Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng bacillus cereus phân lập tại việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐINH THỊ NGA

TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ
NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐINH THỊ NGA

TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ
NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: T.S Phùng Tôn Quyền

.

Hà Nội - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn thạc sĩ tôi đã
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu, nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc tới những sự giúp đỡ này.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Tôn Quyền là người
thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền
đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuậ n lợi cho tôi hoàn thành bản luận
án này.
Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện
Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua
mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên
tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học
tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày

tháng 12 năm 2015
Học viên

Đinh Thị Nga

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả
cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là
trung thực.
Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015
Tác giả

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




MỤC LỤC
Lời cảm ơn Lời
cam đoan Danh
mục hình
Danh mục bảng
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm .. 3
1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning) ................................ 3
1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ................................................. 3

1.2. Tổng quan về Bacillus cereus .................................................................... 5
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus ..................................................... 5
1.2.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................... 7
1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................ 7
1.2.4. Đặc điểm sinh trưởng .......................................................................... 8
1.2.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá................................................................. 10
1.2.6. Đặc điểm huyết thanh học ................................................................. 11
1.2.7. Đặc điểm phân loại ............................................................................ 12
1.3. Các nhân tố gây độc của Bacillus cereus ................................................. 12
1.3.1. Các loại độc tố ruột (enterotoxin) ...................................................... 12
1.3.2. Độc tố gây nôn (cereulide) ................................................................ 16
1.3.3. Những bệnh gây ra bởi Bacillus cereus, không liên quan tới ngộ độc thực
phẩm..................................................................................................... 18
1.4. Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus ................................................... 19
1.4.1. Nguồn gốc lây nhiễm B. cereus ......................................................... 19
1.4.2. Cơ chế gây ngộ độc thực phẩm của Bacillus cereus ......................... 20
1.4.3. Liều lượng gây ngộ độc ..................................................................... 21
1.4.4. Triệu chứng ........................................................................................ 22
1.5. Biện pháp phòng ngừa sự lây nhiễm và phát triển của Bacillus cereus
trong thực phẩm .............................................................................................. 23

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




1.5.1. Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ cao ............................................... 23
1.5.2. Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ thấp .............................................. 24
1.5.3. Sử dụng chất bảo quản....................................................................... 25

1.5.4. Thực hiện điều kiện vệ sinh tốt GHP (good hygienic practices) và
thực hành sản xuất tốt GMP (good manufacturing practices) [45] ............. 25
1.6. Một số phương pháp nghiên cứu để nhận biết Bacillus cereus ............... 26
1.6.1. Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa............. 26
1.6.2. Phương pháp dựa trên đặc điểm huyết thanh học.............................. 28
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 31
2.1. Vật liệu. .................................................................................................... 31
2.1.1. Sinh phẩm. ......................................................................................... 31
2.1.2. Hóa chất và thiết bị. ........................................................................... 31
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 34
2.2.1. Phương pháp phân lập ....................................................................... 34
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn. .......................... 34
2.2.3. Phương pháp tách DNA tổng số ........................................................ 34
2.2.4. Phương pháp tinh sạch plasmid của E. coli. ...................................... 35
2.2.5. Phương pháp PCR khuếch đại gen. ................................................... 36
2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose................................................. 36
2.2.7. Phương pháp tách dòng gen nhe, hblA, bcet. .................................... 36
2.2.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng. ... 37
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 39
3.1. Phân lâp Bacillus cereus trên môi trương MYP ...................................... 39
3.2. Phát hiện gen mã hóa độc tô cua Bacillus cereus băng phan ưng PCR... 39
3.3. Tách dòng va đọc trình tự gen bceT, nhe và hblA. .................................. 41
3.3.1. Tách dòng gen bceT, nhe va hblA. .................................................... 41
3.3.2. Đoc trinh tư gen ma hoa cac đôc tô ................................................... 44
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 47
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 49

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT

Chư viết tắt

Chư viết đầy đủ

1

Bp

Base pair

2

Bc

Bacillus cereus

3

CFU

Colony Forming Unit

4

dH2O

Deion water

5

DNA

Deoxyribonucleotide acid

6

dNTP

deoxyribo Nucleotide 5’- Triphosphate

7

ĐC

Đối chứng

8

E. coli

Escherichia coli

9

EDTA

Ethylene diamine tetra- acetic acid

10

EtBr

Ethidium Bromide

11

kDa

Kilo Dalton

12

OD

Optical density - mật độ quang học

13

PCR

Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi

14

SDS

Sodium dodecyl sulphate

15

Sol

Solution

16

TE

Tris EDTA

17

X-gal

5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Danh mục hình

Hình 1.1: Tế bào (A) và bào tử (B) của B. cereus ........................................... 7
Hình 1.2: Khuẩn lạc B. cereus trên môi trường thạch huyết ............................ 8
Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao của B. cereus.......................................... 11
Hình 1.4. Cấu trúc hoá học của cereulide [24] ............................................... 17
Hình3.1. Hình thái khuẩn lạc .Bcereus trên môi trương MYP sa1u2 giơ nuôi...... 39
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gen độc tố cua gen
bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) và hblA (319 bp) ............................... 40
Hình 3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi Khuẩn E.coli DH5α ................... 41
Hình 3.4. Điên di san phâm căt DNA plasmid cac dong khuân lac trăng
trên gel 1% agarose ....................................................................... 42
Hình 3 .5 . Điên di san phâm PCR cua cac dong khuân lac trăng trên
g el 1% agaros e .................................................................... . 43
Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid của protrein BCET vói trình tự
BAA041341 trên ngân hàng gen quốc tế...................................... 44
Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid của protrein NHE vói trình tự
DQ153257.1 trên ngân hàng gen quốc tế .................................... 45
Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid của protrein HBL vói trình tự
EEK50059.1 trên ngân hàng gen quốc tế ..................................... 46

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




Danh mục bảng
Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus .... 10
Bảng 1.2. Đặc điểm một số độc tố ruột của Bacillus cereus ......................... 13
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu. ........................... 32

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN




MỞ ĐẦU

Bacillus cereus thuôc nhom 1 chi Bacillus là vi khuẩn hình que , Gram dương va
sinh bao tư . B. cereus thương xuât hiên trong đât , trong sưa nguyên liêu, trong cac
san phâm tư sưa va trong cac loai ngu côc

. B. cereus có khả năng liên quan đên cac

bênh vê đương ruôt như gây nôn va tiêu chay nhơ kha năng san sinh 4 loại entero
toxin trong đo co 2 tô hơp hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và
2 enterotoxic protein la enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K (Beecher, Wong, 1994).
Ngoài ra , B. cereus còn có khả năng sản sinh một loại độc tố chịu nhiệt n on-riposome
peptide synthetase (NRPS-cereulide) (Agata et al., 1995).
Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y tế có
khả năng kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tình thành có năng lực
kiểm nghiệm. Tuy nhiên hiện nay phương pháp xét nghiệm vẫn dựa trên phương pháp
đếm tổng số khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với các xét nghiệm
hóa sinh khác. Phương pháp này có nhược điểm là thời gian lâu, có thể mất nhiều
ngày hoặc vài tuần và độ chính xác không cao.Trong những năm gần đây, các
phương pháp xét nghiệm vi sinh vật dựa trên nguyên tắc di truyền phân tử và miễn
dịch học đã được thiết lập như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain Reaction), Elisa cho
kết quả rất khả quan với độ chính xác cao, thời gian rút ngắn có thể xuồng vài giờ,
không đòi hỏi nhiều máy móc thiết bị do đó khả năng cơ động là rất cao. Những

phương pháp trên đã mở ra cho ngành vi hóa sinh học nói riêng và cả ngành công
nghệ thực phẩm hiện đại.
xuất phát từ tính cấp thiết chúng tôi tiến hành đề tài: “Tách dòng và giải trình
tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập
tại Việt Nam”. Với mục đích tạo nguồn gen cho sản xuất nguyên liệu chế tạo kit phát
hiện các độc tố của vi khuẩn B. cereus sau này.

1


*/ Mục tiêu của nhiệm vụ:
- Tách dòng và đọc trình tự gen mã hóa độc tố gây nôn va tiêu chay nhơ khả
năng sản sinh

4 loại enterotoxin trong đó có

nonhemolytic enterotoxin

2 tô hơp hemolysin BL (HBL),

(NHE) và 2 enterotoxic protein la enterotoxin T

(BCET) và cytotoxin K từ vi khuẩn B. cereus.
*/ Nhiệm vu của đề tài:
- Phân lập vi khuẩn B.cereus tư các mẫu phẩm thu thập tại một số quán an vỉa
hè tại hà nội,
- Sàng lọc hệ gen mã hóa độc tố gây nôn va tiêu chay

, trong đo co 2 tô hơp

hemolysi n BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein la
enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K
- Tách dòng và đọc trình tự các gen HBL, NHE, BCET và cytotoxin K từ một số
chủng vi khuẩn B. cereus.

2


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning)
Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy ra
đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa,
tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệt
thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận động…) [3].
1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
Hiện nay tại Việt Nam cũng như trên thế giới, ngộ độc thực phẩm xảy ra
thường xuyên với nhiều nguyên nhân khác nhau. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố. Tác nhân lây nhiễm
bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm các
độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn dư trong thực phẩm như kim loại
nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[60].
Trong các vụ ngộ độc thực phẩm hiện nay, nguyên nhân do vi sinh vật đặc biệt
là vi khuẩn chiếm tỉ lệ cao. Có rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc thực
phẩm tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay là do Staphylococus
aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae,
Escherichia coli và Bacillus cereus… [59]. Do đó việc tìm hiểu các đặc tính của
chúng là vô cùng cần thiết để có thể đưa ra biện pháp kiểm soát hiệu quả. Dưới đây
là đặc tính của một số chủng vi khuẩn có nguy cơ ngộ độc cao:
Staphylococus aureus

S. aureus thường gặp ở các món ăn như salat cà chua, bánh sandwich và các
sản phẩm đóng hộp. Khi S. aureus nhiễm vào thực phẩm, chúng sẽ sản sinh độc tố gây
ngộ độc thực phẩm với triệu chứng nôn, choáng váng và đau quặn bụng [59,60].

3


Salmonellae sp.
Salmonellae thường tồn tại trong các thực phẩm có hàm lượng protein cao như
thịt, cá, trứng…Salmonellae có thể sinh trưởng trong thực phẩm, nhưng không sinh độc
tố, khi chúng vào trong ruột hoặc vào máu chúng mới sinh độc tố. Bệnh ngộ độc do
Salmonellae có triệu chứng điển hình như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau đầu [59,60].
Clostridium perfrigens
C. perfrigens thường xuất hiện trong đất, nước do đó chúng rất dễ nhiễm
vào thức ăn. Khi xâm nhập vào cơ thể người và động vật, chúng thường cư trú
trong ruột non. Nếu thực phẩm chứa một lượng lớn vi khuẩn này được tiêu hoá thì
khi C. perfrigens vào tới ruột non, chúng sẽ sản sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với
triệu chứng đau bụng dữ dội, tiêu chảy ra nước [59,60].
Vibrio cholerae
V. cholerae thường có mặt trong những thực phẩm chưa được nấu chín kỹ đặc
biệt là các loại thuỷ, hải sản sống. Ngộ độc do V. cholerae có các triệu chứng điển hình
như nôn, tiêu chảy dữ dội và liên tục nhưng không đau bụng. Bệnh nhân nếu không
điều trị kịp thời sẽ bị mất nước nghiêm trọng, trụy tim dẫn đến tử vong [59,60].
Escherichia coli
E. coli là vi khuẩn sống chủ yếu trong ruột của người và động vật. Nhiễm trực
khuẩn đường ruột này với số lượng lớn sẽ bị ngộ độc. Triệu chứng bệnh chủ yếu
là đau bụng dữ dội, tiêu chảy, có thể nôn mửa [59,60].
Ngoài ra còn rất nhiều loại vi khuẩn khác có khả năng gây ngộ độc đã được
nghiên cứu. Trên đây chỉ là một vài ví dụ điển hình nhưng nhìn chung vi khuẩn có khả
năng gây ngộ độc thực phẩm ở 2 dạng: Ngộ độc do ăn phải thức ăn có độc tố của vi

khuẩn mà không cần có mặt tế bào của chúng (Staphylococus aureus) và ngộ độc do
ăn phải thức ăn nhiễm một số lượng

4


lớn tế bào hoặc bào tử vi khuẩn để khi vào tới ruột non chúng phát triển sinh độc tố
gây ngộ độc ( Salmonella). Nhưng trong số đó, vi khuẩn Bacillus cereus lại có khả
năng gây ngộ độc thực phẩm ở cả hai dạng trên với hai thể bệnh điển hình là nôn và
tiêu chảy.
1.2. Tổng quan về Bacillus cereus
B. cereus thuộc nhóm 1 chi Bacillus. Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus có mặt ở khắp
mọi nơi trong môi trường sống, chúng mang đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương,
tế bào có dạng hình que, hô hấp hiếu khí hay hiếu khí không bắt buộc, có khả năng
hình thành bào tử [43]. Hiện nay, có khoảng trên
100 loài thuộc chi này đã được miêu tả, một số loài có ứng dụng trong công nghiệp
(sản xuất emzym) hoặc trong nông nghiệp (sản xuất thuốc trừ sâu sinh học), một số
loài lại gây bệnh cho người và động vật. Các loài gây bệnh quan trọng thường nằm
trong nhóm Bacillus cereus (nhóm 1 chi Bacillus) gồm Bacillus
myco¿des,

Bacillus

thuringiensis,

cereus,

Bacillus

Bacillus anthracis, Bacillus megaterium và mới

đây có thêm hai loài là Bacillus weihenstephanensis và Bacillus pseudomyco¿des
được phát hiện [38]. Các loài trong nhóm này có độ tương đồng về trình tự 16S, 23S
rất cao và chúng có % (G + C) tương đồng khoảng 31%-41%. Đây chính là những đặc
điểm quan trọng để phân loại chúng thuộc nhóm Bacillus cereus [43].
Trong các loài thuộc nhóm B. cereus có liên quan tới an toàn thực phẩm và sức
khoẻ con người thì B. thuringiensis được biết đến như là một loài vi khuẩn có khả năng
hình thành protein tinh thể độc có khả năng sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học, B.
anthracis là tác nhân gây bệnh than. Ngoài ra, B. cereus, B. thuringiensis, B.
weihenstephanensis thường được tìm thấy trong các sản phẩm lương thực, thực phẩm bị
hỏng [14]. Trong số đó, B. cereus là nguyên nhân chủ yếu và quan trọng nhất trong các
vụ ngộ độc thực phẩm.
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus
B. cereus được Frankland phân lập đầu tiên vào năm 1887 từ không khí tại một
chuồng bò [64]. Năm 1906 ở Châu Âu, 300 người bệnh được đưa vào

5


bệnh viện với những triệu chứng của bệnh đường ruột do ăn phải món thịt băm bị
nhiễm số lượng lớn một loại vi khuẩn hiếu khí, sinh bào tử, hình que được gọi tên là
Bacillus peptonificans. Sau này nó được đổi tên là Bacillus cereus [61,64].
Từ năm 1926 đến năm 1929: Theo thông báo có hai vụ ngộ độc liên quan tới một
loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus hiếu khí có trong nước sốt vani và món thịt đông.Từ
năm 1936 đến năm 1943: Trong 367 vụ ngộ độc ở thành phố Stockholm thì có 117
vụ nguyên nhân là do Bacillus spp. Tuy nhiên do chưa có những hiểu biết rõ ràng về B.
cereus nên chưa thể khẳng định rõ vai trò của chúng trong các vụ ngộ độc trên [61].
Năm 1950, Steinar Hauge nhà khoa học người Na Uy với những thí nghiệm đặc
biệt đã khẳng định B. cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và là tác nhân
gây bệnh cho con người. Để cung cấp bằng chứng khẳng định B. cereus là nguyên

nhân gây ra ngộ độc thực phẩm, Hauge đã chứng minh bằng cách uống môi trường
nuôi cấy B. cereus. Ông đã nuôi chúng tới mật độ 4.10

6

tế bào /g và uống 200ml. Sau

13 giờ, ông cảm thấy đau bụng dữ dội và bị tiêu chảy ra nước. Đó là những thí nghiệm
đầu tiên về loại B. cereus gây tiêu chảy.
Năm 1954, một số cuộc thí nghiệm với những người tình nguyện ở Mỹ đã thất bại
trong việc xác nhận lại những thí nghiệm của Hauge. Đến năm 1969, những vụ ngộ độc
thực phẩm do B. cereus đầu tiên đã được công bố ở Mỹ [64].
Năm 1971, 20 năm sau khi B. cereus được công nhận là tác nhân gây ra thể
bệnh tiêu chảy, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một loại ngộ độc khác gây ra bởi
B. cereus được gọi là typ gây nôn. Loại B. cereus gây nôn được phát hiện sau 6 vụ
ngộ độc xảy ra ở Anh với các triệu chứng buồn nôn và nôn mửa sau khi ăn món cơm
rang của một nhà hàng Trung Quốc [61,64]. Từ đó đến nay rất nhiều viện nghiên cứu
của các nước trên thế giới đã và đang tiến hành nghiên cứu về B. cereus cũng như các
độc tố của chúng nhằm tìm ra các

6


phương pháp phát hiện nhanh chính xác vi khuẩn này trong các loại thực phẩm,
góp phần giảm thiểu các vụ ngộ độc thực phẩm do nó gây ra.
Ở Việt Nam hiện nay, chưa có những nghiên cứu cụ thể, chi tiết về B. cereus mặc
dù một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus khác đã được nghiên cứu kỹ như B.
thuringiensis, B. antharcis…
1.2.2. Đặc điểm hình thái
B. cereus thuộc chi Bacillus, là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí

không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [43].
Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus thì Bacillus cereus
còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B. cereus dài 3-5 ỡm, rộng 11,2ỡm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông. Phần lớn tế bào B.
cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên cũng có một số chủng
không có khả năng di động. B. cereus có khả năng hình thành nội bào tử. Nội bào tử
của B. cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước của bào tử khoảng 1-1,5ỡm, bào tử
nang không phồng. Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối
(Hình 1.1) [61,64].

A

B

Hình 1.1: Tế bào (A) và bào tử (B) của B. cereus
1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy
B. cereus có thể sinh trưởng, phát triển ở dải nhiệt độ, pH rất rộng. Chúng có thể
phát triển ở nhiệt độ 4-5ºC trong khi đó một số chủng lại có thể phát triển ở nhiệt độ
55ºC. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của B. cereus là 3037ºC. Độ pH biến thiên từ 4,3-9,3; pH tối ưu là 7-7,2. Độ hoạt động của nước
> 0,92. B. cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ 77,5%, một số chủng còn có thể chịu được nồng độ 10% [23,37,61,64]. B.

7


cereus phát triển tốt nhất trong điều kiện hiếu khí nhưng vẫn có thể phát triển trong
điều kiện kỵ khí. Tuy nhiên, quá trình sản sinh độc tố đặc biệt là độc tố gây nôn sẽ
không xảy ra ở nhiệt độ <10ºC và >40ºC cũng như trong điều kiện kỵ khí [28,33,36].
Khi nuôi cấy B. cereus trên môi trường phân lập MYP (manitol-yolk- polimyxin) trong
điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7-7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc B. cereus có màu hồng
eosin (do không có quá trình lên men manitol), xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa
màu hồng (do có khả năng sinh enzym lecithinase) [22,23,37,63].

Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA (meat- pepton-agar), khuẩn
lạc B. cereus có đường kính khoảng 0,4-0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ trắng sữa đến
trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính ướt và có vành ở mép
[14,43].

Hình 1.2: Khuẩn lạc B. cereus trên môi trƣờng thạch huyết
Trên môi trường thạch máu cừu, B. cereus có khả năng sinh haemolysin làm tiêu
huyết (Hình 1.2). Đây là một đặc điểm được sử dụng để phân biệt B. cereus và B.
anthracis do B. anthracis không có khả năng sinh haemolysin. Haemolysin là một
trong những độc tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B. cereus [23,37].
1.2.4. Đặc điểm sinh trưởng
Đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B. cereus nói riêng đó là
khả năng hình thành bào tử. Nhờ có đặc điểm này mà B. cereus có thể

8


tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi trường khắc nghiệt nhất. Vì vậy, khả
năng lây nhiễm B. cereus vào thực phẩm trở nên dễ dàng và nguy hiểm hơn.
Khi tế bào sinh dưỡng của B. cereus gặp phải điều kiện bất lợi như nhiệt
độ quá cao hoặc quá thấp, pH cực đoan, tia tử ngoại hay môi trường thiếu chất
dinh dưỡng, khô hạn… B. cereus sẽ sinh nội bào tử. Nội bào tử nằm trong tế bào
mẹ, khi tế bào mẹ phân giải nội bào tử trở thành tự do. Bào tử rất bền vững chúng có
thể tồn tại và phát triển độc lập trong khoảng thời gian dài. Khi gặp điều kiện môi
trường thuận lợi về chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH tối ưu …, bào tử sẽ nảy mầm và
phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Tế bào sinh dưỡng này sẽ tiếp tục sinh trưởng
phát triển và tiến hành các hoạt động trao đổi chất. Khi dinh dưỡng cạn kiệt, môi
trường bất lợi nội bào tử lại được hình thành [2].
Bào tử của B. cereus có khả năng chịu nhiệt hơn hẳn tế bào sinh dưỡng của
chúng [62,64]. Ở thể sinh dưỡng B. cereus, dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao thì bào

tử của nó lại có khả năng kháng lại nhiệt độ cao. Trong sữa, bào tử B. cereus có thể
chịu đựng được nhiệt độ 100ºC trong 2-3 phút trong khi đó các quá trình thanh trùng
sữa thường chỉ xảy ra tại nhiệt độ 70-80ºC trong vài phút; trong thực phẩm có nồng độ
axít thấp (pH>4,5) B. cereus có thể chịu được khoảng 5 phút [61]. Đặc biệt, trong thực
phẩm có hàm lượng lipit cao như trong dầu đậu nành thì bào tử B. cereus có thể chịu
được nhiệt độ 121ºC trong 30 phút [62]. Vì vậy, trong quá trình chế biến thực phẩm
khó có thể loại bỏ hết bào tử B. cereus. Ngoài ra, bào tử B. cereus còn chịu được tia
bức xạ cao hơn tế bào sinh dưỡng. Nếu ta có thể tiêu diệt được 90% tế bào sinh
dưỡng B. cereus ở 0,17- 0,65 kGy thì để tiêu diệt được 90% bào tử B. cereus thì cường
độ bức xạ phải là 1,25- 4 kGy. Đặc biệt, bào tử B. cereus kỵ nước hơn bào tử của các
loài Bacillus spp. Do vậy, chúng có thể bám chặt vào bề mặt của những dụng cụ,
máy móc dùng cho quá trình chế biến thực phẩm

9


[12]. Điều này chứng tỏ bào tử B. cereus không chỉ nhiễm từ thực phẩm mà còn từ
những dụng cụ chế biến hay đựng thực phẩm và bất cứ lúc nào chúng cũng có thể gây
nguy hiểm cho an toàn sức khoẻ con người.
1.2.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
B. cereus có rất nhiều đặc điểm sinh lý, sinh hoá giống với một số loài thuộc nhóm
Bacillus cereus. Bảng 1 sau đây tóm tắt một số đặc điểm chính để phân biệt một số
loài thuộc nhóm 1 chi Bacillus này:
Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus
B.

B.

B.

B.

B.

cereus

thuringiensis

myco¿des

anthracis

megaterium

Nhuộm Gram

+

+

+

+

+

Phản ứng catalase

+

+

+

+

+

Khả năng chuyển

+/-

+/-

-

-

+/-

+

+/-

+

+

-

Kháng lysozyme

+

+

+

+

-

Phản ứng với

+

+

+

+

-

+

+

+

+

-

Phản ứng VP

+

+

+

+

-

Sinh axít từ

-

-

-

-

+

Sinh hemolysin

+

+

+

-

-

Sinh tinh thể độc

-

+

-

-

-

Đặc điểm

động
Phản ứng khử
nitrate

lòng đỏ trứng
Lên men glucose

kỵ khí

manitol

Chú thích:

+: phản ứng dương tính
ư: phản ứng âm tính
+/-: 50-50% phản ứng dương tính

10


Bảng

1

cho

thấy 4

loài

B.

cereus,

B. thuringiensis,

B.

myco¿des,

B.

anthracis có những đặc điểm sinh lý, sinh hoá rất giống nhau chỉ có

B.

megaterium là có nhiều đặc điểm khác hơn cả. Tuy nhiên, trong 4 loài đó thì mỗi loài
vẫn có những đặc điểm riêng: B. myco¿des có khả năng hình thành khuẩn lạc hình rễ
cây trên môi trường dinh dưỡng cơ bản, trong khi đó B. anthracis lại không có khả
năng chuyển động và không sinh haemolysin. Trên môi trường thạch huyết B.
anthracis vẫn có khả năng hình thành khuẩn lạc có kích thước 0,3-0,5cm nhưng không
phân giải huyết, B. thuringiensis có khả năng sinh protein tinh thể độc. Trong khi đó,
B. cereus lại có khả năng chuyển động và phân giải huyết rất mạnh, không hình thành
khuẩn lạc dạng rễ cây và không có khả năng sinh protein tinh thể độc [37].
1.2.6. Đặc điểm huyết thanh học
Hiện nay theo một số nghiên cứu, B. cereus có 13 kháng nguyên bề mặt (kháng
nguyên O) và giống như B. thuringiensis, B. cereus cũng có kháng nguyên tiêm mao
(kháng nguyên H) và 42 loại kháng nguyên H đã được sử dụng cho phân loại B. cereus.
23 trong 42 typ huyết thanh H có liên quan tới các thể bệnh gây ra bởi B. cereus. Các
nghiên cứu đã cho thấy các typ huyết thanh 1,2,6,8,10,12 và 19 thường liên quan tới
các vụ ngộ độc thể bệnh tiêu chảy còn các nhóm huyết thanh 1,5,8,12,19 của B.
cereus lại liên quan tới những vụ ngộ độc thể nôn. Trong đó, typ huyết thanh H1
thường chiếm ưu thế và gây ra cả hai loại thể bệnh [23,61].

Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao của B. cereus

11

1.2.7. Đặc điểm phân loại
Do B. cereus là loại vi khuẩn có dải nhiệt độ phát triển khá rộng nên dựa
vào nhiệt độ có thể phân chia các chủng B. cereus như sau:
• Các chủng ưa nhiệt (Mesophilic) là những chủng B. cereus có khả năng
sinh trưởng ở dải nhiệt độ 10ºC- 42ºC một số có thể phát triển ở 50ºC55ºC, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 30ºC- 37ºC.
• Các chủng ưa lạnh (Psychrophilic hay Psychorotrophic) là những chủng B.
cereus có khả năng sinh trưởng ở dưới 10ºC một số chủng có thể phát triển ở 4ºC,
nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 30ºC- 37ºC. Các chủng này không sinh trưởng ở nhiệt độ
>42ºC [38].
1.3. Các nhân tố gây độc của Bacillus cereus
B. cereus được biết đến là tác nhân gây ra những bệnh về đường tiêu hoá
cũng như một số bệnh không liên quan đến đường tiêu hoá. Chúng có khả năng gây
ngộ độc thực phẩm với hai thể bệnh điển hình là tiêu chảy và nôn. Có rất nhiều loại
độc tố tham gia vào quá trình gây ra hai thể bệnh này. Thể bệnh nôn gây ra bởi một
loại độc tố có khả năng kháng nhiệt cao được gọi là cereulide hay emetic toxin có mặt
trong thực phẩm trước khi con người tiêu hoá. Trong khi đó, thể bệnh tiêu chảy lại là
kết quả của rất nhiều loại độc tố ruột (enterotoxin) khác nhau gây nên. Chúng là các
sản phẩm trao đổi chất của tế bào B. cereus sinh ra ở ruột non trong quá trình phát
triển [23,38].
1.3.1. Các loại độc tố ruột (enterotoxin)
1.3.1.1. Đặc điểm cấu trúc và cơ chế hoạt động
a. Đặc điểm cấu trúc
Ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy là một loại thể bệnh phổ biến. Hiện nay, có
bốn loại độc tố ruột được biết đến là enterotoxin-T, cytotoxin K, haemolysin BL (HBL)
và non-haemolytic enterotoxin (NHE) [7,39]. Trong đó, ba loại được chứng minh là có
liên quan tới các vụ ngộ độc gây thể bệnh tiêu chảy là HBL, NHE và cytotoxin K còn
enterotoxin-T được coi như là một enterotoxin vì nó có cấu trúc gần giống với
enterotoxin của vi khuẩn [7].

12


Bảng 1.2. Đặc điểm một số độc tố ruột của Bacillus cereus [17,34, 39]
Khối lƣợng
Tên độc tố

Đặc điểm

phân tử

Khả năng gây
ngộ độc thực
phẩm

Haemolysin BL

Protein

(HBL)

3

thành

phần

B

37,5 kDa

L1

38,5 kDa

L2

43 kDa

Non-haemolytic

Protein

A

45 kDa

enterotoxin

3

B

39 kDa

(NHE)

phần

C

105 kDa

Cytotoxin K

Protein đơn

35 kDa

Enterotoxin- T

Protein đơn

41 kDa

thành

Có

Có

Có
Không

Trong 3 loại độc tố nêu ở trên thì HBL và NHE là hai độc tố ruột quan trọng có
mặt trong hầu hết các vụ ngộ độc gây tiêu chảy do B. cereus. Hiện nay, đã có nhiều
nghiên cứu tập trung vào hai loại độc tố này [57].
HBL là một loại độc tố dung huyết có bản chất là một protein 3 thành phần B,
L1, L2. Trong đó, B là nhân tố liên kết (Binding) còn L 1 và L2 là 2 nhân tố phân giải

(Lytic) [19]. Độc tố HBL này đã được tinh chế và xác định đặc điểm. Bằng các thí
nghiệm in vitro, các nhà khoa học đã chỉ ra độc tố này có hoạt tính hoại tử, tăng tính
thấm thành mạch máu cũng như khả năng gây tích tụ dịch trong ruột già [39]. Trong
protein nhiều thành phần này, mỗi protein thành phần đều được mã hoá bởi một gen.
Tiểu phần B được mã hoá bởi gen hblA còn gen hblC và hblD lần lượt mã hoá cho tiểu
phần L1, L2. Các gen này cùng nằm trên một operon. Hoạt tính của độc tố này mạnh
nhất khi có đầy đủ cả 3 protein thành phần [57]. Tuy nhiên, thành phần protein HBL
của B. cereus không phải lúc nào cũng có đầy đủ cả 3 protein thành phần. Trong 3
protein thành phần trên thì thành phần L2 có vai trò làm tăng hoạt

13


tính cho B và L1 nên không phải tất cả HBL của các chủng B. cereus đều sản xuất L2
[61].
NHE cũng là một protein 3 thành phần: A, B, C. Trong đó NHEC là protein liên
kết còn NHEA, NHEB là protein phân giải. Giống như HBL, hoạt tính của NHE mạnh nhất
khi có đầy đủ cả 3 protein này. Các gen nheA, nheB, nheC lần lượt mã hoá cho 3
protein NHEA, NHEB, NHEC, 3 gen này cũng cùng nằm trên một operon [39,57]. Ngoài
sự tương đồng về đặc điểm cấu tạo,
2 loại độc tố HBL và NHE còn có một đặc điểm chung là sự dịch mã operon tổng hợp
HBL, NHE đều được gen plcR điều hoà dương. Gen plcR là gen điều hoà sự tổng
hợp phospholipase C. Nếu chủng B. cereus có gen plcR điều hòa âm thì chủng đó
không có khả năng sản xuất HBL hay NHE còn nếu plcR điều hoà dương thì chúng có
khả năng sinh HBL và NHE. Lúc đó chúng có khả năng gây ngộ độc thực phẩm dạng
tiêu chảy [6].
Enterotoxin- T được biết đến từ năm 1995. Độc tố này đã được nhân dòng và
tiến hành một loạt các thí nghiệm invitro. Nó là một protein đơn mang một số tính
chất của một enterotoxin như khả năng gây độc tế bào, khả năng tăng tính thấm
thành mạch máu, khả năng gây tích tụ dịch, gây chết chuột nhưng nó không có

khả năng phân giải huyết. Nhưng hiện nay vẫn chưa tìm thấy sự có mặt của loại độc tố
này trong các vụ ngộ độc thực phẩm liên quan tới B. cereus. Protein độc tố này được
mã hoá bởi gen bce-T [8].
Cytotoxin K là loại enterotoxin được biết đến muộn nhất nhưng nó lại có khả
năng gây tử vong cao. Năm 2000, các nhà nghiên cứu đã phát hiện sự có mặt của độc
tố này sau một vụ ngộ độc xảy ra tại một gia đình người Pháp, tổng cộng có 44 người
bị ngộ độc trong đó 6 người bị tiêu chảy ra máu dẫn tới tử vong. Cytotoxin K là một
protein đơn có hoạt tính dung huyết và gây hoại tử. Nó bộc lộ tính độc rất cao trên tế
bào biểu mô của người. Gen mã hoá cho độc tố này là cytK [57].
Ngoài B. cereus thì B. thuringiensis và B. weihenstephanensis đều có khả năng
tạo ra ít nhất một trong các độc tố gây tiêu chảy ở trên đặc biệt là B.

14


thuringiensis. Một số chủng B. thuringiensis được thông báo có liên quan tới một số
vụ ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy [29,32,34].
b. Cơ chế hoạt động của độc tố ruột gây tiêu chảy
Hiện nay, cơ chế hoạt động của các độc tố ruột trên chưa được biết rõ nhưng
HBL và NHE đều là sản phẩm trao đổi chất trong quá trình phát triển của tế bào B.
cereus, được sinh ra ở pha phát triển luỹ thừa (pha log) và đạt được lượng lớn nhất ở
cuối pha này [17]. Qua các nghiên cứu invitro trên tế bào CaCo-2 (tế bào biểu mô
ruột non người), các nhà khoa học đã phỏng đoán có 2 cơ chế hoạt động của HBL
[12]. Thứ nhất, tiểu phần B liên kết vào màng tế bào trước sau đó tiểu phần L đi vào
bên trong làm thay đổi các chức năng trao đổi chất của tế bào. Thứ hai, tiểu phần B
liên kết vào màng tế bào và gây ra vết thương trên bề mặt màng tế bào khi có sự liên
kết của cả hai thành phần B và L. Cơ chế hoạt động của NHE cũng tương tự
như vậy [17,39].
Enterotoxin- T đã được tách dòng và biểu hiện trong E. coli. Nhưng độc tố
này chưa được tìm thấy trong bất cứ một vụ ngộ độc nào. Vì vậy, nếu nó có khả

năng gây độc thì hiện nay chưa có thông tin liên quan tới cơ chế hoạt động của
enterotoxin này [8].
Do cytotoxin K chỉ mới được phát hiện vào năm 2000 nên những nghiên
cứu về cơ chế gây độc của nó còn rất hạn chế. Trong nghiên cứu invitro, các tác giả
đã chỉ ra độc tố này có khả năng hình thành lỗ rò trong tầng kép photpholipid. Điều
đó chứng tỏ cơ chế hoạt động của cytotoxin K là khả năng hình thành lỗ rò trên tế
bào biểu mô ruột người gây ra quá trình thoát dịch và phá huỷ tế bào biểu mô ruột
dẫn đến hoại tử [57].
Các độc tố ruột có đặc điểm chung là chúng dễ dàng bị phá huỷ ở nhiệt độ cao,
pH cực đoan và bị phân huỷ bởi các enzym tiêu hoá như trypsin, pepsin… [64]. Vì
vậy, nếu chúng được B. cereus sinh ra trong thực phẩm trước khi được con người
tiêu hoá thì khi vào tới dạ dày chúng sẽ bị phá huỷ,

15


mất khả năng gây độc. Chúng chỉ thực sự gây nguy hiểm khi được hình thành ở ruột
non của người trong quá trình trao đổi chất của B. cereus [57].
1.3.1.2. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố ruột
Hiện nay, theo cơ chế gây bệnh thì thể bệnh tiêu chảy có thể được chia ra làm 3
loại: kích thích bài tiết (sencreoty), loại xâm lấn vào màng nhầy của đường ruột nhưng
không gây hoại tử (invasive) và loại xâm nhập, gây hoại tử (penetrating). Trong đó,
loại tiêu chảy kích thích bài tiết là loại tiêu chảy ra dịch lỏng do quá trình mất cân
bằng nước và chất điện giải giữa 2 bên biểu mô của tế bào ruột non. Nguyên nhân
thường là do các enterotoxin gây ra. Giống như V. cholerae, bệnh tiêu chảy do B.
cereus thuộc loại tiêu chảy này. Sau khi con người ăn phải thực phẩm có chứa bào tử
B. cereus, bào tử B. cereus vào tới ruột non gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ nảy mầm
phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Do tế bào B. cereus có những sợi tiên mao nhỏ nên
chúng có khả năng bám chắc vào tế bào biểu mô ruột [12]. Tế bào B. cereus tăng
nhanh về số lượng, tại pha sinh trưởng trong quá trình trao đổi chất chúng sản

sinh ra các độc tố ruột. Các độc tố này được tạo ra trong tế bào vi khuẩn và được tiết
vào ruột non người. Độc tố này liên kết với thụ thể đặc hiệu trên màng, truyền tín
hiệu giữa màng và kích thích các thông tin nội bào, cuối cùng chúng gây ra mất cân
bằng sự chuyển dịch nước và các chất điện giải. Cụ thể, khi enterotoxin được giải
phóng chúng kích hoạt enzym adenylate cyclase (chuyển ATP → cAMP) làm tăng
cAMP nội bào. Quá trình
sản xuất quá mức cAMP kéo theo sự vận chuyển tích cực ion Cl
ruột non và ngăn cản quá trình hấp thụ ion Na

+

-

vào khoang

gây ra mất cân bằng thẩm thấu làm

cho một lượng lớn nước của cơ thể bị rút ra chuyển vào ruột non gây ra bệnh tiêu chảy
[57].
1.3.2. Độc tố gây nôn (cereulide)
1.3.2.1. Cấu trúc và chức năng
Ngoài thể bệnh tiêu chảy, B. cereus còn gây ngộ độc thực phẩm ở thể

16