum. Theo Verschuere et al. (1999) tính đối kháng in vivo của chín chủng với
mầm bệnh V. proteolyticus CW8T2 đã được giải thích rõ trong những thí nghiệm gây
nhiễm và cho thấy có sự bảo vệ ở nhiều mức độ khác nhau. Những kết quả này chứng
tỏ rằng hai khía cạnh kiểm soát mầm bệnh và dinh dưỡng phải được giải thích tách biệt
nhau, nhưng có thể hiểu rằng sự kết hợp cả hai mặt dinh dưỡng và kiểm soát bệnh
cùng một lúc là cơ chế tác động tốt nhất của probiotic. (trích dẫn bởi Kesarcodi –
Watson, 2007)
2.2.2.9 Tác động lên hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh
a. Giới thiệu về Quorum sensing
Quorum sensing là một cơ chế truyền tín hiệu dựa vào năng lực của vi khuẩn
đáp ứng lại một loại phân tử hóa học được gọi là autoinducer. Khi một nồng độ
autoinducer đạt đến một ngưỡng cụ thể nào đó, vi khuẩn phát hiện được và đáp ứng
với phân tử này bằng việc thay đổi sự biểu hiện của gen. Quorum sensing được mô tả
lần đầu tiên có liên quan đến vi khuẩn gây bệnh phát sáng là Vibrio fischeri và Vibrio
harveyi (Nealson et al, 1970; Nealson và Hasting, 1979). Từ đó chứng tỏ quorum
sensing là một cơ chế rộng rãi trong sự biểu hiện gen của nhiều loài vi khuẩn. Có
nhiều hệ thống quorum sensing mà vi khuẩn sử dụng: hệ thống LuxR/I chủ yếu dược
15

sử dụng cho vi khuẩn gram âm. Trong đó phân tử tín hiệu là một acyl-homoserine
lactone (AHL). Hệ thống phân tử oligopeptide chủ yếu được sử dụng cho vi khuẩn
gram dương. Hệ thống phân tử tín hiệu LuxS/AI – 2 được sử dụng cho những giao
tiếp khác loài. Hệ thống phân tử tín hiệu AI – 3 /epinephrine/norepinephrine được sử
dụng cho những giao tiếp khác giới. (theo Reading et al., 2006)
Sự biểu hiện của gen gây độc trong nhiều mầm bệnh vi khuẩn được báo cáo là
do sự điều hòa của quorum sensing (Defoirdt et al., 2004). Nồng độ của autoinducer
là yếu tố then chốt để phát hiện sự biểu hiện của gen gây độc trong nhiều vi khuẩn
gây bệnh, có thể phát triển chiến lược kiểm soát bệnh bằng việc kiềm chế sự sản suất
autoinducer hoặc loại bỏ autoinducer do vi khuẩn gây bệnh sản xuất ra (Dong et al.,
2000). Phân tử tín hiệu, quorum sensing AHL (N – acyl homoserine lactone) và AI – 2
(autoinducer 2) được tìm thấy có liên quan đến yếu tố gây độc trong nhiều vi khuẩn
gây bệnh, bao gồm những mầm bệnh trên cá (Federle và Basler, 2003; Morohoshi et
al., 2004; Bruhn et al., 2005). Phân hủy quorum sensing được đề nghị là một chiến
lược chống lại sự nhiễm khuẩn mới trong nuôi trồng thủy sản (Defoirdt et al., 2004).
Furanone được halogen hóa sản xuất từ tảo đỏ nước mặn Delisea pulchra (Manefield
et al. 1999) hứa hẹn là một chất đối kháng lại Quorum sensing. Những hợp chất này
khi được bổ sung với nồng độ thích hợp bảo vệ được Brachionus, Artemia và cá hồi
chống lại tác động bất lợi của những mầm bệnh Vibrio (Rasch et al., 2004; Defoirdt et
al., 2006; Tinh et al., 2007).
b. Hệ thống Quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi.
Vibrio harveyi là vi khuẩn phát sáng trong nước mặn, sống trong nhiều môi
trường khác nhau: nó có thể tồn tại tự do trong nước biển, bám chặt vào bề mặt vô
sinh, là thành phần của màng sinh học và gây bệnh trên vật chủ nước mặn (Henke và
Bassler, 2004). Đặc tính gây bệnh của V. harveyi trên cá có liên quan đến sự dung
huyết và phân giải phospho do các hợp chất ngoại bào của vi khuẩn (Zhang và
Austin, 2000; Zhang et al., 2001; Zhong et al., 2006; Sun et al., 2007). (trích dẫn bởi
Reading et al., 2006)
V. harveyi có ba hệ thống autoinducer điều khiển bởi quorum sensing. Hệ
thống autoinducer đầu tiên được gọi là Harveyi, autoinducer 1 (HAI-1) là một chuỗi

acyl được gắn với homoserine lactone, N – butyryl homoserine lactone (Cao và
16


Meighen, 1989). Autoinducer thứ 2 là Autoinducer 2 (AI – 2), là một furanosyl
borate diester (Chen et al.,2002). Autoinducer thứ 3 là một Cholerae Autoinducer 1
(CAI – 1) và cấu trúc của nó thì vẫn chưa được biết (Henke và Bassler, 2004). Tất cả
ba autoindcer điều khiển sự biểu hiện của gen đích bằng một cơ chế truyền tín hiệu
phospho hóa và dephospho hóa. Quorum sensing của V. harveyi sử dụng cả ba hệ
thống tín hiệu tế bào, chức năng của nó cùng song song điều khiển sự phát sáng sinh
học (Bassler et al., 1993; Bassler et al., 1994; Henke và Bassler, 2004) và nhiều yếu
tố gây độc khác như là metalloprotease (Mok et al., 2003), siderophore, sản phẩm
exopolysaccharide (Lilley và Bassler, 2000) và chất bài tiết loại 3 (Henke và Bassler,
2004) theo cách thức lệ thuộc vào mật độ tế bào. Vibrio harveyi là mầm bệnh của
nhiều động vật thủy sản (Gomez – Gil et al. 2004). Gần đây, hệ thống mã hóa AI – 2
được khám phá là quy định yếu tố gây độc của Vibrio harveyi đối với Artemia
franciscana (Defoirdt et al., 2005). Trong khi đó cả hai hệ thống HAI – 1 và hệ thống
AI – 2 có liên quan đến tác động làm chậm lại sự tăng trưởng của Brachionus plicatilis
(Tinh et al. 2007).
Thêm vào đó, furanon được halogen hóa, một hợp chất phân hủy quorum
sensing, chứng tỏ khả năng trung hòa tác động bất lợi của những chủng vi khuẩn
thuộc loài V. harveyi và nhiều Vibrio phát sáng khác (Defoirdt et al., 2005; Tinh et
al., 2007). Defoirdt và cộng sự (2007) đã tìm thấy furanone được halogen hóa làm trở
ngại sự biểu hiện của gen có liên quan đến quorum sensing trên V. harveyi bằng cách
làm giảm hoạt động kết nối của gen quy định quorum sensing với yếu tố điều chỉnh
LuxRvh. (trích dẫn bởi Reading et al., 2006)

17