KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG LÊN SẢN XUẤT PHÔI BÒ IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
LÊN SẢN XUẤT PHÔI BÒ IN VITRO

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN CHÍ HIẾU

Niên khóa

: 2005 – 2009

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

LÊN SẢN XUẤT PHÔI BÒ IN VITRO

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. CHUNG ANH DŨNG

NGUYỄN CHÍ HIẾU

ThS. LÊ CÔNG THIỆN

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Bốn năm đại học trôi qua thật nhanh. Giờ đây, tôi đang cầm trên tay luận văn tốt
nghiệp, đứa con tinh thần đầu tiên của mình, với một niềm vui khó tả. Những ngày tháng
thực hiện luận văn này là quãng thời gian vất vả nhất trong suốt con đường đại học của
tôi. Trong suốt thời gian thực hiện đề tài này, tôi đã luôn nhận được sự quan tâm, động
viên, giúp đỡ của thầy cô, cha mẹ, bạn bè.
Tôi xin gửi những lời cảm ơn trân trọng nhất đền Thầy Chung Anh Dũng. Với
cương vị là trưởng phòng một viện nghiên cứu lớn, dù rất bận rộn với công việc nhưng
Thầy luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi, cho tôi những lời khuyên sâu sắc và sự động viên,
khích lệ tận tình.
Con xin cảm ơn Ba, Mẹ và mọi người trong gia đình đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và là
chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con.
Xin cảm ơn Anh Lê Công Thiện, người đã dẫn dắt tôi từ buổi ban đầu đến với những
kĩ thuật mới mẻ này. Anh luôn sẵn sàng giải đáp cho tôi mọi thắc mắc về kiến thức cũng
như thao tác thí nghiệm. Hơn hết, Anh đã truyền cho tôi lòng say mê, sự tận tụy với mỗi

công việc của mình.
Lần đầu tiên thực hiện một công trình nghiên cứu, tôi không tránh khỏi những bối
rối với khối lượng công việc đồ sộ, nhưng Chị Phạm Thị Quỳnh Lan đã luôn theo sát,
giúp đỡ tôi sắp xếp công việc hợp lí, hỗ trợ tôi hoàn thành công việc theo đúng tiến độ.
Xin cảm ơn Chị, Chị đã giúp tôi trưởng thành lên rất nhiều.
Xin cảm ơn Chị Hoàng Ngọc Minh, sự lạc quan vui vẻ và những lời khuyên bổ ích
của chị đã giúp tôi có thêm niềm tin trong công việc của mình.
Xin cảm ơn Trương Sử Ngọc Hằng và Tăng Kim Hoàng Văn, hai người bạn cùng
nhóm thí nghiệm. Cảm ơn hai bạn đã luôn ở bên cạnh tôi, chia sẻ và cùng tôi giải quyết
những khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài này.
TP. Hồ Chí Minh, 30/7/2009
Nguyễn Chí Hiếu

iii


TÓM TẮT
Trong luận văn này, trứng chọc hút từ buồng trứng sẽ được thụ tinh với tinh trùng
đông lạnh.
Sau khi được thu tại lò mổ, buồng trứng được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong
nước muối sinh lý (0,9% NaCl). Sau thời gian bảo quản, buồng trứng được chọc hút bằng
bơm tiêm 5 ml với đầu kim 18G. Trứng được nuôi trong dung dịch TCM-199 (bổ sung
5% huyết thanh bê) với thời gian 20 giờ. Trứng trưởng thành sẽ được thụ tinh với tinh
trùng ở nồng độ 12 x 106 tế bào/ml. Sau 6 giờ nuôi cấy, tinh trùng sẽ được rửa sạch và
trứng tiếp tục được nuôi trong môi trường Cr1aa. Toàn bộ quy trình nuôi cấy được tiến
hành ở điều kiện nhiệt độ 38,5oC và 5% CO2.
Kết quả thu được cho thấy với thời gian bảo quản 4 giờ, trứng ở các mức nhiệt độ
bảo quản 24oC và 10oC không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa ở tỉ lệ trưởng thành
(P=0,103) cũng như tỉ lệ thụ tinh (P=0,37) và khả năng phát triển của phôi (tỉ lệ tạo thành
phôi dâu).

Với nhóm nghiệm thức bảo quản ở 8 giờ, tỉ lệ trưởng thành của trứng bảo quản ở
nhiệt độ 10oC cao hơn so với trứng bảo quản ở 24oC (P=0,016). Ngoài ra, sự bổ sung dịch
nang trứng vào môi trường nuôi trứng trưởng thành đã làm tăng tỉ lệ trưởng thành một
cách có ý nghĩa. Do số lượng trứng thấp, tỉ lệ thụ tinh và sự phát triển của phôi ở nhóm
nghiệm thức này vẫn chưa thể kết luận được.
Một kết quả khác thu được là khi sử dụng tinh thường (chưa phân loại giới tính) và
tinh X (đã phân loại giới tính) thì tỉ lệ thụ tinh và sự phát triển của phôi không thể hiện sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê. Nhưng khi sử dụng tinh X, toàn bộ các phôi thu được chắc
chắn sẽ là phôi cái. Kết quả xác định giới tính bằng phương pháp PCR đã cho thấy các
phôi trên đúng là phôi cái.

iv


SUMMARY
In this study, oocytes aspirated from ovaries was fetilized with frozen-thawed
semen.
After collected from a slaughterhouse, ovaries were transported to the laboratory in
physiological saline solution (0,9% NaCl). After preservation time, ovaries were aspirated
by using a 5 ml syringe with a 18G needle. Oocytes were incubated in TCM-199 medium
(supplemented with 5% calf serum) for 20 hours. Maturated oocytes were fertilized with
sperm at a concentration of 12 x 106 cells/ml. After 6 hour co-incubation, sperm was
washed away and oocytes were continuously cultured in Cr1aa medium. Culture
condition was carried out at 38,5oC and 5% CO2.
The result showed that after 4-hour preservation at 24oC and 10oC, IVM rates
(P=0,103), IVF rates (P=0,37) and IVC (percentage of morula) were not significant
difference.
In 8-hour preservation groups, the IVM rates of 10oC preservation groups were
higher than those of 24oC preservation groups (P=0,016). Besides, the addition of follicle
fluid into maturation medium increased IVM rates significantly. Due to the low number

of oocytes used in these groups, IVF rates and IVC were not exactly concluded.
Another result showed that IVF rates and IVC when using normal semen (unsorted
semen) were not different from those using X semen (sorted semen). But when using X
semen, all embryos received were female. Sex determination using PCR method
confirmed that those embryos were exactly female.

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn..........................................................................................................................iii
Tóm tắt................................................................................................................................ iv
Summary.............................................................................................................................. v
Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................... x
Danh sách các bảng ............................................................................................................ xi
Danh sách các hình ............................................................................................................ xii
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề..................................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu của đề tài......................................................................................................... 1
1.3. Nội dung của đề tài....................................................................................................... 1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................... 2
2.1. Sơ lược lịch sử của phương pháp IVF.......................................................................... 2
2.2. Các nghiên cứu trong và ngoài nước............................................................................ 2
2.2.1. Các nghiên cứu ngoài nước ....................................................................................... 2
2.2.2. Các nghiên cứu trong nước........................................................................................ 4
2.3. Thụ tinh trong ống nghiệm ........................................................................................... 6
2.3.1. Khái niệm thụ tinh trong ống nghiệm ....................................................................... 6
2.3.2. Sinh lý sinh sản ở bò cái............................................................................................ 6
2.3.2.1. Cấu tạo cơ quan sinh dục cái .................................................................................. 6

2.3.2.2. Sự phát triển nang noãn .......................................................................................... 7
2.3.3. Sinh lý sinh sản ở bò đực........................................................................................... 8
2.3.3.1. Cấu tạo cơ quan sinh dục đực................................................................................. 8
2.3.3.2. Sự tạo thành tinh trùng ........................................................................................... 9
2.3.3.3. Cấu tạo của tinh trùng........................................................................................... 10
2.3.4. Sinh lý quá trình thụ tinh ......................................................................................... 11
2.3.4.1. Sự hoạt hóa tinh trùng .......................................................................................... 11
vi


2.3.4.2. Sự thụ tinh ............................................................................................................ 12
2.3.5. Các giai đoạn phát triển của phôi ............................................................................ 13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................... 15
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 15
3.2. Vật liệu ....................................................................................................................... 15
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................. 15
3.2.2. Hóa chất................................................................................................................... 15
3.2.3. Dụng cụ.................................................................................................................... 16
3.2.4. Thiết bị..................................................................................................................... 16
3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 16
3.3.1. Thu mẫu trứng bò tại lò mổ..................................................................................... 16
3.3.2. Chọc hút trứng tại phòng thí nghiệm....................................................................... 16
3.3.3. Giai đoạn nuôi trứng trưởng thành .......................................................................... 17
3.3.4. Thụ tinh trong ống nghiệm ...................................................................................... 18
3.3.4.1. Chuẩn bị tinh dịch (hoạt hóa tinh dịch) ................................................................ 18
3.3.4.2. Thụ tinh trong ống nghiệm ................................................................................... 18
3.3.5. Nuôi và kiểm tra trứng thụ tinh ............................................................................... 18
3.3.5.1. Nuôi trứng thụ tinh ............................................................................................... 18
3.3.5.2. Kiểm tra giai đoạn phát triển đầu tiên (48 giờ sau khi thụ tinh) .......................... 19
3.3.5.3. Kiểm tra sự phát triển đến phôi nang ................................................................... 19

3.4. Bố trí thí nghiệm......................................................................................................... 20
3.4.1. Thí nghiệm 1............................................................................................................ 20
3.4.1.1. Các yếu tố thí nghiệm........................................................................................... 20
3.4.1.2. Các yếu tố cố định ................................................................................................ 20
3.4.1.3. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................... 20
3.4.2. Thí nghiệm 2............................................................................................................ 20
3.4.2.1. Các yếu tố thí nghiệm........................................................................................... 20
3.4.2.2. Các yếu tố cố định ................................................................................................ 21
3.4.2.3. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................... 21

vii


3.4.3. Thí nghiệm 3............................................................................................................ 21
3.4.3.1. Các yếu tố thí nghiệm........................................................................................... 21
3.4.3.2. Các yếu tố cố định ................................................................................................ 21
3.4.3.3. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................... 22
3.4.4. Thí nghiệm 4: ảnh hưởng của loại tinh sử dụng lên IVF ........................................ 22
3.4.4.1. Các yếu tố thí nghiệm........................................................................................... 22
3.4.4.2. Các yếu tố cố định ................................................................................................ 22
3.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................... 22
3.4.5. Thí nghiệm 5: kiểm tra giới tính của phôi bằng phương pháp PCR ....................... 22
3.4.5.1. Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR ........................................................................ 23
3.4.5.2. Thực hiện phản ứng PCR ..................................................................................... 23
3.4.5.3. Điện di sản phẩm .................................................................................................. 24
3.4.5.4. Đánh giá kết quả................................................................................................... 24
3.5. Xử lí số liệu ................................................................................................................ 24
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................... 25
4.1. Kết quả........................................................................................................................ 25
4.1.1. Các yếu tố ảnh hưởng lên tỉ lệ IVM ........................................................................ 25

4.1.1.1. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản....................................................................... 25
4.1.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản........................................................................ 26
4.1.1.3. Ảnh hưởng của loại trứng..................................................................................... 27
4.1.1.4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng trưởng thành ........................................... 28
4.1.2. Ảnh hưởng của các yếu tố lên tỉ lệ IVF và IVC ...................................................... 29
4.1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản........................................................................ 29
4.1.2.2. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản và môi trường nuôi....................................... 30
4.1.2.3. Ảnh hưởng của loại tinh sử dụng ......................................................................... 31
4.1.3. Kết quả kiểm tra giới tính bằng phương pháp PCR ................................................ 32
4.2. Thảo luận .................................................................................................................... 33
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 36
5.1. Kết luận....................................................................................................................... 36

viii


5.2. Đề nghị ....................................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 37
PHỤ LỤC

ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BSA (Bovine Serume Albumin): albumin huyết thanh bò.
BO (Brackett – Oliphant): môi trường dùng trong các bước hoạt hóa tinh và rửa trứng.
CS (Calf Serum): huyết thanh bê.
D-PBS (Dubelco’s Phosphate Buffer Saline): dung dịch đệm phosphate Dubelco.
ET (Embryo Transfer): kĩ thuật cấy truyền phôi.
FF (Follicle Fluid): dịch nang trứng.

FBS (Fetal Bovine Serum): huyết thanh thai bò.
IVC (In Vitro Culture): giai đoạn nuôi phôi trong điều kiện phòng thí nghiệm.
IVF (In Vitro Fertilization): thụ tinh trong điều kiện phòng thí nghiệm.
IVM (In Vitro Maturation): nuôi trứng trưởng thành trong điều kiện phòng thí nghiệm.
TCM-199 (Tissue Culture Media): môi trường nuôi trứng trưởng thành

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Thành tựu về IVF ở động vật có vú..................................................................... 2
Bảng 2.2 Một số động vật có vú ra đời lần đầu tiên do IVF .............................................. 3
Bảng 3.1 Các loại hóa chất và mục đích sử dụng ............................................................. 15
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 1............................................................................................. 20
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm 2............................................................................................. 21
Bảng 3.4 Trình tự primers cho phản ứng ......................................................................... 23
Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR................................................................................ 23
Bảng 3.6 Chu trình nhiệt cho phản ứng ............................................................................ 23
Bảng 4.1 Kết quả IVM của nhóm nghiệm thức ở thời gian bảo quản 4 giờ..................... 25
Bảng 4.2 Kết quả IVM của nhóm nghiệm thức ở thời gian bảo quản 8 giờ..................... 25
Bảng 4.3 Kết quả IVM của nhóm nghiệm thức ở nhiệt độ 24oC...................................... 26
Bảng 4.4 Kết quả IVM của nhóm nghiệm thức ở nhiệt độ 10oC...................................... 26
Bảng 4.5 Tỉ lệ IVM từng loại trứng trong các nghiệm thức thí nghiệm 1........................ 27
Bảng 4.6 Kết quả IVM của nhóm nghiệm thức bảo quản ở 24oC trong 8 giờ.................. 28
Bảng 4.7 Kết quả IVM của nhóm nghiệm thức bảo quản ở 10oC trong 8 giờ.................. 28
Bảng 4.8 Tỉ lệ IVF của nhóm nghiệm thức 4 giờ ............................................................. 29
Bảng 4.9 Số phôi từng loại của nhóm nghiệm thức 4 giờ................................................. 29
Bảng 4.10 Tỉ lệ IVF của nhóm nghiệm thức ở 8 giờ ........................................................ 31
Bảng 4.11 So sánh tỉ lệ IVF giữa 2 loại tinh..................................................................... 31

Bảng 4.12 So sánh số phôi từng loại giữa 2 loại tinh ....................................................... 32

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cơ quan sinh dục bò cái....................................................................................... 7
Hình 2.2 Cơ quan sinh dục bò đực ..................................................................................... 8
Hình 2.3 Sơ đồ A và hình vẽ B về quá trình sinh tinh...................................................... 10
Hình 2.4 Cấu tạo tinh trùng .............................................................................................. 11
Hình 2.5 Quá trình hoạt hóa tinh trùng trong đường sinh dục cái.................................... 11
Hình 2.6 Phản ứng acrosome ............................................................................................ 12
Hình 2.7 Các giai đoạn phát triển của phôi....................................................................... 14
Hình 3.1 Các loại trứng khác nhau ................................................................................... 17
Hình 4.1 Trứng trưởng thành với sự xuất hiện của thể cực thứ nhất................................ 26
Biểu đồ 4.2 So sánh tỉ lệ IVM giữa 4 nghiệm thức của thí nghiệm 1............................... 27
Biểu đồ 4.3 So sánh hiệu quả tác động của dịch nang trứng lên tỉ lệ IVM ...................... 28
Hình 4.4 Thể cực thứ 2 xuất hiện sau khi thụ tinh............................................................ 29
Hình 4.5 Một phôi dâu được tạo thành trong thí nghiệm ................................................. 30
Biểu đồ 4.6 Tỉ lệ các loại phôi ở nhóm nghiệm thức 4 giờ............................................... 30
Hình 4.7 Sự hình thành 2 tiền nhân sau khi thụ tinh ........................................................ 31
Biểu đồ 4.8 Tỉ lệ các loại phôi giữa 2 loại tinh................................................................. 32
Hình 4.9 Bản gel chụp dưới tia UV .................................................................................. 33

xii


Chương 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, kĩ thuật thụ tinh trong ống nghiệm được sử dụng ngày càng phổ biến. Với
kĩ thuật này người ta có thể rút ngắn thời gian chọn và nhân giống gia súc. Đối với bò, để
cấy được vào tử cung bò mẹ thì phôi phải đạt đến giai đoạn phôi dâu hoặc phôi nang.
Trong suốt quy trình, có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của trứng ở
giai đoạn đầu và phôi ở giai đoạn sau như điều kiện bảo quản trứng, môi trường nuôi
dưỡng, thông số làm việc của thiết bị nuôi cấy, loại tinh sử dụng, phương pháp hoạt hóa
tinh…
Trong các yếu tố kể trên, tôi chọn theo dõi ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ và thời
gian bảo quản buồng trứng, môi trường nuôi dưỡng và loại tinh sử dụng vì đây là các yếu
tố có thể kiểm soát chính xác và dễ dàng nhất. Đề tài này - “Khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng lên sản xuất phôi bò in vitro” – sẽ nghiên cứu những tác động đó.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Tạo được phôi bò bằng trứng thu từ buồng trứng thu ở lò mổ và tinh đông lạnh.
Nuôi phôi phát triển ít nhất đến giai đoạn phôi dâu.
Thử nghiệm sử dụng tinh phân tách giới tính (chỉ có tinh trùng mang nhiễm sắc thể
X) để sản xuất phôi bò in vitro.
1.3. Nội dung của đề tài
Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, thời gian bảo quản, loại trứng, môi
trường nuôi đến sự trưởng thành của trứng, sự thụ tinh và phát triển của phôi.
Khảo sát ảnh hưởng của loại tinh sử dụng đến tỉ lệ thụ tinh và phát triển của phôi.

1


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược lịch sử của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)
Bảng 2.1 Thành tựu về IVF ở động vật có vú

Edwards và cộng sự (1969)
Hammer và cộng sự (1970)

Loài nghiên cứu
Thỏ
Cừu
Chuột đồng
Trung Quốc
Chuột
Chuột đồng
Trung Quốc
Người
Mèo

Yanagimachi (1972)

Chuột lang

Gould và cộng sự (1973)
Miyamoto và Chang (1973)

Khỉ Rhesus
Chuột

Iritani và cộng sự (1975)

Lợn

Tác giả
Chang (1959)

Dauzler và Thibault (1959)
Yanagimachi và Chang
(1964)
Whittingham (1968)
Pickworth và Chang (1969)

Mahi và Yanagimachi
(1976)
Iritani và Niwa (1977)
Hanada và Chang (1978)
Hanada và Tsutsumi

Kết quả đạt được
Đẻ con
Tiền nhân
Thâm nhập, tiền nhân và phân
chia tế bào
Phân chia tế bào và thai
Thâm nhập và tiền nhân
Thâm nhập và tiền nhân
Phân chia tế bào
Thâm nhập, tiền nhân và phân
chia tế bào
Tiền nhân và phân chia tế bào
Thâm nhập và tiền nhân
Thâm nhập, tiền nhân và phân
chia tế bào

Chó

Thâm nhập (mở rộng đầu)

Bò
Cheo cheo
Dê

Thâm nhập và tiền nhân
Thâm nhập và tiền nhân
Thâm nhập

Trong năm 1959, Chang đã tạo một động vật có vú đầu tiên từ quá trình IVF trên
thỏ. Ở người, hơn 1000 cháu bé ra đời bằng IVF kể từ sau ca IVF đầu tiên thành công của
Steptoe và Edward (1978). Ở Nhật, thành công đầu tiên đã đến với nhóm nghiên cứu
thuộc bệnh viện Tổng hợp Tohoku (1983), tiếp đến là rất nhiều thành công của các bệnh
viện tổng hợp khác trong toàn quốc (Viện chăn nuôi, 2000).
Khi IVF ở người, tế bào nang trứng được lấy ra từ người mẹ bằng phương pháp nội
soi ngay trước kỳ trứng rụng, sau đó tế bào trứng này được cho thụ tinh với tinh trùng của
người chồng, nuôi cấy cho phát triển đến giai đoạn 4-8 tế bào và cấy trở lại vào tử cung
2


người mẹ. Phương pháp này được gọi là IVF-ET (In vitro Fertilization and Embryo
Transfer) vì nó gồm hai kỹ thuật: thụ tinh trong ống nghiệm và cấy truyền phôi.
Đã có nhiều công trình về IVF ở động vật có vú được công bố. Phần lớn đề cập đến
sự xâm nhập của tinh trùng vào trong tế bào trứng, việc tạo ra tiền nhân và sự bắt đầu
phân chia.
Quá trình IVF-ET được áp dụng đầu tiên trên người, và thí nghiệm nhiều trên động
vật (như chuột nhắt, chuột cống, thỏ) nhưng có rất nhiều báo cáo về sự thành công trên
đối tượng gia súc ở thập kỷ 80.
Bảng 2.2 Một số động vật có vú ra đời lần đầu tiên do IVF

Tác giả
Chang (1959)
Whittingham (1968)
Toyoda và Chang (1974)
Steptoe và Edwards (1978)
Brackett và cộng sự (1982)
Hanada (1985)
Hanada (1985)
Cheng và cộng sự (1986)

Loài nghiên cứu
Thỏ
Chuột
Chuột cống
Người
Bò
Dê Shiba
Cừu
Lợn

2.2. Các nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực của đề tài
2.2.1. Các nghiên cứu ngoài nước
Công nghệ sinh học sinh sản trong lĩnh vực chăn nuôi đã và đang được áp dụng rộng
rãi ở nhiều nước trên thế giới, nó được sử dụng như một công cụ chính để nhân nhanh đàn
gia súc chất lượng cao. Kỹ thuật cấy chuyển phôi (ET – Embryo Transfer) đã được thực
hiện thành công năm 1951 bởi Willet và cộng sự tại Mỹ. Sau đó, rất nhiều quốc gia trên
thế giới cố gắng áp dụng kỹ thuật này và đã đạt một số thành công nhất định. Do nhu cầu
thương mại về phôi trên thế giới, kỹ thuật ET được phát triển mạnh vào cuối những năm
1970 và đến những năm đầu thập kỷ 1990 đã vượt mức 150.000 phôi/năm. Trong năm
1999, đã có 714.356 phôi được thu thập từ những bò cái cao sản trên toàn thế giới và đã

có 520.712 phôi được sử dụng để cấy sang cho những bò cái khác. Trong số đó, châu Á
chỉ sản xuất được 10,5% phôi và chỉ sử dụng 9,6% số phôi trên thế giới. Mỹ và các nước
ở châu Âu là những nơi sản xuất và sử dụng nhiều phôi nhất trên thế giới. Ở châu Á, Nhật
3


Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc là một trong những nước áp dụng và triển khai thành công
công nghệ sinh học sinh sản trên gia súc. Chỉ tính riêng ở Nhật, số bê sinh ra bằng kỹ
thuật ET năm 2003 đã gấp 16 lần so với 10 năm trước (19.583 bê ET/2003 so với 1.202
bê ET/1993), và số bê sinh ra từ phôi in vitro hiện nay đã nhiều hơn số bê sinh ra từ phôi
in-vivo năm 1993. Một số quốc gia trong ASEAN như Thái lan, Indonesia, Philippines
cũng đã bắt đầu triển khai nghiên cứu các kỹ thuật này trên trâu Carabao và bò sữa từ
những năm đầu thập kỷ 1990 nhưng kết quả đạt được chưa cao.
Trong thí nghiệm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh trong ống
nghiệm, Fabian Ward và các cộng sự đã xem xét các yếu tố như khoảng thời gian nuôi
trứng đạt tới giai đoạn trưởng thành, thời gian ủ chung giữa tinh trùng và trứng và liều
lượng tinh trùng cho quá trình thụ tinh, tác giả đi đến kết luận là khoảng thời gian nuôi
trứng trưởng thành để thu được dạng blastocyte tối đa là 24 giờ; thời gian ủ chung giữa
tinh trùng và trứng là 10 giờ và liều lượng tinh trùng cho việc thụ tinh là 0,25 x 106 đến
0,5 x 106 tinh trùng/ 1ml.
Yếu tố kích thước của nang trứng bò cũng ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh trong
ống nghiệm. Theo Anne-Sophie Lequarre và các cộng sự thì các trứng thu được từ những
nang có kích thước ≥ 6mm thì luôn cho tỷ lệ tạo blastocyte cao hơn so với những trứng từ
những nang có kích thước ≤ 4 mm (Lê Công Thiện, 2008).
2.2.2. Các nghiên cứu trong nước
Bộ môn Cấy chuyển phôi thuộc Viện Chăn nuôi (Hà nội) đã và đang thực hiện các
nghiên cứu về cấy chuyển phôi trên bò sữa trong vài năm gần đây. Bước đầu đã thu được
một số kết quả khả quan như: sử dụng FSH và PGF2 gây đa xuất noãn đạt tỷ lệ khá với
3,3 phôi trên một lần thu phôi, 74,7% số phôi thu được có thể sử dụng cho việc cấy
truyền, tỷ lệ thụ thai đạt 40,7% khi sử dụng phôi tươi và 40,4% khi sử dụng phôi đông

lạnh, bê sinh ra từ kỹ thuật này sinh trưởng và phát triển tốt. Tuy nhiên, tất cả chỉ dừng ở
mức thử nghiệm kỹ thuật mới và chưa triển khai trên diện rộng được vì nhiều lý do như :
- Trang thiết bị và con người chưa được chuẩn bị đầy đủ.
- Tâm lý người chăn nuôi còn nhiều ngần ngại khi áp dụng kỹ thuật mới, nhất là khi
kỹ thuật này có hiệu quả thấp hơn và giá thành lại cao hơn so với kỹ thuật hiện đang
4


- Đàn bò sữa ở khu vực xung quanh Hà Nội chỉ chiếm khoảng 10% đàn bò sữa cả
nước nên việc triển khai trên diện rộng kỹ thuật này gặp nhiều trở ngại.
Tại TP. Hồ Chí Minh, việc thử nghiệm kỹ thuật cấy chuyển phôi mới bắt đầu được
nghiên cứu. Từ 2000-2002, Sở Khoa học và Công nghệ TP.Hồ Chí Minh đã tài trợ cho đề
tài “Nghiên cứu, ứng dụng công nghệ sản xuất và truyền cấy phôi nhằm nhân nhanh giống
bò sữa cao sản ở TP.Hồ Chí Minh”. Kết quả bước đầu cho thấy: tỉ lệ cấy phôi thụ thai là
27,45% (phôi tươi) và 29,51% (phôi đông lạnh ngoại nhập); Sử dụng Glycerol 10% làm
chất bảo vệ lạnh và áp dụng quy trình đông lạnh của Úc trên máy CL 2000 và giải đông
theo phương pháp 3 bước đạt kết quả tốt; Kết quả nuôi trứng chín (IVM) tốt với tỷ lệ
78,94% và tỷ lệ thụ tinh in vitro là 50,61% dựa vào sự phân chia của tế bào trứng đến giai
đoạn 2 tế bào; Tỷ lệ hợp tử phát triển đến phôi dâu và phôi nang là 32,37%; Đã cắt thành
công phôi dâu và phôi nang sớm và tỷ lệ phôi sống sau khi cắt đạt 56,66%. Ngoài ra, Sở
Khoa học và Công nghệ cũng tiếp tục tài trợ cho đề tài nghiên cứu “Tạo phôi bò sữa
(Blastocyst) bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm từ nguồn tế bào trứng cao sản
ngoại nhập và tinh trùng nội giống tốt”. Đề tài này được cấp kinh phí 723 triệu đồng trong
3 năm để tạo ra 100 phôi chất lượng cao, từ đó sản xuất 10 bê đực và 10 bê cái giống tốt.
Nhìn chung, việc áp dụng kỹ thuật cấy chuyển phôi trên chăn nuôi bò sữa trong nước
mới bắt đầu được nghiên cứu và đã đạt được một số kết quả bước đầu. Điều này cho thấy,
đội ngũ cán bộ kỹ thuật trong nước hoàn toàn có thể làm chủ kỹ thuật này nếu được đào
tạo và đầu tư nhiều hơn nữa. Ngoài ra, để triển khai trên diện rộng những kỹ thuật này
như một số nước khác hiện đang thực hiện, đòi hỏi phải thực hiện nhiều biện pháp đồng
bộ như: tăng cường đào tạo đội ngũ kỹ thuật, đầu tư đầy đủ cho phòng thí nghiệm, trang

thiết bị, thực hiện các biện pháp khuyến nông để thay đổi cách nhìn của người chăn nuôi
đối với kỹ thuật mới giống như chúng ta đã làm khi áp dụng kỹ thuật gieo tinh trên bò sữa
trong những năm 1980.
Nhóm nghiên cứu của thạc sĩ Phan Kim Ngọc – Khoa sinh trường ĐH Khoa Học Tự
Nhiên thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm trên bò sữa, đã tạo được 45 phôi đang được
giữ đông bằng nitơ lỏng. Họ hy vọng những phôi được tạo ra trong ống nghiệm sẽ mang

5


những đặc tính nổi trội, có lợi và thích nghi tốt nhất với điều kiện sống và môi trường của
Việt Nam (Chung Anh Dũng, 2007).
2.3. Thụ tinh trong ống nghiệm
2.3.1. Khái niệm thụ tinh trong ống nghiệm
Thụ tinh là quá trình kết hợp tế bào tinh trùng với tế bào trứng để tạo ra một tế bào
mới gọi là "hợp tử", hợp tử sẽ phát triển thành cơ thể mới. Quá trình kết hợp này thường
xẩy ra trong cơ thể mẹ và tại 1/3 phía trên của ống dẫn trứng.
Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF) là quá trình kết hợp giữa tinh
trùng với trứng để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ, tại phòng thí
nghiệm (trong hộp lồng, hộp petri). Tuy xảy ra ngoài cơ thể, nhưng các điều kiện cho quá
trình IVF như môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt .v.v... cùng các chỉ tiêu sinh học khác
phải giống như trong cơ thể mẹ.
2.3.2. Sinh lý sinh sản ở bò cái
2.3.2.1. Cấu tạo cơ quan sinh dục cái

Hình 2.1 Cơ quan sinh dục bò cái (Phan Vũ Hải, 2006).

6

Buồng trứng: tạo noãn (trứng), sản xuất các loại kích thích tố (estrogen,
progesterone...)
Ống dẫn trứng: vận chuyển giao tử (trứng, tinh trùng), nơi trứng được thụ tinh với
tinh trùng.
Thân tử cung và sừng tử cung: giữ và nuôi dưỡng phôi thai.
Cổ tử cung: ngừa vi sinh vật xâm nhập vào tử cung, dự trữ tạm thời và vận chuyển
tinh trùng.
Âm đạo: nơi giao phối, nơi tinh dịch được đặt vào khi phối giống.
Âm hộ: phần bên ngoài của đường sinh dục.
2.3.2.2. Sự phát triển nang noãn
Tại bất kì vị trí nào của lớp vỏ buồng trứng, có thể gặp các loại nang noan với các
giai đoạn phát triển khác nhau. Có 4 loại nang noãn trong buồng trứng. Nang noãn
nguyên thủy nhỏ nhất và noãn được bao bọc bởi một lớp tế bào vảy. Nang noãn nguyên
thủy phát triển thành nang noãn bậc một với đặc điểm là noãn được bao bọc bởi một lớp
tế bào biểu mô hình lập phương (tế bào nang). Khi được sinh ra, buồng trứng của thú cái
đã có sẵn các nang noãn nguyên thủy và nang noãn bậc một cho hoạt động sinh sản suốt
đời. Nang noãn bậc một có thể thoái hóa hoặc phát triển thành nang noãn bậc hai nếu trở
nên nhạy cảm với FSH. Nang noãn bậc hai có hai hoặc nhiều lớp tế bào nang nhưng
không có xoang nang (khoảng trống chứa dịch nang). Thông thường, noãn của nang noãn
bậc hai được bao bọc bởi một lớp trong suốt tương đối dày (vùng trong suốt). Nang noãn
có xoang được xem như nang noãn bậc ba, chứa dịch nang và có thể trở nên trội hẳn để
chuẩn bị xuất noãn (nang Graaf). Nang noãn có xoang tương tư như vết phỏng trên bề mặt
buồng trứng và có thể quan sát được bằng mắt thường. Kích thước của nang noãn có
xoang biến động khoảng nhỏ hơn 1 milimet đến vài centimet tùy theo giai đoạn phát triển
hoặc thoái hóa và tùy loài thú.
Nang noãn có xoang bao gồm 3 lớp: lớp bao ngoài, lớp bao trong và lớp tế bào hạt.
Lớp bao ngoài là mô liên kết lỏng lẻo. Lớp bao trong sản xuất androgen dưới ảnh hưởng
của LH (kích tố thể vàng). Lớp tế bào hạt tách rời lớp bao trong bỏi màng đáy mỏng. Tế

7

bào hạt sản xuất nhiều chất sinh học và trên bề mặt tế bào có thụ thể tiếp nhận LH. Những
chất quan trọng được sản xuất bởi tế bào hạt là estrogen, inhibin và dịch nang.
Khi nang Graaf xuất noãn, những mạch máu nhỏ bị vỡ và gây xuất huyết tại chỗ.
Sau khi xuất noãn, phần còn lại của nang noãn cùng với vết xuất huyết được gọi là thể
xuất huyết với kích thước nhỏ hơn nang noãn nhiều lần. Sau đó, tế bào của lớp bao trong
và tế bào hạt biệt hóa thành tế bào thể vàng. Thể vàng tiết progesterone, đó là kích thích
tố càn thiết để duy trì sự mang thai (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006).
2.3.3. Sinh lý sinh sản ở bò đực
2.3.3.1. Cấu tạo cơ quan sinh dục đực

Hình 2.2 Cơ quan sinh dục bò đực (Nguyễn Xuân Trạch và cộng sự, 2007).
Dịch hoàn: sản xuất tinh trùng, sản xuất kích thích tố (androgen).
Bao dịch hoàn: nâng đỡ dịch hoàn, kiểm soát nhiệt độ và bảo vệ dịch hoàn.
Dây treo dịch hoàn: nâng đỡ và kiểm soát nhiệt độ dịch hoàn.
Phó dịch hoàn: cô đặc lượng tinh trùng, dự trữ tinh trùng, trưởng thành tinh trùng và
vận chuyện tinh trùng.
Ống dẫn tinh: vận chuyển tinh trùng.
Ống dẫn tiểu: vận chuyển tinh dịch.
Túi tinh: đóng góp dịch chất, chất cung cấp năng lượng (fructose, sorbitol) và chất
đệm cho tinh dịch.
8


Tuyến tiền liệt: đóng góp dịch chất và ion vô cơ (natri, clo, magie) cho tinh dịch.
Tuyết Cowper: rửa nước tiểu đọng ở ống đái.
Dương vật: bộ phận giao phối.
Bao quy đầu: bao đầu dương vật.
2.3.3.2. Sự tạo thành tinh trùng

a. Thời kỳ tinh hoàn
So với trứng, tinh trùng nhỏ hơn nhiều. Nhà khoa học Kelliker (1817-1905) đã
chứng minh tinh trùng cũng là một tế bào.
Thành ống sinh tinh có chứa một số tế bào biểu mô mầm được gọi là các tinh
nguyên bào (tế bào sinh dục nguyên thuỷ). Khi động vật bước vào tuổi thành thục về tính
thì các tinh nguyên bào tiến hành giảm phân để tạo thành tinh trùng (trải qua hai lần phân
bào liên tiếp). Trước khi xảy ra quá trình giảm phân thì tinh nguyên bào (2n) đã trải qua
thời kì sinh trưởng để tạo thành tinh bào cấp I (2n). Tinh bào cấp I tiến hành phân chia
giảm nhiễm lần thứ nhất để tạo ra hai tế bào con như nhau được gọi là tinh bào cấp II (n).
Tinh bào cấp II tiếp tục phân chia lần thứ hai để tạo ra bốn tinh tử đơn bội. Các tế bào này
không còn phân chia nữa và biến thành những tinh trùng hoạt động, trong đó có 2 tinh
trùng mang NST giới tính X và 2 tinh trùng mang NST giới tính Y. Điều đó nói lên rằng
số lượng hai loại tinh trùng là bằng nhau. Tất cả các giai đoạn hình thành tinh nguyên bào,
tiền tinh trùng và tinh trùng đều xảy ra tại tế bào sertoli. Tế bào này trực tiếp nuôi dưỡng,
bảo vệ và kiểm soát quá trình sinh sản của tinh trùng.
b. Thời kì mào tinh
Trong thời kì này tinh trùng ở trạng thái ức chế bởi vì trao đổi chất của nó bị giảm và
chúng không có đủ chất dinh dưỡng (fructose). Trong cơ thể sống chúng nằm bất động và
chồng sít lên nhau trong những đoạn nhất định của ống mào tinh. Thời gian lưu lại ở phụ
dịch hoàn, tinh trùng tiếp tục phát dục và hoàn thiện (được xem như là quá trình thành
thục sinh dục). Chất tiết của phụ dịch hoàn ít chất điện giải nên tinh trùng sống lâu hơn,
màng bán thấm được hình thành, đuôi cũng được hoàn thiện. Tinh trùng ở mào tinh nằm
chờ đợi và được xuất ra ngoài nhờ có phản xạ phóng tinh của con đực, nếu không được
xuất ra thì tinh trùng đó bị già cỗi và tiêu biến.
9


Người ta tính được thời gian hình thành tinh trùng khoảng 53-69 ngày.

Hình 2.3 Sơ đồ (A) và hình vẽ (B) về quá trình sinh tinh (Nguyễn Xuân Trạch và

cộng sự, 2007). A: gián phân giảm số;B: gián phân nguyên số; 1: tinh nguyên bào (2n NST); 2:
tinh bào I (2n NST); 3: tinh bào II (n NST); 4: tiền tinh trùng (n NST với X hoặc với Y).

2.3.3.3. Cấu tạo của tinh trùng
Tinh trùng gồm 3 phần chính: đầu, thân và đuôi. Thành tố chính của đầu là nhân
chứa ADN bao bọc bởi một màng nhân có sức kháng cao. Phía trên đầu được phủ bởi
acrosome có chứa một số enzyme phân giải protein và enzyme hyaluronidase rất quan
trọng trong quá trình thụ tinh. Phần sau nhân được bao phủ bởi mũ nhân và trên toàn bộ
cấu trúc này, kể cả thân và đuôi, là một màng nguyên sinh chất mỏng.
Phần thân dày có chứa một phần nhân chứa ty lạp thể cần thiết cho hô hấp và quá
trình trao đổi chất. Đuôi chứa một số sợi dọc, được bao bọc bởi sợi ty lạp thể của phần
thân. Tinh trùng chứa rất ít các chất khác ngoài vật chất di truyền cần thiết cho thụ tinh, vì
vậy nó phải dựa vào nguồn dinh dưỡng của môi trường để lấy năng lượng.

10


Hình 2.4 Cấu tạo tinh trùng (Nguyễn Xuân Trạch và cộng sự, 2007).
2.3.4. Sinh lý quá trình thụ tinh
2.3.4.1. Sự hoạt hóa tinh trùng

Hình 2.5 Quá trình hoạt hóa tinh trùng trong đường sinh dục cái (Phan Vũ Hải, 2006).

11


Sự hoạt hóa tinh trùng là sự thay đổi sinh hóa xảy ra đối với tinh trùng nhằm tạo điều
kiện cho phản ứng acrosome xảy ra. Sự thay đổi này có thể xảy ra trong đường sinh dục
của con cái hoặc trong điều kiện in vitro.
2.3.4.2. Sự thụ tinh

Các bước quan trọng trong quá trình thụ tinh gồm: tinh trùng xâm nhập qua vùng tia
(lớp tế bào hạt), tinh trùng kết dính vùng trong suốt, phóng thích enzyme từ acrosome của
tinh trùng, xâm nhập vùng trong suốt và kết dính màng bao noãn, chuyển nhân của tinh
trùng vào noãn và ngăn cản sự xâm nhập của tinh trùng khác.
Chỉ một tinh trùng thụ tinh một noãn. Tuy nhiên cần có lượng lớn tinh trùng để tạo
ra đường xuyên qua vùng tia, khi ấy một tinh trùng đi đến vùng trong suốt. Enzyme của
acrosome tách mối nối giữa các tế bào hạt của vùng tia để tạo đường qua vùng tia.
Vùng trong suốt chưa glycoprotein để tạo nên màng sợi ba chiều trên bề mặt màng
noãn bào. Khi tinh trùng tiếp xúc vùng trong suốt, các nối liên kết được tạo nên giữa
protein của màng tinh trùng và điểm kết dính của glycoprotein. Điều này làm phóng thích
enzyme của acrosome (phản ứng acrosome). Các enzyme này thủy phân glycoprotein của
vùng trong suốt và tạo nên một kênh mà qua đó tinh trùng có thể tiến tới nhờ cử động của
đuôi. Tinh trùng chỉ cần vài phút để xâm nhập vùng trong suốt.

Hình 2.6 Phản ứng acrosome (Phan Vũ Hải, 2006).

12


Khi tinh trùng đã xâm nhập vào vùng trong suốt và đến màng noãn bào, một phần
nhỏ của màng ở đầu tinh trùng hòa lẫn với màng noãn bào và tinh trùng được đưa vào
trong. Noãn được thụ tinh và thành lập hợp tử. Ngay sau khi hòa lẫn với tinh trùng, màng
noãn bào khử cực nên giảm khả năng xâm nhập của tinh trùng khác. Sự khử cực này làm
tăng hàm lượng Ca2+ trong tế bào chất của hợp tử và phóng thích enzyme từ hạt vỏ
(những hạt nằm sát trong màng noãn bào). Các enzyme này gây thay đổi cấu trúc
glycoprotein của vùng trong suốt để ngăn cản sự xâm nhập của tinh trùng khác. Nếu hiện
tượng đa tinh trùng xảy ra, hợp tử không thể phân chia và chết.
2.3.5. Các giai đoạn phát triển của phôi
Hợp tử bắt đầu phân chia ngay khi nó được tạo nên. Đây là một tế bào khổng lồ với
nhiều tế bào chất và nhân nhỏ. Ở gia súc, tế bào bắt đầu phân chia mỗi 24 giờ. Sau khi thụ

tinh 5 ngày, khối tròn chứa tế bào chưa biệt hóa gọi là phôi dâu (morula). Sau 1-2 ngày
nữa, phôi nang (blastocyst) được thành lập. Phôi nang hình cầu với xoang chứa đầy dịch
chất và vẫn được bao bọc bởi vùng trong suốt. Ở giai đoạn tiếp theo, tế bào biệt hóa để
tạo các mô và cơ quan. Giai đoạn phôi hoàn tất khi cơ thể đã có hình dáng đặc trưng của
loài và các cơ quan được tạo. Ở gia súc, giai đoạn phôi chiếm 20-30% thai kì. Trong giai
đoạn còn lại (giai đoạn thai), các cơ quan tăng trưởng.
Các giai đoạn phát triển của phôi bò:
- 2 tế bào: 1 ngày
- 4 tế bào: 1,5 ngày
- 8 tế bào: 3 ngày
- Phôi dâu: 5 ngày
- Phôi nang: 7-8 ngày
- Phôi thoát màng: 9-11 ngày

13