XÁC ĐỊNH GENOTYPE G BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẨM PCR KHUẾCH ĐẠI TỪ GENE VP7 CỦA ROTAVIRUS CÓ TRONG PHÂN TRẺ EM BỊ TIÊU CHẢY CẤP NHẬP VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG I

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH GENOTYPE G BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH
TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẨM PCR KHUẾCH ĐẠI TỪ GENE
VP7 CỦA ROTAVIRUS CÓ TRONG PHÂN TRẺ EM BỊ TIÊU
CHẢY CẤP NHẬP VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG I

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: LƯU THỊ KHÁNH HỒNG
Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 08/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH GENOTYPE G BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH
TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẨM PCR KHUẾCH ĐẠI TỪ GENE
VP7 CỦA ROTAVIRUS CÓ TRONG PHÂN TRẺ EM BỊ TIÊU
CHẢY CẤP NHẬP VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG I

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN

LƯU THỊ KHÁNH HỒNG

Tháng 08/2009


LỜI CẢM ƠN
Con xin chân thành cám ơn ba mẹ và anh chị cùng những người thân trong gia đình đã
luôn ủng hộ, động viên và luôn bên con.
Con vô cùng biết ơn TS.BS. Phạm Hùng Vân, người thầy đã luôn tận tình dạy dỗ và
truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho con.
Con chân thành cám ơn bác Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, người thầy người bác
luôn bên con và cho con những lời khuyên hữu ích.
Em xin cám ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, các thầy cô và
các anh chị trong Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em
thực hiện tốt đề tài.
Anh Võ Đức Xuyên An, chị Hoàng Hiếu Ngọc cùng các anh chị trong phòng RD và
phòng QC của Công ty TNHH Thương mại và Dịch vụ Nam Khoa đã tận tình hướng
dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng tôi xin cám ơn tập thể lớp DH05SH luôn chia sẻ cùng tôi trong suốt 4 năm
qua.
Sinh viên thực hiện
Lưu Thị Khánh Hồng

iii


TÓM TẮT

Đề tài “ Xác định genotype G bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR
khuếch đại từ gene VP7 của Rotavirus có trong phân trẻ em bị tiêu chảy cấp nhập viện
tại bệnh viện Nhi Đồng I”, được thực hiện từ tháng 02 đến tháng 07/ 2009 tại phòng
Nghiên cứu và Phát triển của Công ty TNHH Thương mại Dịch vụ và Sản xuất Nam
Khoa.
Hiện nay, tình hình trẻ em bị tiêu chảy trên toàn thế giới nói chung và ở Việt Nam nói
riêng là rất cao, do nhiều tác nhân gây ra nhưng chủ yếu là do tác nhân Rotavirus, đa
phần là nhóm A (gene VP7 xác định genotype G của những nòi thuộc nhóm A).
Rotavirus không chỉ gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em mà còn gây ra những bệnh lý dạ
dày ruột, gây nhiễm trùng đường tiêu hóa và nghiêm trọng hơn là có khả năng gây tử
vong cho trẻ. Các biện pháp thông thường như rửa tay sạch sẽ, vệ sinh môi trường, bú
sữa mẹ vẫn không thể ngăn ngừa hữu hiệu việc trẻ em bị tiêu chảy do nhiễm
Rotavirus, vì thế Tổ chức Y tế thế giới đã khuyến cáo nên phòng ngừa Rotavirus bằng
vaccine cho trẻ. Vì vậy, trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành xác định genotype G nhóm
A của Rotavirus một mặt nhằm giúp cho việc phòng bệnh và chẩn đoán bệnh được tốt
hơn, mặt khác dùng để kiểm tra chất lượng vaccine cũng như tiền đề cho việc chế tạo
vaccine sau này. Sau khi tiến hành đề tài, chúng tôi có được những kết quả sau:
1. Xác định được mẫu nhiễm Rotavirus bằng phương pháp phát hiện nhanh và
phương pháp PCR vòng ngoài (phản ứng PCR với mix A1 – A4).
2. Khuếch đại toàn bộ đoạn gene VP7 của Rotavirus
3. Xác định genotype G của Rotavirus nhiễm trong phân của trẻ em bằng kỹ thuật
giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại từ đoạn gene VP7.

iv


SUMMARY
The thesis “Determine the genotype G by direct sequencing the PCR product
amplified from the VP7 gene of rotavirus existed in the fecal samples collected from
children with acute diarrhea hospitalized in Nhi Dong I Hospital” was carried out

from 02/2009 to 07/2009 at Research and Development Department, Nam Khoa Co.
Ltd.
At the present, the state of diarrhea of children is critical in the world as well as Viet
Nam. This state is caused by many factors; but Rotavirus A is the most common and
the gene VP7 determines the genotype G of the strain’s Rotavirus A. Rotavirus cause
not only diarrhea in children but also gastroenteritis, digestive tract infection. The most
serious effect of Rotavirus A in human leads to children’s death. Due to that the
precautionary measures such as washing hands , environmental sanitation as well as
breast milk don’t make sense, World Health Organization encourages everybody to
protect their children from Rotavirus by injecting them with vaccine. To deal with this
issue, we have carried out this thesis in order to make a progress in preventing and
diagnosing this disease, on the other hand, it uses for controlling the quality vaccine
and produce vaccine in the future. After researching, we have got the following
results:
1. Determine the infection Rotavirus by quick-test and reaction PCR with mix A1 –
A4.
2. To amplify the gene VP7.
3. Determine the genotype G of Rotavirus in the fecal samples from children by
direct sequencing the PCR product amplified from the gene VP7.

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .................................................................................................... iii
Tóm tắt ........................................................................................................... iv
Summary ......................................................................................................... v
Mục lục .......................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt ...........................................................................viii

Danh sách các bảng ....................................................................................... ix
Danh sách các hình ......................................................................................... x
Chương 1 Mở đầu ......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................ 1
1.2. Mục đích về yêu cầu đề tài ...................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2
1.3. Nội dung thực hiện .................................................................................. 2
Chương 2 Tổng quan tài liệu ....................................................................... 3
2.1. Tiêu chảy cấp và tác nhân ....................................................................... 3
2.2. Tác nhân Rotavirus .................................................................................. 5
2.3. Các phương pháp phát hiện ..................................................................... 6
2.4. Các type Rotavirus .................................................................................. 8
2.5. Các vấn đề kỹ thuật ................................................................................. 8
2.5.1. Phương pháp tách biệt RNA ................................................................. 8
2.5.2. Kỹ thuật PCR ........................................................................................ 8
2.5.2.1. Sơ lược về phương pháp PCR ........................................................... 8
2.5.2.2. Nguyên tắc PCR ................................................................................ 9
2.5.3. Kỹ thuật giải trình tự .......................................................................... 10
2.5.3.1 Phương pháp hóa học ....................................................................... 10
2.5.3.2. Phương pháp emzyme ..................................................................... 11
2.5.3.3. Giải trình tự bằng máy tự động ....................................................... 13
Chương 3 Vật liệu và phương pháp........................................................... 17
vi


3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................... 17
3.2. Vật liệu .................................................................................................. 17
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 17
3.2.2. Thiết bị dụng cụ và hóa chất ............................................................... 17

3.2.2.1. Thiết bị dụng cụ ............................................................................... 17
3.2.2.2. Hóa chất ........................................................................................... 17
3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 18
3.3.1. Phương pháp phát hiện nhanh Rotavirus ............................................ 18
3.3.2. Tách biệt RNA toàn phần ................................................................... 18
3.3.3. Điện di RNA sau khi ly trích .............................................................. 20
3.3.4. Phiên mã ngược RNA ......................................................................... 20
3.3.5. Thực hiện phản ứng PCR ................................................................... 21
3.3.6 Kỹ thuật giải trình tự ........................................................................... 22
Chương 4 Kết quả và thảo luận ................................................................ 26
4.1. Tỉ lệ nhiễm Rotavirus ............................................................................ 26
4.2. Kết quả của sản phẩm PCR ................................................................... 27
4.3. Kết quà của phản ứng PCR với mix A2 – A4 ....................................... 27
4.4. Kết quả giải trình tự ............................................................................... 29
Chương 5 Kết luận và đề nghị ................................................................... 34
5.1. Kết luận .................................................................................................. 34
5.2. Đề nghị .................................................................................................. 34
Tài liệu tham khảo ........................................................................................ 35
Phụ lục

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
 bp: base - pair
 cDNA: complementary Deoxyribonucleotide Acid
 EDTA: Etylen Diamino Tetra Acetic
 dNTP: deoxynucleotide triphosphate
 ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate
 DNA: Desoxyribonucleic acid

 dsRNA: double – stranded RNA
 kDa: Kilo Dalton
 M: mol/ lít
 NPV: Negative Predict Value
 PCR: Polymerase Chain Reaction
 PPV: Positive Predict Value
 RNA: Ribonucleic acid
 RPM: Revolutions per minute
 Se: Sensitivity
 Sp: Specificity
 TBE: Tris – borate EDTA
 TE: Tris - EDTA


tRNA: Transfer ribonucleic acid



Tm: Temperature melting

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Bảng thành phần bộ kit NKRNAPREP .......................................... 19
Bàng 3.2 Bảng thành phần mix A1 – A4 .................................................... 21
Bảng 3.3 Bảng thành phần mix A2 – A4 .................................................... 21
Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR ............................................... 21
Bảng 3.5 Bảng thành phần mix chạy sequencing ....................................... 25

Bảng 3.6 Chu kỳ nhiệt của sequencing ....................................................... 25
Bảng 4.1 Kết quả mẫu nhiễm Rotavirus ..................................................... 26
Bảng 4.2 Kết quả mẫu nhiễm khi chạy PCR mix A1 – A4 ......................... 27
Bảng 4.3 Kết quả mẫu nhiễm khi chạy PCR mix A2 – A4 .......................... 27
Bảng 4.4 Bảng độ nhạy và độ đặc hiệu, PPV và NPV ................................ 28
Bảng 4.5 Bảng kết quả xác định genotype G của các mẫu chạy PCR ......... 31
Bảng 4.6 Bảng kết quả xác định genotype G của các mẫu chạy PCR tổ ..... 32
Bảng 4.7 Bảng so sánh kết quả giải trình tự ................................................ 32

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Rotavirus được quan sát dưới kính hiển vi .................................... 5
Hình 2.2 Vị trí của các protein cấu trúc ........................................................ 6
Hình 2.3 Dải điện di RNA của Rotavirus ..................................................... 7
Hình 2.4 Các mạch đơn DNA có đầu đánh dấu 32P .................................... 11
Hình 2.5 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA ..................................... 12
Hình 2.6 Sơ đồ khối máy tự động giải trình tự .......................................... 14
Hình 2.7 Phương pháp giải trình tự với ddNTP ........................................ 15
Hình 2.8 Máy ABI3130XL của Applied Biosystem ................................. 16
Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện phương pháp phát hiện nhanh Rotavirus .......... 18
Hình 3.3 Các bước tinh sạch DNA ............................................................. 23
Hình 4.1 Kết quả điện di dịch ly trích RNA .............................................. 26
Hình 4.2 Kết quả điện di mẫu chạy PCR với mix A1 – A4 ........................ 27
Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu chạy PCR tổ ............................................... 27
Hình 4.4 Cây sinh dòng của genotype G của Rotavirus ............................. 33
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ quá trình tách biệt RNA toàn phần ................................... 19
Sơ đồ 3.4 Các bước tiến hành điện di chip ................................................. 24

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Tiêu chảy là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tật và tử vong cho trẻ em trên toàn
thế giới. Ước tính hàng năm có tới 2275,4 triệu đợt trẻ em dưới 5 tuổi mắc tiêu chảy
(theo Tổ chức Y tế thế giới – WHO) và chiếm 90 % tại các nước đang phát triển. Ở
Việt Nam trung bình 2,2 đợt tiêu chảy / một trẻ em dưới 5 tuổi mỗi năm. Bên cạnh đó,
tiêu chảy cũng là nguyên nhân hàng đầu gây suy dinh dưỡng ở trẻ, do bệnh nhi ít ăn
khi bệnh và khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng bị giảm,ngoài ra còn là gánh nặng
kinh tế đối với các nước đang phát triển vì bệnh thường được điều trị bằng các dịch
truyền tĩnh mạch đắt tiền.
Tại các quốc gia có khí hậu nhiệt đới như trong vùng Ấn Độ, châu Phi, Đông
Nam châu Á, trong đó có Việt Nam, ước tính hằng năm có đến gần 900.000 trường
hợp tử vong do Rotavirus gây ra. Bệnh không có tính chất theo tháng rõ rệt, và hầu
như trẻ em dưới 5 tuổi thì đều bị ít nhất một lần tiêu chảy do nhiễm Rotavirus, nếu so
sánh với các nguyên nhân khác thì Rotavirus là tác nhân thường gặp nhất chiếm đến
56 – 76 % ca tiêu chảy ở trẻ em trong các bệnh viện. Đặc biệt đa số trường hợp bị tử
vong do nhiễm Rotavirus xảy ra chủ yếu ở những nước đang phát triển, lý do chính là
cơ thể bị mất quá nhiều nước và chất điện giải. Nghiêm trọng hơn là bệnh lại tập trung
cao ở những trẻ nhỏ từ 6 – 24 tháng tuổi gây nên những triệu chứng như ói mửa, sốt
cao, đau bụng, viêm đường hô hấp trên. Tại Việt Nam mãi đến năm 1980 mới phát
hiện được Rotavirus là căn nguyên gây tiêu chảy và viêm dạ dày ruột cấp cho trẻ em,
đặc biệt tiêu chảy vào mùa hè và thu đông, chiếm khoảng ¼ (khoảng 27 %) trong số
tác nhân gây tiêu chảy. Vì vậy, việc phát hiện các chủng Rotavirus trong các mẫu bệnh
phẩm là hết sức cần thiết nhằm giúp cho việc phòng ngừa và chẩn đoán cũng như điều
trị. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định genotype G bằng kỹ

thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại từ gene VP7 của Rotavirus có
trong phân trẻ em bị tiêu chảy cấp nhập viện tại bệnh viện Nhi Đồng I”.

1


1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục đích
Thông qua kỹ thuật PCR và giải trình tự để xác định các genotype G của
Rotavirus từ mẫu phân của bệnh nhi bị tiêu chảy thu thập từ bệnh viện Nhi Đồng I.
1.2.2. Yêu cầu
 Thành thạo thao tác trích biệt RNA tổng số.
 Nắm vững kỹ thuật tổng hợp cDNA.
 Nắm vững kỹ thuật PCR, hạn chế sai sót trong quá trình thực hiện.
 Nắm vững kỹ thuật giải trình tự.
1.3. Nội dung thực hiện
 Thử nghiệm trên những mẫu phân đã xác định rõ bệnh tiêu chảy để phát hiện
Rotavirus bằng phương pháp PCR dùng mồi đặc hiệu cho type G.
 Giải trình tự đoạn gene VP7 trực tiếp từ sản phẩm khuếch đại.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tiêu chảy cấp và tác nhân tiêu chảy cấp
 Định nghĩa: tiêu chảy thường được định nghĩa là đi cầu phân lỏng hoặc tóe
nước trên 3 lần trong 24 giờ. Phân lỏng là phân không thành khuôn.
 Ba hội chứng lâm sàng khác nhau của tiêu chảy, thể hiện ba cơ chế sinh bệnh
khác nhau, đòi hỏi các biện pháp điều trị khác nhau:

– Tiêu chảy phân lỏng cấp tính: tiêu chảy kéo dài không quá 14 ngày (thường
dưới 7 ngày), phân lỏng hoặc tóe nước, không thấy máu. Tiêu chảy phân lỏng cấp
tính gây mất nước, bệnh nhân có thể bị sốt, nôn và có thể bị suy dinh dưỡng.
– Hội chứng lỵ: đây là bệnh tiêu chảy thấy có máu trong phân. Tác hại chính của
lỵ là gây cho bệnh nhân chán ăn, sụt cân nhanh, niêm mạc bị tổn thương do sự xâm
nhập của vi khuẩn.
– Tiêu chảy kéo dài: là bệnh tiêu chảy kéo dài bất thường (ít nhất là 14 ngày).
Bệnh nhân thường bị sút cân rõ rệt, suy dinh dưỡng, tổn thương hệ miễn dịch.
 Dịch tễ học của bệnh tiêu chảy
– Sự lây lan các mầm bệnh tiêu chảy: các tác nhân gây tiêu chảy thường truyền
bằng đường phân – miệng, thông qua thức ăn hoặc nước uống ô nhiễm, hay tiếp
xúc trực tiếp với phân đã nhiễm khuẩn… và một số tập quán xấu như không rửa tay
sau khi đi ngoài, trước khi chế biến thức ăn, để trẻ bò chơi ở vùng dơ bẩn có dính
phân người hay gia súc.
– Những tập quán làm tăng nguy cơ tiêu chảy: không nuôi con hoàn toàn bằng
sữa mẹ trong 4 – 6 tháng đầu, tập quán cai sữa quá sớm trước 1 tuổi, để thức ăn đã
nấu ngoài nhiệt độ phòng, dùng nước không đảm bảo độ an toàn, không xử lý phân
đặc biệt là phân trẻ em một cách hợp vệ sinh.
– Tuy nhiên, các yếu tố của cơ thể trẻ cũng làm tăng tính mắc bệnh tiêu chảy, như
trẻ bị suy dinh dưỡng, trẻ đang bị bệnh sởi hoặc suy giảm miễn dịch.
– Tính chất theo mùa: có sự khác biệt theo mùa rất rõ rệch, ở những vùng ôn đới
tiêu chảy do vi khuẩn thường xảy ra vào mùa nóng, còn tiêu chảy do virus đặc biệt
là Rotavirus lại xảy ra cao vào mùa đông. Còn những vùng nhiệt đới, tiêu chảy do
3


 Tác nhân gây tiêu chảy: có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng tiêu chảy ở
trẻ em, thông thường là do nhiễm vi khuẩn, virus, ký sinh trùng hay do uống
thuốc và do rối loạn đường ruột.
 Tác nhân vi khuẩn

– Staphylococcus aureus (S.aureus), Clotridium perfringens, Bacillus cereus,
Shigella, Campylobacter jejuni, Vibrio parahaemolyticus.
– Salmonella, đặc biệt gây sốt thương hàn khi bị nhiễm Salmonella typhi.
– Escherichia coli (E.coli) – thường bị nhiễm trong thịt chưa nấu chín, các nước
trái cây chưa qua diệt khuẩn theo phương pháp Pasteur, các nem chua, rau cải.
– Vibrio cholerae – gây bệnh tả, thường gặp ở các nước đang phát triển.
 Tác nhân virus
– Rotavirus thường là tác nhân gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em đặc biệt là trẻ nhỏ
dưới 24 tháng tuổi.
– Adenovirus, Caliciviruses, Astrovirus.
 Tác nhân ký sinh trùng
– Giardia lamblia
– Entamoeba histolytica – được lan truyền qua đường nước, thực phẩm đã bị dính
phân người hay có thể do trực tiếp tiếp xúc qua tay dơ bẩn kể cả quan hệ tình dục.
– Cryptosporidium – có thể lan truyền qua thực phẩm, đặc biệt là các loại rau trộn
(salad) được trồng bằng phân bón.Và ký sinh trùng có khả năng sống được trong
nước nên nguồn nước cũng có thể là nguồn lây lan ký sinh trùng này.
 Tác nhân thuốc men
– Thuốc trụ sinh
– Thuốc chống cao huyết áp
– Thuốc nhuận tràng
– Một số hóa chất khác cũng gây nên bệnh tiêu chảy như rượu, cà phê, trà, chất
phụ gia, thủy ngân, asen …
Ngoài ra, bệnh cũng là nguyên nhân gây nên tiêu chảy, chẳng hạn như khi cơ thể
cảm thấy buồn phiền, lo lắng, nhiễm trùng máu, cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị ngộ
độc thức phẩm hay bị dị ứng với thức ăn …
4


2.2. Tác nhân Rotavirus

Nhóm: nhóm III (dsRNA)
Họ: Reoviridae
Giống: Rotavirus
Loài: A, B, C, D, E, F và G.
Năm 1973, Ruth Bishop đã phát hiện ra Rotavirus nhờ quan sát dưới kính hiển
vi điện tử mẫu sinh thiết tá tràng của trẻ em bị tiêu chảy cấp. Với những nghiên cứu về
hình thái học, các nhà khoa học đã xác định Rotavirus thuộc họ Reoviridae. Và virus
này được được đặt tên là Rotavirus là do quan sát dưới kính hiển vi điện tử virus có
hình khối cầu, đường kính trung bình 65 – 75 nm, đường kính nhân virus từ 37 – 40
nm, các capsome của lớp trong xếp theo hình nan hoa và kéo nối với các capsome ở
lớp bên ngoài tạo nên hình vòng như bánh xe, Rota tiếng Latinh có nghĩa là bánh xe.
Rotavirus bao gồm có 7 loài: A, B, C, D, E, F và G; trong đó thì loài A, B, C là
gây bệnh trên người nhưng 90 % là do Rotavirus A, và tất cả 7 loài trên đều gây bệnh
trên động vật.

Hình 2.1 Rotavirus được quan sát dưới kính hiển vi điện tử
( />Cấu trúc nhân của Rotavirus là RNA gồm 2 sợi với 11 đoạn dsRNA, có tổng
kích thước là 18,555 bp và trọng lượng phân tử của mỗi đoạn từ 20 – 125 kDa. Mỗi
đoạn này là một gene và được đánh số từ 1 – 11 theo nguyên tắc là giảm dần kích
thước từ 3302 – 667 bp. Hạt rotavirion có cấu trúc 3 lớp protein capsid, phức tạp và
5


không có màng bao bọc. 11 dsRNA này sẽ mã hóa cho sáu loại protein cấu trúc là
VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 và VP7 và sáu protein phi cấu trúc là NSP1, NSP2, NSP3,
NSP4, NSP5 và NSP6.

Hình 2.2 Vị trí của các protein cấu trúc trên vỏ capsid
( />Việc xử lý nước hay đồ vật bị nhiễm Rotavirus là rất đơn giản, chúng ta có thể
xử lý bằng EDTA hay một số hóa chất tẩy uế, tuy nhiên nếu xử lý bằng Clo thì sẽ

không hiệu quả. Rotavirus có khả năng tồn tại trong phân lâu hơn trong nước, điều
đáng chú ý là nếu phân được giữ ở nhiệt độ bình thường thì Rotavirus nhiễm trong
phân sẽ có khả năng truyền bệnh trong thời gian dài từ vài ngày đến vài tuần. Ngoài ra,
Rotavirus còn bị tiêu diệt ở pH<3 hay pH>10. Formaldehyde có tác dụng ức chế hoạt
động của Rotavirus trong khi đó các chất sát trùng ngoài da như Sodium hypochloride,
chlorhexidine glutamate và providane-iodine không có tác dụng đối với Rotavirus.
2.3. Các phương pháp phát hiện tác nhân Rotavirus
Với những hậu quả để lại khi bị bệnh tiêu chảy do Rotavirus đồng thời tránh
việc sử dụng thuốc kháng sinh một cách vô ích hay giảm chi phí điều trị cũng như
giảm sự nhập viện không cần thiết nên việc chẩn đoán tác nhân Rotavirus cần thực
hiện nhanh chóng.
Cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật cũng như trong lĩnh vực sinh học thì
việc phát hiện Rotavirus là rất đơn giản. Những kỹ thuật dùng để chẩn đoán Rotavirus:
 Quan sát hình thái và cấu trúc Rotavirus dưới kính hiển vi điện tử.
 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.

6


 Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ.
 Phản ứng kết hợp bổ thể.
 Thử nghiệm ELISA.
 Kỹ thuật ly trích và điện di RNA.
 Kỹ thuật ngưng kết trên hạt Latex.
Kỹ thuật ly trích và điện di RNA cũng cho kết quả chính xác lại rẻ tiền, đơn giản
và nhanh hơn. Như đã giới thiệu ở trên, nhân của Rotavirus là 2 sợi RNA bao gồm 11
đoạn kép hợp thành, vì vậy sau khi ly trích từ bệnh phẩm, đem điện di trên gel thì sẽ
cho thấy sự sắp xếp một cách đặc thù của 11 đoạn này do chúng có kích thước hoàn
toàn khác nhau.

Hình 2.3 Dải điện di RNA của Rotavirus
( />2.4. Các type Rotavirus và ý nghĩa của việc phát hiện type
Rotavirus gồm có 7 loài A – G, trong đó loài A là tác nhân gây bệnh chính trên
người, do đó chúng tôi chỉ đề cập đến các type của loài A.
Loài Rotavirus A có hệ thống phân loại kép, dựa trên protein ở lớp vỏ capsid
ngoài cùng, đó chính là VP4 quy định cho type P còn VP7 thì quy định cho type G.
Các nghiên cứu đã cho thấy có 14 serotype G, 14 genotype G và 14 serotype P, 26
genotype P, nhưng chỉ có 5 sự kết hợp giữa P và G đó là P[8] với G1, G3, G4 và G9;

7


P[4] với G2, đó cũng chính là các type gây bệnh phổ biến trên toàn thế giới và tùy theo
mỗi vùng mà có type gây bệnh khác nhau.
Trên cơ sở đó, việc phát hiện chính xác các type gây bệnh là việc làm hết sức
cần thiết và quan trọng vì sẽ giúp cho việc chẩn đoán được chính xác hơn và việc điều
trị sẽ tốt hơn. Ngoài ra, việc xác định các type còn giúp cho việc tạo vaccine trong việc
phòng ngừa bệnh tiêu chảy do tác nhân Rotavirus.
2.5. Các vấn đề kỹ thuật có liên quan trong nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp tách biệt RNA toàn phần
Phương pháp dựa trên phương pháp do CHOMCZYNSKI và SACCHI sáng
chế. Nguyên tắc là dùng Guanidine 14M và ure, phối hợp với phenol và các chất tẩy
khác để làm các chất gây biến tính các protein, kết quả là các protein trong mẫu thử sẽ
bị vón lại, DNA sẽ tan trong phase phenol, còn RNA thì nằm lại trong phase nước và
sẽ được tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay ly tâm lắng tách.
RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol với sự hỗ trợ của tRNA
và glycogen.
Phương pháp tách chiết thô RNA toàn phần áp dụng cho hầu hết các mẫu thử,
các mục đích sử dụng vì đây là phương pháp rất hiệu quả cho tất cả các loại RNA từ
virus, vi khuẩn, nấm men cho đến dịch tế bào có nhân. Do vậy, mẫu thử có thể là các

canh cấy tế bào có nhân hay mô nghiền, vi khuẩn hay virus trong các dịch sinh học
như máu, huyết thanh, huyết tương và các dịch khác (TS.BS. Phạm Hùng Vân, 2009).
2.5.2. Kỹ thuật PCR
2.5.2.1. Sơ lược về phương pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 được sử dụng
rộng rãi nhất. Thực chất đây là phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện
của tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ
nhiệt. Thử nghiệm được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản
ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào khoảng tứ 10 μl đến 50 μl với các thành phần chủ
yếu là:

8


 Enzyme polymerase chịu nhiệt, thường được dùng hiện nay là Taq polymerase
(được tách triết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus), có hoạt tính tối
đa ở 720C và bền với nhiệt độ, xúc tác sự tổng hợp suốt quá trình phản ứng.
 Bốn loại dNTP là Adenine, Thymine, Guanine và Cytosine (dATP, dTTP,dGTP
và dCTP).
 DNA mẫu: có thể là DNA được ly trích trực tiếp từ dịch tế bào, cDNA hoặc
DNA được thu thập từ một nguồn nào khác.
 Các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có chiều dài
khoảng 20 – 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự
của hai đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản.
 Ion Mg++ trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp.
 Dung dịch đệm Tris-KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng.
Khi ống nghiệm phản ứng này được cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt của máy luân
nhiệt (thermal cycler), mà chúng ta thường gọi là máy PCR, chương trình nhiệt độ

trong máy sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu kỳ, nhờ
vậy mà phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra (TS.BS. Phạm Hùng Vân, 2009).
2.5.2.2. Nguyên tắc của PCR
Về nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn sau:
 Bước 1: Giai đoạn biến tính
Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 940C (nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử) trong
vòng 30 giây đến 1 phút, ở nhiệt độ này thì các liên kết hydro của mạch đôi DNA
sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch DNA đơn.
 Bước 2: Giai đoạn lai
Ở giai đoạn này, nhiệt độ sẽ được hạ xuống đến 550C – 650C là nhiệt độ thích hợp
để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích. Thời
gian của giai đoạn này kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút tùy thuộc vào nhiệt
độ nóng chảy Tm của các mồi sử dụng.
 Bước 3: Giai đoạn tổng hợp (giai đoạn kéo dài)
Đây là giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’ – 3’ của 2 mồi nhờ
hoạt động của polymerase. Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase

9


hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự
DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân lên thành hai bản sao và nếu
chu kỳ này được lặp đi lặp lại n lần thì từ một DNA đích sẽ nhân bản thành 2n bản sao.
Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gene quan tâm bằng
mồi chuyên biệt kết hợp với hoạt động của enzyme chịu nhiệt polymerase như Taq
DNA polymerase trong một chu kỳ nhiệt hợp lý. Tác động của mồi được xem như yếu
tố đánh dấu cho hoạt động của polymerase khi nó được gắn kết vào DNA mạch đơn
làm khuôn trong giai đoạn bắt cặp. Mồi bên trái tác động trên dây DNA 3’ – 5’ còn
được gọi là mồi xuôi – forward primer, kí hiệu là F. Mồi bên phải tác động trên dây 5’

– 3’ còn được gọi là mồi ngược – reverse primer, kí hiệu là R.
2.5.3. Kỹ thuật giải trình tự
2.5.3.1. Phương pháp hóa học giải trình tự DNA
Vào năm 1977, Maxam và Guilbert đã phát minh được một phương pháp hóa
học để có thể giải trình tự một đoạn DNA. Nguyên tắc của phương pháp này là:
 (1) Trước hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự
bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P).
 (2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi
đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA. Ví dụ,
dimethylsulphate để làm biến đổi Guanine bằng cách thêm một gốc methyl ở vị
trí nitrogen thứ 7 (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine và Cytosine, hydrazine
và NaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến đổi Guanine và Adenine,
NaOH để làm biến đổi Adenine và Cytosine với Adenine ưu tiên hơn Cytosine.
Như vậy, trong giai đoạn này phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống
nghiệm DNA được xử lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa
học nêu trên để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn
DNA này chỉ có một vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi.
 (3) Các nucleotide bị biến đổi này sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đườngphosphate của đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một
đầu đánh dấu

32

P và một đầu bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra

khỏi mạch khung.

10


 (4) Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng

của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển
trong gel khơng bị biến đổi trong q trình điện di.
Nhờ đó, sau khi hồn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác
nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài
của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các
mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị đánh
dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P. Từ các vạch
trên phim xạ ký tự ghi này, có thể đọc được trình tự của các nucleotide của đoạn DNA.
Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực tế khơng
phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thơng số tối ưu cho thí nghiệm, trong
đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học sao cho
khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với mỗi
vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu 32P được tách ra.
Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert hiện nay ít được sử dụng, mà
thay vào đó các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội
hơn (TS.BS. Phạm Hùng Vân, 2009).

Mạc h đơn DNA

Các mạc h DNA
đơn có đầu bò
đánh dấu 32P

32P

A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A..

32P
32P
32P

32P
32P

Hình 2.4 Các mạch đơn DNA có đầu đánh dấu 32P (TS.BS. Phạm Hùng Vân, 2009).

Các mạch đơn có một đầu đánh dấu với 32P và một đầu base Guanine bị lấy khỏi mạch khung
do bị biến đổi. Các mạch đơn này có chiều dài ngắn khác nhau tùy thuộc vào vị trí của
Guanine trên đoạn DNA.

2.5.3.2. Phương pháp enzyme giải trình tự DNA
Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm
1977, và ngày nay phương pháp này càng ngày càng được hồn thiện và thực hiện dễ
dàng tại các phòng thí nghiệm.
Ngun tắc chung của phương pháp này có thể được tóm tắt như sau:
11


Hình 2.5 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA
(TS.BS. Phạm Hùng Vân, 2009).
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là
phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ.
Chuyển thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để
nhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector
từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí
chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide
tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các
nucleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP
có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A,T,C và G). Phản ứng được thực hiện trong 4
ống nghiệm, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, men

12


DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA
chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo
vào thay vì dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị
mất đi gốc OH tại vị trí cacbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này
chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch
đơn DNA có chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên
đoạn DNA gốc.
Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide
biến tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ 32P
hay 35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người
ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi và từ các vạch này giải được
trình tự của đoạn DNA.
2.5.3.3. Giải trình tự bằng máy tự động
Trong thực tế hiện nay, các phòng thí nghiệm đều dùng phản ứng giải trình tự
bằng phương pháp enzyme nhưng dùng máy tự động chứ không dùng kỹ thuật xạ ký
tự ghi như trước đây. Để thực hiện việc giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch
DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang
để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng
laser.
Cấu tạo của máy tự động giải trình tự gồm hai phần chủ yếu sau:
 Phần điện di với gel polyacrylamide – có thể là một bản gel hay một ống mao
quản chứa gel.
 Phần phát hiện các vạch điện di – là những con mắt cảm quang và một chùm tia
laser đi qua trước nó.
Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một
vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này

sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong
biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh
tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.

13


Các con mắt cảm
quang phát hiện
vạc h điện di phát
sáng khi đi qua
chùm tia laser

Chiều
điện di

Chùm tia
LASER

A G C T T A C G G A C T A A TGC

Ống 1
Máy vi tính

Ống 2
Ống 3
Ống 4

Hình 2.6 Sơ đồ khối máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyacrylamide
(TS.BS. Phạm Hùng Vân, 2009).

Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác
nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được
chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà khơng
cần phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây.

14


CATACGTGG CCTTACG
GGAATGC
theâm
dNTP, DNA
polymerase,
ddATP, ddTTP,
ddGTP, ddCTP

CGTAAGGCCdA
CGTAAGGCdC
CGTAAGGCCACdG
CGTAAGGCCACGTdA
CGTAAGGdC
CGTAAGGCCACGTA TdG
CGTAAGGCCAdC
CGTAAGGCCACGdT
CGTAAGGCCACGTAdT
ñieän di treân gel
mao quản

*CGTAAGGCCACGTA TdG
*CGTAAGGCCACGTAdT

*CGTAAGGCCACGTdA
*CGTAAGGCCACGdT
*CGTAAGGCCACdG
*CGTAAGGCCAdC
*CGTAAGGCCdA
*CGTAAGGCdC
*CGTAAGGdC

Chieàu ñieän di

Hình 2.7 Phương pháp giải trình tự với ddNTP đánh dấu huỳnh quang khác nhau
(TS.BS. Phạm Hùng Vân, 2009).
Nếu dùng điện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có thể chạy một lần
mà người làm thí nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều hay ít, như máy
giải trình tự CEQ8000 của Becman Coulter có 8 mao quản, còn máy ABI 3130XL của
Applied Biosystem có 16 mao quản. Các thế hệ máy về sau này ngày càng có những
chương trình đi kèm chẳng những giúp cho việc hiển thị tự động các ký tự hóa học của
trình tự DNA mà còn giúp các nhà nghiên cứu:
 Phát hiện các chi tiết cần thiết trên trình tự như mã mở đầu, mã kết thúc, vùng
đọc mở, trình tự đặc hiệu cho các enzyme cắt giới hạn, các dấu ấn di truyền…
mà các chi tiết này rất cần thiết để lập bản đồ gene…

15