NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ VÀ KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHỒI CỦA CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ
VÀ KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHỒI CỦA CÂY CỎ NGỌT
(Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ NHẬT LỆ

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013

i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ
VÀ KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHỒI CỦA CÂY CỎ NGỌT
(Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TÔN TRANG ÁNH

NGUYỄN THỊ NHẬT LỆ

KS. TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 06/2013
ii


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.
Các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố
Hồ Chí Minh đã giảng dạy và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.
Cô Tôn Trang Ánh và cô Tô Thị Nhã Trầm đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ rất
nhiều và động viên, nhắc nhở tôi trong suốt thời gian làm đề tài.
Các bạn Lê Thị Ngân Hà, Huỳnh Phước và toàn thể lớp DH09SH đã động viên và
giúp đỡ lúc tôi khó khăn nhất.

Cuối cùng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người đã luôn bên con, cho con
niềm tin và nghị lực để vượt qua mọi khó khăn.
Nguyễn Thị Nhật Lệ

iii


TÓM TẮT
Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) (chất làm ngọt tự nhiên) thuộc họ
Cúc và có thể được sử dụng để thay thế các chất làm ngọt nhân tạo cho bệnh nhân
tiểu đường. Thông thường, nó được trồng bằng hạt hoặc cắt cành, nhưng tỷ lệ khả
năng phát triển hạt giống là rất thấp. Nghiên cứu sự phát sinh mô sẹo từ mẫu lá
cây cỏ ngọt làm nguyên liệu và tiền đề cho các nghiên cứu nhằm ứng dụng vào
sản xuất sinh khối thu nhận các hợp chất thứ cấp quý có trong cây. Do đó, đề tài
“Nghiên cứu sự tạo mô sẹo từ mẫu lá và khảo sát sự phát sinh chồi của cây cỏ ngọt
(Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro” được tiến hành.
Các đoạn thân và mẫu lá được khử trùng bề mặt bằng HgCl2 0,1% trong 2 phút
sau đó rửa lại 5 lần với nước cất. Bề mặt mẫu lá đã được khử trùng được nuôi cấy
trên môi trường Murashige và Skoog (MS) với nồng độ các chất điều hòa tăng
trưởng thực vật khác nhau như 2,4 - D và kinetin kết hợp với 2,4 - D. Mô sẹo được
phát sinh hiệu quả khi các mảnh lá được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
0,5 mg/l 2,4 - D kết hợp với 1 mg/l kinetin sau 4 tuần nuôi cấy. Mô sẹo trên được
cấy truyền trên môi trường MS có bổ sung 3 mg/l BA kết hợp với 1 mg/l NAA cho
khả năng nhân chồi cao nhất.
Cảm ứng hình thành chồi từ đoạn thân cao nhất trong môi trường MS bổ sung BA.
Giảm nồng độ BA thúc đẩy quá trình nhân chồi. Số lượng chồi tối đa tăng lên
nhanh chóng đã thu được trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l BA sau 3 tuần nuôi
cấy.

iv

SUMMARY
Stevia rebaudiana Bertoni (natural sweetener) belongs to Asteraceae family and
can be used as substitute of artificial sweeteners for diabetic patients.
Conventionally, it is cultivated by seeds or stem cutting, but seed viability rate is
poor. Study the callus incurred from leaf samples of the Stevia rebaudiana Bertoni,
as materials and the premise for the research to apply in biomass production receive
for secondary compounds in plants. Therefore, the thesis “Research callus
formation from leaf samples and shoots generation of Stevia rebaudiana Bertoni in
vitro” were achieved.
Nodal segments and leaf explants were surface sterilized with 0.1% HgCl2 for 2
minutes followed by rinsing them five times with double distilled water. Surface
sterilized leaf explants were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium with
different concentrations of plant hormone like 2,4 - D and kinetin in combination
with 2.4 - D. Leaf - derived callus was efficiently induced when leaf segments were
cultured on MS medium supplemented with 0.5 mg/l 2.4 - D and 1 mg/l kinetin
after 4 weeks. The above callus was sub - cultured on MS medium with 3 mg/l BA
and 1 mg/l NAA for the highest shoot multiplication.
The induction of multiple shoots from nodal segments was the highest in MS
medium supplemented with BA. Decreasing BA concentration promoted shoot
multiplication. The maximum number of proliferated shoots was obtained on MS
medium supplement with 0.1 mg/l BA after 3 weeks.
Key words: Stevia rebaudiana Bertoni, callus formation, shoots.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................... i

TÓM TẮT....................................................................................................................... iv
SUMMARY..................................................................................................................... v
MỤC LỤC ...................................................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................ x
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................. xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu .................................................................................................................................. 2
1.3 Nội dung thực hiện ................................................................................................................ 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt (Stevia rebaudianna Bertoni) .................................................... 3
2.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................................................................ 5
2.2.1 Khái niệm............................................................................................................................ 5
2.2.2 Các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật...................................................... 5
2.2.2.1 Nuôi cấy phôi .................................................................................................................. 6
2.2.2.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời ................................................................................... 6
2.2.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh ................................................................................................... 6
2.2.2.4 Nuôi cấy bao phấn........................................................................................................... 7
2.2.2.5 Nuôi cấy tế bào đơn ........................................................................................................ 7
2.2.2.6 Nuôi cấy các protoplast................................................................................................... 7
2.2.3 Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật......................................... 8
2.2.4 Một số thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thực vật ..................................................... 8
2.3. Nhân giống vô tính in vitro .................................................................................................. 9
2.3.1. Sinh sản vô tính và hữu tính ............................................................................................. 9
2.3.2. Mục đích của nhân giống in vitro..................................................................................... 9

vi


2.3.2.1 Ưu điểm của vi nhân giống ............................................................................................ 9

2.3.2.2 Hạn chế của vi nhân giống ........................................................................................... 10
2.3.3 Các bước trong nhân giống vô tính in vitro .................................................................... 11
2.3.4. Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro...................... 12
2.3.4.1 Đặc tính của auxin......................................................................................................... 12
2.3.4.2 Đặc tính của cytokinin .................................................................................................. 12
2.3.5. Hệ thống hình thành chồi ................................................................................................ 13
2.3.5.1 Nhân giống thông qua giai đoạn callus........................................................................ 13
2.3.5.2 Tạo chồi bất định ........................................................................................................... 14
2.3.6. Các nhân tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro ........................................................... 14
2.3.6.1 Mẫu nuôi cấy ................................................................................................................. 14
2.3.6.2 Môi trường nuôi cấy...................................................................................................... 15
2.3.6.3 Tính bất định về mặt di truyền ..................................................................................... 16
2.3.6.4 Mẫu đưa vào nuôi cấy................................................................................................... 16
2.3.6.5 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cây ................................................................. 16
2.3.6.6 Hiện tượng thủy tinh thể ............................................................................................... 17
2.4 Nhân giống........................................................................................................................... 18
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................ 19
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 19
3.2 Vật liệu ................................................................................................................................. 19
3.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................... 20
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% và NaOCl 25% tới khử trùng mẫu lá cây cỏ ngọt
..................................................................................................................................................... 20
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo sau 3
tuần nuôi cấy .............................................................................................................................. 21
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4 – D và kinetin đến sự hình thành mô sẹo sau 3
tuần nuôi cấy ............................................................................................................................ 22
vii


3.3.4 Khảo sát sự tạo chồi từ mô sẹo ........................................................................................ 23

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi từ đốt thân ................. 24
3.5 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................................. 24
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 25
4.1 Thời gian và chất khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy lá cây cỏ ngọt ........................... 25
4.2 Ảnh hưởng của 2,4 - D đến sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá sau 3 tuần nuôi cấy ..... 27
4.4 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng tạo chồi của mô sẹo lá .................. 30
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 34
5.1 Kết luận ................................................................................................................................ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 35

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4 - D

2,4 - dichlorophenoxyacetic acid

BA

Benzyladenin

BAP

6-benzylaminopurine

HgCl2

Thủy ngân clorua

IAA

3-indol-acetic acid

IBA

Indol-3-butyric acid

Kinetin

N-(2-furanylmethyl)-1H-purine-6-amine

MS

Môi trường Murashige và Skoog (1962)

NAA

Naphthalene acetic acid

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của HgCl2 và NaOCl đến khử trùng mẫu lá cây cỏ ngọt .....20
Bảng 3.2 Nồng độ 2,4 - D được bổ sung vào môi trường phát sinh sẹo lá ............21
Bảng 3.4 Sự kết hợp giữa BA và NAA trong môi trường tạo chồi từ mô sẹo lá ...23
Bảng 3.5 Nồng độ BA được bổ sung vào môi trường tạo chồi từ đốt thân ...........24
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian và chất khử trùng đến mẫu lá cây cỏ ngọt .....25
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của 2,4 - D đến sự hình thành mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy .27

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của 2,4 - D và kinetin đến sự hình thành mô sẹo và trọng
lượng tươi của mẫu cấy ..........................................................................................28
Bảng 4.4 Cảm ứng phát sinh chồi từ mô sẹo lá......................................................30
Bảng 4.5 Số lượng chồi được tạo thành từ đốt thân trên các loại môi trường .......32 

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cây cỏ ngọt (2004) ..........................................................................................3
Hình 3.1 Mẫu lá và đốt thân cây cỏ ngọt ......................................................................22
Hình 4.1 Mẫ lá cây cỏ ngọt được khử trùng bằng HgCl2 và NaOCl ............................26
Hình 4.2 Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4 - D .......................................................27
Hình 4.3 Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4 – D và kinetin ......................................29
Hình 4.4 Sự hình thành chồi từ mô sẹo lá cây cỏ ngọt .................................................31
Hình 4.5 Chồi mới được tạo thành từ đốt thân cây cỏ ngọt sau 28 ngày. ....................32 

xi


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây cỏ ngọt (Stevia ribaudiana Bertoni) là loại cây rất có triển vọng trong y học và
trong công nghệ thực phẩm. Stevia ribaudiana Bertoni có thể sử dụng để thay thế các
chất làm ngọt nhân tạo cho bệnh nhân tiểu đường. Bệnh tiểu đường là một trong những
nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình là bệnh tim mạch vành, tai
biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư. Ở Anh khoảng 1,6 triệu
người bị đái tháo đường. Tại Hoa Kỳ, số người bị đái tháo đường tăng từ 5,3% năm
1997 lên 6,5% năm 2003 và tiếp tục tăng rất nhanh. Tại Việt Nam, trong 4 thành phố
lớn Hà Nội, Huế, Thành phố Hồ Chí Minh, Hải Phòng tỷ lệ bệnh tiểu đường là 4%.

Ước tính đến năm 2025 sẽ lên tới 330 triệu người (gần 6% dân số toàn cầu). Tỷ lệ
bệnh tăng lên ở các nước phát triển là 42%, nhưng ở các nước đang phát triển (Việt
Nam) sẽ là 170%.
Loại cây này chứa rất nhiều chất có vị ngọt trong đó có stevioside – chất có vị ngọt
gấp 300 lần đường sucrose đóng vai trò là thành phần chủ đạo, không gây độc hại cho
con người, được sử dụng trong y học để dùng cho người bị bệnh đái đường, phòng
chống xơ cứng động mạch ở người già, chống béo phì ở phụ nữ, chống sâu răng,
chống ung thư vòm họng. Trong công nghiệp thực phẩm stevioside là chất phụ gia để
sản xuất bánh kẹo, rượu màu và nước giải khát. Cây có rất nhiều ưu điểm như dễ
trồng, thích nghi rộng rãi với nhiều vùng sinh thái khác nhau, khả năng chống chịu khá
tốt. Trồng cây trên quy mô lớn là một việc làm cần thiết để đảm bảo cung cấp đủ
nguồn nguyên liệu ban đầu cho y học, công nghệ thực phẩm. Hiện nay việc nhân giống
cây bằng cách giâm cành, gieo hạt đang rất phổ biến nhưng có nhiều nhược điểm như
chất lượng không đồng đều, thoái hóa giống, nếu nhân giống bằng giâm cành với số
lượng lớn đòi hỏi phải có đầy đủ trang thiết bị và kỹ thuật cao; việc nhân giống bằng
hạt gặp nhiều khó khăn thường không giữ được đặc tính của giống, thời gian nhân
giống lâu, cây giống không đồng đều. Việc nghiên cứu nuôi cấy mô in vitro thành
công có thể nhân giống vô tính với tốc độ nhanh, tạo cây trồng sạch bệnh và kháng
bệnh, cảm ứng và tuyển lựa các cây trồng đột biến, sản xuất số lượng lớn với độ đồng

1


đều cao. Hiện nay việc nuôi cấy mô tế bào thực vật là công cụ rất tốt cho việc nhân
giống nhanh và nghiên cứu tạo giống mới, có thể khắc phục các nhược điểm của
phương pháp nhân giống truyền thống. Do đó đề tài “ Nghiên cứu sự tạo mô sẹo từ
mẫu lá và khảo sát sự phát sinh chồi của cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) in
vitro” được thực hiện.
1.2 Yêu cầu
Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy, nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng

thực vật đến sự phát sinh mô sẹo từ mẫu lá và quá trình hình thành chồi từ mô sẹo lá,
số lượng chồi được tạo ra từ các đốt thân cây cỏ ngọt.
1.3 Nội dung thực hiện
Khảo sát chất khử trùng và thời gian khử trùng mẫu cấy lá và thân cây cỏ ngọt nhằm
cung cấp nguồn mẫu sạch cho các thí nghiệm sau.
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích sinh trưởng lên khả năng phát sinh
mô sẹo từ nuôi cấy mẫu lá sau 3 tuần nuôi cấy.
Khảo sát khả năng phát sinh chồi từ mô sẹo lá và khả năng tạo chồi từ các đốt thân
cây cỏ ngọt.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt (Stevia rebaudianna Bertoni)
Vị trí phân loại
Giới: Plantae
Ngành: Asterales
Lớp: Asteraceae
Bộ: Eupatorieae
Chi: Stevia
Loài: Rebaudianna

Hình 2.1 Cây cỏ ngọt (2004)

(www.henriettesherban.com)

Stevia là 1 chi gồm 240 loài gồm các loại thảo mộc và cây bụi, có nguồn gốc ở
vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới. Những thế kỉ trước, người dân bản địa đã sử dụng lá
của cây này để làm ngọt các thức uống có vị đắng của họ. Stevia có nguồn gốc hoang

dã ở miền Nam nước Mỹ, ngoài ra còn có thể tìm thấy ở trong các môi trường bán khô
hạn khác nhau, từ đồng cỏ đến địa hình rừng núi.
Cây cỏ ngọt là loại cỏ sống lâu năm, 6 tháng sau khi trồng gốc bắt đầu hoá gỗ, mỗi
gốc có nhiều cành (nếu để mọc tự nhiên cây có thể cao đến 100 cm). Cành non và lá
đều phủ lông trắng mịn, lá mọc đối, hình mũi mác, dài 30 - 60 mm, rộng 15 - 30 mm,
có 3 gân chính xuất phát từ cuống lá. Mép lá có răng cưa ở nửa phần trên. Cụm hoa
hình đầu, mỗi tổng bao có chứa 5 hoa nhỏ, tràng hình ống, màu trắng ngà, có 5 cánh
nhỏ. Có hai vòi nhụy dài đưa ra ngoài, hoa có mùi thơm nhẹ (hình dáng giống hoa cỏ
Lào nhưng nhỏ hơn nhiều), mùa hoa từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau. Toàn
thân có vị ngọt, nhiều nhất ở lá, lá già chết khô ở dưới nhưng cuống rất dai nên không

3


rụng (vẫn còn vị ngọt). Cỏ ngọt sinh sản hữu tính (gieo hạt) và vô tính (giâm cành) là
cây ưa ẩm, ưa sáng nhưng sợ úng và chết khi ngập nước.
Stevia là loại cây có xu hướng phát triển tốt trên nhiều loại đất khác nhau từ đất cát
đến đất sét pha bùn nhưng sẽ không phát triển trong đất mặn. Trong mùa sinh trưởng,
chúng phát triển mạnh trong phạm vi nhiệt độ từ 15 – 30oC, đòi hỏi các kỹ thuật canh
tác tương tự các cây trồng khác. Các bộ phận được dùng là cành mang lá phơi hoặc
sấy khô (khi đoạn cành dài khoảng 20 - 25 cm là thời điểm cắt cành, trung bình mỗi
tháng có thể được một lần thu hoạch).
Các hoạt chất chính trong cây: Lá Stevia được sử dụng lâu đời như một chất làm
ngọt do có sự hiện diện của tinh thể ngọt glucoside. Stevioside (là một glucoside) có vị
ngọt gấp 250 - 300 lần đường kính (saccharoza), nhưng stevioside không sinh năng
lượng, không lên men, nhiệt độ nóng chảy 95oC, có một tuổi thọ dài (Swiss, 1899).
Sản phẩm của nó có thể được thêm vào đồ nấu nướng, chế biến thực phẩm hoặc đồ
uống không gây độc hại cho người, không đòi hỏi kỹ thuật sản xuất phức tạp, năng
suất cao, công nghệ thu hái chế biến đơn giản. Các công bố khoa học cho thấy cỏ ngọt
có thành phần chống ung thư vòm họng, phòng và chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp,

chống béo phì. Trong cỏ ngọt khô (cả cành lá) chứa khoảng 1,5% chất ngọt stevioside
(trong lá chứa khoảng 6 - 7% stevioside). Như vậy 100 g cỏ ngọt khô có lượng chất
ngọt tương đương 400 - 450 g đường kính.
Ngày 4 tháng 7 năm 2008 Tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hợp Quốc
(FAO) phê chuẩn và Cục quản lí dược và thực phẩm Mỹ (FDA) cho phép vào ngày 17
tháng 12 năm 2008 về việc sử dụng cây cỏ ngọt để chế xuất chất làm ngọt. Đường
chiết xuất từ cây cỏ ngọt (Stevia) đang trở thành mặt hàng thiết yếu và an toàn, cụ thể
là các hãng thực phẩm lớn trên thế giới như Coca, Pepsi, Cargill đang sử dụng đường
cỏ ngọt thay đường mía.
Cây cỏ ngọt được nhập vào Việt Nam tháng 8 năm 1988. Ngày nay cỏ ngọt đã được
phát triển trên nhiều vùng ở trong nước, từ các tỉnh miền núi phía Bắc như: Hà Giang,
Cao Bằng, Sơn La, Bắc Thái, Vĩnh Phú, Hoà Bình, Hà Tây, Hải Hưng, Hà Nội cho đến
các tỉnh phía Nam như Bình Dương, Bình Phước, Lâm Đồng (Đà Lạt), Đắk Lắk.

4


2.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1 Khái niệm
Sự thành công của công nghệ sinh học dựa trên nền tảng cơ bản là kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào thực vật. Sự hiểu biết những đặc điểm sinh học của các loại cây là một
điều kiện tiên quyết cho việc sử dụng hợp lí các hệ thống và bộ phận của chúng. Nuôi
cấy mô tế bào thực vật giúp cung cấp sự hiểu biết cơ bản về những yêu cầu vật lí, hóa
học của sự nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan, sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Quá
trình nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan và việc nhân giống cây trồng dưới điều kiện in vitro
đã mở ra con đường mới cho lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật.
Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do
Haberland nêu ra năm 1902. Theo quan niệm của công nghệ sinh học hiện đại thì tính
toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông
tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế

bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Quá trình phát sinh hình thái
của nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa
của tế bào.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật, mô và các cơ
quan trên môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng và những điều kiện điều khiển
của ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm. Sự phát triển của nuôi cây mô tế bào thực vật như một
nền khoa học cơ bản là mối liên kết chặt chẽ với sự khám phá và điều khiển các đặc
tính của cây, đã tạo cho chúng ta sự hiểu biết về sự tăng trưởng và phát triển của thực
vật. Hơn thế nữa, khả năng phát triển của tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy còn
được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, công nghiệp, và là điều kiện tiên quyết cho
kỹ thuật di truyền gen thực vật (Evans và cộng sự, 2003).
2.2.2 Các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm dùng chung cho tất cả các loại nguyên
liệu thực vật hoàn toàn sạch được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, ở
điều kiện vô trùng. Bao gồm các kỹ thuật như nuôi cấy phôi, nuôi cấy mô và các cơ
quan tách rời, nuôi cấy mô phân sinh, nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy tế bào đơn và nuôi
cấy các protoplast.

5


2.2.2.1 Nuôi cấy phôi
Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là sự tách phôi Phascolus và Fagopyrum
trong đất (Charles bonnet, thế kỷ 18) nhưng nhận được cây là cây lùn. Từ đầu thế kỉ 20
các công trình nuôi cấy mô được hoàn thiện hơn. Năm 1922, Knudson đã nuôi cấy
thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và ông khám phá ra nếu thiếu
đường thì phôi không thể phát triển thành protocom.
Năm 1976, Raghavan đã công bố rằng phôi phát triển qua 2 giai đoạn dị dưỡng và
tự dưỡng, ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hòa sinh trưởng để
phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hòa

sinh trưởng.
Đối với nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng. Ngoài ra một số chất tự
nhiên như nước dừa, nước chiết malt là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Các chất
điều hòa sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinin thường được dùng nhiều trong môi
trường nuôi cấy.
2.2.2.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
Các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi (Wetmore,
1946). Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận của các cây là khác nhau nhưng
có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn carbon dưới dạng đường và các muối của
nguyên tố đa lượng (nito, phospho, kali, canxi) và vi lượng (Mg, Fe, Co, Zn). Ngoài ra
cần một số chất đặc biệt như vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng.
Đối với nuôi cấy mô sẹo thì môi trường giàu auxin mô sẹo sẽ được hình thành. Mô
sẹo là những tế bào không phân hóa, thường được tạo ra do quá trình tạo cơ quan nhất
là trong sự tạo rễ. Sự tạo mô sẹo nhờ auxin gồm 3 quá trình: sự phản phân hóa của tế
bào nhu mô hoặc sự phân chia của tế bào tượng tầng hoặc sự xáo trộn của các mô phân
sinh sơ khởi. Khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi
trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Cây tái sinh từ mô sẹo có nhiều chồi hơn
so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao.
2.2.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh
Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi sinh trưởng và cành, có kích thước
khoảng 0,58 – 1 cm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non,
các chồi mới hình thành hoặc các cành non.

6


Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống
in vitro, ngoài ra còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo
cây đa bội.
2.2.2.4 Nuôi cấy bao phấn

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu
trên cây thuốc lá (Bourgin và Nitsch, 1967) và cây lúa (Niixeki và Ono, 1968).
Kết quả nghiên cứu cho thấy cây đơn bội được tạo ra từ việc nuôi cấy túi phấn
hoặc hạt phấn theo 2 cách: phôi phân hóa trực tiếp từ hạt phấn và phát triển thành cây
hoàn chỉnh (trực tiếp); hoặc hạt phấn phải qua giai đoạn mô sẹo sau đó hình thành phôi
hay chồi bất định rồi phát triển thành cây hoàn chỉnh (gián tiếp). Việc tạo ra thể đơn
bội rồi sau đó nhân đôi nhiễm sắc thể của các thể đơn bội để tạo ra các cá thể nhị bội
đồng hợp tử giúp rút ngắn thời gian trong các quá trình di truyền và chọn giống.
2.2.2.5 Nuôi cấy tế bào đơn
Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được
tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Tế bào đơn có thể nhận được bằng con
đường nghiền mô, hoặc xử lí enzyme. Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi
những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau.
Nuôi cấy tế bào đơn được dùng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh
hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát triển và phân
hóa của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn giống tế bào.
2.2.2.6 Nuôi cấy các protoplast
Nuôi cấy các protoplast được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960). Ông là
người đầu tiên dùng enzyme để thủy phân thành tế bào và tách được protoplast từ rễ cà
chua. Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới,
phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Do không có thành tế bào nên protoplast trở nên một đối tượng lí tưởng trong
nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast
có thể tạo ra các cây lai soma. Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp
protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gen (Trần Văn Minh, 2003).

7


2.2.3 Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn trong việc nghiên cứu lý
luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp trong thực tiễn sản xuất và
đời sống.
 Về mặt lý luận sinh học cơ bản: Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có
thể tiến hành so sánh những đặc tính của cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách
rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra quy luật về mối tương quan của các bộ phận trong cây. Kỹ
thuật nuôi cấy mô giúp chúng ta phân biệt được từng giai đoạn theo chu kỳ phát triển
của cá thể một các cụ thể và chính xác. Điều này tạo thuận lợi cho việc nghiên cứu các
quy luật sinh trưởng, phát triển cùng với mối quan hệ của thực vật với môi trường bên
ngoài. Từ đó có thể thúc đẩy cây trồng phát triển theo chiều hướng mong muốn. Ngoài
ra, bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào có thể tìm hiểu và tiến hành nghiên cứu
mối quan hệ khởi đầu giữa kí sinh và kí chủ. Như vậy nhiều vấn đề về bệnh lý được
giải quyết một cách cơ bản.
 Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục
tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quý có giá trị kinh tế cao. Kiểm soát được
dịch bệnh cây trồng vì hoàn toàn có thể loại bỏ những cá thể nhiễm bệnh hay mang
mầm bệnh. Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống
đem vào sản xuất, toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch. Tạo ra sự
đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt về sản phẩm.
2.2.4 Một số thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thực vật được bắt đầu bằng thành công của
White (1934) nuôi cấy được một dòng rễ cà chua sinh trưởng mạnh và liên tục. Sau đó,
năm 1938 Nobecourt thu được phân bào ở mô củ cà rốt Daucus carota, White đã nuôi
cấy được mô tượng tầng của cây thuốc lá Nicotiana glauca lai với N. langsdorffi. Năm
1949, Camus ghép chồi lên khối mô nuôi cấy và thấy quá trình phân hóa ống mạch xảy
ra trong khối mô. Năm 1956, Miller và Skoog đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá
nuôi cấy. Trong giai đoạn này, Skoog đã phát hiện ra kinetin là một chất điều khiển
quá trình phân bào và phân hóa chồi. Từ năm 1958 đến năm 1959, Steward và Reinert
đã sử dụng nước dừa vào nuôi cấy tế bào cà rốt và đã thu được phôi từ tế bào cà rốt
nuôi cấy.

8


Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan
trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào thực vật
đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả của chúng trong nhiều lĩnh vực.
2.3. Nhân giống vô tính in vitro
2.3.1. Sinh sản vô tính và hữu tính
 Nhân giống theo cấu trúc tự nhiên của thực vật:
Dạng căn hành (bull): lá được sắp xếp chồng lên nhau, bên ngoài có lớp lá bảo
vệ, lá là nhu mô dự trữ dày và xốp. Dạng căn hành thường được thấy ở họ hoa tulip, họ
hành...
Dạng giò (corm): nhu mô dự trữ lớn, dây có cấu tạo giống như căn hành, nằm
dưới gốc thân, dạng giò thường được thấy ở hoa gladiolus.
Dạng củ (rhizome): dây có cấu tạo như thân rễ nằm chìm dưới mặt đất, phía
trên là vòm tăng trưởng chứa chồi thân dạng này thường được thấy ở họ hoa iris.
Thân bò (stolom): nhánh hay thân mỏng manh, thường là dạng thân bò, chóp
ngọn là một cây hoàn chỉnh thấy ở cây dâu tây.
Dạng căn hành nhỏ (bulbil): giống căn hành, tròn nằm ở nách lá thấy ở hoa lily.
 Nhân giống theo phương thức nông học:
Giâm cành (cutting): thường là một đoạn thân, nhánh không có chồi lá và rễ,
sau một thời gian đoạn thân hay nhánh bắt đầu ra rễ và chồi bên.
Chiết cành (marcots): là một đoạn thân, một đoạn thân đã được tách lớp biểu bì
và được bó lại bằng vật liệu có cơ cấu xốp nhằm duy trì độ ẩm, sau một thời gian lớp
được tách biểu bì ra rễ.
Ghép cành (grafis): phần dưới là thân của một giống, phần trên có thể cùng
giống hoặc khác giống. Phần trên là một đoạn thân, nhánh hay mắt mầm. Gốc ghép
thường mang đặc tính chống chịu (Trần Văn Minh, 2003).
2.3.2. Mục đích của nhân giống in vitro

2.3.2.1 Ưu điểm của vi nhân giống
Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kì đều có thể tạo ra một quần
thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại dù
cây đó là dị hợp về mặt di truyền.

9


Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp công nghệ vi
nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo
ra thành hàng triệu cây.
Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng. Nó
tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
Tiết kiệm không gian: Vì quá trình nhân giống hoàn toàn trong phòng thí nghiệm,
không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây
tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và
trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại
trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra
bằng cây mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc.
Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác nhau
có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro (trong ống nghiệm) hoặc
trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ.
Lợi thế về vận chuyển: Các cây non kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ
dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng xác nhận là sạch
bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng qui định về vệ sinh thực phẩm quốc tế.
Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kì thời gian nào,
không phụ thuộc vào mùa vụ.
2.3.2.2 Hạn chế của vi nhân giống
Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất

cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây trồng
có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương
mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn đề về lí thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái
sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp.
Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do
đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền thống như chiết, ghép
và nhân giống bằng hạt.
Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiều hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác
với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ
được đặc tính quý của cây mẹ. Tỉ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống,
10


nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất
sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm sản xuất hàng
triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền.
2.3.3 Các bước trong nhân giống vô tính in vitro
Theo Geogre (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm:
Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ: Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc
cẩn thận cây mẹ (nguồn mẫu ban đầu). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là sạch
virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng cây mẹ trong điều kiện môi trường
thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi
cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu.
Nuôi cấy khởi động là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu cấy in vitro. Các giai
đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồn tại
và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của
cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối
cùng là đoạn thân và mảnh lá.
Nhân nhanh là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và nhân
nhanh số lượng thông qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo

phôi vô tính. Cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để
có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích
thích tạo chồi. Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25 – 27oC, thời gian chiếu sáng là 16
giờ/ngày với cường độ chiếu sáng 2000 – 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối
tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy khác nhau.
Tạo cây in vitro hoàn chỉnh: Để tạo rễ cho chồi người ta thường chuyển chồi từ
môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Một số chồi có thể tạo rễ sau khi
chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất
kích thích sinh trưởng.
Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên: Để đưa cây từ ống nghiệm ra
ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo những yêu cầu
sau: cây trong ống nghiệm đã đạt những hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao
cây). Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp, giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. Phải
chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng vườn ươm cũng như có chế độ dinh
dưỡng thích hợp (Lê Văn Hoàng, 2007).
11


2.3.4. Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro
Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹ thuật nuôi
cấy mô và tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh trưởng ở mức
độ thích hợp có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy.
Auxin và cytokinin là 2 chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong
nuôi cấy mô.
2.3.4.1 Đặc tính của auxin
Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong
nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của
môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và
điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó được sử dụng với cytokinin. Sự áp
dụng loại và nồng độ auxin trong các loại môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu

tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi
cấy, sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh (Nguyễn Đức Lượng
và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Cùng với cytokinin
các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào. Các hormone của nhóm này có hoạt
tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng sáng, tính ưu thế ngọn, kích
thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác động của auxin thường liên quan tới độ dài của
thân, đốt, chồi chính, rễ... Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật: IBA (Indoly Butyric
Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α – Naptalen Acetic Acid), 2,4 – D
(Dichlorphenoxy Acetic Acid) (Đỗ Năng Vịnh, 2005).
2.3.4.2 Đặc tính của cytokinin
Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế
bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các
cytokinin thường được sử dụng nhất là BAP (6-Benzyl Amino Purine), kinetin, zeatin,
BA (6-Benzyl Adenine). Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 – 0,2
mg/l. Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành
chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy.
Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua đó tăng kích
thước chồi nuôi cấy... GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất.
12


Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật các loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin,
tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ hợp tỉ lệ khác nhau sẽ
cho hiệu quả tốt hơn (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2005).
2.3.5. Hệ thống hình thành chồi
Sự hình thành chồi có tương quan với hàm lượng etylen và CO2. Chồi phát sinh
nhiều nhất khi trong bình nuôi cấy tích lũy 5 – 8 µM C2H4 và 10% CO2 trong 15 ngày
nuôi cấy, khi hai chất này được tách ra khỏi bình nuôi cấy thì quá trình biệt hóa bị ức

chế. Sau 15 ngày các chất này thoát ra ngoài thì cũng không ảnh hưởng đến quá trình
biệt hóa. Trong 10 ngày đầu tiên CO2 và C2H4 ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa phù
hợp với giai đoạn tăng trưởng và phân chia tế bào dẫn đến sự hình thành vòm đỉnh
sinh trưởng. Như vậy tác động kích thích của C2H4 trong sự phát sinh hình thái có sự
tác động bổ sung của quá trình phân bào.
Sự tác động tương hỗ của C2H4 và CO2 cho thấy quy luật tác động của CO2:
Trong 10 ngày đầu CO2 kích thích quá trình sinh tổng hợp C2H4.
Sau 10 ngày tác động tương phản với C2H4
Sau cùng CO2 tham gia vào quá trình trao đổi chất, tỷ lệ tác động C2H4/CO2 chỉ
có hiệu quả khi có mặt CO2 và O2 duy trì quá trình trao đổi oxy hóa ở mô SF (shoot
forming) và SNF (non shoot forming): chồi mầm được nuôi cấy trên môi trường không
có BA, phát sinh chồi sau 3 ngày thì tiến hành phân chia tế bào và không phân chia
trong môi trường có BA thì sự hình thành chồi không xảy ra.
Tóm lại có 3 phương thức tạo cây con trong nhân giống in vitro là mẫu mô trực
tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh; mẫu mô phát sinh callus và callus tạo chồi; mẫu mô
phát sinh callus, callus phát triển phôi (hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh
phôi) và từ phôi thu được cây hoàn chỉnh.
2.3.5.1 Nhân giống thông qua giai đoạn callus
Callus là khối tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo
ra do sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ, hoặc do các điều
kiện đặc biệt như vết thương, xử lý chất điều hòa sinh trưởng (Bùi Trang Việt, 2000).
Trong nhân giống in vitro nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi
cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng đồng nhất về
mặt di truyền. Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà
phát triển thành khối callus. Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về
13


mặt di truyền. Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh,
tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hi vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất. Thông

qua giai đoạn callus còn có thể thu được những cá thể sạch virus (Kehr, Schaffer, 1976).
Cắt mẫu vật từ cây (đoạn thân, mảnh lá...) cấy vào môi trường dinh dưỡng thích
hợp sau đó cấy gây. Từ cấy gây ta có thể tái sinh chồi trực tiếp hoặc cấy vào môi
trường dinh dưỡng phù hợp để tạo callus và từ callus tái sinh chồi (tạo chồi bất định).
Kết thúc của quá trình là tạo rễ in vitro nhằm tạo cây in vitro hoàn chỉnh.
2.3.5.2 Tạo chồi bất định
Đỉnh chồi bất định có thể phát triển trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô
callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật. Một số loại mẫu
vật được dùng như đoạn thân (thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải), mảnh lá (thuốc
lá, cà chua, bắp cải, cà phê, cacao), cuống lá (thủy tiên), các bộ phận của hoa (súp lơ,
lúa mì, thuốc lá), nhánh củ (họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên) và đoạn mầm (măng tây).
Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô nằm trong biểu
bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trở thành mô phân sinh và
các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển. Các thể phân sinh này rõ ràng có nguồn gốc
từ các tế bào đơn. Tuy nhiên chiều hướng phát triển của thực vật cũng phụ thuộc vào
nồng độ phytohormone. Nghiên cứu sự tạo chồi ở mô nuôi cấy của cây linh sam
(Douglas) cho thấy khi bổ sung cytokinin (BAP 5 µM) chỉ có chồi phát triển. Khi nồng
độ auxin cao hơn (NAA > 5 µM) lá mầm tạo ra cả callus và chồi. Khi cung cấp chỉ
riêng auxin (NAA = 5 µM) thì chỉ có callus được tạo thành.
Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình thành callus cơ
sở từ các chồi được tách trong nuôi cấy. Chồi sau đó được phát triển từ ngoại vi mô
callus và không có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn của mẫu vật.
2.3.6. Các nhân tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
2.3.6.1 Mẫu nuôi cấy
Các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa
vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.
Kiểu gen: ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số lượng chồi tạo được, sự
khác nhau về tăng sinh chồi, sự khác nhau về khả năng phát sinh phôi.
Chọn cơ quan: hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in
vitro (Murashige, 1974). Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau,

14