Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN
QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus (L.) G. Don.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên 2017

i


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN
QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus (L.) G. Don.)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh
học
Mã số: 60 42 02
01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm

THÁI NGUYÊN – 2017

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện
dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận
văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn
là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 09 năm
2016
TÁC GIẢ

Hoàng Ngọc
Anh

iii
iiii


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm
đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và
thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn, phòng Công nghệ ADN ứng
dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ

Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình
thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu trong đề tài luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán
bộ Khoa Khoa học sự sống trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thành luận văn; cảm ơn sự đóng góp những ý kiến quý báu trong
các buổi seminar khoa học và báo cáo đề cương luận văn.
Trong

quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của

kĩ thuật viên Trần Thị Hồng, phòng Công nghệ tế bào thực vật, Khoa
Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân
thành cảm ơn bộ môn Sinh học hiện đại và GD sinh học, Trường Đại học
Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực
hiện quá trình nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Khoa học sự
sống, các thầy cô và cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học
Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi hoàn thành khóa học này.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên,
quan
tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.
Thái Nguyên, tháng 9 năm
2016
TÁC GIẢ
Hoàng Ngọc
Anh

iv

MỤC LỤC
DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN .............viii
MỞ ĐẦU
....................................................................................................... 1
1. Đặt vấn
đề.................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên
cứu.................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu
................................................................................. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Giới thiệu về cây dừa
cạn....................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm phân loại và phân bố cây dừa
cạn................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn
................................................ 4
1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn
............................................................... 5
1.2. Hợp chất alkaloid và tác
dụng................................................................ 6
1.2.1. Alkaloid
........................................................................................... 6
1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn
............................................................. 8
1.3. Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa
cạn....... 10
1.4. Enzyme peroxidase (Prx) và gen mã hóa Prx
...................................... 12

1.4.1 Enzyme peroxidase
Prx.................................................................. 12
1.4.2. Gen mã hóa peroxidase (Prx)
....................................................... 13
1.5. Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens
................ 14
1.6. Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và
vincristine
ở cây dừa
cạn............................................................................................... 16

v


1.6.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và
vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực
vật...................... 16
1.6.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và
vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen
............................................ 17
1.7. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
..................................... 18
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 20
2.1. Vật liệu nghiên cứu
.............................................................................. 20
2.1.1. Vật liệu thực vật
............................................................................ 20

vi

2.1.2. Vật liệu di
truyền........................................................................... 20
2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên
cứu............................................ 20
2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu
........................................................ 20
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
..................................................................... 21
2.3. Phương pháp nghiên
cứu...................................................................... 21
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro
...................................................... 21
2.3.2. Phương pháp chuyển gen vào cây dừa cạn
................................... 22
2.3.3. Phân tích cây chuyển gen
.............................................................. 26
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 30
3.1. Kết quả tạo cây dừa cạn mang gen chuyển
crPrx................................ 30
3.1.1. Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào cây dừa cạn nhờ A.
tumefaciens .............................................................................................
..... 30
3.1.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển crPrx trong hệ gen cây
dừa cạn
.................................................................................................................
.... 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................
37
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................... 38

vi
i


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don [24]
................... 4
Hình 1.2. Công thức hóa học của Vinblastine (A) và Vincristine (B)
................. 9
Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa tạo vinblastine và vincristine
................................. 11
Hình 1.4. Cấu trúc Cấu trúc intron và exon của CrPrx
[15]............................... 13
Hình 2.1. Sơ đồ chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A.
Tumefaciens ......................................................................................................
....... 23
Hình 3.1. Gieo hạt tạo cây con in vitro
................................................................. 30
Hình 3.2. Ngâm mảnh lá mầm trong dịch huyền phù vi
khuẩn.......................... 31
Hình 3.3. Mảnh lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy CCM
.......................... 31
Hình 3.4. Mẫu được thấm khô và đặt lên môi trường
SIM................................. 32
Hình 3.5. Mẫu phát triển đa chồi trên môi trường
SIM....................................... 32
Hình 3.6. Chọn lọc kéo dài chồi trên
SEM........................................................... 33
Hình 3.7. Cây ra giá thể

.......................................................................................... 33
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen
chuyển
crPrx trong các cây dừa cạn chuyển gen
.............................................................. 36

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Một số loại môi trường tái sinh cây đối với Dừa cạn
......................... 24
Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn
......................................... 24
Bang 2.3 : Hoa chất pha đêm rưa
.......................................................................... 28
Bang 2.4: Hoa chất pha đêm chiết
......................................................................... 28
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi
35S...................................... 28
Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR
.......................................................................... 29
Bảng 3.1. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây dừa
cạn................. 34

viii
viiiv


DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

AS

Acetosyringone

bp

base pairs

Cặp bazơ nitơ

ix


CrPrx
roseus

Catharanthus

Gen Prx ở cây dừa cạn

peroxidase
cs
CCM
cấy

Cộng sự
Cocultivation medium

DNA

Deoxyribonucleic acid

ELISA

Enzyme-Linked

Môi trường đồng nuôi

Xét nghiệm ELISA

ImmunoSorbent Assay
EDTA
Tetraacetic

Ethylene Diamine
Acid

GM

Germination medium

GMO

Genetic Modify Origanism

Môi trường tái sinh
Lương thực thực
phẩm biến đổi gen

kb

LB

Kilo base
Luria Bertami

Môi trường dinh dưỡng
cơ bản nuôi cấy vi khuẩn

MS

Murashige và Skoog, 1962

Môi trường dinh dưỡng
cơ bản nuôi cấy in vitro
theo Murashige và
Skoog

OD

Optical Density

PCR
hợp

Polymerase Chain Reaction

Prx

Peroxidas
e

Prx

Mật độ quang
Phản ứng chuỗi trùng
Gen mã hóa peroxidase
Protein peroxidase

Peroxidas
e
RM

Rooting Medium

Môi trường tạo rễ

SEM

Shoot Elongation Medium

Môi trường kéo dài chồi

x


SIM

Shoot Induction Medium

Môi trường tạo đa chồi

T-DNA

Transfer DNA

Đoạn DNA được chuyển
vào thực vật

Ti-plasmid

Tumor inducing – plasmid

Vir

Virulence region

WHO

World Health Organization

Plasmid gây khối u

Tổ chức y tế thế giới


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ung thư và sức khỏe cộng đồng là những vấn đề ngày càng
được quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Theo ước tính và
thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) hàng năm trên toàn cầu có

khoảng 9-10 triệu người mới mắc bệnh ung thư và một nửa trong số đó
chết vì căn bệnh này. Vì vậy, rất nhiều nhà khoa học quan tâm và tìm
ra những loại thuốc mới có tác dụng chống ung thư cao. Ung thư có đặc
điểm là tăng trưởng không giới hạn và di căn, trong khi các khối u lành
tính thường là tự giới hạn, không xâm lấn và di căn.
Hiện có ba phương pháp điều trị ung thư chủ yếu là phẫu thuật,
hóa trị, xạ trị. Ngoài ra, còn có một số phương pháp điều trị mới đang
bắt đầu được ứng dụng vào điều trị cho bệnh nhân ung thư như sinh hóa,
nội tiết, liệu pháp gen… Các liệu pháp điều trị ung thư có thể được sử
dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với nhau, loại điều trị phụ thuộc vào vị trí
ung thư, mức độ lan, tuổi và tình trạng sức khỏe của bệnh nhân, các
chọn lựa điều trị sẵn có và các mục tiêu cho việc điều trị. Các phương
pháp này gây ra những tác dụng không mong muốn như làm suy
giảm sức đề kháng, mệt mỏi, rụng tóc, đau nhức.
Trong bối cảnh như vậy cùng với sự phát triển của Công nghệ Sinh
học, các nhà khoa học không ngừng quan tâm nghiên cứu để tìm ra các
hợp chất thứ cấp có giá trị đóng vai trò quan trọng đối với ngành công
nghệ dược phẩm trong việc sản xuất ra các loại thuốc mới, có giá trị,
trong số đó quan trọng nhất là nhóm dược phẩm điều trị ung thư. Một số
hợp chất thuộc các nhóm alkaloid, terpenoid, phenolic, saponin được
chiết xuất từ một số thực vật tiêu biểu như thông đỏ, dừa cạn, trinh nữ
hoàng cung, nấm linh chi, giảo cổ lam được biết đến như là các hợp chất
có khả năng trị bệnh ung thư.

1


Dừa cạn là một trong những cây có khả năng sản xuất các indol
alkaloid có dược tính quan trọng trong chế tạo các loại thuốc chống
ung thư, đặc biệt là các loại ung thư máu. Trong các indol alkaloid có

mặt trong cây dừa cạn, hai loại alkaloid là vinblastine và vincristine
được sử dụng nhiều nhất. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ
trong cây dừa cạn, khoảng nửa tấn lá khô mới chiết xuất được 1g
vinblastine cho sản xuất dược phẩm, các chất này không thể tổng hợp
bằng con đường hóa học do có cấu trúc rất phức tạp. Trong cây dừa
cạn, vinblastine và vincristine được tạo ra từ sự kết hợp của
catharanthine và vindoline. Gen mã hóa enzyme peroxidase có chức
năng xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho sự tổng hợp vinblastine
và vincristine. Các nghiên cứu đã cho thấy trong các giống dừa cạn
hiện có thì giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím có hàm lượng
alkaloid toàn phần và các chất là vinblastine và vincristine đạt cao
nhất.
Nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây
dừa cạn phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết. Vì
những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu
chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng
hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo được dòng dừa cạn chuyển gen chứa gen mã hóa
enzyme
peroxidase.
3. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase ở cây dừa
cạn
2. Phân tích biểu hiện của gen chuyển crPrx trong các dòng
cây
chuyển gen ở thế hệ T0 bằng kỹ thuật PCR

2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn
1.1.1. Đặc điểm phân loại và phân bố cây dừa cạn
Cây dừa cạn hay hải đằng, dương giác, bông dừa, trường xuân
hoa, thuộc Họ: Apocynaceae, Chi: Catharanthus, Loài: Catharanthus
roseus. Có tên khoa học là: Catharanthus roseus (L) G.Don [24].
Dừa cạn thuộc họ trúc đào Apocynaceae gồm có 8 loài, loài
Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại
có nguồn gốc từ Madagasca, số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài
Catharanthus đều là 2n=16 [7], [19]. Tám loài thuộc giống này đó là:
 Catharanthus coriaceus Markgr. Madagascar;
 Catharanthus lanceus (Bojer ex A.D.C.) Pichon. Madagascar;
 Catharanthus longifolius (Pichon) Phichon. Madagascar;
 Catharanthus ovalis Markgr. Madagasca;
 Catharanthus pusillus (Murray) G.Don India subcontinent;
 Catharanthus roseus (L) G. Don. Madagascar;
 Catharanthus scintulus (Pichon) Pichon. Madagascar;
 Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon. Madagascar. [7],
[19]
Cây dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc alkaloid terpenoid
indole được phân lập từ 3 giống cây khác nhau: (1) Catharanthus
roseus “Roseus” có hoa màu hồng tím; (2) Catharanthus roseus
“Albus” có hoa màu trắng. Trong đó, hoa màu hồng tím có hàm lượng
vincristien và vinblastine cao nhất [24].

3


A

C

B

Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G.
Don [24]
A: Catharanthus roseus var. roseus
B: Catharanthus roseus var. ocellatus
C: Catharanthus roseus var. albus
Cây dừa cạn có nguồn gốc ở Madagasca (Châu Phi), mọc hoang
và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn đới như Việt Nam, Ấn Độ,
Indonesia… Cây dừa cạn được người Pháp dưa vào trồng ở Việt Nam để
làm cây cảnh. Cây dễ trồng, phát triển nhanh chịu nắng, chịu hạn tốt,
không kén đất và ít phải chăm sóc, cách chăm sóc không quá đặc
biệt nên ít lâu sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các tỉnh
đồng bằng và ven biển nước ta [7].
Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc
trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng biển, tương
đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa
Thiên – Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên. Ở những
vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại
trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ, cây bụi thấp, có khả năng
chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Cây dừa cạn
còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc [7].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa
cạn
Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 – 60 cm,
phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở
phần trên. Cây dừa cạn mọc thành bụi dày có cành đứng, lá mọc đối,
thuôn dài, đầu lá

4


hơi nhọn, phía cuống hẹp nhọn, kích thước thường biến động tùy từng
vùng phân bố dài 3cm – 6cm, rộng 2cm – 3 cm. Mỗi cành thường có 8
– 15 cặp lá, lá có phiến bầu dục màu xanh thẫm, mặt trên nhẵn, mặt
dưới có nhiều lông, mùa hoa và quả vào tháng 4 – 5 và tháng 9 – 10
hàng năm [7].
Hoa trắng hoặc hồng, mùi thơm, mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía
trên. Quả gồm hai đại dài 2cm – 4cm, rộng 2mm – 3mm, mọc thẳng
đứng hơi ngả hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả
chứa 12 – 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột
nổi thành đường chạy dọc [7].
Rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ, rễ cái đâm thẳng
xuống đấy có thể đạt chiều dài 30cm – 40cm, rễ phụ mọc thành chùm
thưa ngắn, phát triển theo chiều ngang [7].
1.1.3. Tác dụng của cây dừa
cạn
Theo từ điển Cây thuốc Việt Nam, dừa cạn có vị hơi đắng, tính mát,
có độc, có tác dụng kháng ung thư, trấn tĩnh, an thần, hạ huyết áp,
thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết, tiêu thũng. Dừa cạn được nghiên cứu
làm thuốc kìm hãm sự phát triển tế bào và được chỉ định trong điều trị
bệnh Hodgkin (một loại ung thư hệ bạch huyết), bệnh bạch cầu
lymphoblastic cấp tính, một số ung thư. Ở Trung Quốc, cây dừa cạn
dùng trị cao huyết áp, bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính và ung thư,
mụn nhọt độc. Còn ở Nouvelle-Calédonie (châu Đại Dương), dừa cạn cũng
là vị thuốc chống ung thư. Ở Australia, nước hãm rễ cây dừa cạn là loại
thuốc dân gian chống tiểu đường [24].
Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid. Người

ta đã chiết, phân lập ra trên 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu là
vinblastine,

vincritine,

catharanthine, ajmalicin…

tetrahydroalstonine,

pirinine,

vindoline,

Trong đó, ajmalicin có hiệu quả tốt trong

điều trị rối loạn thần kinh tim. Còn vinblastine và vincristine có tác dụng
làm ngừng sự phân chia tế bào ở pha giữa. Vì thế, chúng được sử dụng
làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [7].

5


Hoạt chất trong dừa cạn phụ thuộc vào nơi trồng và thu hái. Giống
trồng ở Việt Nam được đánh giá là thảo dược tốt tương đương dừa cạn ở
Madagascar, chứa khoảng 0,1 – 0,2% alkaloid toàn phần. Tỉ lệ
alkaloid trong rễ (0,7 – 2,4%) cao hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37 –
1,15%). Các nước Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc… cũng đang ra sức
bào chế thuốc từ loại cây này [19].
Hiện nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp nào điều trị
bệnh bạch cầu tốt hơn nên chiết xuất dừa cạn càng trở nên quý với

bệnh nhân ung thư máu. Tuy nhiên, không phải chỉ cần dùng cây
dừa cạn sắc lấy thuốc uống là khỏi bệnh. Vì để chữa được bệnh ung thư
cần một liều vincristine, vinblastine có hàm lượng rất cao. Nhưng dùng
các thành phần này cũng dễ bị ngộ độc nên cần có sự hướng dẫn của
bác sỹ điều trị.
Một số bài thuốc dân gian chữa bệnh ung thư của cây dừa cạn:
Chữa ung thư máu, viêm đại tràng: lấy từ 15 – 20 g thân lá dừa
cạn khô sao vàng, sắc, chia từ 2 – 3 lần uống trong ngày.
Chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc uống thân và
lá cây dừa cạn (khoảng 15g thân lá khô/ ngày).
Điều trị u xơ tuyến tiền liệt: dừa cạn 12g, huyền sâm 12g, xuyên
sơn
10g, chè khô 12g, hoàng cung trinh nữ 5g, cát căn 16g, bối mẫu 10g,
đinh lăng 16g; sắc uống ngày chia 1 lần.
1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng
1.2.1. Alkaloid
1.2.1.1. Đặc điểm chung của alkaloid
Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ và có tính
base, thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong
một vài loài động vật.

6


Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể
con người và động vật nhất là đối với hệ thần kinh. Chỉ cần một lượng nhỏ
alkaloid là chất độc gây chết người nhưng lại có khi nó là thần dược
trị bệnh đặc hiệu [13].
Alkaloid có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối
này dễ kết tinh. Hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại

rau quả thông dụng như khoai tây, chè, cà phê. Chúng là hợp chất
nhóm thiên nhiên rất quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt trong lĩnh vực y
học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao [13].
1.2.1.2. Phân loại alkaloid
Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng
phân tử chung của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất được sử dụng để
tạo ra phân tử.
Khi không biết nhiều về tổng hợp sinh học của alkaloid, thì chúng
được gộp nhóm theo tên của các hợp chất đã biết. Ví dụ: do các cấu trúc
phân tử xuất hiện trong sản phẩm cuối cùng nên các alkaloid thuốc
phiện đôi khi còn được gọi là các “phenanthren”. Hay gọi tên dựa theo
nhóm động vật, thực vật mà từ đó người ta chiết xuất ra các alkaloid, ví
dụ như các alkaloid chiết từ cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các
vinca alkaloid.
Khi người ta biết nhiều hơn về một alkaloid cụ thể nào đó, thì việc
gộp nhóm thường lấy theo tên gọi của amin quan trọng về mặt sinh học
và nổi bật nhất trong tiến trình tổng hợp.
Các nhóm alkaloid hiện nay gồm có:
• Nhóm pyridin: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin,
guvacin,
pilocarpin, cytisin, nicotin, spartein, pelletierin.
• Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohtgrin, nicotin.
• Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin.

7


• Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin,
dihydroquinidin, strychnin, brucin, cevadin.
• Nhóm isoquinolin: các alkaloid gốc thuốc phiện như:

morphin,
codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin,
berberin.
• Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin,
amphetamin.
• Nhóm indol:
- Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin.
- Các ergolin: Các alkaloid từ ngũ cốc/ cỏ như ergin, ergotamin,
acid
lysergic.
- Các beta-cacbolin: Harmin, harmalin, yohimbin, reserpin,
emetin.
- Các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia): reserpin
• Nhóm purin: Các xanthin (cafein, theobromin, theophyllin).
• Nhóm terpenoit:
- Các alkaloid aconit: aconitin.
- Các steroit: solanin, samandari (các hợp chất amoni bậc
bốn):
muscarin, cholin, neurin.
- Các vinca alkaloid: Vinblastine, vincristine…
1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn
1.2.2.1. Một số alkaloid chính trong cây dừa cạn
Một số alkaloid chính trong cây dừa cạn là vinblastine,
vincristine, ajmalicine, vindolinine và serpentine…
Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37 – 1,15%,
thân
0,40%, rễ chính 0,7 – 2,4%, rễ phụ 0,9 – 3,7%, hoa 0,14 – 0,84%, vỏ
quả

8

1,14%, hạt 0,18%. Trong khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết
từ

9


Catharanthus roseus cần đặc biệt chú ý là nhóm 20 alkaloid dimeric là
những nhóm có hoạt tính chống ung thư bao gồm vincristine và
vinblastine [19].
Vinblastine

(vincaleukoblastine),

công

thức

phân

tử:

C48H58N4O9, có ở lá với hàm lượng 0,013 – 0,063%, ở bộ phận trên
mặt đất là 0,0015%, ở rễ 0,23%. Nếu cây bị bệnh astetylow-virus thì sẽ
không có vinblastine. Vincristine (leurocristine) có công thức phân tử:
C46H56N4O10, hàm lượng thấp hơn, trong khoảng 0,0003 – 0,0015%
[17].
Lá dừa cạn thu thập ở nhiều địa phương khác nhau chứa 0,7 –
1,2% alkaloid toàn phần. Vinblastine có với hàm lượng 1,6 – 2 phần vạn

ở lá. Thời gian thu hái nguyên liệu tốt nhất để trên cây có hàm lượng
hoạt chất cao là vào cuối tháng 8 đến giữa tháng 9 dương lịch [17].

A
B
Hình 1.2. Công thức hóa học của Vinblastine (A) và
Vincristine (B)
1.2.2.2. Tác dụng của alkaloid trong cây dừa cạn
Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây dừa cạn
hai alkaloid vinblastine và vincristine là những chất ức chế mạnh sự
phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với Tubulin, là protein ống
vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây
ngừng phân chia tế bào ở pha giữa. Cho nên chúng hạn chế được việc
hình thành bạch cầu thừa ở bệnh nhân ung thư máu. Ở nồng độ cao,
thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào.
Ngoài ra, cây dừa cạn còn có tác dụng hạ huyết áp và kháng một số
chủng nấm gây bệnh. Nhưng ở giai đoạn

10


mang thai lại ngăn cản sự phát triển của thai trên động vật gây độc cho
thai nhi, thuốc chỉ dùng ở thời kì mang thai khi bệnh đe dọa đến tính
mạng hoặc các thuốc khác không thể sử dụng được [20].
Hiện nay, vinblastine được ứng dụng rộng rãi vào điều trị bệnh
ung thư ở người và được hấp thu nhanh chóng theo đường tiêm tĩnh
mạch, thuốc phân bố nhanh vào các mô của cơ thể, liên kết nhiều
với protein huyết tương. Vinblastine được chuyển hóa nhiều, chủ yếu ở
gan để thánh desacetyl vinblastine – là chất có hoạt tính mạnh hơn
vincristine, thuốc thải trừ qua mật vào phân và nước tiểu, một số đào

thải dưới dạng thuốc không biến đổi [11].
Hiệu quả chống ung thư vincristine hơn vinblastine cao hơn
khoàng
10 lần để điều trị bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính, tác dụng tốt hơn
trên bệnh bạch cầu cấp tính khác, bệnh Hodgkin, lymphosarcoma,
sarcom tế bào lưới và ung thư vú có hiệu lực [11].
1.3. Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong
cây dừa cạn
Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và cincristine được tạo
thành từ sự ghép nối của hai monomer alkaloid: catharanthine (indole)
và vindoline (dihydroindole). Cả hai đều xuất hiện tự do trong cây.
Vincristine cũng có cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay nhóm
fromyl bằng một nhóm methyl trên phân tử nitrogen indole của
vindoline [22].

11


Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa tạo vinblastine và
vincristine
Những alkaloid này được hình thành bởi sự kết hợp của hai nửa:
một nửa là indole và một nửa là dihydrodole. Vì thế, chúng được biết
đến với tên gọi là “dimer alkaloid” hoặc “bisindole alkaloid” [22].
Deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) là một enzyme
quan trọng cho bước cuối cùng của quá trình tổng hợp vindoline. Theo
Wang và đồng tác giả (2010) các gen promoter của gen DAT được
nhân lên, giải trình tự và phân tích. Theo đó, promoter của gen
DAT gồm khoảng
1773bp. Phân tích trình tự cho biết promoter gen DAT có chưa một số
yếu tố làm cho nó được tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện

gen. Hoạt

12


động điều tiết của promoter DAT đã được xác định với các xét nghiệm
định lượng huỳnh quang [22].
Phản ứng dimerization dẫn đến 3’,4’ -anhydrovinblastine là
một bước quan trọng để sản xuất các alkaloid chống ung thư. 3’,4’anhydrovinblastine là chìa khóa trung gian từ sự ghép nối của
catharanthine và vindoline. Phản ứng dimerization đã thu hút nhiều sự
chú ý do tầm quan trọng của nó và khả năng ứng dụng để sản xuất bán
tổng hợp của các alkaloid dimeric. Việc tìm kiếm các enzyme
dimerization trong mô lá phát hiện một loại peroxidase hiện diện trong
lá cây. Enzyme này có tác dụng quan trọng trong việc xúc tác cho phản
ứng kết hợp giữa catharanthine và vindoline [8], [10].
1.4. Enzyme peroxidase (Prx) và gen mã hóa Prx
1.4.1 Enzyme peroxidase Prx
Peroxidase là một họ các peroxidase cysteine phụ thuộc vào
phản ứng với hydrogen peroxide, axit béo và nhiều chất hydroperoxide
thơm, peroxynitrite. Những enzyme chống oxy hóa phổ biến và cao,
biểu hiện ở nhiều sinh vật bao gồm cả thực vật, vi khuẩn và động vật có
thể có tối đa
1% hoặc nhiều hơn các protein tế bào [1].
Peroxidase là enzyme thực vật có khả năng sử dụng H2O2 để
oxi hóa một số chất cho quá trình chuyển hóa trung gian, đặc biệt là hợp
chất phenol. Những enzyme này được định vị trên thành tế bào và
không bào [12].
Peroxidase là các enzyme đa chức năng, điển hình của thực vật,
xúc tác quá trình oxy hóa của các phân tử nhỏ. Peroxidase thành tế
bào chủ yếu liên quan đến sự quyết định tính chất cấu trúc và bảo vệ

thành tế bào thực vật, như sinh tổng hợp ligin và suberin. Nó cũng liên
qua đến dị hóa auxin, trong sự trao đổi chất thứ cấp.

13