THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH
LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE
DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: PHẠM NGỌC KHÔI

Niên khoá

: 2005 – 2009

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH
LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE
DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

Th.S NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN

PHẠM NGỌC KHÔI

PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến:
Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng với các
Thầy Cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt bốn năm học vừa qua tại Trường.
Ban Chủ nhiệm Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM đã luôn tạo mọi
điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp này.
Th.S Nguyễn Khắc Hân Hoan và PGS.TS. Trần Thị Dân đã tận tình hướng
dẫn, truyền đạt những kiến thức quý giá và chân thành động viên tôi trong khoảng
thời gian thực hiện Khóa luận tốt nghiệp này.
Tập thể Y – Bác sĩ, Thầy Cô và Anh Chị – Phòng Di truyền đã tận tâm chỉ
bảo, đóng góp nhiều ý kiến quý báu, hết lòng hỗ trợ và đã cầm tay chỉ việc cho tôi
trong suốt khoảng thời gian thực hiện Khóa luận này tại Phòng Di truyền.
TS. Trần Vân Khánh (Labo Trung tâm Y Sinh học – Đại học Y Hà Nội), Th.S

Nguyễn Thị Băng Sương (Bộ môn Hóa sinh – Đại học Y khoa Huế), Th.S Ngô
Diễm Ngọc (Bệnh viện Nhi Trung ương), KS. Nguyễn Thị Phương Mai (Bệnh viện
Nhi Trung ương), Th.S Thái Hạnh Quyên (Công ty TNHH BCE Việt Nam) và Ông
Robert Schuit (MRC – Holland, Amsterdam, Hà Lan) đã nhiệt tình góp ý, truyền đạt
những kinh nghiệm quý giá để tôi có thể hoàn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp này.
CN. Phan Thị Thùy Ngân, BS. Nguyễn Minh Đức và Anh Chị tại Trung tâm Y
khoa Phước An (HEPA) đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi vào thời điểm cuối của Khóa luận.
Tập thể lớp DH05SH cùng với những người bạn thân của tôi, những người
bạn đã gắn bó, chia sẻ cùng tôi những buồn vui trong suốt quá trình học tập của tôi
cũng như đã hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện Khóa luận này.
Và trên tất cả là lời ghi ơn sâu sắc nhất xin được dành cho Ba Mẹ đã sinh
thành, dưỡng dục, dạy dỗ để tôi có được như ngày hôm nay, với tất cả sự kính
trọng, niềm tự hào và lòng biết ơn chân thành nhất.
TP.HCM, ngày 25 tháng 08 năm 2009
Phạm Ngọc Khôi

iii


TÓM TẮT
Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một trong
những bệnh thần kinh – cơ di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3500 trẻ
trai đẻ sống. Bệnh DMD có bản chất là do đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc
thể giới tính X. Hơn 65% trường hợp là đột biến mất hoặc lặp đoạn gen. Kỹ thuật
MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả.
Mục tiêu: Sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính trước
chẩn đoán đột biến DMD và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện
đột biến mất đoạn gen DMD.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hai mươi mẫu DNA của bệnh nhân
được dùng để xác định giới tính và hai mươi mẫu DNA của bệnh nhân được chẩn

đoán lâm sàng là bệnh DMD/BMD và đã được phát hiện đột biến mất đoạn gen
bằng multiplex PCR. Bảy mươi chín exon của gen được khảo sát bằng kit SALSA®
MLPA® P034 – A2 và P035 – A2, điện di mao quản bằng CEQTM 8000 và phân tích
tự động bằng phần mềm Gene Marker.
Kết quả: Đã hoàn thiện kỹ thuật multiplex PCR để xác định giới tính và
phương pháp MLPA cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột
biến, kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh và có độ lặp lại cao. Tất cả exon
của gen DMD bị mất đều được khẳng định trên biểu đồ kết quả. Bộ ba multiplex
PCR chẩn đoán trước đó chỉ khảo sát được hai mươi lăm exon và có những exon
không được phát hiện so với MLPA.
Kết luận: Kỹ thuật multiplex PCR dùng để xác định giới tính chính xác, đặc
hiệu; và phương pháp MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến
mất đoạn gen DMD và ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR.

iv


SUMMARY
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common genetic
neuromuscular disorders affecting 1/3500 live man births. DMD is caused by
mutation in the X – linked dystrophin gene. More than 65% of cases are deletion or
duplication mutation. Recently, MLPA is described as an effective method to detect
these mutations.
Objective: To set up multiplex PCR that determines the sex and evaluate the
effectiveness of MLPA in detecting DMD gene deletion mutations.
Method: Twenty DNA samples of patient that were used to determine the sex
and twenty DNA samples of patient having clinical signs of DMD/BMD detected
the deletion mutations by multiplex PCR, which were tested for seventy nine exons
with SALSA® MLPA® P034 – A2 and P035 – A2 kit, capillary electrophoresis with
CEQTM 8000 and automated analysis with Gene Marker software.

Results: The multiplex PCR method to determine the sex and the MLPA
protocol to detect the size of DNA fragment lost were optimized. The techniques are
easy, visual, rapid and reproducible. All deleted exons were present in
electropherogram results. The previous set of three multiplex PCR only detects twenty
five exons and some exons can not be found by this set in comparison with MLPA.
Conclusion: The multiplex PCR method determined the sex exactly and
specifically; and the MLPA helps to rapid detect all deletions of DMD gene and has
more advantage than the multiplex PCR.

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .................................................................................................................iii
Tóm tắt ....................................................................................................................... iv
Summary ..................................................................................................................... v
Mục lục....................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt........................................................................................... x
Danh sách các hình.................................................................................................... xii
Danh sách các biểu đồ và lưu đồ..............................................................................xiii
Danh sách các bảng.................................................................................................. xiv
Chương 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1.

Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1

1.2.

Yêu cầu nghiên cứu......................................................................................... 2

1.3.

Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1.

Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD...................................................................... 3

2.2.

Tổng quan về bệnh DMD............................................................................... 3

2.3.

Nguyên nhân gây bệnh................................................................................... 6

2.3.1. Gen dystrophin và các sản phẩm của nó ........................................................ 6
2.3.2. Chức năng của dystrophin............................................................................ 10
2.4.

Phương pháp chẩn đoán bệnh DMD ............................................................ 11

2.4.1. Phương pháp chẩn đoán điện ....................................................................... 11
2.4.1.1. Đo tốc độ dẫn truyền vận động .................................................................... 11
2.4.1.2. Điện cơ ......................................................................................................... 11
2.4.2. Kiểm tra creatine kinase............................................................................... 11
2.4.3. Sinh thiết cơ.................................................................................................. 12

vi


2.4.4. Hóa mô miễn dịch ........................................................................................ 12
2.4.5. Western blot ................................................................................................. 12
2.5.

Chẩn đoán di truyền phân tử ........................................................................ 13

2.5.1. Multiplex PCR ............................................................................................. 13
2.5.2. Southern blot ................................................................................................ 14
2.5.3. DGGE........................................................................................................... 14
2.5.4. MAPH .......................................................................................................... 15
2.5.5. MLPA........................................................................................................... 15
2.5.6. Phân tích liên kết gen ................................................................................... 17
2.5.6.1. RFLP ............................................................................................................ 17
2.5.6.2. STR .............................................................................................................. 18
2.5.7.

FISH ............................................................................................................. 18

2.5.8.

RT – PCR ..................................................................................................... 18

2.5.9.

PTT............................................................................................................... 20

2.6.

Chẩn đoán trước sinh ................................................................................... 20

2.7.

Điều trị ......................................................................................................... 20

2.8.

Tổng quan nghiên cứu bệnh DMD trên thế giới.......................................... 21

2.9.

Tổng quan nghiên cứu bệnh DMD tại Việt Nam......................................... 21

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 26
3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................ 26

3.2.

Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 26

3.3.

Vật liệu ......................................................................................................... 26

3.3.1.

Xác định giới tính bằng multiplex PCR....................................................... 26

3.3.1.1. Mẫu bệnh phẩm............................................................................................ 26
3.3.1.2. Mồi ............................................................................................................... 26
3.3.1.3. Hóa chất cho tách chiết DNA ...................................................................... 27
3.3.1.4. Hóa chất cho phản ứng multiplex PCR........................................................ 27
3.3.1.5. Hóa chất cho điện di trên gel agarose .......................................................... 27

vii


3.3.1.6. Thiết bị – Dụng cụ ....................................................................................... 28
3.3.2.

Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA ................................ 29

3.3.2.1. Mẫu bệnh phẩm............................................................................................ 29
3.3.2.2. SALSA® MLPA® Kit P034 – A2 / P035 – A2 DMD / Becker ................... 29
3.3.2.3. Hóa chất cho điện di mao quản trên máy CEQTM 8000 ............................... 30
3.3.2.4. Thiết bị – Dụng cụ ....................................................................................... 31
3.4.

Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 31

3.4.1.

Xác định giới tính bằng multiplex PCR....................................................... 31

3.4.1.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu .................................................................... 31
3.4.1.2. Phương pháp tách chiết DNA ...................................................................... 32

3.4.1.3. Phương pháp multiplex PCR ....................................................................... 32
3.4.1.4. Đảm bảo chất lượng phản ứng ..................................................................... 33
3.4.1.5. Phương pháp điện di trên gel agarose .......................................................... 34
3.4.2.

Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA ................................ 34

3.4.2.1. Bảo quản mẫu............................................................................................... 34
3.4.2.2. Phương pháp MLPA .................................................................................... 34
3.4.2.3. Đảm bảo chất lượng phản ứng ..................................................................... 36
3.4.2.4. Điện di MLPA bằng hệ thống điện di mao quản CEQTM 8000.................... 36
3.4.2.5. Phương pháp phân tích kết quả.................................................................... 37
3.4.3.

Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh .............................................................. 37

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 38
4.1.

Kết quả ......................................................................................................... 38

4.1.1. Xác định giới tính bằng multiplex PCR ....................................................... 38
4.1.2. Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA................................. 42
4.1.3. Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh .............................................................. 51
4.2.

Thảo luận...................................................................................................... 51

4.2.1. Xác định giới tính bằng multiplex PCR ....................................................... 51
4.2.2. Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA................................. 52

viii


4.2.3. Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh .............................................................. 55
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................ 57
5.1.

Kết luận ........................................................................................................ 57

5.2.

Đề nghị ......................................................................................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 59
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 62

ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BMD

Becker muscular dystrophy

bp

base pair

cDNA

complementary deoxyribonucleic acid

CK

creatine kinase

DGGE

Denaturing gradient gel electrophoresis

DMD

Duchenne muscular dystrophy

DMSO

dimethyl sulfoxide

DNA

deoxyribonucleic acid

DSCP

Double strand conformation polymophism

dATP

2’ – deoxyadenosine – 5’ – triphosphate

dCTP

2’ – deoxycytidine – 5’ – triphosphate

dGTP

2’ – deoxyguanosine – 5’ – triphosphate

dNTP

2’ – deoxyribonucleotide – 5’ – triphosphate

dTTP

2’ – deoxythymidine – 5’ – triphosphate

EDTA

ethylene diamine tetraacetic acid

FISH

Fluorescent in situ hybridization

HDA

Heteroduplex analysis

kb

kibobase

MAPH

Multiplex amplifiable probe hybridisation

MK

marker

MLPA

Multiplex ligation-dependent probe amplification

mRNA

messenger ribonucleic acid

NIL

nihil (Latin), nothing hay zero

NST

nhiễm sắc thể

nt

nucleotide

OD

optical density

PCR

Polymerase chain reaction

x


PTT

Protein truncation test

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

RNA

ribonucleic acid

RT – PCR

Reverse transcriptase – PCR

STR

Short tandem repeat

SNP

Single nucleotide polymorphism

SSCP

Single strand conformation polymophism

STT

số thứ tự

Taq

Thermus aquaticus

tt

tiếp theo

UV

ultraviolet

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang
Hình 2.1 Kiểu di truyền của bệnh DMD ..................................................................4
Hình 2.2 Chuyển đoạn Xp21 giữa NST X và NST 21 .............................................5
Hình 2.3 So sánh giữa dạng bình thường với DMD và BMD..................................6
Hình 2.4 Vị trí protein dystrophin trên mặt trong màng tế bào cơ vân. ...................7
Hình 2.5 Vị trí locus Xp21 .......................................................................................7
Hình 2.6 Chuỗi gen dystrophin.................................................................................9
Hình 2.7 Dystrophin liên kết với phức hệ glycoprotein định vị ở màng bao cơ ....10
Hình 2.8 So sánh kỹ thuật MLPA với các kỹ thuật sinh học phân tử khác............16
Hình 2.9 Quy trình kỹ thuật MLPA........................................................................17
Hình 2.10 Thủ thuật chọc ối .....................................................................................20
Hình 3.1 Bộ ly trích DNA của Roche.....................................................................27
Hình 3.2 Máy ly tâm...............................................................................................28
Hình 3.3 Máy ủ nhiệt ..............................................................................................28
Hình 3.4 Máy định lượng DNA..............................................................................28
Hình 3.5 Máy luân nhiệt .........................................................................................28
Hình 3.6 Bể điện di.................................................................................................29
Hình 3.7 Máy chụp hình gel ...................................................................................29
Hình 3.8 Các bộ hóa chất cho điện di mao quản ....................................................30
Hình 3.9 Máy CEQTM 8000 ....................................................................................31
Hình 3.10 Hệ thống 8 mao quản...............................................................................31
Hình 3.11 Đĩa đựng mẫu ..........................................................................................31
Hình 3.12 Nắp đĩa Buffer .........................................................................................31
Hình 3.13 Wetting Tray............................................................................................31
Hình 3.14 Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản CEQTM 8000........36

xii


Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu máu ......39

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu ối..........41
Hình 4.3 Kết quả đột biến mất exon bằng ba bộ multiplex A, B và C...................43
Hình 4.4 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P034 – A2 (1)...................47
Hình 4.5 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P034 – A2 (2)...................47
Hình 4.6 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P035 – A2 (1)...................48
Hình 4.7 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P035 – A2 (2)...................48
Hình 4.8 Kết quả phân tích mẫu chứng nam bằng Probemix P034 – A2...............49
Hình 4.9 Kết quả phân tích mẫu chứng nam bằng Probemix P035 – A2...............49

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ LƯU ĐỒ
BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1 Vùng mất đoạn các exon của gen DMD................................................51
LƯU ĐỒ
Trang
Lưu đồ 4.1 Lưu đồ tư vấn và tầm soát trước sinh bệnh DMD.................................56

xiii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Trình tự 4 đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng multiplex PCR........27
Bảng 3.2 Thành phần bộ kit SALSA® MLPA® (100 phản ứng).............................30
Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng multiplex PCR xác định giới tính .................33
Bảng 3.4 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR .................................33
Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng MLPA ..............................................35
Bảng 4.1 Danh sách bệnh nhân làm bộ NST đồ karyotype ....................................38
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát gen SRY của bệnh nhân làm karyotype.......................39
Bảng 4.3 Danh sách thai nhi làm kỹ thuật FISH.....................................................40

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát gen SRY của thai nhi làm kỹ thuật FISH ....................41
Bảng 4.5 Danh sách gia đình mắc DMD cùng với đột biến đã chẩn đoán .............42
Bảng 4.6 Kích thước của 25 exon được khuếch đại trong 3 bộ multiplex PCR .....42
Bảng 4.7 Danh sách 18 bệnh nhân DMD cùng với đột biến đã chẩn đoán ............43
Bảng 4.8 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P034 – A2....................................44
Bảng 4.9 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P035 – A2....................................45
Bảng 4.10 Danh sách bệnh nhân DMD bị đột biến mất exon (MLPA)....................50
Bảng 4.11 Tần suất mất đoạn các vùng exon của gen DMD ....................................50

xiv


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một
bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính. Bệnh gây nên bởi sự đột biến gen dystrophin,
gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST X, và đến bây giờ chúng được biết như là một gen
lớn nhất trong cơ thể người với chiều dài hơn 2400 kb, mã hóa bản phiên mã mRNA
dài 14 kb, bao gồm 79 exon và 99,4% cấu trúc gen là intron. Protein mã hóa bởi gen
này là dystrophin với khối lượng phân tử là 427 kDa, có chức năng chính trong việc
duy trì sự ổn định của màng cơ. Bệnh DMD là bệnh cơ rất nặng, hầu hết những trẻ trai
mắc bệnh đều có triệu chứng suy yếu cơ tiến triển, cuối cùng dẫn đến tàn phế, mất khả
năng đi lại ở lứa tuổi 12 và tử vong ở lứa tuổi 20 – 25 do tổn thương cơ tim và rối loạn
hô hấp.
Bệnh DMD chiếm tỷ lệ cao nhất trong số nhóm bệnh di truyền về thần kinh cơ
(1/3500 trẻ trai) và gây hậu quả nặng nề cho gia đình người bệnh cùng cộng đồng xã
hội. Cho đến nay bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định hoàn tất
với hai vùng đột biến mất đoạn trọng điểm (hotspot region) là vùng 5’ tận cùng (vùng
exon 3 – 19) và vùng trung tâm (vùng exon 45 – 52) chiếm trên 60% tỷ lệ đột biến, đột

biến điểm đứng thứ 2 chiếm 25 – 30%, còn lại là đột biến lặp đoạn chiếm tỷ lệ khoảng
10 – 15%.
Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu ở mức độ phân tử. Tuy nhiên, do khó khăn
trong việc tách chiết RNA tổng số từ máu tươi, những nghiên cứu này mới chỉ xác
định đột biến ở mức DNA. Do chỉ mới sử dụng 19 cặp mồi để khuếch đại 19 exon hay
xảy ra đột biến mất đoạn nên kết quả chỉ phát hiện được gần 40% số bệnh nhân có đột
biến mất đoạn so với tỷ lệ thường gặp là 60%. Điều này chứng tỏ rằng khoảng 20%
đột biến nằm ở ngoài vùng 19 exon hay xảy ra đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD
được nghiên cứu ở Việt Nam.
Trong khi đó nếu chẩn đoán bệnh DMD bằng kỹ thuật MLPA (Multiplex
ligation-dependent probe amplification) thì có thể khuếch đại được toàn bộ chiều dài
gen dystrophin. Xác định đột biến bằng kỹ thuật MLPA có thể xác định được toàn bộ
đột biến mất đoạn và lặp đoạn trên gen dystrophin ở bệnh nhân DMD. Bên cạnh đó, vì
1


bệnh DMD hầu hết chỉ xảy ra ở các trẻ trai vì thế nếu xây dựng được quy trình xác
định giới tính thì ta có thể sàng lọc được bệnh ở giai đoạn đầu mà không cần đến việc
phải chẩn đoán đột biến về sau.
Việt Nam hiện có tần suất bệnh khá cao, chi phí điều trị lại quá lớn trong khi
nước ta nguồn lực lại có hạn vì thế không thể nào kham nổi chi phí này. Do đó, chẩn
đoán trước sinh là biện pháp hiệu quả làm giảm gánh nặng bệnh tật lên xã hội. Vì thế
việc thành lập một chương trình phòng chống bệnh DMD với những kỹ thuật di truyền
thích hợp tại Việt Nam là hết sức cần thiết.
Hiện tại, Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM đang bắt đầu triển khai
áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định các đột biến gây bệnh DMD trong
chẩn đoán trước sinh. Khóa luận này nằm trong khuôn khổ của nghiên cứu trên, được
thực hiện tại Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM từ ngày 05/02/2009 đến
ngày 05/06/2009 và được mang tên là “Thiết lập kỹ thuật chẩn đoán bệnh loạn dưỡng
cơ Duchenne dựa trên phản ứng PCR”.

1.2. Yêu cầu nghiên cứu
Khóa luận này được tiến hành với mục tiêu xây dựng quy trình xác định chính
xác giới tính thai nhi và quy trình MLPA phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Xây dựng protocol cho phản ứng multiplex PCR xác định giới tính thai nhi.
Sử dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán các loại đột biến gen dystrophin gây nên
bệnh DMD, và so sánh kết quả chẩn đoán bằng MLPA với kết quả chẩn đoán trước đó
của Bệnh viện Nhi Trung ương dùng kỹ thuật multiplex PCR với 25 cặp mồi đặc hiệu.
Thiết lập quy trình chẩn đoán bệnh DMD trước sinh.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD
Bác sĩ Edward Meryon người Anh là người đầu tiên đã mô tả chi tiết về 8 trẻ trai
trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà hiện nay gọi là bệnh DMD. Đến năm 1861,
nhà thần kinh học người Pháp Guillaume Benjamin Amand Duchenne mô tả dạng giả
phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai, phân biệt với các bệnh cơ khác
nhau và sau đó, bệnh được mang tên ông. Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen
dystrophin đã được phát hiện đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 2400 kb. Đến nay,
cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen
đã và đang được các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt
nhất khắc phục hậu quả nặng nề của bệnh.
2.2. Tổng quan về bệnh DMD
Theo Nguyễn Hữu Công (2006), bệnh DMD nằm trong nhóm bệnh loạn dưỡng cơ
với năm đặc trưng: bệnh có tính di truyền; tất cả các triệu chứng đều là do yếu cơ gây
nên, không có biểu hiện của mất phân bố thần kinh, không rối loạn cảm giác; yếu cơ
tăng tiến không ngừng; các triệu chứng chủ yếu khu trú ở các cơ vân, đôi khi cũng có

thể gặp ở cơ trơn và cơ tim; mô học chỉ có biểu hiện bệnh của tế bào cơ (thoái hóa và tái
sinh tế bào cơ) mà không có hiện tượng tích lũy các sản phẩm chuyển hóa bất thường.
Bệnh DMD do rối loạn gen DMD nằm trên nhiễm sắc thể X. Đặc trưng của bệnh là
thoái hóa cơ không ngừng và không hồi phục, khởi đầu từ những thay đổi vi mô ở các cơ,
cơ không cân xứng ở hai bên, sức cơ yếu dần, cuối cùng là liệt mềm và xơ hóa của cơ.
Bệnh có đặc điểm di truyền gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể X. Cá thể nữ 46,XX
mang gen bệnh là người có một NST X mang gen đột biến. Người nữ mang gen
thường không biểu hiện bệnh nhưng lại có 50% khả năng truyền gen đột biến này cho
con trai hoặc cho con gái. Một số trường hợp hiếm có thể gặp bé gái có biểu hiện bệnh
do bé gái đó chỉ có một NST X (hội chứng Turner – 45,X), hay do hiện tượng bất hoạt
của NST X bình thường còn lại của cặp XX.

3


Ở cá thể nam 46,XY chỉ có một NST X. Nếu NST X mang gen đột biến thì cá thể
nam sẽ có biểu hiện bệnh ở các mức độ như trên. Hầu hết các trường hợp con trai bị
bệnh là do thừa hưởng NST X mang gen đột biến từ mẹ.
Mẹ mang gen bệnh DMD Bố bình thường

Con gái bình thường Con gái mang gen Con trai bình thường Con trai bị bệnh
(25%)
(25%)
(25%)
(25%)
Hình 2.1 Kiểu di truyền trong bệnh DMD (Nguồn: www.uptodateonline.com).
Ngoài ra, cũng có trường hợp con trai bị bệnh DMD trong khi mẹ là người hoàn
toàn bình thường không mang gen đột biến. Đó là do đột biến gen mới phát sinh trong
quá trình tạo giao tử, xảy ra khoảng 1/3 trường hợp bệnh (Emery, 1993).
Có thể có hai cách giải thích cho một gia đình không có tiền sử mắc bệnh DMD

lại bất ngờ có một đứa con bị mắc chứng bệnh này: đột biến gen đã xảy ra và lưu hành
trong số các phụ nữ của gia đình trong nhiều thế hệ mà không ai hay biết, không có
một trẻ trai nào của các đời thế hệ trước đó sinh ra mắc bệnh hoặc nếu có mắc bệnh
nhưng lại không hay chưa được chẩn đoán phù hợp; trẻ bị bệnh DMD là do thừa
hưởng một đột biến mới, chỉ nảy sinh từ một trong các tế bào noãn của quá trình tạo
trứng của mẹ.
Khi sinh con ra với chứng DMD, bao giờ cũng có thể có khả năng là trên tế bào
noãn bị đột biến gen dystrophin khiến người mẹ này có nguy cơ cao hơn mức bình
thường về việc truyền gen đột biến cho một đứa con khác nữa. Một khi sự đột biến

4


mới được chuyển qua cho đứa con trai hay con gái, em này có thể chuyển nó cho thế
hệ kế tiếp.
Cá thể nam bị bệnh DMD không thể nào chuyển các gen bất thường cho con trai
vì con trai chỉ nhận NST Y từ bố. Thế nhưng, chắc chắn là ông ta sẽ truyền gen đột
biến cho con gái vì con gái chỉ nhận NST X từ bố. Và như thế những người con gái
này sẽ là người mang mầm bệnh và mỗi người con trai của họ có 50% nguy cơ bị mắc
bệnh và cứ thế tiếp diễn.
Khi một trẻ gái thừa kế gen DMD từ người mẹ, thì đồng thời trẻ cũng có được
gen dystrophin tốt từ người bố, nhờ vậy em có đầy đủ protein để bảo vệ mình không bị
mắc bệnh. Các trẻ trai một khi thừa kế sự đột biến sẽ mắc bệnh ngay vì rằng cơ thể các
em không có gen dystrophin thứ hai để bù đắp cho gen bị khiếm khuyết.
Thực tế lâm sàng cho thấy một số phụ nữ mang gen đột biến cũng bị ảnh hưởng
với biểu hiện lâm sàng ở dạng nhẹ hơn. Ở các phụ nữ này, tình trạng khiếm khuyết
dystrophin có thể làm cho các cơ bị yếu ở vùng lưng, chân và tay khiến rất dễ bị mỏi.
Ngoài ra còn có thể có các triệu chứng về tim như cảm giác bị hụt hơi hay không thể
thực hiện được các động tác thể dục vừa phải, đôi khi có thể trở nên rất nghiêm trọng.

NST 21

NST 21

NST X

NST X
Bình thường

Chuyển đoạn

Hình 2.2 Chuyển đoạn Xp21 giữa NST X và NST 21 (Một trường hợp làm mất gen
dystrophin trên Xp21 mã hóa cho protein dystrophin) (Nguồn: www.cbs.dtu.dk).

5


Một thể nhẹ hơn DMD là bệnh loạn dưỡng cơ Becker (Becker muscular
dystrophy, BMD) cũng do đột biến gen DMD gây ra. Bệnh BMD thường khởi phát ở
tuổi thiếu niên và diễn tiến bệnh thường chậm hơn.
Chất nền ngoại bào
Bình thường

BMD

Dystrophin

Actin
DMD

Hình 2.3 So sánh giữa dạng bình thường với DMD/BMD (Nguồn: www.humgen.nl).
2.3. Nguyên nhân gây bệnh
Năm 1986, nguyên nhân bệnh đã được xác định là do sự đột biến tại locus định
vị Xp21 mã hóa cho một loại protein đa chức năng tên là dystrophin. Dystrophin là
một protein nằm ở mặt trong màng tế bào cơ vân và hoạt động như là một yếu tố ổn
định chức năng màng, thiếu dystrophin gây biến đổi thoái hóa cả hệ cơ xương lẫn hệ
cơ tim (hình 2.4).
2.3.1. Gen dystrophin và các sản phẩm của nó
Từ đầu những năm 1980 những hiểu biết về bệnh và thay đổi trong chức năng
bệnh này đã có những tiến bộ rất đáng kể, khởi đầu là việc xác định chính xác locus
DMD ở cánh ngắn p của NST Xp21 (Dvies và cộng sự, 1983).
Đến bây giờ nó được biết như là một gen lớn nhất trong cơ thể người với 2400kb,
gồm 79 exon và 99,4% cấu trúc gen là intron. Gen có kích thước lớn này mã cho bản
phiên mã mRNA 14kb với nhiệm vụ kiểm soát sự ghép nối và phiên mã một cách tinh
tế, tổng hợp nên protein dystrophin có khối lượng phân tử là 427 kDa (Brown và
Dickson, 1994) (hình 2.5).

6


Toàn bộ cơ

Bó sợi cơ
Màng sợi cơ (vị trí chất dystrophin)
Protein
Màng tế bào cơ

Dystrophin
Hình 2.4 Vị trí protein dystrophin trên mặt trong
màng tế bào cơ vân (Theo Muscular Dystrophy Association of NSW).

Hình 2.5 Vị trí locus Xp21 (Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov).
Trình tự amino acid của dystrophin chỉ có bốn domain cấu trúc phân biệt:
Domain cuối N (amino acid 14 – 240): bao gồm khoảng 240 amino acid đầu
tiên, tương đồng trình tự cao với domain gắn actin của -actin và -spectrin.

7


Domain mảnh (rod domain) (amino acid 253 – 3040): ở trung tâm có 24 đoạn
lặp tương đồng, trung bình có 109 amino acid cũng tương đồng cao với -actin và spectrin. Cấu trúc này theo dự đoán là làm thúc đẩy tương tác xoắn  để có cấu trúc
giống hình que dài 100 – 125 nm, tạo thuận lợi cho sự kết hợp (Blake và cộng sự,
1995). Tính linh hoạt này giống như bản lề trên phân tử là do có mặt 4 vùng giàu
proline nằm rải rác dọc chiều dài của que này (Blake và cộng sự, 1994). Tuy nhiên,
domain này thường được coi là vùng ít chức năng nhất.
Domain giàu cystine (amino acid 3080 – 3360): gồm hai motif gắn calcium có
ở calmodulin cũng như ở -actin và -spectrin, mặc dù khả năng gắn calcium thực sự
của nó vẫn còn đang tranh cãi (Ahn và Kunkel, 1993).
Cuối cùng là domain cuối C (amino acid 3361 – 3685): bao gồm 240 amino
acid đặc hiệu đối với họ dystrophin mà chủ yếu là dystrophin và nhiều protein có liên
quan đến dystrophin (dystrophin-related proteins, DRP) như protein utrophin (DRP1),
DRP2, Torpedo 87 (Robert và cộng sự, 1996) và dystrobrevin (Blake và cộng sự, 1996).
Đến nay 8 promoter độc lập đã được sáng tỏ nhờ việc kiểm soát phiên mã ở locus
DMD bằng những phương pháp đặc hiệu tế bào (Matsuo, 1996). Bốn trong số các
promoter này khởi đầu phiên mã cho một bản phiên mã mRNA có độ dài đầy đủ, khác
nhau ít nhất là exon đầu tiên khi mã cho các protein 427 kDa là M (muscle), L
(lymphoblastoid), C (cortical) và protein dystrophin P (Purkinje) với tất cả bốn domain
cấu trúc.
Các promoter bổ sung S (Schawann) và G (glal) kiểm soát sự biểu hiện của
protein apo-dystrophin cuối C ngắn. Promoter S phiên mã cho một bản phiên mã

mRNA 5,6 kb mã cho protein 116 kDa có tên là Dp 116 hay apo-dystrophin-2, chỉ
biểu hiện ở hệ thần kinh ngoại biên của người trưởng thành (Blake và cộng sự, 1995).
Promoter G phiên mã cho ít nhất 2 bản phiên mã mRNA 4,8 và 2,2 kb có tên là
apo-dystrophin-1 và apo-dystrophin-3, chúng có các mẫu biểu hiện đồng nhất và dư
thừa trong não bộ và các mô không phải là mô cơ, nhưng không phát hiện được ở mô
cơ xương đã biệt hóa hoàn toàn (Tinsley và cộng sự, 1994).
Gần đây hai bản phiên mã dystrophin bổ sung 260 kDa (Piller và cộng sự, 1993)
và 140 kDa (Lodov và cộng sự, 1995) đã được sáng tỏ, nó khởi đầu từ các promoter R
mới (retina) và B (brain, CNS). Tuy nhiên, tính phức tạp của sự kiểm soát phiên mã
8


gen dystrophin và sự ghép nối của mRNA thì vượt rất xa những protein khung tế bào
đã biết và có thể còn có những bản phiên mã nhỏ khác nữa cũng đang tồn tại.
(A)
Dystrophin genome: Xp21

(B)
Chiều dài đầy đủ của dystrophin: 427 kDa
Domain cuối N

Gắn actin
Exon 1 – 8

Domain mảnh

Tự dimer hóa
Exon 8 – 64

Vùng bản lề

Vùng giàu cystine
Domain cuối

Gắn dystrophin Gắn syntrophin
Exon 65 – 67 Exon 68 – 79

Hình 2.6 Chuỗi gen dystrophin; (A): Sơ đồ gen dystrophin chỉ vị trí gần đúng của 79 exon
và 8 promoter đồng nhất; (B): Sự tổ chức các domain giả định của sản phẩm gen dystrophin

(Theo Stephen Murphy, George Dickson, Gene Therapy Technologies, Applications
and regulations, John Wiley & Sons Ltd., 1999).
Sự biểu hiện của DMD và BMD cho đến nay đều do đột biến ở gen mã cho
dystrophin. Tỷ lệ đột biến vào khoảng 790 – 100 x 10-6 gen/thế hệ, tỷ lệ này cao hơn
rất nhiều so với các bệnh di truyền khác (Emery, 1993). Sự tác động đặc biệt cao và
với phạm vi rộng của các đột biến có liên quan đến locus gen DMD.
Tuy nhiên, nhiều điểm trong gen dystrophin có tỷ lệ đột biến cao nên rõ ràng nó
là đích đặc hiệu cho việc gây đột biến (Brown và Dickson, 1994). Trong nhiều trường
hợp, sự nghiêm trọng lâm sàng của kiểu hình này có thể có liên quan đến bản chất của
sự loại bỏ phân tử (Monaco và cộng sự, 1988). Kiểu hình DMD nói chung là do đột
biến làm phá vỡ khung đọc rồi dẫn đến tạo sản phẩm gen không có chức năng và kiểu
hình thiếu hụt chức năng một cách nghiêm trọng. Tuy nhiên kiểu hình BMD nói chung
cũng do sự đột biến hay sự loại bỏ nhưng vẫn duy trì được khung đọc do đó tạo nên
9


các sản phẩm protein bất thường, tuy có bị biến đổi về cấu trúc nhưng vẫn còn giữ
được một vài chức năng, kiểu hình này luôn luôn phụ thuộc vào quá trình đột biến
(Bushby và cộng sự, 1992).
2.3.2. Chức năng của dystrophin
Dystrophin là thành phần chính của các sợi cơ bình thường, nó định vị ở màng

bao cơ với mức đầy đủ ngay khi thai đang phát triển (Arahata và cộng sự, 1988). Ngay
từ giai đoạn sớm của sự tạo cơ, những nguyên bào cơ chưa biệt hóa bình thường đã có
một lượng dystrophin. Sự xuất hiện dystrophin trùng với việc hòa lẫn một cách tự
động các tế bào tạo cơ đơn nhân để hình thành một hợp bào đa nhân sau giảm phân
(Miranda và cộng sự, 1988). Tuy nhiên, trong loạn dưỡng cơ thì không có hay thiếu
hụt nhiều dystrophin, sở dĩ như vậy là do khi các sợi cơ được tái tạo, thoái hóa hay
hoại tử thì kích cỡ sợi sẽ bị biến đổi (Miranda và cộng sự, 1988). Sự vắng mặt của
dystrophin không làm chết tức thời tất cả các sợi cơ ở bệnh nhân DMD và BMD, các
chức năng của chúng vẫn được duy trì trong các quá trình tiến triển của bệnh. Tuy
nhiên, sự tái sinh của các sợi cơ bị hủy hoại không bù đắp được mức độ thoái hóa sợi
cơ ngày càng tăng và tai hại hơn là có thể dẫn đến sự hóa xơ ở các vị trí bị tác động
nghiêm trọng dẫn đến bất ổn định các sợi cơ (Miller và Hoffman, 1994) (Nguyễn Văn
Kình, 2007).

Hình

2.7

Sơ

đồ

đại

diện

của

dystrophin

liên

kết

với

phức hệ glycoprotein định vị ở màng bao cơ của tất cả tế bào cơ bình thường
(Nguồn: Bruce R. Korf, 1996).
10


2.4. Phương pháp chẩn đoán bệnh DMD
Chẩn đoán bệnh DMD thường được dựa vào: hỏi tiền sử bản thân và gia đình,
khám và phát hiện các dấu chứng lâm sàng, thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán như
điện cơ, xét nghiệm enzyme creatine kinase, sinh thiết cơ và chẩn đoán phân tử.
2.4.1. Phương pháp chẩn đoán điện
2.4.1.1. Đo tốc độ dẫn truyền vận động
Khi kích thích một dây thần kinh vận động bằng một xung điện, dây thần kinh sẽ
bị khử cực tại điểm kích thích, tạo thành một xung thần kinh. Xung thần kinh này di
chuyển dọc theo dây thần kinh vận động, gây co cơ. Điện cực ghi đặt trên bắp cơ ghi
được một làn sóng do co cơ sinh ra.
Mục đích của phương pháp chẩn đoán này là muốn xác định tình trạng yếu của
bệnh nhân bắt nguồn từ cơ hay các dây thần kinh kiểm soát các cơ này. Các dây thần
kinh kiểm soát cơ hay là các neurone vận động, bắt nguồn từ não bộ, tủy sống và nối
với tất cả các cơ, có thể gây ra tình trạng yếu có vẻ như từ bắp thịt nhưng sự thật lại
không phải như vậy (Nguyễn Hữu Công, 2006).
2.4.1.2. Điện cơ (Electromyography, EMG)
Điện cơ là phương pháp dùng điện cực có hình dáng giống một kim chích để ghi
các hoạt động điện của cơ vân. Nếu một cơ tăng hoạt động điện do đâm kim và có hoạt
động điện tự phát, thì nghi cơ đó bị mất phân bố thần kinh, căn nguyên do đứt dây thần

kinh, hay bệnh dây thần kinh tổn thương sợi trục. Điện thế của đơn vị vận động: trong
bệnh cơ thì thấp bé và hẹp lại, trong yếu cơ do căn nguyên thần kinh thì cao lớn và
rộng ra (Nguyễn Hữu Công, 2006).
2.4.2. Kiểm tra creatine kinase, CK
Trong giai đoạn đầu của tiến trình chẩn đoán, các bác sĩ thường yêu cầu người
bệnh làm xét nghiệm máu bởi vì định lượng enzyme huyết thanh rất có giá trị trong
chẩn đoán bệnh. Creatine kinase là enzyme thường dùng nhất cho chẩn đoán bệnh
DMD, đây là một enzyme xúc tác sự tạo năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và
quá trình chuyển hóa chất trong tế bào cơ. Enzyme này xúc tác phản ứng:
Creatine kinase
Creatine + ATP

Phosphocreatine + ADP

11