BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN GENE rpoB Ở VI KHUẨN LAO (Mycobacterium tuberculosis) ĐỀ KHÁNG RIFAMPICIN Ngành

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH
CÁC ĐỘT BIẾN GENE rpoB Ở VI KHUẨN LAO
(Mycobacterium tuberculosis)
ĐỀ KHÁNG RIFAMPICIN

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: HUỲNH VIẾT LỘC

Niên khóa

: 2005-2009

Tháng 8 năm 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH

CÁC ĐỘT BIẾN GENE rpoB Ở VI KHUẨN LAO
(Mycobacterium tuberculosis)
ĐỀ KHÁNG RIFAMPICIN

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN THÁI THỦY

HUỲNH VIẾT LỘC

Tháng 8 năm 2009


LỜI CẢM ƠN
Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ, các em và người thân trong gia đình
luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con.
Con vô cùng biết ơn thầy Nguyễn Thái Thủy đã tận tình hướng dẫn và truyền
đạt những kinh nghiêm quý báu cho con trong suốt thời gian con thực hiện đề tài.
Con xin cám ơn bác Lưu Khánh Toàn đã có những gợi ý bổ ích cho con trong
lúc thực hiện đề tài.
Em xin gởi lời cảm ơn đến:
Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời
gian học tập tại trường.
Thầy Lưu Phúc Lợi và anh Nguyễn Văn Lẫm tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Hoc
đã có những gợi ý bổ ích cho em khi thực hiện đề tài.
TS.BS.Phạm Hùng Vân, anh Võ Đức Xuyên An cùng toàn thể các anh chị tại
phòng QC công ty Nam Khoa đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt

nghiệp.
Và cuối cùng là các bạn lớp CNSH 31 đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt
thời gian qua.

Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng7 Năm 2009
HUỲNH VIẾT LỘC


TÓM TẮT
Đề tài “Bước đầu xây dựng quy trình xác định đột biến gene rpoB ở vi khuẩn
lao Mycobacterium tuberculosis đề kháng rifampicin”. Đề tài được thực hiện tại phòng
xét nghiệm y khoa NK-biotek, công ty Nam Khoa từ 3/2009-7/2009 nhằm xây dựng
quy trình xác định đột biến gene rpoB bằng kỹ thuật giải trình tự. Đề tài tiến hành thiết
kế primer nhằm khuếch đại “điểm nóng đột biến” trên gene rpoB, Tối ưu hóa điều kiện
phản ứng cho primer thu được (primer T1), khuếch đại đoạn DNA đích bằng phản ứng
PCR và giải trình tự đoạn DNA này. Sau khi giải trình tự kết quả được phân tích và
tìm kiếm đột biến sử dụng phần mềm clustalX đã thu được kết quả: trên 13 mẫu lao
kháng R sử dụng trong đề tài thì đột biến xảy ra trên 3 codon 432 (CAA→CCA), 445
(CAC→TAC, GAC, CTC hoặc CGC) và 450 (TCG→TTC) và không có mẫu kháng
nào mà không tìm thấy đột biến (đột biến làm thay đổi acid amin). Điều này cho thấy
các đột biến trên gene rpoB dẫn đến khả năng kháng thuốc của Mycobacterium
tuberculosis chủ yếu nằm trên “Điểm nóng đột biến”. Vì vậy quy trình xác định đột
biến gene rpoB ở vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis đề kháng rifampicin bằng
kỹ thuật giải trình tự sử dụng primer T1 là hoàn toàn có thể thực hiện.


SUMMARY
“The first step establishing a protocol to detect mutations in rpoB gene of TB
rifampicin resistant”. Organism of reaseach: Mycobacterium tuberculosis. This reseach
conducted at Medical Service NK-biotek room, Nam Khoa Co., Ltd. from March,

2009 to July, 2009 for established a protocol to detect mutations in rpoB gene by
sequencing method. The content of reseach: Design primers to amplify the “mutation
hot spot region”, optimize T1 primer, amplify and sequence the DNA target with T1
primer. The sequencing result was analysed and detected on clustalX software. All
resistant samples mutated at three codons: 432 (CAA→CCA), 445 (CAC→TAC,
GAC, CTC or CGC), 450 (TCG→TTC) and all resistant samples had mutation. It
means, the most mutations of Tb rifampicin resistant occur mainly on “mutation hot
spot region”. Therefore the process detects mutations in rpoB gene with T1 primer by
sequencing method be usefull.


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A

Adenine

AFB

Acide fast bacillus

C

Cytosine

CDNA

Complementary DNA

CSDL

Cơ sở dữ liệu

CTCL

Công tác chống lao

D

Aspartic acid

DNA

Deoxy nucleotide ạcid

E

Glutamic acid

EMB, E

Ethambutol

F

Phenylalanine

G

Guamine

H

Histidine

I

Isoleucine

K

Lysine

Kb

Kilo base

L

Leucine

M

Nồng độ mol/lit

MDR

Multi drug resistant

MMDB

Molecular Modeling database

N

Nucleotide

NCBI

National center for bioinformatic information

NIH

National Institute of Health

P

Photpho

PAS

Acid paraaminosalicylic

P/C/I

Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol

PH

Pondus Hydrogenii

Pro
Q

Proline
glutamine

R

Agrinine


RMP, R

Rifampicin

Rimifon, INH, H

Isoniazid

RCF

Relative centrifugal force

RPM

Revolution per minute

S

Serine

SM, S

Streptomycin

T

Threonine

TCYTTG

Tổ chức y tế thế giới

TE

Tris EDTA

Tm

Melting temperature

TP.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

XDR

Extensively drug resistant

Y

Tyrosine

V

Valine

W

Tryptophan

Z, PZA

Pyrazinamid

WHO

World Health Organization


MỤC LỤC
Trang
Chương 1 MỞ ĐẦU....................................................................................... ... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................. ... 1
1.2. Mục đích-Ý nghĩa..................................................................................... ... 2
1.3. Nội dung ................................................................................................... ... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ ... 3
2.1. Bệnh lao và vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis ................................. ... 3
2.1.1. Tình hình bệnh lao................................................................................. ... 3
2.1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới ......................................................... ... 3

2.1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam .......................................................... ... 5
2.1.1.3. Tình hình vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc .... ... 5
2.1.2. Trực khuẩn lao....................................................................................... ... 6
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại............................................................................. ... 6
2.1.2.2. Đặc điểm hình thái.............................................................................. ... 6
2.1.2.3. Đặc điểm cấu tạo ................................................................................ ... 7
2.2. Các phương pháp phát hiện vi khuẩn lao ................................................. ... 7
2.2.1. Phát hiện vi khuẩn lao ............................................................................... 7
2.2.1.1. Phương pháp chụp X-quang lồng ngực ................................................. 7
2.2.1.2. Phương pháp xét nghiệm đàm trực tiếp ............................................................... 8
2.2.1.3. Phương pháp nuôi cấy ........................................................................... 8
2.2.1.4. Phương pháp kháng lao tố ..................................................................... 9
2.2.1.5. Phương pháp PCR ................................................................................. 9
2.2.2. Một số phương pháp xác định lao kháng thuốc .................................... ... 9
2.2.2.1. Phương pháp lâm sàng và cận lâm sàng ................................................ 9
2.2.2.2. Phương pháp nuôi cấy ........................................................................... 10
2.2.2.3. Phương pháp giải trình tự ...................................................................... 10
2.3. Điều trị bệnh lao ....................................................................................... ... 10
2.3.1. Phác đồ điều trị lao ................................................................................ ... 12
2.3.2. Điều trị lao kháng thuốc ........................................................................ ... 12


2.3.2.1. Một số nguyên tắc ................................................................................. 12
2.3.2.2. Các ví dụ về phác đồ điều trị lao kháng thuốc ...................................... 13
2.4. Kháng sinh và khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn......................... ... 15
2.4.1. Kháng sinh............................................................................................. ... 15
2.4.1.1. Định nghĩa, phân loại ........................................................................ ... 15
2.4.1.2. Cơ chế tác động của một số loại kháng sinh chống lao...................... ... 16
2.4.2. Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn...................................................... ... 17
2.4.2.1. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn .............................................. ... 17

2.4.2.2. Cơ chế kháng một số loại thuốc của vi khuẩn lao.............................. ... 17
2.5. Rifampicin (R).......................................................................................... ... 18
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. ....20

3.1. Vật liệu ..................................................................................................... ... 20
3.1.1. Thời gian và địa điểm thực hiện............................................................ ... 20
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ ... 20
3.1.3. Thiết bị dụng cụ hóa chất ...................................................................... ... 20
3.1.3.1. Thiết bị................................................................................................ ... 20
3.1.3.2. Dụng cụ............................................................................................... ... 21
3.1.3.3. Hóa chất.............................................................................................. ... 21
3.2. Những phương pháp nghiên cứu dùng trong đề tài.................................. ... 21
3.2.1. Tìm kiếm dữ liệu trên trang web NCBI................................................. ... 22
3.2.2. Chương trình fastPCR ........................................................................... ... 22
3.2.3. Phương pháp DNAPREP-BOOM ......................................................... ... 23
3.2.4. PCR (polymerase chain reaction).......................................................... ... 23
3.2.5. Các phương pháp giải trình tự DNA ..................................................... ... 25
3.2.5.1. Phương pháp Maxam và Gilbert ........................................................... 25
3.2.5.2. Phương pháp Sanger .............................................................................. 25
3.2.5.3. Phương pháp cải biên từ phương pháp Sanger ...................................... 26
3.3. Các bước thí nghiệm tiến hành trong đề tài.............................................. ... 28
3.3.1. Thiết kế primer cho gene rpoB.............................................................. ... 28
3.3.1.1. Các bước tìm kiếm trình tự rpoB trên NCBI...................................... ... 28
3.3.1.2. Các bước thiết kế mồi rpoB ............................................................... ... 29
3.3.2. Các bước ly trích DNA từ vi khuẩn lao................................................. ... 30


3.3.3. Thực hiện PCR ...................................................................................... ... 31
3.3.3.1. Thiết kế chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với mồi T1 .................... ... 31
3.3.3.2. Tối ưu điều kiện phản ứng cho mồi T1 .............................................. ... 32

3.3.4. Giải trình tự ........................................................................................... ... 34
3.3.4.1. Tinh sạch sản phẩm PCR ....................................................................... 34
3.3.4.2. Các bước giải trình tự ............................................................................ 35
3.3.5. Áp dụng quy trình giải trình tự ............................................................. ... 36
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... ... 37
4.1. Kết quả thiết kế mồi ................................................................................. ... 37
4.1.1. Kết quả tìm kiếm dữ liệu ....................................................................... ... 37
4.1.2. Kết quả thiết kế ..................................................................................... ... 39
4.2. Kết quả PCR ............................................................................................. ... 39
4.2.1. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng cho mồi T1 .......................................... ... 39
4.3. Kết quả giải trình tự.................................................................................. ... 42
4.3.1. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................... ... 42
4.3.2. Kết quả giải trình tự............................................................................... ... 44
4.4. So sánh kết qủa......................................................................................... ... 46
4.5. Kết quả giải trình tự ................................................................................. ... 47
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... ... 48
5.1. Kết luận..................................................................................................... ... 48
5.2. Đề nghị ..................................................................................................... ... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... ... 49
PHỤ LỤC


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Số bệnh nhân lao mới mắc theo khu vực............................................ 4
Bảng 2.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam .......................................................... 5
Bảng 2.3 Thứ bậc và liều lượng thuốc trong điều trị lao đa kháng .................... 13
Bảng 2.4 Bảng phát đồ điều trị bệnh lao............................................................. 14
Bảng 2.5 Phác đồ điều trị đối với vi khuẩn lao kháng INH................................ 14
Bảng 2.6 Phác đồ điều trị lao kháng 2 loại thuốc INH và RIF ........................... 15

Bảng 3.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR...................................................... 32
Bảng 3.2 Thành phần các chất của Mix1 ............................................................ 32
Bảng 3.3 Thành phần các chất của Mix2 ............................................................ 33
Bảng 3.4 Thành phần các chất trong phản ứng giải PCR giải trình tự ............... 35
Bảng 4.1 Bảng đặc điểm của reference rpoB tìm kiếm được trên NCBI ........... 37
Bảng 4.2 Bảng kết quả đột biến của những chuỗi DNA tải về từ trang NCBI... 37
Bảng 4.3 Những cặp mồi tối ưu được chọn ........................................................ 39
Bảng 4.4 Bảng phân tích kết quả PCR với Mix1 sau khi điện di trên gel .......... 40
Bảng 4.5 Bảng phân tích kết quả PCR với Mix2 sau khi điện di trên gel .......... 41
Bảng 4.6 Bảng so sánh hiệu quả phản ứng PCR giữa Mix1 và Mix2 ................ 42
Bảng 4.7 Bảng kết quả tinh sạch khi kiểm tra bằng phương pháp điện.............. 43
Bảng 4.8 Bảng kết quả giải trình tự .................................................................... 44
Bảng 4.9 Bảng kết quả xác định đột biến của các mẫu kháng trong đề tài. ....... 45
Bảng 4.10 Bảng kết quả xác định đột biến của các mẫu nhạy R trong đề tài..... 45
Bảng 4.11 Bảng so sánh kết quả xác định vi khuẩn lao kháng R ....................... 46
Bảng 4.12 kết quả phân tích trình tự trên mẫu bệnh phẩm trực tiếp................... 47


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Hình ước lượng số ca nhiễm lao mới trên toàn thế giới .................. .. 3
Hình 2.2 Hình vi khuẩn lao chụp dưới kính hiển vi điện tử ........................... ... 6
Hình 2.3 Hình Mtb bắt màu thuốc nhuộm carbon fuchsin ............................. ... 8
Hình 2.4 Hình khuẩn lạc Mtb trên môi trường Lowenstein-Jensen medium . ... 8
Hình 2.5 Hình minh họa cơ chế tác động của kháng sinh trên vi khuẩn ........ ... 16
Hình 2.6 Hình Cấu trúc phân tử rifampicin .................................................... ... 18
Hình 2.7 Các vị trí đột biến trên vùng “mutation hot spot region” ............... ... 19
Hình 3.1 Nguyên tắc chung của PCR ............................................................. ... 23
Hình 3.2 Hình minh họa giải trình tự theo phương pháp Maxam & Gilbert.. ... 25
Hình 3.3 Hình minh họa phương giải giải trình tự của Sanger....................... ... 26

Hình 3.4 Máy ABI 3130XL của Applied Biosystem ..................................... ... 28
Hình 3.5 Hình minh họa phương pháp PCR dùng trong sequencing ............ ... 28
Hình 4.1 Kết quả PCR sử dụng Mix1................................................................. 40
Hình 4.2 Kết quả PCR sử dụng Mix2................................................................. 41


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay bệnh lao là một trong ba bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất thế
giới. Theo WHO, bệnh lao là vấn đề toàn cầu với 1/3 dân số đã nhiễm lao. Mỗi năm có
từ 8 – 10 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao. Như vậy cứ 4
giây lại có một người mắc lao mới và 10 giây lai có một người chết vì lao. Việt Nam
hiện đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao mới mắc hàng năm cao nhất thế
giới (80 % số bệnh nhân lao nằm ở các nước này). Tỷ lệ dân số Việt Nam bị nhiễm lao
là 44 %, tỷ lệ tử vong là 26/100.000 và mỗi ngay có 400 ca mắc lao mới. Trong quá
khứ bệnh lao từng là nổi kinh hoàng của nhân loại, ngày nay với sự xuất hiện của
chủng lao đa kháng thuốc (MDR) và đặc biệt là chủng siêu kháng thuốc (XDR) đã làm
cho tình hình bệnh lao trở nên ngày càng phức tạp và nghiêm trọng hơn. Những chủng
vi trùng kháng thuốc này là nguồn lây nguy hiểm và là mối đe dọa cho sức khỏe cộng
đồng. Tỷ lệ bệnh nhân kháng thuốc ở Việt Nam là 32,5%.
Hiện nay nhóm thuốc tuyến đầu dùng trong điều trị lao bao gồm: isoniazid,
rifampicin, pyrazinamide, ethambutol và streptomycine. Trong quá trình điều trị, ở
từng giai đoạn khác nhau thầy thuốc thường kết hợp nhiều loại kháng sinh nhằm nâng
cao hiệu quả điều trị, trong các gian đoạn đó thì rifampicin thường được tin dùng để
kết hợp điều trị với các loại kháng sinh khác.
Rifampicin được bán tổng hợp từ rifampicin B lấy từ môi trường nuôi cấy của
Streptomyces mediterian, là một trong những kháng sinh hàng đầu chính trong điều trị
lao do hoạt tính diệt khuẩn nhanh. Việc kháng rifampicin rất hiếm khi được tìm thấy
mà không có kèm theo kháng các loại kháng sinh khác và kháng rifampicin cho phép

tiên đoán một kết quả điều trị không thành công. Vì vậy, kháng rifampicin được xem
là một dấu hiệu đáng xem xét cho khả năng đa kháng thuốc của Mycobacterium
tuberculosis. Cơ sở di truyền của Mycobacterium tuberculosis (vi khuẩn lao) kháng
rifampicin đã được xác định, chủ yếu là đột biến ở gene rpoB mã hóa cho tiểu phần β
của enzyme RNA-polymerase (Telenti 93, Wiliams, Muser 95, Miller). Hiện nay
phương pháp kháng sinh đồ xác định lao kháng thuốc cần thời gian 2-3 tháng mới cho
1


kết quả. Vì vậy xác định vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng rifampicin
nhanh và chính xác đang là nhu cầu cấp thiết trong chuẩn đoán và điều trị bệnh lao.
1.2. Mục đích – Ý nghĩa
Thực hiện đề tài này chúng tôi nhằm xây dựng quy trình xác định vi khuẩn
Mycobacterium tuberculosis kháng rifampicin nhanh chóng với độ chính xác và độ
nhạy cao. Đáp ứng nhu cầu cấp thiết trong chuẩn đoán và điều trị lao kháng thuốc hiện
nay tại Việt Nam.
1.3. Nội dung
1/ Tìm hiểu về bệnh lao và cơ chế phân tử của vi khuẩn Mycobacterium
tuberculosis kháng rifampicin
2/ Tìm hiểu những công cụ thiết kế primer, những phương pháp: PCR, giải trình
tự, điện di.
3/ Nghiên cứu, thiết kế primer cho gene rpoB của vi khuẩn Mycobacterium
tuberculosis.
2/ Thiết kế - tối ưu điều kiện cho phản ứng PCR khuếch đại gene rpoB.
3/ Giải trình tự gene rpoB trực tiếp từ sản phẩm khuếch đại PCR.
4/ Xử lý số liệu giải trình tự thu được và xác định các vị trí đột biến trên gene rpoB.
`

5/ So sánh kết quả giữa phương pháp kháng sinh đồ và phương pháp giải trình tự.
6/ Triển khai phương pháp xác định vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis

kháng rifampicin bằng giải trình tự trực tiếp trên mẫu bệnh phẩm.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Bệnh lao và vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis
2.1.1. Tình hình bệnh lao
2.1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới

Hình 2.1 Hình ước lượng số ca nhiễm lao mới trên toàn thế giới năm 2005 của WHO
(http//www.who.inten).
Ước lượng số ca mắc lao mới của toàn vùng; 1/ những vùng không ước lượng; 2/ 0 – 999;
3/ 1000 – 9999 , 4/10 000 – 99999; 5/ 100 000 - 999 999; 6/ 1 000 000 hoặc hơn

Theo Lương Chí Thành (2008), bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài
người từ hàng ngàn năm nay, trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia nào,
một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao. Do sự phát minh các
thuốc hóa học chống lao làm cho việc chữa trị bệnh lao trở nên đơn giản hơn và hiệu
quả hơn. Ngày nay, bệnh lao đã trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS đã trở thành
một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt là tại các
nước đang phát triển.
Năm 1993, TCYTTG đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và
mối hiểm họa của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc. Hiện nay, trên thế giới

3

có khoảng 2,2 tỷ người nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới). Theo số liệu công bố
của TCYTTG (2004), ước tính trong năm 2003 có thêm 9 triệu người mắc lao mới và
2 triệu người chết vì lao. Khoảng 95 % số bệnh nhân lao và 98 % số người chết vì lao
ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75 % số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao
động. Trong đó, có khoảng 80 % số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh
nặng bệnh lao cao.
Hiện nay tỷ lệ điều trị thành công toàn cầu là 82 %, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ
đạt 37 % số bệnh nhân ước tính. Như vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được
điều trị và tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo TCYTTG, mỗi năm có thêm 1 %
dân số thế giới bị nhiễm lao, ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực.
Bảng 2.1 Số bệnh nhân lao mới mắc theo khu vực

Khu vực

Châu Phi

Tử vong do lao ( bao

Số BN (nghìn)

Tỷ lệ/100.000

Các thể

AFB (+)

Các thể

AFB (+)

SL (nghìn) TL/100.000

1000

350

149

556

83

2354
(26%)

gồm cả nhiễm HIV)

Châu Mỹ

370 (4%)

165

43

19

53

6

Trung Đông

622 (7%)

279

124

55

143

28

Châu Âu

472 (5%)

211

54

24

73

8

1294

182

81

625

39

939

122

55

373

22

3887

141

63

4823

29

Đông Nam 2890

Châu Á
Tây

(33%)
Thái 2090

Bình Dương (24%)
Toàn Cầu

8797
(100%)

(http//www.cimsi.com.vn)
Bệnh lao là bệnh của người nghèo lây lan nhanh trong cộng đồng có điều kiện
sống chật chôi, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dưỡng kém. Bệnh lao là kết quả của
nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển.

4


2.1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Ở nước ta bệnh lao còn phổ biến ở mức trung bình cao. Việt Nam đứng thứ 12
trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (TCYTTG, 2004). Trong khu vực
Tây - Thái Bình Dương, Việt Nam đứng sau Trung Quốc và Philipinse về số bệnh
nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm (Lương Chí
Thành. 2008).
Năm 1995, trước biến động xấu đi của tình hình bệnh lao toàn cầu, công tác
chống lao thực sự đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và
lao/HIV. Nhà nước Việt Nam và bộ y tế đã đưa chương trình chống lao thành một
trong những chương trình y tế quốc gia trọng điểm. Trong giai đoạn 1997-2004,

CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82 %
số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của TCYTTG là 70 %), CTCLQG đã điều trị
260.698 bệnh nhân lao phổi AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92 %.
Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1.5 % (ở các tỉnh
phía nam là 2 %, ở các tỉnh phía bắc là 1 %). Vì vậy với dân số khoảng 70 – 80 triệu
ước tính hàng năm nước ta có số người mắc bệnh lao khoảng 130.000, bảng 2.2.
Bảng 2.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Số mới mắc lao ( mọi thể)
130.000
Số lao phổi BK dương tính mới

60.000

Tổng số trường hợp lao

260.000

Tổng số lao phổi BK dương tính

120.000

(http// www .cimsi.com.vn)
Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể còn cao hơn 1,5
%. Như vậy con số trên còn có thể lớn hơn.
2.1.1.3. Tình hình vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc trên thể
giới và ở Việt Nam
Theo ước tính của WHO, trên thế giới có 424.203 người bị mắc MDR, chiếm số
lượng lớn nhất là Tây Thái Bình Dương 152.203 trường hợp, kế đến là khu vực Đông
Nam Á và sau đó là khu vực Đông Âu và Đông Phi.

5


Một số nước có tỷ lệ MDR ở những bệnh nhân lao mới rất cao là: Cộng hòa
Dominica, Ecuador, Bờ Biển Ngà, Latvia, Uzbekistan, Trung Quốc, Iran, Istael…
Trước tình hình MDR ngày càng trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến
11/2005, WHO và trung tân kiểm soát bệnh Hoa Kỳ đã tiến hành phân tích 17.690
mẫu đàm được gởi từ 40 nước trên thế giới. Kết quả phân tích cho thấy có 20 %
trường hợp là MDR và 2 % là XDR.
Ở khu vực tại Tây Thái Bình (trong đó có Việt Nam) thì MDR là 4,2 % ở bệnh
nhân lao mới và 26 % ở các trường hợp có tiềm căn bệnh lao.
Theo nghiên cứu của CTCL quốc gia thì có 32.5 % trường hợp bệnh lao mới có
mang vi trùng lao kháng thuốc. Tại TP.HCM, số liệu nghiên cứu cho thấy tỷ lệ
kháng thuốc tại khu vực nội thành nổi trội hơn khu vực ngoại thành. Tỷ lệ MDR của
toàn TP.HCM là 2.3 %, trong đó MDR ở nội thành là 3.8 %.
2.1.2. Trực khuẩn lao
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại
Giới

Bacteria

Nghành

Antinobacteria

Bộ

Antinomycetales

Bộ phụ

Corynebacterineae

Họ

Mycobacteriaceae

Giống

Mycobacterium

Loài

Mycobacterium tuberculosis

2.1.2.2. Đặc điểm hình thái

Hình 2.2 Hình vi khuẩn lao chụp dưới kính hiển vi điện tử
(http//www.textbookofbacteriology.net)
6


Mycobacterium tuberculosis là phẩy khuẩn không di chuyển được. Nó có quan
hệ họ hàng xa với nhóm Antinomycetes. Phẩy khuẩn Mtb dài 2 – 4 micrometers và
rộng khoảng 0,2 – 0,5 micrometers. Vi khuẩn Mtb sống ưa khí bắt buộc và là loại vi
khuẩn sống ký sinh tùy ý. Thời gian nhân đôi của chúng từ 15 – 20 giờ, vì vậy khi
dùng môi trường agar Lowenstein-Jensen medium có bổ sung trứng gà để nuôi cấy
Mtb thì sau 4 – 6 tuần mới thấy được khuẩn lạc Mtb. Vi khuẩn lao không thuộc nhóm
Gram (-) hay Gram (+), vách tế bào của chúng chứa peptidoglycan, trong một số
trường hợp Mtb có đặc tính của vi khuẩn Gram (+) rất yếu.

2.1.2.3. Đặc điểm cấu tạo
Cấu trúc vách tế bào của Mtb rất thuận lợi cho chúng tồn tại và phát triển, vách
tế bào của chúng có đặc điểm của loài prokaryotes và đồng thời chứa những yếu tố độc
lực của vi khuẩn. Vách tế bào Mtb bao gồm peptidoglycan và rất nhiều lipid (khoảng
60 %), lớp lipid này được tạo thành từ ba thành phần, mycolic acids, cord factor và
wax-D: Mycolic acid là những phân tử lipids có nhánh anpha, chúng chiếm 50% trọng
lượng khô của bề mặt vi khuẩn. Mycolic acide có tính kỵ nước mạnh, chúng trải rộng
khắp bề mặt tế bào lao và nó quyết định đặc tính của vách tế bào. Loại acid này được
cho là quyết định tính độc của Mtb, chúng ngăn cản sự xâm nhập của các protein có
chứa gốc cation, lysozime và oxy. Chúng bảo vệ bên ngoài tế bào từ bổ thể lắng trong
serum. Cord factor là yếu tố gậy độc cho tế bào động vật, chúng bao gồm tất cả các
sản phẩm có tính độc của Mtb. Wax-D có trong bề mặt tế bào.
(http//www.textbookofbacteriology.net)
2.2. Các phương pháp phát hiện vi khuẩn lao
2.2.1. Phát hiện vi khuẩn lao
2.2.1.1. Phương pháp chụp X-quang lồng ngực
- Phương pháp này xem xét hình ảnh X-quang về những tổn thương ở phổi để
chuẩn đoán lao. Chụp X-quang thường dùng trong chuẩn đoán lao phổi và phần lớn
lao ngoài phổi.
Ưu điểm: Cho kết quả nhanh và thường được dùng trong khám lao chủ động (kiểm tra
bệnh lao định kỳ).
Nhược điểm: Cho kết quả chuẩn đoán không chính xác vì một số nguyên nhân sau:
 Khi chụp phim X-quang khó nhận biết được các tổn thương nhỏ.
7


 Những tổn thương ở phổi hay những phản ứng ở phổi do nhiều bệnh trong cơ
thể tạo ra.
2.2.1.2. Phương pháp xét nghiệm đàm trực tiếp sử dụng bộ thuốc nhuộm Ziehl Neelsen
Nguyên tắc: Do vách tế bào vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis có lớp vỏ sáp

bao bọc nên khi nhuộm với phức hợp carbon fuchsin sẽ không bị tẩy màu bởi dung
dịch có tính tẩy mạnh (alcohol acid). Mẫu đàm dương tính với lao sẽ có vi khuẩn bắt
màu đỏ.

Hình 2.3 Hình Mtb bắt màu thuốc nhuộm carbon fuchsin
(http//www.textbookofbacteriology.net)
Ưu điểm của phương pháp là cho kết quả nhanh nhưng nó có nhược điểm là
khi mẫu bệnh phẩm chứa vi khuẩn có phản ứng AFB (+) thì phải dựa vào thêm những
biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân để kết luận bệnh nhân có mắc lao hay không. Đồng
thời khi phản ứng AFB (-) cũng không có nghĩa bệnh nhân âm tính với lao vì nó còn
phụ thuộc vào cách lấy mẫu đàm của kỹ thuật viên có đúng hay không.
2.2.1.3. Phương pháp nuôi cấy

Hình 2.4 Hình khuẩn lạc Mtb trên môi trường Lowenstein-Jensen
medium (http//www.textbookofbacteriology.net).

8


Phương pháp này dựa trên nguyên tắc vi khuẩn lao chỉ phát triển trên môi trường
Lowenstein-Jensen medium có bổ sung trứng gà. Dùng 0,1 ml bệnh phẩm (nếu là đàm
phải loại tạp nhiễm) cấy vào môi trường nuôi cấy và ủ ở 35 – 370C/2 – 5 %CO2 trong
3 – 4 tuần.
Ưu điểm: đây là phương pháp có độ nhạy cao (phương pháp nuôi cấy để phát
hiện vi sinh vật luôn là “tiêu chuẩn vàng” trong các phương pháp phát hiện vi sinh vật)
Nhược điểm: thời gian cho mỗi lần nhân đôi của Mtb là 15 – 20 giờ vì vậy phải
mất 3 – 4 tuần mới có kết quả nuôi cấy.
2.2.1.4. Phương pháp kháng lao tố
Phương pháp này dùng bộ test Tuberculin PPDRt23 + tween 80, IP48. Với
PPDRt23 dùng với liều hai đơn vị, với IP48 dùng 10 đơn vị. Tất cả dùng Tuberculin

tiêm trong da ở mặt trước cẳng tay. Phản ứng dương tính khi đường kính nốt sần ≥
6mm (đối với PPDRt23) và ≥ 10 mm (đối với IP48).
Ưu điểm của phương pháp này là cho kết quả nhanh nhưng chỉ xác định được
có nhiễm Mtb hay không mà không xác định được chúng ở dạng hoạt động hay không
hoạt động và thường cho kết quả âm tính giả. Kết quả âm tính giả là do một trong các
nguyên nhân sau:
 Đang nhiễm một bệnh do siêu vi.
 Tiêm vaccine từ virut sống.
 Suy dinh dưỡng.
 Rối loạn tiêu hóa.
 Bệnh lý hệ bạch huyết.
 Các bệnh hay các thuốc làm giảm sự chống đỡ của cơ thể.
2.2.1.5. Phương pháp PCR
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là sự khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu
trên bộ gene vi khuẩn lao Mtb. Đoạn DNA được khuếch đại là đoạn IS6110, đoạn
DNA này lặp lại 16 lần trên bộ genome vi khuẩn lao vì thế phương pháp PCR phát
hiện vi khuẩn lao Mtb có độ nhạy rất cao.
Ưu điểm của phương pháp PCR là nhanh, nhạy và chính xác nhưng PCR thì đắt
tiền và cần phòng thí nghiệm có sự trang bị tốt .
2.2.2. Một số phương pháp xác định lao kháng thuốc
2.2.2.1. Phương pháp lâm sàng và cận lâm sàng
9


Lâm sàng: Khi đang điều trị lao nhưng các triệu chứng sốt, ho, khạc đờm không
thuyên giảm hoặc thuyên giảm một thời gian rồi lại xuất hiện trở lại với các triệu
chứng tăng lên.
Cận lâm sàng: Hình ảnh tổn thương trên phim X-quang phổi không thay đổi
hoặc xuất hiện thêm tổn thương mới. Xét nghiệm AFB dương tính liên tục hoặc âm
tính một thời gian rồi dương tính trở lại hoặc âm tính dương tính xen kẽ.

Nhược điểm của phương pháp này là cần bác sĩ giàu kinh nghiêm trong chuẩn
đoán và điều trị đồng thời kết quả thường có độ chính xác không cao và có thể gây
nguy hiểm cho bệnh nhân.
2.2.2.2. Phương pháp nuôi cấy
- Kháng sinh đồ trực tiếp trên bệnh phẩm: là phương pháp nuôi cấy trực tiếp
bệnh phẩm trên môi trường kháng sinh để xác định vi khuẩn lao kháng thuốc.
- Kháng sinh đồ bằng phương pháp pha loãng kháng sinh trong thạch: là
phương pháp xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn lao đã qua nuôi cấy.
Phương pháp kháng sinh đồ xác định vi khuẩn lao kháng thuốc cho kết quả với
độ tin cậy cao. Tuy nhiên do chu kỳ phân chia của vi khuẩn lao rất chậm nên phải mất
2 – 3 tháng mới có kết quả.
2.2.2.3. Phương pháp giải trình tự
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc giải trình tự và xác định đột biến trên
đoạn DNA mã hóa cho yếu tố là đích tác động của kháng sinh. Các đột biến trên đoạn
DNA này dẫn tới sự thay đổi trong đích tác động của kháng sinh, do đó kháng sinh
không còn đích tác động nữa. Vì vậy vi khuẩn Mtb vẫn phát triển khi có sự hiện diện
của kháng sinh.
Phương pháp này cho độ chính xác cao nhanh và nhạy nhưng cần phòng xét
nghiệm được trang bị tốt và kỹ thuật viên xét nghiệm có chuyên môn cao.
2.3. Điều trị bệnh lao
Bệnh lao ngày nay điều trị lành với thuốc hóa chất trị lao là chủ yếu ngoại trừ
một số trường hợp lao xương khớp và lao tiết niệu sinh dục cần điều trị thêm bằng
phẫu thuật. Hóa trị liệu kết hợp với nhiều loại thuốc đảm bảo điều trị hết bệnh, diệt hết
vi khuẩn lao với điều kiện dùng thuốc đúng cách. Sự lây lan lao sẽ giảm nhanh sau
điều trị 2 – 3 tuần. Vì có nhiều quần thể lao khác nhau trong một cơ thể bệnh nhân,
nên phác đồ điều trị ngắn ngày nhất hiện nay phải kéo dài từ 6-8 tháng.
10


Hóa trị liệu lao cần tuân theo nguyên tắc “đúng đủ và đều” (Lê Bá Trung, 2002).

Điều trị đúng:
 Đúng phác đồ được TCYTTG đã chứng minh là có hiệu quả tốt. Ngày nay điều
trị lao với phác đồ hóa trị ngắn ngày có ít nhất là ba loại thuốc lao chính R, H, Z
Kết hợp lại trong giai đoạn tấn công. Chương trình chống lao Việt Nam hiện
điều trị bệnh lao, lao phổi và lao ngoài phổi với phác đồ 2SHRZ/6HE và tái
điều trị với phác đồ 2SHRZE/53H3E3 (S.Streptomycine, H.Isoniazide,
R.Rifampicine, Z.Pyrazinamide, E.Ethambutol).
 Đúng liều lượng từng thuốc lao: đã quy định theo cân nặng của cơ thể bệnh
nhân, thuốc đúng chất lượng, còn hạn dùng, dùng liều thấp thì không hiệu quả,
dùng liều cao thì gây tai biến.
 Dùng thuốc lao phải đúng cách: thuốc lao phải được chích và uống cùng một
lúc trong ngày để đạt nồng độ thuốc cao nhất và phải uống lúc đói bụng để
được hấp thụ tối đa.
Điều trị đều: Điều trị lao phải “đều đặn liên tục” hàng ngày hay tuần 3 lần. Nếu tự
ý ngưng thuốc, bỏ điều trị nữa chừng hay điều trị không đều đặn, điều trị không đủ số
lượng thuốc quy định sẽ tạo ra bệnh lao kháng thuốc.
Điều trị đủ: dùng đủ các loại thuốc đã quy định với từng giai đoạn của phác đồ và
đủ thời gian quy định của phác đồ 6 hay 8 tháng để được lành bệnh và tránh tái phát.
2.3.1. Phác đồ điều trị lao
Theo công văn hướng dẫn chuẩn đoán và điều trị bệnh lao (24/3/2009 ) của bộ y tế thì
phác đồ điều trị lao như sau:
 Phác đồ I: 2S (E)HRZ/6HE hoặc 2S (E)RHZ/4RH (Chỉ áp dụng khi thực hiện
kiểm soát trực tiếp cả giai đoạn duy trì).
Hướng dẫn:
Giai đoạn tấn công kéo dài 2 tháng, gồm 4 loại thuốc dùng hàng ngày, E có thể
thay thế cho S.
Giai đoạn duy trì kéo dài 6 tháng gồm 2 loại thuốc là H và E dùng hàng ngày
hoặc 4 tháng gồm 2 loại thuốc R và H dùng hàng ngày.
Chỉ định: Cho các trường hợp người bệnh lao mới (chưa điều trị lao bao giờ
hoặc đã từng điều trị lao nhưng dưới 1 tháng).

 Phác đồ II: 2SHRZE/1HRZE/5H3 R3 E3
11


Hướng dẫn: Giai đoạn tấn công kéo dài 3 tháng, 2 tháng đầu tiên với cả 5 loại
thuốc chống lao thiết yếu (SHRZE) dùng hàng ngày, 1 tháng tiếp theo với 4 loại thuốc
(HRZE) dùng hàng ngày. Giai đoạn duy trì kéo dài 5 tháng với 3 loại thuốc H, R và E
dùng 3 lần một tuần.
Chỉ định: Cho các trường hợp người bệnh lao tái phát, thất bại phác đồ I, điều
trị lại sau bỏ trị, một số thể lao nặng và phân loại khác.
 Phác đồ III: 2HRZE/4HR hoặc 2HRZ/4HR
Hướng dẫn: Giai đoạn tấn công kéo dài 2 tháng, gồm 4 loại thuốc (HRZE) hoặc 3
loại thuốc (HRZ) dùng hàng ngày, điều trị cho tất cả các thể lao trẻ em. Giai đoạn
duy trì kéo dài 4 tháng gồm 2 loại thuốc là H và R dùng hàng ngày.
Chỉ định: Cho tất cả các thể lao trẻ em. Trong trường hợp lao trẻ em thể nặng có
thể cân nhắc dùng phối hợp với S.
2.3.2. Điều trị lao kháng thuốc
Nếu bệnh nhân mắc lao không kháng thuốc thì thời gian điều trị tối thiểu là 6
tháng, bệnh nhân mắc lao kháng thuốc thì thời gian điều trị phải kéo dài đến 18 – 24
tháng. Nếu bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lao kháng các loại thuốc tuyến 2 (Kanamycin,
Ethionamide, Cycloserine, PAS và Fluoroquinolone) thì không thể cứu chữa.
Theo hướng dẫn của WHO (1999.Lê Bá Trung dịch) thì phác đồ điều trị lao đa
kháng thuốc có một số đặc điểm.
2.3.2.1. Một số nguyên tắc
Bệnh nhân có biểu hiện kháng thuốc với INH và kháng thêm với SM hay TB1,
nhưng còn nhạy với RIF sẽ đáp ứng tốt với phác đồ tái trị 2SHRZE /1HRZE/ 5HRE
hay 5H3R3E3.
Nếu BN có vi khuẩn lao kháng ít nhất INH, R và đã thất bại với phác đồ tái trị
và các phác đồ khác ngoài CTCL. Bệnh nhân này cần phải điều trị thêm với vài thuốc
lao hàng thứ 2 dự trữ. Vì thuốc lao hàng thứ 2 mắc tiền, ít hiệu quả và có nhiều độc

tính nên thầy thuốc phải hướng dẫn bệnh nhân rõ ràng để bệnh nhân phấn đấu vượt
qua các phản ứng phụ để sống còn và chấp nhận điều trị có kiểm soát cho đến khi đàm
âm hoá.
Dùng phác đồ điều trị hữu hiệu nhất có thể được. Nên dùng trước tiên các loại
thuốc lao chưa được dùng ở các lần trước và các thuốc chuẩn còn nhạy cảm. Trong
giai đoạn tấn công, có ít nhất là 3 thuốc, nếu được nên có từ 4 – 5 thuốc còn nhạy cảm.
12


Nên dùng phối hợp Aminoglycosid + PZA. Khi đàm đã âm hoá chuyển qua giai đoạn
củng cố, bớt 1 – 2 thuốc lao yếu và gây nhiều phản ứng phụ.
Bảng 2.3 Thứ bậc và liều lượng thuốc trong điều trị lao đa kháng
Liều trung bình
Stt
Tác dụng
Thuốc
hằng ngày
Aminoglycosid:
SM,
Diệt vi khuẩn lao sinh sản
1
15 mg/Kg
Kanamycin hay Amikacin
nhanh
Cappreomycin
2

Thioamid

10 – 20 mg/Kg

Diệt khuẩn

Ethionamid
3

Prothionamid

10 – 20 mg/Kg

Diệt khuẩn

4

Pyrazinamid

20 – 30 mg/Kg

Diệt khuẩn (môi trường acid)

5

Ofloxacin

7,5 – 15 mg/Kg

Diệt khuẩn yếu

6

Ethambutol

15 – 20 mg/Kg

Kiềm khuẩn

Cycloserin

10 – 20 mg/Kg

Kiềm khuẩn

PAS acid

10 – 12 mg/Kg

Kiềm khuẩn

7

(Hướng dẫn điều trị lao kháng thuốc của WHO.1997)
2.3.2.2. Các ví dụ về phác đồ điều trị lao kháng thuốc
Một test nhạy cảm có kết quả từ 2 – 4 tháng.
Nếu không có kết quả test nhạy cảm trước khi điều trị lao đa kháng thuốc:
Ðã thất bại với phác đồ tái trị 2SHRZE/1HRZE/5HRE hay 5H3R3E3, dùng phác
đồ được thể hiện ở bảng 2.4.
Giai đoạn tấn công: ít nhất 4 thuốc: Kanamycin + Ethionamid + Ofloxacin +
Pyrazinamid. Âm hoá đàm sau 3 – 4 đến 6 tháng.
Giai đoạn củng cố: (nếu chưa có kết quả test nhạy cảm), sử dụng Ethionamid +
Ofloxacin trong 18 tháng tiếp.

Nếu có kết quả test nhạy cảm trước khi điều trị hay trong lúc điều trị tấn công
lao. Tùy theo có kháng R hay không.

13