KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHIỄM FAECAL COLIFORMS, E. coli, Salmonella VÙNG NƯỚC NUÔI NHUYỄN THỂ TẠI CẦN GIỜ, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ VÙNG BÌNH ĐẠI, BA TRI TỈNH BẾN TRE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHIỄM FAECAL COLIFORMS, E. coli,
Salmonella VÙNG NƯỚC NUÔI NHUYỄN THỂ
TẠI CẦN GIỜ, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VÀ VÙNG BÌNH ĐẠI, BA TRI
TỈNH BẾN TRE

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: BÙI VĂN THÔNG
Niên khóa: 2005-2009

Tháng 08/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHIỄM FAECAL COLIFORMS, E. coli,
Salmonella VÙNG NƯỚC NUÔI NHUYỄN THỂ
TẠI CẦN GIỜ, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VÀ VÙNG BÌNH ĐẠI, BA TRI
TỈNH BẾN TRE

Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

ThS.NGUYỄN TIẾN DŨNG

BÙI VĂN THÔNG

CN.HỒ THANH BÁ

Tháng 08/2009


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian học tập tại trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và
khoảng thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, em xin chân thành cảm ơn:
Xin gởi lời thành kính nhất đến cha, mẹ đã sinh thành và dưỡng dục con nên
người. Cha mẹ đã không quản khó khăn tạo mọi điều kiện cho con cắp sách đến trường
và thường động viên em trong những lúc khó khăn, chán học.
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô, anh chị đã truyền đạt kiến
thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.
Thạc sĩ Nguyễn Tiến Dũng _công tác tại NAFIQAVED_đã tận tình hướng dẫn
và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn này.
Cử nhân Hồ Thanh Bá, anh Nguyễn Văn Lẫm đã hết lòng chỉ dẫn, giúp đỡ tận
tình và truyền đạt cho em những kinh nghiệm trong suốt thời gian làm đề tài I5 (ở
phòng Vi Sinh) Bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
Tập thể giáo viên, nhân viên và các anh, chị trong Viện Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Môi Trường thuộc trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Cùng tất cả các bạn lớp DH05SH đã cùng nhau học tập, vui chơi, chia sẽ những

vui buồn, giúp đỡ mình trong suốt 4 năm học và khoảng thời gian khó khăn thực hiện
đề tài tốt nghiệp tại trường.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn tất cả.
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2009
Sinh viên
Bùi Văn Thông

iii


TÓM TẮT
Nhằm mục tiêu kiểm tra tính an toàn vùng nước nuôi nghêu hiện nay tại Bến Tre và
Cần Giờ nhằm đánh giá chất lượng vùng nuôi và mối liên hệ các yếu tố ảnh hưởng chất
lượng thủy sản. Đề tài được thực hiện từ 02/2008 đến 06/2008 tại phòng thí nghiệm I5
thuộc Bộ Môn Công nghệ Sinh học thuộc trường Đại học Nông Lâm, Tp. HCM.
Đề tài đã khảo sát định lượng Faecal Coliforms, E. coli và định tính sự hiện diện
Salmonella trên tổng số 60 mẫu nước tại 3 khu vực nuôi nghêu. Phương pháp MPN ở 3
nồng độ với độ lặp lại 5 lần tham chiếu theo MFHPB 19-2002 Sổ tay phương pháp
phân tích vi sinh vật của Canada được sử dụng cho quá trình định lượng Faecal
coliforms, E. coli và tham chiếu theo tiêu chuẩn NMKL71/1999 cho quá trình định tính
Salmonella trong nước vùng nuôi. Phần mền thống kê sinh học STATGRAPHICSPLUS-5.1 được dùng để xử lý số liệu với kết quả đạt được.
Kết quả khảo sát vùng nuôi Bình Đại cho kết quả trung bình trên tổng số 20 mẫu về
Faecal Coliforms là 146,12, E. coli là 24,16, Salmonella không phát hiện sự hiện trong 100
ml/ mẫu phân tích. Tương tự, vùng Ba Tri có kết quả trung bình là 98,8, 33,9 và không
phát hiện sự hiện diện Salmonella. Vùng Cần Giờ có kết quả trung bình là 140,75, 24,16
và phát hiện 2 mẫu có sự hiện diện Salmonella trong 20 mẫu lấy phân tích.
Kết quả khảo sát tại khu vực Ba Tri, Bình Đại của tỉnh Bến Tre và vùng Cần Giờ,
Tp.HCM đều đạt tiêu chuẩn vùng nuôi an toàn theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 59431995 về mức giới hạn ô nhiễm ven biển. Tổng số Coliform dưới 1000/100 ml theo phương
pháp MPN/100 ml áp dụng cho khu vực nuôi thủy sản.
Trong số các mẫu đã phân tích đã phát hiện 2 mẫu trong tổng số 20 mẫu tại Cần

Giờ nhiễm Salmonella. Đây là thách thức và cảnh báo thực trạng môi trường nuôi thủy
sản tại khu vực này.

iv


SUMMARY
Our purpose was that: we tested the safety of the water in the raising area (Ben
Tre and Can Gio). Hence, we evaluated the quality of the raising area and some factors
affect to the quality of sea food. The subject was studied from February 2009 to July
2009 at the laboratory of Department of Biotechnology, Nong Lam University, Ho Chi
Minh City.We counted the numbers of Faecal Coliforms and E. coli. Besides, we tested
the present Salmonella in 60 water’s samples at 3 rasing areas
With Faecal coliforms, E. coli. We used MPN’s method at three concentrations
(5 times repeatedly). This method follows MFHPB 19-2002, Canada standard. With
Salmonella, We used the method which follows NMKL71/1999 standard. Finally,
STATGRAPHICS-PLUS-5.1 sofware were used to deal with the result.
The result was in Bình Đại’s raising area, Faecal Coliforms was 146,12; E. coli
was 24,16. There was no Salmonella in 100 ml sample. Similar, in Ba Tri’s raising area
Faecal Coliforms is 98,8; E. coli is 33,9. There was no Salmonella in 100 ml sample.
Contrast, in Cần Giờ raising area, there were 2 samples which had Salmonella. The
result with Faecal Coliforms and E. coli was 140,75 and 24,16
The result of water’s safty was: Ba Tri, Bình Đại and Cần Giờ were all enough
safe condition for the raising area which follows Việt Nam standard, 5943-1995.
Coliform’s total was lower 1000/100 ml following MPN method
There were 2 samples which had Salmonella. This is big challenge to the factual
enviroment of these raising area

v

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .................................................................................................................. iii
Tóm tắt......................................................................................................................... iv
Summary....................................................................................................................... v
Mục lục ........................................................................................................................ vi
Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... viii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... ix
Danh sách các hình ....................................................................................................... x
Chương 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
1.2. Mục đích ................................................................................................................ 1
1.3. Ý nghĩa................................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 3
2.1. Sự phân bố Faecal Coliform, E. coli, Salmonella trong nước vùng nuôi ............. 3
2.2. Nguồn gốc lây nhiễm của vi sinh vật đường ruột vào trong nước nuôi ............... 4
2.3. Đặc điểm nhóm vi sinh vật đường ruột ................................................................ 5
2.3.1. Giới thiệu chung về Coliforms ........................................................................... 5
2.3.2. Đặc điểm E. coli ................................................................................................. 6
2.3.3. Đặc điểm Salmonella ......................................................................................... 9
2.4. Các phương pháp phân tích Faecal coliforms, E. coli, Salmonella..................... 13
2.4.1. Các phương pháp màng lọc .............................................................................. 13
2.4.2. Phương pháp Petri ............................................................................................ 14
2.4.3. Phương pháp PCR ............................................................................................ 14
2.4.4. Các phương pháp sinh học phân tử khác…...................................................... 14
2.5. Chế độ thủy triều ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật vùng nuôi................................. 15
Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 16
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 16
3.2. Vật liệu................................................................................................................. 16

3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 16

vi


3.2.2. Nơi lấy mẫu và số lượng mẫu........................................................................... 16
3.2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ............................................................................ 16
a) Dụng cụ................................................................................................................... 16
b) Thiết bị ................................................................................................................... 16
3.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 17
3.2.1. Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu................................................... 17
3.2.2. Phương pháp phân tích ..................................................................................... 18
a) Quy trình phân tích định lượng Faecal Coliforms ................................................. 18
b) Quy trình định lượng Escherichia coli trong nước vùng nuôi nghêu ................... 18
c) Quy trình định tính Salmonella trong nước vùng nuôi nghêu................................ 19
3.3. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu số liệu .................................................. 20
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................... 21
4.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của các chủng sử dụng làm đối chứng................... 21
4.1.1. Khảo sát các đặc điểm của chủng đối chứng Faecal Coliforms, E. coli........... 21
a) Khảo sát đặc điểm của Faecal Coliforms .............................................................. 21
b) Khảo sát đặc điểm của E. coli ............................................................................... 22
4.1.2. Khảo sát salmonella trên mẫu đối chứng dương .............................................. 23
4.2. Kết quả khảo sát tại các vùng nuôi ..................................................................... 24
4.2.1. Kết quả khảo sát tại vùng nuôi HTX Rạng Đông, Bình Đại, Bến Tre ............. 24
4.2.2. Kết quả khảo sát tại vùng nuôi HTX An Thủy, Ba Tri, Bến Tre ..................... 24
4.2.3. Kết quả khảo sát tại vùng nuôi HTX Cựu Chiến Binh, Cần Giờ, Tp.HCM..... 25
4.3 Thảo luận kết quả khảo sát ................................................................................... 25
4.3.1 Kết quả khảo sát mật độ VSV tại HTX Rạng Đông, Bình Đại ......................... 25
4.3.2. Kết quả khảo sát mật độ VSV tại HTX An Thủy, Ba Tri ................................ 26
4.3.3. Kết quả khảo sát mật độ VSV tại HTX Cựu Chiến Binh, Cần Giờ ................. 28

4.3.4. So sánh mật độ hiện diện vi sinh vật tại các địa điểm lấy mẫu ........................ 29
4.3.5. Ảnh hưởng thủy triều lên mật độ hiện diện của vi sinh vật ............................. 30
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 32
5.1. Kết luận................................................................................................................ 32
5.2. Đề nghị................................................................................................................. 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 33
PHỤ LỤC
vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATVSTP

An toàn vệ sinh thực phẩm

BGBL

Brilliant Green Bile Latose

BPW

Buffered Pepton Water

E. coli

Escherichia coli

EMB

Eosin Methyl Blue

HTX

Hợp tác xã

KIA

Kligler Iron Agar

LDC

Lysine Decarboxylase

LSB

Lauryl Sulfate Broth

MR - VP

Methyl Red - Vosges Poskauer

RV

Rappaport Vassiliadis

SC

Simmons Citrate

SPW

Saline Pepton Water

TSA

Trypton Soya Agar

VSV

Vi sinh vật

XLD

Xylose Lysine Deoxycholate

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1 Kết quả phân tích mức độ nhiễm tại Bình Đại ...........................................24
Bảng 4.2 Kết quả phân tích mức độ nhiễm tại Ba Tri................................................24
Bảng 4.3 Kết quả phân tích mức độ nhiễm tại Cần Giờ…………………………….25

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Vi khuẩn Coliforms dưới kính hiển vi ........................................................5

Hình 2.2 Hình thái vi khuẩn E. coli dưới kính hiển vi...............................................7
Hình 2.3 Thử nghiệm indole trên vi khuẩn E. coli ....................................................9
Hình 2.4 Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi điện tử ........................................10
Hình 2.5 Các bộ phận của thiết bị lọc vi sinh vật. ..................................................13
Hình 4.1 E. coli có phản ứng dương tính sinh hơi trên môi trường EC...................21
Hình 4.2 Khuẩn lạc E. coli trên môi trưởng EMB...................................................22
Hình 4.3 Thử nghiệm indol có phản ứng dương tính. .............................................23
Hình 4.4 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD............................................23
Hình 4.5 Thử nghiệm sinh hóa của chuẩn Salmonella trên các môi trường............24
Biểu đồ 4.1 Biểu diễn mật độ vi sinh vật tại HTX Rạng Đông, Bình Đại...............25
Biểu đồ 4.2 Mức độ phân tán về kết quả phân tích giữa các mẫu tại Bình Đại.......26
Biểu đồ 4.3 Biểu diễn mật độ vi sinh vật tại HTX An Thủy, Ba Tri .......................27
Biểu đồ 4.4 Mức độ phân tán về kết quả phân tích giữa các mẫu tại Ba Tri. ..........27
Biểu đồ 4.5 Mật độ vi khuẩn đường ruột tại HTX CCB, Cần Giờ. .........................28
Biểu đồ 4.6 Mức độ phân tán về kết quả phân tích giữa các mẫu tại Cần Giờ........29
Biểu đồ 4.7 So sánh mật độ hiện diện vi khuẩn tại 3 khu vực lấy mẫu. ..................29
Biểu đồ 4.8 Mật độ Faecal coliforms theo thủy triều tại khu vực lấy mẫu..............30
Biểu đồ 4.9 Mật độ E. coli theo thủy triều tại khu vực lấy mẫu. .............................30

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 . Đặt vấn đề
Điều kiện địa lý nước ta rất thuận lợi để phát triển nuôi trồng thủy hải sản, góp
phần đáng kể vào việc phát triển kinh tế đất nước. Thủy sản là nguồn thực phẩm tươi
sống bổ dưỡng được phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước, đồng thời cũng là nguồn
xuất khẩu có tiềm năng lớn của nước ta.
An toàn vệ sinh thực phẩm đang được sự quan tâm rất lớn của cộng đồng. Trong

thời gian gần đây xuất hiện một số trường hợp ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng không tốt
đến sức khỏe và tính mạng con người cũng như uy tín chất lượng hàng thực phẩm của
Việt Nam trên thương trường quốc tế. Yêu cầu tiêu dùng hiện nay cần cung cấp thực
phẩm sạch, không mang mầm bệnh ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng.
Trong nhóm thực phẩm tiêu dùng hằng ngày, thủy hải sản tươi sống và đông lạnh với
dư lượng kháng sinh, hàm lượng vi sinh vật có hại thấp nhất trong sản phẩm. Hiện nay
việc giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm có xu hướng kiểm soát theo chuỗi từ vùng
nuôi, trang trại đến bàn ăn. Vì vậy việc giám sát vệ sinh vùng nuôi được thực hiện một
cách thường xuyên.
Theo Báo Lao Động số 240 ngày 17/10/2008 – Hội đồng Bảo tồn biển quốc tế
vừa cấp giấy chứng nhận thương hiệu MSC (Marine Sterwarship Council) cho nông
dân nuôi nghêu Bến Tre. Đây là loại thủy sản đầu tiên của cả khu vực Đông Nam Á
được Hội đồng Bảo tồn biển quốc tế công nhận thương hiệu. Với thương hiệu MSC,
nghêu Bến Tre sẽ vào được các thị trường khó tính nhất. Tỉnh Bến Tre hiện có khoảng
15 ngàn hécta nuôi nghêu, tập trung ở 10 HTX thuộc 3 huyện Bình Đại, Thạnh Phú và
Ba Tri, với sản lượng hàng năm gần 20,000 tấn.
Việc giám sát các chỉ tiêu chỉ điểm vệ sinh vùng nuôi như mật độ Faecal
Coliforms, E. coli và Salmonella là việc làm cần thiết để khẳng định chất lượng và
thương hiệu nghêu Bến Tre trên thị trường quốc tế.

1


1.2. Mục đích và nội dung
1.2.1. Mục đích
Khảo sát mật độ nhóm vi sinh vật đường ruột trong nước vùng nuôi nghêu hiện
nay tại Bến Tre và Cần Giờ nhằm đánh giá chất lượng an toàn vệ sinh của sản phẩm
nghêu khai thác từ các vùng nuôi này. Trong quá trình phân tích tìm mối liên hệ giữa
mật độ vi sinh vật đường ruột hiện diện trong nước với các yếu tố môi trường như thủy
triều, mùa, nhiệt độ,…Qua đó tìm mối quan hệ với mật độ các virus đường ruột gây

bệnh khác hiện diện trong môi trường nuôi nghêu.
1.2.2. Ý nghĩa
Khảo sát sự hiện diện Faecal Coliforms, E. coli bằng phương pháp MPN/100
ml và định tính Salmonella trong nước nuôi nghêu. Căn cứ vào kết quả của quá trình
khảo sát để xác định mối liên hệ giữa mật độ vi sinh vật chỉ thị các yếu tố môi
trường. Đồng thời đánh giá sơ bộ chất lượng của từng vùng nuôi.
1.2.3. Nội dung
Khảo sát mật độ Faecal Coliforms, E. coli và tần suất hiện diện Salmonella trong
nước vùng nuôi nghêu tại Cần Giờ, TP.HCM và vùng biển thuộc 2 huyện Ba Tri và
Bình Đại của tỉnh Bến Tre.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sự phân bố hệ vi sinh vật trong nước vùng nuôi nhuyễn thể
Vi sinh vật có mặt ở khắp nơi trong các nguồn nước. Sự phân bố của chúng hoàn
toàn không đồng nhất mà rất khác nhau tùy thuộc vào đặc trưng của từng vùng nuôi.
Các yếu tố môi trường quan trọng quyết định sự phân bố của vi sinh vật là hàm lượng
muối, chất hữu cơ, pH, nhiệt độ và ánh sáng. Nguồn gây nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài
cũng là yếu tố rất quan trọng vì ngoài những nhóm vi sinh vật bản địa của nước, còn
có nhóm vi sinh vật ngoại lai này cũng góp phần hình thành nên hệ vi sinh vật trong
nước vùng nuôi nghêu.
Trong nguồn nước biển luôn luôn hiện hữu hai nhóm vi sinh vật là nhóm vi
sinh vật tự dưỡng và nhóm vi sinh vật dị dưỡng. Nhóm vi sinh vật dị dưỡng có khả
năng phân huỷ các chất hữu cơ. Hầu hết các nhóm vi sinh vật dị dưỡng trong đất
đều có mặt ở đây.
Ngoài các hệ vi sinh vật bản địa của nước, các nhóm vi sinh vật trong đất, ở
những nơi bị nhiễm bẩn bởi nước thải sinh hoạt còn có mặt các vi khuẩn đường ruột

và các vi sinh vật gây bệnh cho người và động vật. Tuy những vi khuẩn này chỉ
sống trong nước một thời gian nhất định nhưng nguồn nước thải lại được đổ vào
thường xuyên nên lúc nào chúng cũng có mặt trong nước tại các khu vực nuôi thủy
sản. Đây chính là nguồn ô nhiễm vi sinh vật nguy hiểm đối với sức khỏe con người.
Ở môi trường nước mặn bao gồm hồ nước mặn và biển, sự phân bố của vi sinh
vật khác hẳn so với môi trường nước ngọt do nồng độ muối ở những nơi này cao hơn.
Tuỳ thuộc vào thành phần và nồng độ muối, thành phần và số lượng vi sinh vật cũng
khác nhau rất nhiều. Tuy nhiên tất cả đều thuộc nhóm ưa mặn ít có mặt ở môi trường
nước ngọt. Có những nhóm phát triển được ở những môi trường có nồng độ muối cao
gọi là nhóm ưa mặn cực đoan. Nhóm này có mặt ở cả các ruộng muối và các thực phẩm
ướp muối. Đại diện của nhóm này là Halobacterium có thể sống được ở dung dịch
muối bão hòa.

3


Có những nhóm ưa mặn vừa phải sống ở nồng độ muối từ 5 đến 20 ‰, nhóm ưa mặn
yếu sống được ở nồng độ dưới 5 ‰. Ngoài ra có những nhóm chịu mặn sống được ở môi
trường có nồng độ muối thấp, đồng thời cũng có thể sống ở môi trường nước ngọt.
Các vi sinh vật sống trong môi trường nước mặn nói chung có khả năng sử dụng
chất dinh dưỡng có nồng độ rất thấp. Chúng phát triển chậm hơn nhiều so với vi sinh
vật đất. Chúng thường bám vào các hạt phù sa để sống. Vi sinh vật ở biển thường thuộc
nhóm ưa lạnh, có thể sống được ở nhiệt độ từ 0 đến 40C. Chúng thường có khả năng
chịu được áp lực lớn nhất là ở những vùng biển sâu (Lê Xuân Phương, 2003).
2.2. Nguồn gốc lây nhiễm vi sinh vật đường ruột vào môi trường nước nuôi thủy sản
Trong hoạt động nuôi thủy sản nước ta hiện nay đang trên đà phát triền nhưng
còn một số hạn chế ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản. Theo tiêu chuẩn về chất lượng
thủy sản ngoài các tiêu chuẩn về các kim loại, độc tố còn có yếu tố vi sinh vật. Chưa có
báo khoa học công bố chính xác nguyên nhân và nguồn gốc lây nhiễm vi sinh vật vào
vùng nuôi thủy sản.

Có rất nhiều nguyên nhân trong nguồn gốc lây nhiễm vi sinh vật vào nguồn
nước nuôi thủy sản có thể từ đất do bụi bay lên, nguồn nước này chủ yếu bị nhiễm vi
sinh vật trên bề mặt hay có thể do nước mưa sau khi chảy qua những vùng đất khác
nhau cuốn theo nhiều vi sinh vật nơi nước chảy qua. Do nước ngầm hoặc nguồn nước
khác qua những nơi nhiễm bẩn nghiêm trọng hay số lượng và thành phần vi sinh vật
trong nước mang đặc trưng vùng đất bị nhiễm mà nước chảy qua…
Các chất thải sinh hoạt các khu dân cư, các chất thải nông nghiệp xung quanh
vùng nuôi cũng là nguồn gốc gây nhiễm vi sinh vật vào vùng nuôi thủy sản. Tại các
khu vực nuôi cùng với hoạt động nuôi thiếu quy hoạch làm ảnh hưởng đến môi trường
tạo điều kiện thích hợp cho sự tích tụ và phát triển vi sinh vật. Đặc biệt, bãi không bằng
phẳng, có nhiều chỗ nước đọng rất dễ làm cho nghêu chết khi thủy triều xuống thấp.
Khi nghêu chết thịt thối rữa rất nhanh gây ô nhiễm cả bãi và rất dễ dẫn đến hiện tượng
nghêu chết hàng loạt. Cùng với sự tích tụ các chất thải sinh hoạt của các khu dân cư các
thành phố lớn cũng là nguồn gốc tiềm ẩn các vi sinh vật đường ruột và các vi khuẩn có
hại khác.Theo mùa, nhiệt độ, độ mặn cũng ảnh hưởng đến mật độ vi khuẩn đường ruột
trong nước. Những tháng mùa mưa làm cho độ mặn, nhiệt độ giảm thích hợp cho vi
khuẩn phát triển hơn so với mùa nắng và theo hoạt động thủy triều làm biến động sự
hiện vi khuẩn đường ruột ở trong nước.
4


2.3. Đặc điểm nhóm vi khuẩn đường ruột trong vùng nuôi thủy sản
Trong vùng nuôi thủy sản hiện rất nhiều vi sinh vật khác nhau tùy thuộc vào mật
độ cũng như điều kiện phân bố. Chỉ tiêu các vi khuẩn đường ruột phản ánh được mức
độ an toàn vệ sinh thực phẩm.
2.3.1. Giới thiệu chung về Faecal Coliforms

Hình 2.1 Vi khuẩn Coliforms chụp dưới kính hiển vi
().

Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý,
có khả năng lên men lactose tạo acid sinh hơi ở 37oC trong 24 - 48 giờ. Trong thực tế phân
tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men lactose và sinh hơi
trong 48 giờ khi được ủ ở 37oC trong môi trường canh Lauryl Sulphate và canh Brilliant Green
Lactose Bile Salt. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động
vật và được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng có trong thực phẩm,
nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện các vi sinh vật gây
bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi mật độ Coliforms của thực phẩm cao thì khả
năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. Tuy nhiên, mối liên hệ giữa vi sinh vật
gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị vẫn là vấn đề đang nhiều tranh cãi.
Nhóm Coliforms gồm 4 giống: Escherichia với loài duy nhất là E. coli,
Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter. Tính chất sinh hóa đặc trưng nhóm này được
thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và
Citrate (C) thường được gọi tóm tắt là IMViC.
Căn cứ vào nhiệt độ để vi sinh vật có thể phát triển để chia nhóm Coliforms thành 2
nhóm. Nhóm Coliforms có nguồn gốc từ phân của các động vật còn gọi là Coliforms phân hay
Faecal Coliforms (E. coli giả định). Nhóm Coliforms không có nguồn gốc từ phân động vật.

5


Faecal Coliforms là những Coliforms chịu nhiệt có khả năng lên men lactose
sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường EC. Chúng có phản
ứng dương tính với indole khi ủ ở 44,5oC khoảng 24 giờ trong canh tryptone. Faecal
Coliforms là một thành phần hệ vi sinh vật đường ruột người và các động vật khác. Nó
được dùng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển
thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường. E.
coli là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là + +- - (Indol +, Methyl Red +,
Voges-Prokauer -, Citrate -) (Nguyễn Tiến Dũng, 2007).
2.3.2. Đặc điểm Escherichia coli

Escherichia coli là vi khuẩn thuộc họ vi sinh vật đường ruột, Enterobacteriaccea,
thuộc nhóm Faecal Coliforms, có hình que, Gram âm, di động, có khả năng lên mên đường
lactose sinh acid ở 44oC hay nhiệt độ thấp hơn. Chúng có khả năng sinh indol ở 44oC và
37oC, có phản ứng Voges Proskauer âm tính và không có khả năng sử dụng Citrate như
nguồn carbon duy nhất (Trần Linh Thước, 2005).
 Lịch sử phát hiện
Năm 1885, vi khuẩn này do Theodor Escherich phát hiện từ trong tã lót trẻ em
và được đặt tên đầu tiên là Bacterium coli commune. Năm 1889, vi khuẩn này được giới
chuyên môn đổi tên thành Escherichia nhằm tri ân người có công khám phá. Năm 1895,
nó được gọi là Bacillus và năm 1896 được gọi thành Bacterium coli. Vào năm 1991, vi
khuẩn này được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli và đây cũng là tên khoa
học được sử dụng thông dụng nhất hiện nay.
 Phân loại
1. Ngành: Proteobacteria
2. Lớp: Gamma Proteobacteria
3. Bộ: Enterobacteriales
4. Họ: Enterobacteriaceae
5. Chi: Escherichia
6. Loài: E. Coli
Các nhóm E. coli gây bệnh cho người có mang plasmid gây bệnh như nhóm sinh
độc tố ruột (Enterotoxingenic E. coli viết tắt ETEC) gây ra những vụ tiêu chảy kiểu
giống tả ở trẻ em và người lớn. Nhóm E. coli gây bệnh (Enteropathogenic E. coli viết
tắt EPEC) gây ra viêm ruột và tiêu chảy ở trẻ em và người lớn thành dịch hoặc lẻ tẻ.
6


Nhóm E. coli bệnh tích ( Enterohemorrhagic E. coli viết tắt EHEC )/ Veroytocin E. coli
(VTEC) hay E. coli O157:H7 gây xuất huyết tiêu hóa. Nhóm E. coli xâm nhập
(Enteroinvarive E. coli viết tắt EIEC) gây ra những vụ tiêu chảy có nhiễm độc thức ăn
kiểu giống lỵ. Nhóm E. coli gây bệnh mới Enteroadherent E. coli (EAEC).

 Đặc điểm hình thái
E. coli là trực khuẩn hình que thẳng, gram âm, kích thích dài ngắn khác nhau,
trung bình khoảng 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm, đôi khi trong môi trường nuôi cấy trực
khuẩn dài 6 – 8 µm. Trực khuẩn có thể có vỏ, có lông, di động (một số chủng không di
động), là trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử.

Hình 2.2 Hình thái vi khuẩn E. coli dưới kính hiển vi
( />
 Cấu trúc kháng nguyên
Cấu trúc kháng nguyên của E. coli rất phức tạp với 4 loại kháng nguyên O, H, K,
F. Những vi khuẩn có cấu trúc kháng nguyên khác nhau thì đặc điểm gây bệnh cũng khác
nhau. Kháng nguyên O là kháng nguyên thân, đến nay đã phát hiện được 157 loại, do đó
chia E. coli thành 157 kiểu huyết thanh. Đối với kháng nguyên K là kháng nguyên bề
mặt, dựa vào sự nhạy cảm với nhiệt độ của loại kháng nguyên này, người ta chia kháng
nguyên thành ba loại A, B, L. Kháng nguyên A bền vững với nhiệt độ trong khi đó kháng
nguyên L không bền vững với nhiệt độ và kháng nguyên B có tính trung gian giữa hai
loại kháng nguyên trên. Ngược lại, kháng nguyên H: là kháng nguyên lông, được ghi
bằng các số 1, 2, 3, 4 và có 48 loại. E. coli gây ngộ độc thực phẩm bao gồm các serotype
O26, O86, O111, O119, O125,O126, O157:H7 là kiểu huyết thanh gây ngộ độc thực phẩm mạnh
nhất (Đặng Thị Kim Thoại, 2007).

7


 Phân bố Escherichia coli
Chúng hiện diện thường xuyên trong hệ tiêu hóa của động vật và người có tác
dụng ổn định sinh lý đường tiêu hóa. Dễ dàng tìm thấy sự hiện diện vi khuẩn E. coli
trong môi trường nước, thực phẩm, đất bị ô nhiễm, phân hay chất thải. Nó có thể tồn tại
2 - 3 tháng trong môi trường nước ở nhiệt độ bình thường. E. coli nhiễm và phân bố
trong tự nhiên từ chất thải của động vật và người. Trong thực phẩm nhiễm E. coli từ

nguyên liệu, nước hay quá trình chế biến.
Trong các thực phẩm đông lạnh số lượng E. coli sẽ giảm dần theo thời gian
và sau 2 tháng không tìm thấy sự hiện diện trong sản phẩm. Trong những năm gần
đây các nhà nghiên cứu cũng chứng minh rằng E. coli cũng được phân lập từ những
vùng nước ấm không bị nhiễm hữu cơ.
 Đặc điểm gây bệnh
E. coli là vi sinh vật hiếu khí phổ biến trong đường tiêu hóa của người và các động vật
máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại đường tiêu
hóa, ngược lại chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường tiêu hóa.
Sự hiện diện E. coli thường xuyên trong đường tiêu hóa khi có sự mất cân bằng vi
khuẩn đường ruột thì biểu hiện thành bệnh lý. Dòng E. coli có khả năng gây bệnh là
những dòng có mang plasmid gây bệnh.
Tuỳ theo dòng nhiễm, thời gian ủ bệnh từ 8 – 44 giờ, trung bình từ 12 – 24 giờ,
người trúng độc đau bụng dữ dội, ít nôn mửa, đi phân lỏng 1 – 15 lần trong ngày, nếu
nặng thì sốt cao, các chi co giật, đổ mồ hôi, thời gian khỏi bệnh tương đối dài. Để
phòng ngừa các bệnh do E. coli gây ra cách tốt nhất là phải vệ sinh ăn uống, ăn chín
uống sôi và có biện pháp phòng ngừa như các bệnh đường ruột khác, đặc biệt chú ý khi
có dịch viêm dạ dày ruột ở trẻ em.
 Đặc điểm nuôi cấy
E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, phát triển được từ 5 – 44oC,
ở pH 7,2 – 7,4, sinh indol và sinh nhiều acid, không sử dụng Citrate như nguồn
carbon duy nhất. Trên môi trường lỏng, E. coli làm đục môi trường sau 4 – 5 giờ
và càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể đóng ván mỏng trên bề mặt,
để lâu lắng xuống đáy ống. Trên môi trường thạch Eosin Methyl Blue, E. coli tạo
khuẩn lạc dẹt, có màu tím ánh kim, đường kính lớn hơn hay bằng 0,5 mm sau 18 – 24

8


giờ. Trên môi trường phân lập Brilliant Green Bile Lactose agar, vi khuẩn thường làm

thay đổi màu môi trường vì lên men đường lactose.
 Đặc tính sinh hoá

Hình 2.3 Thử nghiệm indole trên vi khuẩn E. Coli. Phản ứng
dương tính xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường.

E. coli có khả năng lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như:
lactose, glucose, manitol, căn cứ vào khả năng đường lactose mà người ta phân biệt
E. coli với một số vi khuẩn đường ruột khác. E. coli có phản ứng sinh hóa Urea (-),
H2S (-), Indole (+), Methyl red (+), Vosges Proskauer (-), Citrate (-). Thông thường
E. coli có sức đề kháng kém, bị giết chết sau 60 phút ở nhiệt độ 55oC, ở nhiệt độ 60oC
chúng bị giết chết sau 30 phút.
2.3.3 Đặc điểm Salmonella
Salmonella là những trực trùng gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, có khả năng di
động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men
saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả năng tách
nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Cho đến nay đã xác định
được 2339 serotype (kiểu huyết thanh) thuộc giống Salmonella. Các serotype này được
chia theo hệ thống Kaffmann-White dựa trên công thức kháng nguyên O và kháng nguyên
tiêm mao H. Salmonella có thể được phân tích định tính thông qua 4 bước như tăng sinh,
tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với
lượng nhỏ, dễ bị tổn thương và bị ức chế bởi số lượng lớn các loại vi khuẩn khác thuộc họ
Enterobacteriacee có tính cạnh tranh mạnh (Đặng Thị Kim Thoại, 2007).
9


Hình 2.4 Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi điện tử
( /> Lịch sử phát hiện
Salmonella là một trong những loại vi khuẩn quan trọng nhất thuộc họ vi khuẩn
đường ruột Enterobacteriaceae, thuộc nhóm vi sinh vật gây ngộ độc đứng hàng đầu

trong nhóm các vi sinh vật gây hại trong thực phẩm. Tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quy
định không phát hiện Salmonella/25 g mẫu phân tích. Năm 1885, Smith và Salmon D.E
đã phân lập được vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở heo con đầu tiên từ một ca “dịch tả
heo” và cho là nguyên nhân gây bệnh dịch tả nên đặt tên là Bacillus choleraesuis. Năm
1888, Gartner đã phân lập được nhóm vi khuẩn từ một ca tử vong do ăn thịt tươi của một
con bò bị bệnh và đặt tên cho nhóm vi khuẩn này là Bacillus enteritidis. Năm 1892, Loeffer
đã phân lập nhóm vi khuẩn Bacillus typhimurium từ chuột và đây cũng chính là Salmonella
typhimurium sau này. Năm 1990, Lignieres đã chính thức đặt tên vi khuẩn này là Salmonella
để tỏ lòng tôn kính Salmon D.E (Đặng Thị Kim Thoại, 2007).
 Phân loại
 Họ: Enterobacteriaceae
 Tộc: Salmonellaea
 Giống: Salmonella.
Salmonella có 2 loài chính là S.enterica và S.bongori (Salmonella V). Tuy nhiên,
S.enterica có 6 loài phụ như S. enterica I, S. enterica II,S. enterica IIIa, S. enterica IIIb,
S. enterica IV, S. enterica VI. Trong đó có Salmonella II, IIIa, IV và V thường tìm thấy
trong động vật máu lạnh, rất hiếm khi tìm thấy trong động vật máu nóng. Chủng
Salmonella phát hiện được hơn 2300 serotypes. Các serotypes được phân chia theo hệ

10


thống của Kaffmann-White dựa trên công thức kháng nguyên O (Kháng nguyên
somatic) và kháng nguyên lông H (flagella). Các loài Salmonella thường được gọi theo
tên kiểu huyết thanh như S. typhi, S. enteritidis, S. typhimurium,…Trong các kiểu huyết
thanh gây bệnh chủ yếu nằm trong S. enterica I.
 Đặc điểm hình thái và cấu trúc kháng nguyên
Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý nhưng phát triển tốt trong
điều kiện hiếu khí. Hầu hết đều có khả năng di động bằng tiêm mao (trừ S. gallinarum, S.
pullorum và các thể đột biến). Hình dạng Salmonella hình gậy, ngắn mập, hai đầu tròn,

kích thước 0,4 – 0,6 x 1 – 3 m, không hình thành giáp mô và nha bào, có khả năng di
động nhờ vào lông mao, có khoảng 7 – 12 lông mao chung quanh thân, ngoại trừ S.
gallinarum và S. pollorum gây bệnh cho gia cầm. Salmonella có 2500 kiểu kháng
nguyên trong phân loại dựa trên 3 loại kháng nguyên chính. Trong đó kháng nguyên O
(somatic) có hơn 60 loại, được bao phủ bởi bề mặt vi khuẩn tạo thành một lớp không đồng
đều, gồm chuỗi lipopolysaccharide – protein trên bề mặt tế bào. Loại kháng nguyên này
được coi là độc tố của vi khuẩn, nó có đặc tính ổn định với nhiệt độ 100oC trong 2 giờ,
không bị alcol và acid fenic phá hủy, rất độc, chỉ cần 1/20 mg là đủ giết chết một con chuột
sau vài giờ. Ngoài ra kháng nguyên này còn có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu đi qua
mao mạch làm thay đổi tạm thời sự thẩm thấu của mao quản. Kháng nguyên H (flagella)
có bản chất là protein, là loại protein không bền nhiệt, bị giết chết ở 70oC hay dưới tác
dụng của cồn 50 %. Kháng nguyên Vi (capsul) là kháng nguyên bao phủ kháng nguyên O
và là nơi biểu hiện độc tố, được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào. Nó
thường kết hợp với tính chuyên biệt của vật chủ, ức chế sự ngưng kết của kháng nguyên O
khi phát triển nhiều và bị phá hủy bởi nhiệt trong vòng 120 phút. Kháng nguyên Vi chỉ có ở
các kiểu huyết thanh như S. typhi; S. paratyphi; S. dublin (Đặng Thị Kim Thoại, 2007).
 Đặc điểm phân bố và nguồn nhiễm vào thực phẩm
Được tìm thấy khắp nơi như đất, các nguồn nước, thực phẩm và thủy hải
sản…Tế bào chủ của Salmonella bao gồm các động vật hoang dã, các vật nuôi, thực vật
và con người. Salmonella có thể phát triển tốt ở môi trường bên ngoài khá lâu, trong
xác chết sống được 100 ngày, trong đất khô từ 2 – 3 tháng, trong nước sống từ 1 –2
tháng, trong ruột bánh mì sống được 25 – 30 ngày, trong thực phẩm bảo quản lạnh ở
nhiệt độ -18oC chúng có thể sống được vài tháng.

11


Salmonella kháng nhiều chất diệt khuẩn như green malachite, selenite, tetrathionate,
iodine,… Phát triển tốt ở pH trong khoảng 4,5 - 8,5 với nhiệt độ 20 - 40oC. Tuy nhiên chúng
lại mẫn cảm với thuốc sát trùng và nhiệt độ, ở 60oC chỉ sống được trong khoảng 60 phút, ở

70oC bị chết sau 10 phút, ở nhiệt độ sôi của nước bị chết ngay lập tức. Trong 15 – 20 phút,
Salmonella có thể bị chết bởi clorua thủy phân (HgCl2) 1 %, formol 0,5 %, acid fenic 3 %.
Nhóm Salmonella có ký chủ rộng như S. enteritidis, S. typhimurium,.. Ngược lại, nhóm
Salmonella có ký chủ hẹp như S. dublin, S. cholerasuis,…Ngoài ra, S. typhi chỉ tìm
thấy ờ người và động vật linh trưởng.
Nguồn lây nhiễm vào thực phẩm chủ yếu qua nguồn nguyên liệu chế biến,
nguồn nước bị nhiễm hay các quy trình chế biến vận chuyển, bảo quản không đảm bảo
vệ sinh an toàn thực phẩm. Các con đường lây nhiễm vào người khoảng 90 % lây
nhiễm chủ yếu qua con đường thực phẩm và nước uống. Khoảng 10 % còn lại lây trực
tiếp từ người này sang người khác.
 Đặc điểm gây bệnh
Số lượng Salmonella đủ để gây độc là khi chúng hiện diện 103 - 109 tế bào
trong một gam sản phẩm. Thời gian ủ bệnh cho đến khi biểu hiện các triệu chứng
lâm sàng thường là sau 12 - 36 giờ khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm bệnh. Các triệu
chứng gây bênh như tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn, đau thắt vùng bụng,…Có khi kèm
theo sốt cao kéo dài ít nhất từ 2 đến 7 vài ngày. Tuy nhiên, trong một số trường hợp
khi dùng thực phẩm nhiễm bệnh không có biểu hiện các triệu chứng lâm sàng. Khi
Salmonella xâm nhiễm vào cơ thể bị bài tiết ra ngoài nên không có đủ khả năng biểu
hiện bệnh. Salmonella gây bệnh thương hàn thuộc các serotype S. typhi, S. paratyphi A, B, C.
Các dòng này thường không gây bệnh cho các loại động vật.
 Đặc điểm phát triển nuôi cấy
Salmonella là vi khuẩn sống kỵ khí tùy nghi, phát triển dễ dàng ở điều kiện
môi trường nuôi cấy thông thường với nhiệt độ phát triển thích hợp là 37oC, pH 7,6.
Nhưng chúng cũng có thể phát triển ở nhiệt độ 5 – 45oC, pH 4 – 9. Khi nuôi cấy trên
môi trường canh thăng sau 18 giờ làm đục đều môi trường. Trên môi trường thạch,
khuẩn lạc Salmonella có dạng gọn, tròn, hơi lồi lên ở giữa, màu trắng trong, hơi
sáng, mặt bóng, phẳng đều (dạng S), đường kính khuẩn lạc 1 – 2 mm, tuy nhiên
cũng có thể thay đổi tùy mức độ phân bố của khuẩn lạc trên đĩa thạch.

12

 Đặc điểm sinh hóa
Salmonella có những đặc tính sinh hóa chủ yếu mà dựa vào đó người ta có thể
định hướng phân loại với các vi khuẩn đường ruột khác. Phần lớn Salmonella sinh acid
do lên men glucose, manitol, dulticol, maltose, mucate nhưng không lên men sacharose
và lactose (trừ S. arizona), sucrose và salicin, không có khả năng sinh amine từ
tryptophan. Không làm tan chảy Gelatin, không sinh indol hoặc acetoin và không phân
giải urea. Phần lớn các loài Salmonella sinh hydrogen sulfide - H2S (trừ S. typhi) và tách
carboxyl từ orthine và lysin. Có khả năng tạo enzymelysine decarboxylase, Phản ứng VP
âm tính, Phản ứng MR dương tính, Oxydase âm tính.
2.4. Các phương pháp phân tích Faecal Coliforms, E. coli, Salmonella trong nước
2.4.1. Phương pháp màng lọc
Phương pháp màng lọc (Membrane Felter Method) thường dùng để định lượng vi
sinh vật – đặc biệt là vi sinh vật chỉ an toàn thực phẩm – trong mẫu nước với mật độ vi
sinh vật nói chung và vi sinh vật chỉ thị nói riêng tương đối thấp. Bản chất của phương
pháp này là tập trung số vi sinh vật ít ỏi trong mẫu nước có khối lượng khá lớn trên màng
lọc khuẩn và định lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên môi
trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại sinh vật cần kiểm tra.
Dựa trên khối lượng mẫu nước ban đầu và qui ước coi mỗi khuẩn lạc được hình thành
từ một vi khuẩn người ta qui ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích nước. Đây
là phương pháp kết hợp của phương pháp lọc khuẩn và phương pháp điếm khuẩn lạc trên
đĩa. Hiện nay người ta tạo ra nhiều màng lọc với kích thước lỗ từ 0,2 - 1 µm với các vật
khác nhau như sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi amiante, polypropylen….Tất cả vật liệu có khả
năng chịu được nhiệt độ vá áp suất cao của nồi hấp triệt trùng (Trần Linh Thước, 2005).

Hình 2.5 Các bộ phận của thiết bị lọc vi sinh vật (Nguyễn Tiến Dũng, 2007).
13

2.4.2. Phương pháp màng petri
Màng petri (Petrifilm) bao gồm các thành phần dinh dưỡng dưới dạng đông khô
được gắn trên màng mỏng. Môi trường dinh dưỡng giúp cho vi sinh vật phát triển tốt
sau thời gian ủ và có thể đếm trực tiếp số khuẩn lạc trên màng. Màng petri được dùng
để kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, nấm mốc, nấm men,..
Ưu điểm của hệ thống Petrifilm là dễ dàng thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo
quản, thời gian sử dụng lâu do dùng môi trường đông khô và không cần xử lý nhiệt như
phương pháp đỗ đĩa thông thường.
2.4.3. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR được K.Kleppe và cộng sự phát thảo lần đầu tiên vào năm
1971 và được nhà hóa sinh K.Mullis biến thành hiện thực. Ứng dụng PCR để phát hiện
Salmonella trong thực phẩm thủy sản với quá trình tăng sinh mẫu. Quá trình xử lý mẫu
và thu nhận DNA là bước đầu thực hiện quá trình khuếch đại. Sản phẩm của quá trình
khuếch đại được nhuộm với Ethidium Brommiide và điện di trên gel agarose. Nhuộm
mẫu và đọc kết quả điện di trên gel agarose 2 %. Kết luận có hay không phát hiện
Salmonella trong 25 g mẫu khi đọc kết quả điện di và so sánh với đoạn DNA đích.
Trong phương pháp PCR sử dụng cặp đoạn mồi invA1 và invA2 với đoạn DNA đích có
kích thước 520 bp.
2.4.4. Các phương pháp sinh học phân tử khác
Phương pháp ELISA (Emzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là phương pháp
hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme. Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể
đơn dòng phủ bên ngoài những giếng nhỏ nhằm mục đích thu giữ những kháng nguyên
mục tiêu. Những kháng nguyên thu giữ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể
thứ hai có gắn enzyme phát tính hiệu (thường là horseradish peroxidase hay alkaline
phosphatase). Khi cho hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặc hiệu của enzyme, phản ứng
xảy ra và tạo ra sản phẩm làm đổi màu phản ứng. Như vậy, chúng ta có thể phát hiện
được sự hiện diện của kháng nguyên. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi để phân
tích Salmonella, E. coli gây bệnh và có thể định lượng, phát hiện vi sinh vật trong thực
phẩm sau vài giờ tăng sinh nhằm tăng độ nhạy của phương pháp .
Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp có độ nhạy phụ thuộc vào mật độ

tế bào trước khi nhuộm được lọc bởi màng lọc. Có thể phân biệt tế bào sống và tế bào
chết bằng cách nhuộm nhân với fluorochrome acridine orange. Màu sắc phát quang
14


trong tế bào thay đổi trong suốt quá trình tăng trưởng. Thuốc nhuộm phát đỏ với RNA
và màu xanh với DNA. Thông thường thì tế bào sống cho màu đỏ da cam trong khi các
tế bào chết cho màu xanh lục. Năm 1991, phương pháp ISO-GRID® ứng dụng trên đối
tượng Salmonella đã được AOAC công nhận áp dụng cho mọi loại thực phẩm.
2.5. Chế độ triều ảnh hưởng lên vùng nuôi nhuyễn thể trong khảo sát
Tác động của chế độ thủy triều lên vùng nuôi thủy sản không rõ rệt và cũng
không ổn định. Chưa có báo cáo chính xác đánh giá tác động thủy triều tại các bãi nuôi.
Theo kinh nghiệm của nông dân vùng nuôi, lúc thủy triều dâng lên mang theo các đợt
lắng tụ phù sa tại các bãi nuôi đồng thời mang nhiều các chất gây ô nhiễm môi trường
như dầu, các loài tảo độc, vật chất lơ lửng và chất dinh dưỡng do sông thải ra, các chất
thải từ các khu vực kinh tế ven sông đổ ra làm thay đổi quần xã sinh vật đáy…Các chất
gây ô nhiễm ảnh hưởng không nhỏ đến nuôi trồng cũng như chất lượng thủy sản.
Cường độ thủy triều làm dịch chuyển độ mặn theo mùa làm ảnh hưởng tốc độ sinh
trưởng và phát triển của nhuyễn thể. Mùa mưa làm độ mặn tại bãi nuôi giảm xuống,
không ổn định nhưng mùa nắng tương đối ổn định hơn. Nơi bãi nuôi là vùng triều
tương đối cao, đất đáy cứng, có nhiều bùn nhưng thời gian nước rút tương đối dài, cũng
dẫn đến nghêu chết. Các bãi nuôi không bằng phẳng, lúc thủy triều xuống có sự tích tụ
tạo điều kiện các vi khuẩn gây bệnh phát triển ảnh hưởng đến chất lượng vùng nuôi.
Theo kinh nghiệm nông dân thì thời gian khai thác thuận lợi vào tháng 3 - 10 âm lịch
với thủy triều lên xuống rõ rệt.

15