CẢM ỨNG HÌNH THÀNH RỄ TÓC Ở ĐẬU XANH BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes ĐỂ LÀM VẬT LIỆU TẠO CÂY CHUYỂN GEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CẢM ỨNG HÌNH THÀNH RỄ TÓC Ở ĐẬU XANH BẰNG
VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes ĐỂ LÀM
VẬT LIỆU TẠO CÂY CHUYỂN GEN

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

MAI THỊ THANH LIÊN

Niên khóa:

2011 – 2013

Tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CẢM ỨNG HÌNH THÀNH RỄ TÓC Ở ĐẬU XANH BẰNG
VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes ĐỂ LÀM

VẬT LIỆU TẠO CÂY CHUYỂN GEN

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TÔN BẢO LINH

MAI THỊ THANH LIÊN

Tháng 12/2013


LỜI CẢM ƠN
Để có thể bước đi trên con đường tri thức, con vô cùng biết ơn công lao to lớn
của ba mẹ. Ba mẹ luôn là người quan tâm, lo lắng và chứa đầy tình yêu thương đối với
con. Ba mẹ đã khuyến khích để con có nghị lực, cố gắng học tập cho thật tốt.
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Lãnh
đạo Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường, Bộ môn Công nghệ sinh học
và tất cả các cán bộ của Viện và Bộ môn đã tạo thuận lợi cho em trong quá trình học
tập và thực hiện đề tài.
Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, em đã được sự giúp đỡ, hướng
dẫn, hỗ trợ và động viên từ quý thầy cô cùng các bạn. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc
và chân thành đến:
Cô Tôn Bảo Linh, người đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức với sự
nhiệt tình và tận tâm giúp em thực hiện tốt công việc của mình. Cô đã tạo mọi điều
kiện tốt nhất có thể cho em trong quá trình làm đề tài.
Cô Trần Thị Lệ Minh vì những hỗ trợ vật chất và tinh thần trong quá trình em
thực hiện đề tài.
Cảm ơn bạn Anouck và Maxime đã phụ giúp tôi trong một khoảng thời gian và

các bạn Hường, Sang, Sương, Tiên, Vinh đã giúp đỡ và động viên những khi tôi cần.
Các thành viên lớp LT11SH, những người bạn đã cùng chia sẻ những niềm vui
và cả những khó khăn trong quá trình học tập.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 12 năm 2013
Mai Thị Thanh Liên

i


TÓM TẮT
Chuyển gen qua trung gian Agrobacterium là công cụ hiệu quả nhất và được sử
dụng rộng rãi để tạo ra thực vật biến đổi di truyền. Phương pháp này ít tốn kém và đơn
giản, dễ thực hiện hơn so với các phương pháp khác cùng với khả năng chuyển gen ổn
định, tạo sinh khối lớn. Đối tượng thí nghiệm là đậu xanh (Vigna radiata (L.)
Wilczek), một cây trồng quan trọng ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới nhưng
thiệt hại về năng suất, chất lượng rất lớn do các yếu tố bất lợi từ môi trường và đặc biệt
là côn trùng phá hoại trong lưu trữ. Vì vậy, đề tài “Cảm ứng hình thành rễ tóc ở đậu
xanh bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để làm vật liệu tạo cây chuyển gen”
được thực hiện để tối ưu hóa phương thức chuyển đổi thông qua A. rhizogenes nhằm
tạo cơ sở cho mục tiêu chuyển các gen mong muốn về sau.
Hạt đậu xanh TN 182 được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho thí nghiệm.
Các yếu tố quan trọng như là chủng vi khuẩn, thời gian lây nhiễm và thời gian đồng
nuôi cấy, tuổi mẫu cấy đã được nghiên cứu. Các mẫu lá mầm đã cắt bỏ trục phôi được
lây nhiễm với các chủng A. rhizogenes ICPB TR7, 18912, ATCC 15834, ATCC
11325, là những chủng vi khuẩn hoang dại với 3 cách thức lây nhiễm khác nhau. Vi
khuẩn A. rhizogenes chủng ATCC 15834 thuộc dòng agropine là lựa chọn tốt nhất cho
quá trình cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh. Đồng thời, các mẫu cấy được ngâm trong dịch
khuẩn 5 phút cũng là phương pháp được lựa chọn đối với cách thức lây nhiễm vi
khuẩn. Sự kết hợp đó tạo ra 53,08% mẫu cảm ứng rễ với chất lượng tốt.

Theo kết quả thí nghiệm, thời gian lây nhiễm 15 phút được coi là tối ưu cho sự
bám dính của vi khuẩn trên bề mặt tế bào thực vật (65,09% mẫu cảm ứng rễ tóc). Ba
ngày đồng nuôi cấy cần thiết cho sự vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật và sự biểu
hiện của chúng để hình thành kiểu hình rễ tóc (60,91%). Mẫu cấy 2 ngày tuổi (53,94%
mẫu cảm ứng rễ tóc) mẫn cảm với Agrobacterium hơn so với mẫu cấy 3 ngày
(45,84%) và 4 ngày tuổi (31,07%). Khả năng tăng trưởng nhanh, phân nhánh nhiều
của rễ tóc được chứng minh trên môi trường rắn không bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng. Mô sẹo cảm ứng 100% và tốt hơn trên môi trường MS cơ bản bổ sung 0,1 mg/l
2,4 D và 0,4 mg/l kinetin so với nghiệm thức còn lại.

ii


SUMMARY
Agrobacterium mediated genetic transformation is the most effective tool and
widely used to generate genetically modified plants. This method is less expensive,
more simple and feasible than others along with the stable transgenic ability.
Experimental subject is mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek), an important pulse
crop in many tropical and subtropical countries but crop losses often occur due to
environmental disadvantages and especially insect pest attack during storage. Thus, the
thesis “Induce hairy root formation in mung bean by Agrobacterium rhizogenes to
make material create transgenic plants” was carried out to optimize the A. rhizogenes
mediated transformation protocol on mungbean and provide the basic for target
transfer the desired genes later.
Seeds of TN 182 mung bean were used as original material for experiments.
Important factors like bacteria strains, infection and co-cultivation time, explants age
were studied. Cotyledonary node explants were removed embryonic axis and infected
with A. rhizogenes strains IPCB TR7, 18912, ATCC 15834, ATCC 11325, are wildtype bacteria strains along with three different infection mannor. Agrobacterium
rhizogenes strain ATCC 15834 with belongs to agropine-type is the best choice for
mung bean hairy root induction. Simultaneously, explants soaking in bacterial

suspensions is the method of choice for bacteria infection. This combination generated
53.08% of explants induced hairy roots with good quality.
According to research results, infection time 15 minutes was considered
optimal for bacteria attachment to the surface of the plant cells (65.09% explants
induced hairy root). Three day co-cultivation were required for transport of T-DNA
into plant cells and expression to form hairy root phenotype (60.91%). Two day old
explants (53.94%) were more susceptible to Agrobacterium than explants of 3 day old
(45.84%) and 4 day old (31.07%). The ability fast growing, multiple branching of
hairy roots was substantiated on solid medium not supplemented with growth
regulators. Callus induction rate from assumed transformed hairy roots was 100% and
better on basal MS medium was supplemented with 0.1 mg/ml 2,4 D and 0.4 mg/l
kinetin than the other treatment.
iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
TÓM TẮT ...................................................................................................................... ii
SUMARY ....................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ vi
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu của đề tài..................................................................................................... 2
1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1. Sơ lược về cây đậu xanh ........................................................................................... 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại đậu xanh ......................................................................... 3

2.1.2. Đặc điểm thực vật học cây đậu xanh ..................................................................... 3
2.1.3. Tầm quan trọng của cây đậu xanh ........................................................................ 4
2.1.4. Tình hình sản xuất cây đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam .............................. 5
2.2. Vi khuẩn Agrobacterium rhizognenes ...................................................................... 6
2.2.1. Phân loại ................................................................................................................ 6
2.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizognenes ............................................................ 6
2.2.3. Cơ sở phân tử và sinh lý của sự hình thành rễ tóc ................................................. 7
2.2.4. Các gen rol của Ri plasmid ................................................................................... 9
2.2.5. Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật ............ 10
2.3. Một số nghiên cứu chuyển gen qua trung gian Agrobacterium ở đậu xanh........... 11
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 15
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 15
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 15
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 15
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị .............................................................................................. 15
iv


3.2.3. Môi trường nuôi cấy ............................................................................................ 15
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 16
3.3.1. Giai đoạn chuẩn bị nguyên vật liệu ..................................................................... 16
3.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh ....... 16
3.3.3. Kiểm tra khả năng tăng trưởng và cảm ứng tạo mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh ........ 20
3.3.4. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................................ 21
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 22
4.1. Giai đoạn chuẩn bị mẫu để chuyển gen .................................................................. 22
4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh .......... 23
4.3. Kiểm tra khả năng tăng trưởng và cảm ứng tạo mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh ........... 34
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 38
5.1. Kết luận................................................................................................................... 38

5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 39
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4 D: 2,4-Dichlorophenolxyacetic Acid
ATCC: American Type Culture Collection
BAP: 6-Benzyl aminopurine
bp: base pair
CAEA: cotyledon attached with embryonal axis
cs: cộng sự
IAA: Indole-3-acetic acid
IBA: Indole-3-butyric acid
ICPB: International Collection of Phytopathogenic Bacteria
gusA: β-glucuronidase
hpt: hygromycin phosphotransferase
LB: Left Border
NAA: α-Naphthalene acetic acid
NT: Nghiệm thức
nptII: neomycin phosphotransferase
OD: Optical Density
PCR: Rolymerase Chain Reaction
RB: Right Border
Ri-plasmid: Root inducing plasmid
T-DNA: Transfer Deoxiribonucleic Acid
Ti-plasmid: Tumor inducing plasmid
TSS: T-DNA transfer stimulator sequence

vir: Virulence
YMB: Yeast Mannitol Broth
WHR: Wide host range

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Các nghiệm thức lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes vào lá mầm đậu xanh .. 18
Bảng 3.2 Các nghiệm thức xác định ảnh hưởng của 2,4 D và kinetin lên sự cảm
ứng mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh ....................................................................................... 21
Bảng 4.1 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc ở lá mầm đậu xanh in vitro của các chủng
vi khuẩn A. rhizogenes và cách thức lây nhiễm khác nhau ........................................... 24
Bảng 4.2 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc ở lá mầm đậu xanh in vitro với các thời gian
lây nhiễm A. rhizogenes khác nhau ............................................................................... 28
Bảng 4.3 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc ở lá mầm đậu xanh in vitro với các thời
gian đồng nuôi cấy khác nhau ....................................................................................... 30
Bảng 4.4 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc ở lá mầm đậu xanh in vitro độ tuổi khác nhau .. 33
Bảng 4.5 Kết quả cảm ứng tạo mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh............................................ 36

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cây đậu xanh ................................................................................................... 3
Hình 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium ................................................................................. 6
Hình 2.3 Cấu trúc Ri plasmid của A. rhizogenes ........................................................... 9
Hình 4.1 Hạt đậu xanh TN 182 và sau 2 ngày tuổi kể từ ngày ủ hạt ............................ 22
Hình 4.2 Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ..................... 22
Hình 4.3 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh ở các chủng khuẩn A. rhizogenes

và cách thức lây nhiễm khác nhau ................................................................................. 26
Hình 4.4 Mẫu cấy sau 10 ngày kể từ ngày lây nhiễm A. rhizogenes chủng
ATCC 15834.................................................................................................................. 27
Hình 4.5 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh ở các thời gian lây nhiễm khác nhau 29
Hình 4.6 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh ở các thời gian đồng nuôi cấy
khác nhau ....................................................................................................................... 32
Hình 4.7 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh ở các độ tuổi mẫu cấy khác nhau ....... 34
Hình 4.8 Rễ đối chứng và rễ tóc trên môi trường MS rắn ............................................ 35
Hình 4.9 Mô sẹo xốp và mô sẹo chắc ........................................................................... 37
Hình 4.10 Mô sẹo được cảm ứng từ rễ tóc sau 14 ngày nuôi cấy ................................ 37

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Chuyển gen qua trung gian Agrobacterium là phương pháp hiệu quả nhất và
được sử dụng rộng rãi để tạo ra thực vật biến đổi gen. Phương pháp này ít tốn kém và
đơn giản, dễ thực hiện hơn so với biến nạp gen bằng súng bắn gen, xung điện hay vi
tiêm đồng thời khả năng chuyển gen ổn định và cho hiệu quả cao. Việc sử dụng vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes cho mục đích chuyển gen giúp mang lại lượng sinh
khối lớn đó là rễ tóc trên môi trường không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng,
nó có thể được dùng trong sản xuất các hợp chất thứ cấp hoặc như là một nguồn vật
liệu cho tái sinh một số lượng lớn cây chuyển gen hay sản xuất protein ngoại bào.
Mặc dù việc biến đổi di truyền ở cây họ đậu rất khó khăn do tần suất tái sinh thấp
nhưng cũng đã có những tiến bộ đáng kể trong việc phục hồi cây chuyển gen qua
Agrobacterium ở một vài loài cây họ đậu trong đó có đậu xanh.
Đậu xanh là một cây họ đậu quan trọng ở châu Á, có giá trị kinh tế và dinh
dưỡng cao. Ở nước ta, cây đậu xanh có vị trí quan trọng trong cơ cấu luân canh,
xen canh và gối vụ. Đặc biệt ở các tỉnh Bắc Trung Bộ, Đông Nam Bộ và Tây

Nguyên, đậu xanh đã trở thành cây trồng chính trong sản xuất vụ hè. Tình hình sản
xuất, tiêu thụ và chế biến đậu xanh ở nước ta đang có chiều hướng gia tăng nhờ
khai thác được một số ưu điểm quan trọng của cây đậu xanh. Đó là khả năng cung
cấp dinh dưỡng cao, dễ tiêu hóa. Thân đậu xanh dùng làm phân hữu cơ góp phần
cải tạo đất, tăng độ phì nhiêu. Ngoài ra, đây còn là một loại cây giúp cải thiện tình
trạng nitơ trong đất hoặc phá vỡ chu kì sâu bệnh trong điều kiện luân canh, xen
canh. Tuy nhiên, chúng nhạy cảm đối với nấm, vi khuẩn, vi rút gây bệnh, không
chịu mặn và hạn hán, năng suất và chất lượng đậu xanh bị suy giảm nghiêm trọng
bởi ảnh hưởng của sâu, cỏ dại, thiệt hại nặng nề nhất là sau khi thu hoạch cũng như
trong quá trình cất trữ bởi sự phá hoại của côn trùng (mọt đậu).
Để giảm tác hại của những yếu tố trên nhằm tăng năng suất và chất lượng đậu
xanh cùng với mục tiêu giảm lượng thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ và kỹ thuật canh tác
làm đất tối thiểu ngày càng càng phổ biến trong nền nông nghiệp hiện đại thì chúng ta
cần đến kĩ thuật di truyền để cải thiện gen đậu xanh. Tuy nhiên, việc nghiên cứu
1


chuyển gen vào cây đậu xanh ở nước ta vẫn còn hạn chế. Do vậy, tối ưu hóa các yếu tố
ảnh hưởng đến quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium là rất cần thiết. Với
mục đích xây dựng một quy trình chuyển gen thích hợp sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium, làm cơ sở cho mục tiêu chuyển những gen mang tính trạng mong
muốn vào đậu xanh, cùng những điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và phương
pháp khả thi, đề tài “Cảm ứng hình thành rễ tóc ở đậu xanh bằng vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes để làm vật liệu tạo cây chuyển gen” được thực hiện.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Xác định được một vài thông số ảnh hưởng đến hiệu quả cảm ứng tạo rễ tóc
như chủng vi khuẩn, cách thức lây nhiễm, thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy
và độ tuổi của mẫu cấy.
Tạo mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh.
1.3. Nội dung nghiên cứu

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tóc ở lá mầm đậu
xanh in vitro để tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào đậu xanh thông qua vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes.
Kiểm tra khả năng tăng trưởng của rễ tóc so với rễ không chuyển gen và khảo
sát khả năng tạo mô sẹo từ rễ tóc làm bước đầu cho quá trình tái sinh thành cây đậu
xanh chuyển gen.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về cây đậu xanh
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại đậu xanh
Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) có bộ nhiễm sắc thể 2n = 22, là loại
cây ăn hạt, thân thảo. Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố
rộng rãi ở các nước Đông và Nam Á, khu vực Đông Dương. Dạng dại của V. radiata
cũng được tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi (Nguyễn Đăng
Khôi, 1997 – trích dẫn bởi Hoàng Thị Thao, 2010).
Cây đậu xanh thuộc ngành Magnoliopyta, lớp Magnoliopsida, bộ Fabales, họ
Fabaceae, chi Vigna. Chi Vigna là một trong những chi lớn của họ đậu, bao gồm 7 chi
phụ là:

Vigna,

Ceratotropic,

Haydonia, Plectropic,

Lasionspron,

Macrohynchus,

Sigmoidotrotopis. Đậu xanh

theo quan điểm lấy hạt của nhân dân ta bao gồm các loại
thuộc hai chi phụ là Vigna và Ceratotropic. Chi phụ
Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu châu Á mang những
đặc điểm điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất cho Vigna
(Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998).

Hình 2.1 Cây đậu xanh

2.1.2. Đặc điểm thực vật học cây đậu xanh
Đậu xanh là loại cây trồng cạn thu quả và hạt. Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc
bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ chính ăn sâu khoảng 20 – 30 cm, có khi sâu tới 70
– 100 cm. Rễ phụ thường gồm 30 – 40 rễ, dài khoảng 20 – 25 cm (Trần Văn Lài, 1993
– trích dẫn bởi Hoàng Thị Thao, 2010). Đặc biệt do rễ đậu xanh có khả năng sống
cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ, nhất là sát rễ
chính hình thành các nốt sần. Các nốt sần có khả năng cố định nitơ thường có kích
thước 4 – 5 mm, màu đỏ, hồng hay nâu. Trung bình mỗi vụ, một hecta đậu xanh có thể
bù lại cho đất tương ứng 85 - 107 kg nitơ làm cho đất tơi xốp hơn (Nguyễn Đăng
Khôi, 1997 – trích dẫn bởi Nguyễn Thị Luyện, 2009).
Thân đậu xanh thuộc loại thân thảo, mọc thẳng đứng hoặc hơi nghiêng, thân
yếu có màu xanh hay tím tùy thuộc kiểu gen và lớp lông mịn màu nâu sáng, cao
khoảng 40 – 70 cm, đường kính trung bình từ 8 – 12 mm. Thân cây gồm 7 – 8 đốt.
3


Thân phân cành muộn và có trung bình từ 10 - 12 cành, một số giống có từ 9 – 10 cành
(Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998).

Lá thuộc loại lá kép mọc cách, có ba lá chét. Lá thật hoàn chỉnh gồm lá kèm,
cuống lá và phiến lá. Cả hai mặt lá đều có lông bao phủ. Trên thân chính có 7 – 8 lá
thật (Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998).
Hoa đậu xanh là hoa lưỡng tính mọc thành chùm trên các trục hoa. Mỗi trục hoa
có thể phát triển thành hai hàng hoa mọc đối nhau, các hoa trên hàng xếp liên tục với
nhau tạo cho hoa có hình dạng co rút. Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm,
màu xanh tím, khi nở màu vàng (Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998).
Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹp, dài từ 8 – 10
cm, đường kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả. Quả chín có
màu vàng, nâu hoặc đen. Một cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, mỗi quả có từ 5 –
10 hạt. Trên vỏ quả được bao phủ một lớp lông mịn (Đường Hồng Dật, 2006; Nguyễn
Mạnh Chính và Nguyễn Mạnh Cường, 2008 - trích dẫn bởi Hoàng Thị Thao, 2010).
Hạt đậu xanh có hình dạng khá phong phú như hình trụ, trụ hơi cạnh, ovan,
tròn, thoi, tam giác. Vỏ hạt màu xanh lục, xanh mỡ, xanh tối hay vàng rơm. Ruột có
màu trắng, vàng hay xanh nhạt (Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, 1996). Một hạt
đậu có 2 tử diệp (lá mầm). Lá mầm chiếm khoảng 90% khối lượng hạt, chúng được
cấu tạo từ những tế bào lớn thành mỏng, giữa các tế bào là các khoảng trống. Phôi
chiếm khoảng 3% khối lượng toàn hạt, gồm 2 phần chính là chồi mầm và rễ mầm,
phôi là phần phát triển thành cây non khi hạt nảy mầm.
2.1.3. Tầm quan trọng của cây đậu xanh
Đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, đứng hàng thứ ba sau đậu
tương và lạc. Về dinh dưỡng, hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (24 28%), ngoài ra còn có lipid khoảng 1,3%, glucid 60,2% và các chất khoáng như Ca,
Fe, Na, K, P cùng nhiều loại vitamin hòa tan trong nước như vitamin B1, B2, C.
Protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế như leucine,
isoleucine, lysine, methyonine, valine. Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể
được dùng để làm rau, muối dưa. Thân lá non cây đậu xanh dùng làm thức ăn cho
chăn nuôi, còn thân lá già đem phơi khô, nghiền nhỏ làm bột dự trữ cho gia súc
(Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998).
4

Hạt đậu xanh được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn
như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, xôi đậu và một số đồ uống. Cây đậu
xanh có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng sinh trưởng mạnh, mỗi chu kỳ sinh
trưởng kéo dài từ 60 - 90 ngày. Mặt khác, yêu cầu kỹ thuật canh tác đơn giản, vốn đầu
tư ít, thu hồi nhanh, có thể trồng nhiều vụ trong một năm. Do đó, cây đậu xanh có thể
được trồng xen, trồng gối, luân canh trên nhiều loại đất canh tác khác nhau. Trồng đậu
xanh còn có tác dụng trong cải tạo và bồi dưỡng đất. Đậu xanh là nguồn đạm sinh học
quan trọng trong cơ cấu cây trồng luân canh bởi hệ rễ đậu xanh có các nốt sần chứa
các vi khuẩn cộng sinh có khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm
cho cây và để lại lượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch. Vì vậy, đất sau khi
trồng đậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn (Phạm Văn Thiều, 1997 trích dẫn bởi Hoàng Thị Thao, 2010). Đậu xanh còn có giá trị trong y học, hạt có vị
ngọt, tính mát nên có công dụng thanh nhiệt, giải độc ().
2.1.4. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam
Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới ngày một tăng. Đặc biệt trong những
năm gần đây do nhu cầu của con người về dinh dưỡng protein thực vật tăng nhanh đã
làm thúc đẩy việc sản xuất đậu xanh phát triển mạnh.
Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả Châu Á có bộ sưu tập giống đậu xanh
với khoảng 6.000 mẫu giống, trong đó có những giống cho năng suất cao từ 18 – 25
tạ/hecta. Theo kết quả điều tra của trung tâm này, trên thế giới có khoảng 20 nước sản
xuất đậu xanh, trong đó Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Philippin, Srilanca được
coi là những trọng điểm về diện tích, năng suất và sản lượng (Nguyễn Thị Luyện, 2009).
Năm 2002 – 2006, diện tích trồng đậu xanh khoảng 928.000 ha, sản lượng đạt
hơn 6.445 triệu tấn. Ấn Độ là nước trồng nhiều nhất với 15.000 ha, chiếm trên 70%
diện tích đậu xanh toàn cầu, sản lượng đạt 420.000 tấn, năng suất đạt 2.800 kg/ha
(2008). Thái Lan là nước sản xuất lớn thứ hai và đứng đầu về xuất khẩu đậu xanh với
sản lượng 92.000 tấn (2008), chiếm khoảng 40% sản lượng thế giới. Nước nhập khẩu
nhiều đậu xanh nhất là Nhật Bản với 80 tấn/năm và Hoa Kỳ 50 tấn/năm.
Ở Việt Nam, đậu xanh được gieo trồng ở nhiều địa phương trên cả nước, việc
sản xuất trong nước chủ yếu để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng của người dân như làm giá,

làm bánh. Các sản phẩm làm từ đậu xanh rất phong phú nhưng hiện nay chỉ một số ít
5


sản phẩm có chất lượng ổn định và có thương hiệu lâu năm trên thị trường như bánh
đậu xanh là một đặc sản của tỉnh Hải Dương.
Ngày nay, đậu xanh có xu hướng gia tăng về diện tích và sản lượng do nhu
cầu sử dụng. Để đạt được kết quả tốt cần có các phương pháp lai tạo, áp dụng kỹ
thuật di truyền để tạo ra các giống mới có năng suất cao, chống chịu được các điều
kiện khắc nghiệt của môi trường.
2.2. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
2.2.1. Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Rhizobiaceae
Chi: Agrobacterium
Hình 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium.

Loài: Agrobacterium rhizogenes

()

()
2.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium rhizogenes (trước đây được gọi là Phytomonas rhizogenes) như là
một tác nhân gây bệnh thực vật với triệu chứng rễ tóc hoặc bệnh thảm rễ.
Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn gram âm, sống trong đất, hình que, có tính di

động, không sinh bào tử, thuộc chi Agrobacterium. Vi khuẩn A. rhizogenes có quan hệ
rất gần với A. tumefaciens là tác nhân gây khối u sần trên cây.
Đến nay, những hiểu biết cơ bản về cơ chế phân tử của sự biến nạp gen thực vật
bởi những thành viên của chi Agrobacterium đều là dựa trên những nghiên cứu mở
rộng sử dụng A. tumefaciens. Quá trình lây nhiễm được xem như là tương tự nhau
trong cả 2 loài. Agrobacterium rhizogenes lây nhiễm vào tế bào thực vật ở vị trí vết
thương do A. rhizogenes bị thu hút bởi hợp chất phenol được tiết ra từ những tế bào bị
tổn thương. Ri plasmid của A. rhizogenes sẽ xâm nhập vào tế bào thực vật và một đoạn
nhỏ của Ri plasmid là T-DNA sẽ được chuyển và gắn vào bộ gen của tế bào thực vật.
Theo cách này T-DNA được duy trì ổn định trong bộ gen mà nó chuyển vào. Từ vùng
bị nhiễm sẽ tạo ra những rễ nhánh bất thường gọi là rễ tóc. Những rễ này có đặc điểm
là phát triển ăn nghiêng, phân nhánh nhiều, tăng trưởng nhanh (Tepfer, 1984;
6


Balandrin và cs, 1985; Charlwood và Charlwood, 1991; Flores và cs, 1999 - trích dẫn
bởi Veena và Taylor, 2007). Một đặc tính quan trọng của rễ tóc là chúng có khả năng
phát triển in vitro trong điều kiện không có các yếu tố kích thích tăng trưởng (Rao và
Ravishankar, 2002). Những đặc tính này làm cho rễ tóc trở thành một công cụ được sử
dụng rộng rãi trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp, khảo sát chức năng gen, và
nghiên cứu sinh học rễ nói chung.
Vi khuẩn A. rhizogenes có một vùng DNA lõi được bảo tồn cao thiết yếu cho sự
hình thành rễ tóc (Filetici và cs, 1987). Các chủng A. rhizogenes có thể được phân loại
vào nhiều nhóm phụ khác nhau dựa trên kiểu opine mà chúng sản xuất ra. Trong đó,
hai nhóm chính là các chủng thuộc dòng agropine (ví dụ như A4, 15834, HRI,
LBA9402, 1855) cảm ứng rễ để tổng hợp agropine, mannopine và các axit tương ứng,
và dòng mannopine (ví dụ như 8196, TR7, TR101) cảm ứng rễ để sản xuất mannopine
và các axit tương ứng (Rhodes và cs, 1990 – trích dẫn bởi Sevón và cs, 2002). Ngoài
ra, còn có dòng cucumopine (đại diện là chủng 2659) và mikimopine (đại diện là
chủng 1724). Mikimopine và cucumopine là những chất đồng phân lập thể, nhưng

không có tính tương đồng giữa các gen tổng hợp opine ở mức độ nucleotide. Trong số
các dòng A. rhizogenes khác nhau thì K47, K599 và HRI là các dòng gây độc cao có
khả năng lây nhiễm cho nhiều loài thực vật khác nhau.
2.2.3. Cơ sở phân tử và sinh lý của sự hình thành rễ tóc
Quá trình hình thành rễ tóc có thể được chia thành 4 bước: kích hoạt, xử lý,
sự di chuyển của DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật, và sau đó là sự cảm ứng
hình thành rễ và tăng trưởng. Trong đó, 3 bước đầu tiên được hiểu nhiều hơn nhờ
các nghiên cứu sâu ở A. tumefaciens chủng C58. Sự lây nhiễm và chuyển gen bằng
A. rhizogenes như thế nào sau đó dẫn tới kiểu hình của sự hình thành rễ tóc và sự
tăng sinh vẫn còn chưa hiểu rõ.
Ri plasmid của A. rhizogenes có cấu trúc tương tự với Ti plasmid của
A. tumefaciens, cả hai đều có kích thước lớn (200 – 800 kb). Các cơ chế của sự hoạt
hóa và vận chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật được bảo tồn giữa 2 loại
plasmid. Trong cả Ri và Ti plasmid, hai bên T-DNA có đoạn lặp lại dài khoảng 25
bp, được gọi là trình tự biên (Yadav và cs, 1982). T-DNA mang một nhóm gen vir
gây độc và gen dị hóa opine, biểu hiện ở tế bào thực vật chuyển gen là sự phát triển
bất tận của mô và sự sản xuất opine, các dẫn xuất amino acid hầu như được vi khuẩn
7


sử dụng độc quyền như là nguồn carbon và nitrogen (Guyon và cs, 1980). Chúng
chứa các gen chịu trách nhiệm cho xử lý, bám dính và chuyển T-DNA đến tế bào
thực vật, và cho chuyển hóa các opine trong mô thực vật (Chilton và cs, 1982).
Mặc dù tương tự nhau trong thành phần cơ bản và cơ chế chuyển gen nhưng
Ri và Ti plasmid vẫn tồn tại một số khác biệt (Moriguchi và cs, 2001). Ví dụ như
vùng T-DNA của Ti plasmid chứa các gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine trong
khi Ri plasmid chỉ mang các gen tổng hợp auxin và opine, gây ra hiệu quả tác động
khác nhau lên thực vật. Ri plasmid của A. rhizogenes không chứa trình tự overdrive
được tìm thấy trong Ti plasmid của A. tumefaciens. Trình tự overdrive 24 bp với 1
trình tự trung tâm 8 bp được bảo tồn nằm liền kề biên phải trên Ti plasmid

(Shurvinton và Ream, 1991) và được biết là làm gia tăng hiệu quả hình thành khối u
bằng cách tăng cường xử lý biên T-DNA. Trong khi đó, biên phải TR của Ri plasmid
có một trình tự lặp lại 8 bp gọi là trình tự kích thích vận chuyển T-DNA (TSS), nó
tăng cường hiệu quả chuyển T-DNA vào hệ gen thực vật (Hansen và cs, 1992). TSS
gồm 12 lần lặp lại trình tự 5-TGCCTTCG-3 ở các chủng dòng mikimopine, 6 lần lặp
lại trình tự 5-ATTAGTTC-3 ở các chủng dòng mannopine, 5 lần trình tự 5TTGTTCAA-3 ở các chủng dòng agropine, và 16 lần trình tự 5-GTTCGTCA-3 ở các
chủng A. rhizogenes dòng cucumopine.
Một sự khác biệt nữa là việc thiếu gen virE1 và virE2 trong Ri plasmid và bộ
gen A. rhizogenes (Moriguchi và cs, 2001; Hogdes và cs, 2004). VirE2 là một protein
liên kết với DNA chuỗi đơn, và virE1 là chất tiết đi kèm của nó. Chức năng của
virE2 là bảo vệ T-DNA sợi đơn khỏi sự phá hủy của nuclease (Rossi và cs, 1996) và
thúc đẩy sự xâm nhập nhân của nó trong tế bào thực vật (Yusibov và cs, 1994; Rossi
và cs, 1996; Zupan và cs, 1996; Gelvin, 1998). Các gen virE rất quan trọng cho sự
phát sinh bệnh của A. tumefaciens nhưng không phải là thiết yếu cho sự cảm ứng rễ
tóc (Moriguchi và cs, 2001). Vi khuẩn A. rhizogenes chứa gen GALLS trên Ri
plasmid, có thể thay thế chức năng của gen virE2 trong A. tumefaciens. Cả GALLS
và virE2 đều chứa trình tự định vị nhân và một tín hiệu tiết loại IV đầu C. Tuy nhiên,
cơ chế mà protein GALLS có thể thay thế chức năng VirE2 trong A. rhizogenes vẫn
chưa được biết đến.

8


Tất cả các chủng A. rhizogenes đều chứa một vùng T-DNA trên Ri plasmid
mang những gen liên quan đến khởi xướng và phát triển rễ (gen rol), các gen liên quan
đến sinh tổng hợp opine, và các gen chưa rõ chức năng (Slightom và cs, 1986). Một
T-DNA thứ 2 có thể xuất hiện chứa những gen liên quan đến sự tổng hợp auxin (aux1
hoặc iaaM và aux2 hoặc iaaH) cùng với các gen chưa rõ chức năng khác. Ri plasmid
với hai T-DNA (TL và TR) được gọi là “slipt” T-DNA. Ri plasmid của các chủng sản
xuất cucumopine và mannopine chỉ có

một vùng T-DNA, chủng sản xuất
agropine có một split T-DNA, mỗi vùng
có kích thước khoảng 15-20 kb. Cả TLDNA và TR-DNA đều được chuyển và
tích hợp một cách độc lập vào bộ gen cây
chủ, việc chuyển TL-DNA là cần thiết cho
sự cảm ứng rễ tóc (Phelep và cs, 1991;
Nilsson và Olsson, 1997; Sevon và

Hình 2.3 Cấu trúc Ri plasmid của
A. rhizogenes (Veena và Taylor, 2007).

Oksman-Caldentey, 2002).
2.2.4. Các gen rol của Ri plasmid

Các gen liên quan đến cảm ứng rễ tóc đều nằm trên TL-DNA (Cardarelli và cs,
1987). TL-DNA của Ri plasmid dòng agropine có chứa 4 locus rolA, rolB, rolC, rolD
tương ứng với các khung đọc mở ORF 10, 11, 12, 15. Ba gen rolA, rolB, rolC đóng
vai trò quan trọng nhất trong cảm ứng rễ tóc. Đặc biệt, rolB có vẻ là quan trọng nhất
trong quá trình phân biệt các tế bào chuyển đổi, trong khi rolA và rolC cung cấp với
các chức năng phụ trợ (Palazón và cs, 1997 – trích dẫn bởi Sevón và cs, 2002).
TR-DNA chỉ thấy trong Ri plasmid của A. rhizogenes dòng agropine chứa các
gen (aux1, aux2, RolB TR, mas1, mas2 và ags) kiểm soát quá trình tổng hợp opine
và auxin (Christey, 2001). Các gen aux không đóng vai trò thiết yếu cho sự sản xuất
rễ tóc (Cardarelli và cs, 1987). Các dòng A. rhizogenes sản xuất các opine như
mannopine, cucumopine, hay mikimopine chuyển một đoạn T-DNA đơn tương đồng
với TL-DNA của agropine nhưng không có gen rolD (Meyer và cs, 2000; Christey,
2001). T-DNA của các chủng sản xuất cucumopine và mannopine không có các gen
aux mà chỉ có gen rol và đủ cho việc tạo ra kiểu hình rễ tóc (Veena và Taylor, 2007).
9

Gen rolA được tìm thấy trên tất cả các Ri plasmid. Tuy nhiên, chỉ có một nửa
số protein đầu N được bảo tồn cao trong các chủng A. rhizogenes được nghiên cứu
(Britton và cs, 2008). RolA đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành rễ tóc và có
liên quan đến sự mất cân bằng hormon thực vật như làm giảm auxin, cytokinin,
giberellin và axit abscisic (Dehio và cs, 1993). Trình tự gen rolA của nhiều dòng A.
rhizogenes khác nhau dài khoảng 279 – 423bp (Meyer và cs, 2000).
RolB là gen gây độc quan trọng nhất, biểu hiện một mình rolB cũng đủ để
cảm ứng rễ tóc (Britton và cs, 2008). Phụ thuộc vào dòng vi khuẩn, gen rolB có
kích thước từ 762 – 837 bp và mã hóa một protein 259 – 279 amino acid (Meyer
và cs, 2000). Sự biểu hiện của rolB ở mức độ thích hợp cần thiết cho rễ tóc tăng
trưởng vì mức độ biểu hiện cao hay thấp sẽ làm suy yếu sự tăng trưởng của những
cơ quan này (Tanaka và cs, 2001).
Gen rolC từ các Ri plasmid khác nhau tương tự về kích thước với khoảng 540
bp và mã hóa protein có 179 - 181 amino acid. Sự biểu hiện của rolC ảnh hưởng đến
sự cân bằng của các cytokinin dạng tự do và kết hợp, cũng như auxin và gibberellins
(Estruch và cs, 1991b; Nilsson và cs, 1993b, 1996a, b). Biểu hiện của rolC cũng làm
giảm đáng kể mức độ axit abscisic (ABA), polyamine, và ethylene (Nilsson và cs,
1996a; Martin-Tanguy 1996, 2001 - trích dẫn bởi Veena và Taylor, 2007).
Gen rolD chỉ được tìm thấy trong T-DNA của Ri plasmid dòng sản xuất
agropine. Nó có kích thước 1.032 bp và mã hóa một protein có 344 amino acid
(Meyer và cs, 2000), đó là một enzyme ornithine cyclodeaminase xúc tác chuyển hóa
ornithine thành proline. Sự biểu hiện của rolD trong cây chuyển gen sẽ kích thích ra
hoa sớm, tăng số lượng hoa và có thể có liên quan đến năng suất của cây. Thêm vào
đó, sự tích lũy proline có thể là một phản ứng bảo vệ liên quan đến stress. Bên cạnh
các gen rol, T-DNA của Ri plasmid còn chứa một vài ORF mà sự có mặt của nó ảnh
hưởng tới sản xuất rễ tóc như là ORF 3, 8 và 13 (Veena và Taylor, 2007).
2.2.5. Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật
Các vùng T-DNA của cả A. tumefaciens và A. rhizogenes đều nằm ở bên cạnh
trình tự biên và các điểm kết thúc của T-DNA đã hợp nhất trong genome thực vật nằm

sát với các trình tự này. Trình tự liên ứng của biên T-DNA là GGCAGGATATTC/GA/G
GT/GTCTAAA/TT/C. Hầu hết các nghiên cứu cơ chế chuyển T-DNA từ Agrobacterium
vào tế bào thực vật đã được tiến hành ở A. tumefaciens. Việc loại bỏ biên phải của Ti10


plasmid dòng nopaline đã làm mất sự hình thành khối u, nhưng khi đoạn
oligonucleotid tương đồng với biên phải được tạo dòng với sự định hướng chính xác
với Ti plasmid thiếu biên phải thì sự hình thành khối u lại được phục hồi, cho thấy
rằng các trình tự lặp lại 25 bp phân cực và tác động cis.
Sự tiếp xúc của Agrobacterium với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị
tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti plasmid phiên mã. Trong quá trình này một
chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là acetosyringone.
Gen virA và gen virC được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù
gen virC chỉ được phiên mã ở mức độ thấp. Khi Agrobacterium gặp dịch rỉ của các
tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc acetosyringone tinh khiết, sản phẩm của gen
virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với acetosyringone và
truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen virC.
Sau đó protein VirC đã biến đổi làm cho hoạt hóa các gen virB, C, D và E không
hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen virC.
Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các
trình tự biên 25 bp nằm ở mép của T-DNA (Stachel và Zambryski, 1986; Albright,
1987) và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch thẳng tương ứng với T-DNA. Các sản
phẩm của operon virD có hoạt tính endonuclease (Yanofsky, 1986). Bằng một cơ
chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật và
xen một cách ổn định vào DNA nhân (Stachel và Zambryski, 1986). Sự kiện này có
thể liên quan đến protein được mã hóa bởi operon virE (Winans, 1987) (Trần Quốc
Dung và cs, 2006).
2.3. Một số nghiên cứu chuyển gen qua trung gian Agrobacterium ở đậu xanh
Những nghiên cứu về chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium đã
được thực hiện trên nhiều loài thực vật khác nhau cả cây lương thực và cây dược

liệu như khoai tây, khoai lang, thuốc lá, đậu nành, cà độc dược, thanh hao và nhân
sâm. Tuy nhiên, những nghiên cứu chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium vào
cây đậu xanh vẫn còn rất hạn chế không chỉ ở trong nước mà ở cả nước ngoài, đặc
biệt là chuyển gen bằng A. rhizogenes. Pal và cộng sự (1991) là người đầu tiên
phục hồi thể biến nạp trên sự chọn lọc kanamycin từ lá mầm của đậu xanh được ủ
với vi khuẩn A. tumefaciens.
11


Tazeen và Mirza (2004) đã sử dụng A. tumefaciens chủng C58C1 (pGV2260)
chứa vector nhị phân p35SGUSINT với gen chọn lọc nptII và gen chỉ thị gus cho khảo
sát các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen qua trung gian Agrobacterium ở V. radiata
giống NM92 (khả năng nảy mầm tốt hơn so với giống NCM 209 và NM98). Vi
khuẩn được tăng trưởng qua đêm ở 28 - 300C trong môi trường YEB chứa 50 mg/l
kanamycin và ampicillin. Dùng kanamycin 50 mg/l để chọn lọc các tế bào chuyển đổi.
Kết quả đưa ra là biểu hiện GUS tạm thời cao nhất (70%) ở pH môi trường đồng
nuôi cấy bằng 5,8 sau 3 ngày đồng nuôi cấy ở mẫu cấy 2 ngày tuổi. Giá trị pH 5,7
cũng cho kết quả tốt nhưng thấp hơn nữa hiệu quả chuyển đổi sẽ giảm, đặc biệt ở pH
5,0 không có sự biểu hiện GUS. Kéo dài thời gian đồng nuôi cấy quá 3 ngày làm
giảm tần suất chuyển đổi. Mẫu cấy 4 và 6 ngày tuổi cho phần trăm biểu hiện GUS
tạm thời tương ứng là 50% và 30%. Mật độ tế bào vi khuẩn OD560 = 1 được coi là tối
ưu cho tỷ lệ chuyển đổi cao nhất (36,36% biểu hiện GUS), biểu hiện GUS tạm thời
giảm khi giá trị OD thấp hoặc cao hơn đặc biệt thấp nhất (5,8%) là ở OD bằng 1,5.
Các mẫu cấy lá sơ cấp cho thấy hiệu quả chuyển đổi cao (80%) trong khi trụ hạ diệp
(60%) hoặc rễ (40%). Theo Tazeen và Mirza, Jaiwal và cs cũng đã báo cáo kết quả
tương tự (1998, 2001). Mẫu trụ hạ diệp, lá sơ cấp, rễ sau lây nhiễm cũng đã được sử
dụng để tái sinh thành cây chuyển gen nhưng hiệu quả thấp.
Trong năm 2004, Suraninpong và cộng sự cũng báo cáo nghiên cứu “Chuyển
gen qua trung gian Agrobacterium ở đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek)”. Plasmid
pCAMBIA 1301-choA với gen chọn lọc hpt và gen gusA được chuyển vào vi khuẩn

A. rhizogenes chủng K599 và A. tumefaciens chủng EHA105 để đưa gen choA
(cholesterol oxidase) kháng côn trùng vào đậu xanh. Nghiên cứu cũng thực hiện với
chủng vi khuẩn chưa biến nạp plasmid mang gen choA. Hạt giống KPS 1 và SUT 1
được khử trùng và nuôi trên môi trường MS. Lá mầm 2 ngày tuổi của giống KSP1
được tiêm và đồng nuôi cấy 3 ngày với vi khuẩn rễ tóc cho khả năng sản xuất rễ nhánh
cao nhất (96,23%, trung bình 10 rễ trên mỗi mẫu) trong khi nghiệm thức 5 và 7 ngày
tuổi thì hiệu quả tương ứng là 75,47% và 42,86%. Đồng nuôi cấy ở 240C và chuyển
sang môi trường MB (chứa 500 µg/ml timentin) là 280C dưới 16 giờ chiếu sáng. Kết
quả cuối cùng thu được 13,25% dòng dương tính GUS. Chuyển gen với A. tumefaciens
EHA105 pCAMBIA 1301-choA, mẫu 2 ngày tuổi nuôi trên MB chứa 2 µg/ml BAP 4
ngày trước khi lây nhiễm cho hiệu quả chuyển đổi cao nhất (31,25%). Đồng nuôi cấy
12


và nuôi cấy được nuôi lần lượt ở 250C và 25±30C. Nghiên cứu này cho thấy rằng
acetosyringone không dẫn đến tỷ lệ chuyển đổi cao ở đậu xanh mặc dù rễ sản xuất
nhiều, tăng trưởng nhanh ở nồng độ 100 µM acetosyringone kết hợp với 5 hoặc 10
µg/ml BAP nhưng không có sự hoạt động của GUS. Ngoài ra, 250C giúp tăng cường
biểu hiện GUS tạm thời trong khi nhiệt độ càng cao sẽ ức chế sự vận chuyển T-DNA.
Nghiên cứu “Hiệu quả chuyển gen đậu xanh được tăng cường bằng việc sử
dụng các mẫu lá sơ cấp” đã được thực hiện bởi Mahalakshmi và cộng sự (2006). Tác
giả đã sử dụng phương pháp tái sinh trực tiếp từ mẫu cấy được lây nhiễm vi khuẩn để
tạo cây chuyển gen. Hạt giống K-851 được khử trùng và cho nảy mầm trên môi trường
B5 với 3% đường sucrose và 0,7% agar, nuôi ở điều kiện 16 giờ chiếu sáng, 25±10C,
độ ẩm 75%, cường độ ánh sáng 60 μE/m2.s. Các mẫu lá từ cây 10 ngày tuổi được
ngâm trong 5 phút với huyền phù vi khuẩn A. tumefacien chủng C58 có A600 bằng 0,6,
thấm trên giấy lọc vô trùng và đồng nuôi cấy trong 2 ngày. Sau đó, chúng được chuyển
đến môi trường tạo chồi (SIM) đã khảo sát trước đó chứa 200 mg/l cefotaxime trong 1
tuần để loại bỏ vi khuẩn và phục hồi mẫu cấy. Tiếp tục chuyển mẫu vào môi trường
SIM với tác nhân chọn lọc là hygromycin trong 4 tuần rồi đến môi trường tạo rễ

(RIM). Phân tích GUS được thực hiện sau đồng nuôi cấy 3 tuần với 70% biểu hiện
GUS. Các nhà nghiên cứu cũng đã chứng minh sự ổn định của gen chuyển thông qua
phân tích PCR cây chuyển gen T0 và cây thế hệ T1.
“Chuyển gen qua trung gian Agrobacterium ở đậu xanh (Vigna radiata (L.)
Wilczek)” là công trình nghiên cứu của Islam và Islam năm 2010. Hạt đậu xanh
giống BINA-5 được cho nảy mầm trên môi trường WA (Water Agar) không đường.
Hai loại mẫu cấy sử dụng là lá mầm 1 ngày tuổi đến 2 ngày tuổi và CAEA (lá mầm
kèm trục phôi) từ hạt đã khử trùng bề mặt cho nảy mầm qua đêm. Chúng được lây
nhiễm với A. tumefaciens chủng LBA 4404 chứa plasmid nhị thể pBI121 với các
gen đánh dấu là gusA và neomycinphosphotransferase (nptII). Hiệu quả biểu hiện
GUS cao nhất được thu nhận ở mẫu CAEA sau 45 phút ngâm trong dịch khuẩn với
OD600 bằng 1,3 và 3 ngày đồng nuôi cấy. Sau đó mẫu cấy cũng đã được cảm ứng
chồi và rễ để tái sinh thành cây chuyển gen.
Năm 2012, Yadav và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu “Tối ưu hóa chuyển
gen qua trung gian Agrobacterium ở mẫu cấy nốt lá mầm của Vigna radiata”. Chồi
được tái sinh trực tiếp từ nốt lá mầm được tạo vết thương bằng kim tiêm và lây
13


nhiễm A. tumefaciens chủng LBA 4404 (pTOK233) có vector nhị phân pCAMBIA
2301 chứa gen nptII, gus và annexin 1 bj cho thấy hoạt động GUS mạnh hơn so với
chủng EHA105 và C58C1. Khi thí nghiệm với dịch khuẩn có OD 0,5 - 1,5, pH môi
trường 5,8 thì giá trị OD 0,8 cho hiệu quả chuyển đổi cao nhất. Theo tác giả, Jaiwal
và cộng sự (1998, 2001) cũng đã báo cáo kết quả tương tự. Mật độ tế bào vi khuẩn từ
106 - 109 tế bào/cm3 được khảo sát và cho thấy hiệu quả chuyển đổi tăng theo nồng
độ lên 108 tế bào/cm3. Thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy, tuổi mẫu cấy,
nồng độ acetosyringone, môi trường lây nhiễm đều được thử nghiệm. Kết quả là 15
phút ngâm trong dịch khuẩn, 3 ngày đồng nuôi cấy, mẫu từ cây 3 ngày tuổi,
acetosyringone ở nồng độ 100 mM và sử dụng môi trường MSB5 được thấy là cho
kết quả tốt nhất. Ngoài ra, nuôi mẫu cấy trên môi trường tái sinh trước khi lây nhiễm

2 – 3 ngày cũng đóng vai trò trong nâng cao hiệu quả chuyển đổi và phản ứng tái
sinh. Tái sinh cây chuyển gen thu được sau 80 ngày trên môi trường cảm ứng chồi
chứa 100 mg/l kanamycin và 250 mg/l cefotaxime và tạo rễ trên ½ MSB5. Biểu hiện
của gen GUS được phát hiện trong cả cây T0 và T1. Ngoài ra vẫn còn một vài nghiên
cứu khác nhưng chủ yếu vẫn là sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens.

14


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ ngày 1/6/2013 đến ngày 1/12/2013 tại Bộ môn Công
nghệ sinh học và Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh, khu phố 6, phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Thành phố
Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đậu xanh TN 182 sản xuất bởi Công ty TNHH – TM Trang Nông, Bình Chánh,
Thành phố Hồ Chí Minh. Chọn những hạt có kích thước đồng đều nhau để thực hiện
các thí nghiệm trong đề tài.
Vi khuẩn A. rhizogenes chủng ICPB TR7, 18912, ATCC 11325, ATCC 15834
là những chủng vi khuẩn nguyên thủy không mang plasmid tái tổ hợp do TS. Trần Thị
Lệ Minh, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ: dao cấy, kẹp cấy, kéo, đèn cồn, đĩa petri, micropipet, đầu típ,
eppendorf, erlen, ống đong các loại, que cấy.
Thiết bị: tủ lạnh, tủ hút, tủ cấy, nồi hấp, máy lắc, cân phân tích, máy đo pH,
máy ly tâm.
3.2.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường YMA để nuôi cấy vi khuẩn và môi trường YMB lỏng để tăng sinh

vi khuẩn A. rhizogenes.
Môi trường MB5 là môi trường khoáng đa lượng và vi lượng MS (Murashige
và Skoog, 1962) được cải biên để môi trường giàu vitamin hơn bằng cách thay thế
thành phần vitamin trong MS thành vitamin B5 của Gambrog và cộng sự (1968) dùng
để nuôi mẫu cấy cảm ứng rễ tóc sau khi đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn A. rhizogenes
và nuôi tăng sinh rễ tóc.
Môi trường MS (bổ sung chất điều hòa sinh trưởng) dùng để nuôi mẫu rễ tóc
đậu xanh cho cảm ứng tạo mô sẹo.

15