NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ (CP) CỦA VIRUS KHẢM VÀNG (CYMBIDIUM MOSAICVIRUS) VÀO PROTOCORM LAN DENDROBIUM SONIA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ
(CP) CỦA VIRUS KHẢM VÀNG (CYMBIDIUM MOSAICVIRUS)
VÀO PROTOCORM LAN DENDROBIUM SONIA

Ngành học
Sinh viên
Niên khóa

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
: NGUYỄN THỊ THANH THẢO
: 2009 – 2013

Tháng 06/2013
1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ
(CP) CỦA VIRUS KHẢM VÀNG (CYMBIDIUM MOSAICVIRUS)
VÀO PROTOCORM LAN DENDROBIUM SONIA

Hướng dẫn khoa học
ThS. NGUYỄN XUÂN DŨNG

Sinh viên thực hiện
NGUYỄN THỊ THANH THẢO

Tháng 06/2013

2


LỜI CÁM ƠN
Con xin được gửi lời chi ân đến bố mẹ con là những đấng sinh thành, dưỡng
dục, luôn đồng hành và ủng hộ con trong suốt thời gian qua. Em cũng xin được gửi lời
cảm ơn chân thành nhất đến:
Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm,
Ban giám đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ chí Minh
Quý thầy, cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nông Lâm
Cùng các anh, chị thuộc phòng Công Nghệ Sinh Học Thực vật Trung tâm Công
Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh.
Đặc biệt, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến thầy Nguyễn Xuân
Dũng là người đã vô cùng tận tình dạy dỗ và hướng dẫn em thực hiện đề tài trong suốt
thời gian vừa qua.
Em cũng xin được gửi lời cảm ơn đến bạn bè là những người đã giúp đỡ, ủng
hộ, động viên trong suốt thời gian em làm đề tài này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2013
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thanh Thảo

i


TÓM TẮT
Bệnh do virus gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển
của cây lan và hiện vẫn chưa có thuốc đặc trị. Do đó, việc tạo ra giống lan có khả năng
kháng virus là một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay, và một trong những phương
pháp đang được quan tâm nhất để tạo cây lan kháng virus là kỹ thuật chuyển gen
RNAi thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensđược nghiên cứu trong đề tài
‘‘Nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein vỏ (cp) của virus khảm vàng (cymbidium
mosaicvirus) vào protocorm lan dendrobium sonia’’.
Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang
vector chuyển gen thực vật pK7GWIWG2(II)/CP-CyMV, chứa cấu trúc RNAi của gen
mã hóa cho protein vỏ (CP) của virus CyMV,được lây nhiễm và đồng nuôi cấy với
protocorm của lan Dendrobium Sonia trong 4 ngày. Các protocorm sau lây nhiễm
được khử khuẩn bằng cefotaxime 300 mg/l và sàng lọc sơ bộ mẫu giả định chuyển gen
với kanamycin 500 mg/l. DNA bộ gen ly trích từ các protocorm giả định chuyển gen
được sử dụng cho phản ứng PCR với cặp mồi của đoạn gen để xác định các protocorm
có mang gen mục tiêu. Kết quả cho thấy có 6 mẫu DNA ly trích từ protocorm cho sản
phẩm khuếch đại phù hợp về kích thước với đoạn gen mục tiêu. Điều này chứng tỏ các
protocorm này đã được chuyển gen mục tiêu vào DNA bộ gen.

ii


SUMMARY
Viral

diseasescausedserious

impacton

the

growthanddevelopmentoforchidsandstill nocure. The creation of virus resistant
orchidsisone of thepressing problemstoday, andAgrobacteriumtumefaciens mediated
RNAi transgenictechnique is one ofthese methodsaremost interestedtocreatevirus
resistant orchid “Transgenic research coding for envelope protein (cp) yellow mosaic
virus (Cymbidium mosaic virus) in Dendrobium sonia protocorm”
Inthis

study,

AgrobacteriumtumefaciensC58carryingplanttransgenicvector

pK7GWIWG2(II) /CP-CyMV, bearingRNAi structuresofcoat protein gene(CP)
ofCyMV,

is

infectedwithprotocormofDendrobiumSoniafor

4days.

Theprotocormdisinfectedafterinfectionwithcefotaxime300mg/landpreliminary
screeningfor

transgenicprotocorm

withkanamycin500mg/l.GenomicDNAextractedfromtransgenicprotocormusedforPCRr
eaction withprimersoftarget gene to identifyprotocormsthat have targetgene. The
resultsshowed thatamplifiedproduct of6samplesof protocorm extractedDNAhave size
similar tothetarget gene. This proves thattarget gene hasbeeninserted into genomic
DNAof theseprotocorms.
Key words: orchids, protocorm, A.tumefaciens, D.Sonia, cost protein, CyMV,
transgenic

iii


MỤC LỤC
Lời cảm ơn ................................................................................................................... i
Tóm tắt ........................................................................................................................ ii
Summary .................................................................................................................... iii
Mục lục ...................................................................................................................... iv
Danh sách chữ viết tắt .............................................................................................. vii
Danh sách hình ........................................................................................................ viii
Danh sách bảng và biểu đồ ........................................................................................ ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2 Nội dung thực hiện và yêu cầu đề tài ................................................................... 1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 2
2.1 Giới thiệu chung về lan Dendrobium Sonia ......................................................... 2
2.1.1 Nguồn gốc.......................................................................................................... 2
2.1.2 Phân loại ............................................................................................................ 2
2.1.3 Đặc điểm về hình thái ........................................................................................ 3
2.2 Giới thiệu sơ lược về vi khuẩn Agrobacterium .................................................... 4
2.2.1 Phân loại ............................................................................................................ 4
2.2.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Agrobacterim ................................................ 5

2.2.3 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium ........................................................... 6
2.3 Tổng quan về virus khảm vàng .......................................................................... 10
2.3.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc ........................................................................ 10
2.3.2 Tác hại, triệu chứng và biểu hiện của CyMV trên lan......................................11
2.3.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen trên lan ...................................................... 13
2.4 Cơ chế chuyển gen thông qua Agrobacterium ................................................... 15
2.5 Tổng quan về RNA can thiệp ............................................................................. 19
2.5.1 Giới thiệu về RNA can thiệp ........................................................................... 19
2.5.2 Một số khái niệm ............................................................................................. 21
2.5.3 Cơ chế hoạt động ............................................................................................. 24
2.5.4 Ứng dụng của RNAi trong việc tạo cây trồng kháng virus ............................. 22
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 24
iv


3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................... 24
3.2 Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 24
3.3 Vật liệu nghiên cứu............................................................................................. 24
3.3.1 Vật liệu ............................................................................................................ 24
3.3.2 Trang thiết bị và dụng cụ ................................................................................. 25
3.3.3 Hóa chất ........................................................................................................... 25
3.3.4 Điều kiện thí nghiệm ....................................................................................... 25
3.4

Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 26

3.4.1 Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn ............................................................................ 26
3.4.2 Chuyển gen CP vào protocorm ........................................................................ 26
3.4.3 Sàng lọc protocorm bằng kháng sinh Kanamycin. .......................................... 27
3.4.4 Phương pháp phát hiện gen mục tiêu .............................................................. 28

3.5 Xử lý thống kê .................................................................................................... 29
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 30
4.1 Chuyển gen CP vào protocorm ........................................................................... 30
4.1.1 Giai đoạn đồng nuôi cấy .................................................................................. 30
4.1.2 Giai đoạn khử khuẩn........................................................................................ 31
4.2 Sàng lọc mẫu giải định chuyển gen .................................................................... 32
4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin ................................................................ 32
4.2.2 Sàng lọc mẫu giả định chuyển gen .................................................................. 33
4.3 Kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu ........................................................... 35
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 36
5.1 Kết luận............................................................................................................... 36
5.2 Đề nghị ............................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 37

v


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
A.tumefacien

Agrobacterium tumefacien

AS

Acetosyringone

CyMV

Cymbidium mosaic virus

DNA

Deoxyribonucleic acid

dsRNA

double strand RNA

hpRNA

hairpin RNA

ihpRNA

hpRNA được lặp lại với một trình tự intron

LB

Left border

LB

Right Border

MS

Murashige and Skoog

PCR

Polymerase Chain Reaction

PEG

Polyethylene glycol

PLB

Protocorm like body

Pri- mRNA

primary- mRNA

RB

Right border

RdRp

RNA dependent RNA polymerase

RISC

RNA – incluced silencing complex

RNAi

RNA inteference

siRNA

small interfeing RNA

T-DNA

Tranferred DNA

Ti-plasmid

Tumor inducing plasmid

Vir

Virulence

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH
Bảng 4.1 Tỷ lệ chết của protocorm trên môi trường kháng sinh ............................... 32
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ chết của protocorm trên môi trường kháng sinh ........................... 33
Hình 2.1LanDendrobium Sonia ................................................................................. 2
Hình 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi ................................................ 5
Hình 2.3 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium .................................................... 7
Hình 2.4Cấu trúc của Ti-Plasmid............................................................................... 7
Hình 2.5Vị trí Ti-plasmid trong tế bào vi khuẩn ....................................................... 8
Hình 2.6 Cấu trúc các dạng opine .............................................................................. 9
Hình 2.7Hình dạng của virus CyMV ....................................................................... 10
Hình 2.8 Cấu trúc bộ gen của virus CyMV ..............................................................11

Hình 2.9Triệu chứng vệt hoại tử trên hoa lan Cattleya............................................ 12
Hình 2.10 Triệu chứng khảm vàng trên lá lan Hồ điệp .......................................... 12
Hình 2.11 Sự thay đổi màu của hoa petunia sau khi chuyển gen .......................... 19
Hình 2.12 Cơ chế hoạt động của RNAi ................................................................... 22
Hình 3.1 Cấu trúc vector pK7GWIWG2(II)/CP-CyMV ......................................... 24
Hình 4.1Protocorm lanDendrobiumSonia sau 3 ngày nuôi cấy. .............................. 30
Hình 4.2Protocorm Dendrobium Sonia trên môi trường khử khuẩn ....................... 31
Hình 4.3Protocorm lanDendrobiumSonia trên môi trường sàng lọc ....................... 34
Hình 4.4 PCR phát hiện gen CP trong mẫu giả định chuyển gen ............................ 35

vii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Dendrobium là giống lớn thứ hai trong họ lan (Orchidaceae), có phân bố rộng
từ các vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới, rất thích hợp trong điều kiện khí hậu Việt
Nam. Trong đó, Dendrobium Sonia là loài lan lai có hoa đẹp, màu tím, rất được ưa
chuộng và là loại lan cắt cành chủ lực hiện nay ở Việt Nam nói chung và Thành phố
Hồ Chí Minh nói riêng. Tuy nhiên, lanDendrobium Sonia cũng như hoa lan nói chung
rất dễ mắc các loại bệnh gây hại, đặc biệt là bệnh virus.
Bệnh do virus gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển
của cây lan và hiện vẫn chưa có thuốc đặc trị. Do đó, việc tạo ra giống lan có khả năng
kháng virus là một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay, và một trong những phương
pháp đang được quan tâm nhất để tạo cây lan kháng virus là chuyển gen.
Mặc dù phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens thường được sử dụng để chuyển gen trên các cây thuộc lớp hai lá mầm.
Tuy nhiên, gần đây đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng vi khuẩn này để
chuyển gen trên các cây một lá mầm.Với mục tiêu thu nhận được những dòng tế bào
lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng, đề tài “Nghiên cứu chuyển gen

mã hóa cho protein vỏ (CP) của virus khảm vàng (Cymbidyum mosaic virus) vào
protocorm lan Dendrobium Sonia”được thực hiện.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
-

Xác định được nồng độ kháng sinh kanamycin thích hợp cho việc sàng lọc các

mẫu chuyển gen; Thu được một số mẫu protocorm có mang gen mục tiêu.
1.3 Nội dung thực hiện
-

Cấy chuyền tạo nguồn mẫu protocorm lan, lây nhiễm vi khuẩn mang vector

chuyển gen RNAi vào protocorm.
-

Khử khuẩn cho protocorm sau lây nhiễm bằng kháng sinh cefotaxime; Thử

nghiệm nồng độkanamycin thích hợp và tiến hành sàng lọc mẫu chuyển gen trên môi
trường có bổ sung kanamycin.
-

Kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong mẫu giả định chuyển gen bằngPCR.

1


CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu tổng quan về lan Dendrobium Sonia
2.1.1 Nguồn gốc

Giống lan này được đặt tên vào năm 1799. Chữ Dendrobium có nguồn gốc từ
tiếng Hy Lạp. Dendro có nghĩa là cây lớn, bio là sống, vì tất cả các loài của
Dendrobium đều là phụ sinh sống bám trên cây gỗ hay phong lan. Tiếng Việt thường
gọi là lan Hoàng Thảo có lẽ bởi vì trước kia chúng ta không phân biệt giữa loài và
giống nên chỉ nhằm vào các cây có hoa mầu vàng mà thôi. Thực ra lan Dendrobium có
nhiều màu sắc và hình thái khác nhau. Hiện nay có nhiều người dùng chữ Đăng lan
thay cho Dendrobium như Cát lan cho Cattleya chẳng hạn.
Dendrobium rất phong phú về chủng loại, là giống lớn thứ hai của họ lan với
khoảng 1.600 loài phân bố trên các vùng thuộc châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều nhất
ở Đông Nam Á và Châu Úc.
Điều kiện sinh thái của Dendrobium rất đa dạng, có loài chỉ mọc và ra hoa ở
vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài ở vùng trung gian, và cũng có loài có thể thích
nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào.
2.1.2 Phân loại
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Monocotyledons (Một lá mầm)
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae
Giống: Dendrobium
Tên khoa học: DendrobiumSonia
Hình 2.1Lan Dendrobium Sonia
()

2


2.1.3 Đặc điểm về hình thái
Rễ:Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp với nhiều
điều kiện sống. Ở một số loài có lối sống bám lơ lửng trên vỏ thân cây gỗ khác, thân
rễ dài hay ngắn, mập hay mảnh mai giúp đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các

bụi dày. Hệ rễ vừa làm nhiệm vụ lấy nước, hấp thu chất dinh dưỡng trên vỏ cây thân
gỗ vừa làm nhiệm vụ bám chặt vào giá thể để giữ cho cây khỏi bị gió cuốn đi. Hệ rễ
phát triển nhiều hay ít phụ thuộc vào hình dạng chung của cả cây lan. Ở một số loài
sống hoại sinh thì rễ có dạng búi nhỏ dày đặc các vòi hút ngắn hút chất dinh dưỡng từ
xác thực vật.
Thân:Thuộc nhóm đa thân (sympodial), đây là nhóm gồm những cây tăng trưởng
liên tục mà có những chu kì nghỉ sau những mùa tăng trưởng. Dendrobium vừa có
thân thật vừa có giả hành. Giả hành tuy là thân nhưng có diệp lục, dự trữ nước và
nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới. Cấu tạo giả hành gồm
nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày,
nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước. Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên
cùng với lá, nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp. Thường các loài thuộc giống
Dendrobium dùng cho mục đích kinh doanh là lan đa thân với nhiều giả hành.
Lá: Phong lan đều là cây tự dưỡng, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống lá, có
rất nhiều kiểu lá mỏng khác nhau, có mỏng mềm, có dai cứng và cũng có cả mọng
nước, có lá dài, lá dẹt, hình trụ. Về màu sắc, phiến lá có màu xanh bóng, nhưng đôi
khi hai mặt lá có màu sắc khác nhau.
Hoa:Mọc từ thân thành từng chùm, các chồi hoa không những mọc trên các giả
hành mới mà còn mọc trên các giả hành cũ. Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm chính
giữa hoa, mang phần đực ở phía trên và phần cái (đầu nhụy) ở mặt trước. Côt này
thường dài, thẳng hay cong về phía trước. Nhị đực gồm hai phần, bao phấn và hốc
phấn. Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy, còn hốc phấn thì lõm lại, mang khối phấn và
thường song song với bao phấn. Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau,
rất cứng do có tinh bột, sáp hay chất sừng. Vì thế giống Dendrobium khi ra hoacho
một số lượng cành hoa nhiều hơn loài lankhác.
Quả: Quả phong lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3 – 6 đường nứt dọc. Khi chín
3


quả mở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Ở một số loài

quả chỉ mở ra ở 1-2 khía dọc, thậm chí không nút ra, và hạt chỉ có thể ra khỏi vỏ quả
khi lớp vỏ này mục nát
Hạt: Hạt cấu tạo bởi một phôi chưa phân hóa, trên một mạng lưới nhỏ, xốp chứa
đầy không khí. Mỗi quả lan chứa hàng triệu hạt lan, hạt lan rất nhỏ giống như hạt bụi
và không có chất dinh dưỡng dự trữ, chính vì vậy mà trong tự nhiên hạt lan có thể nảy
mầm nhưng lại không phát triển được trừ phi bị nhiễm bởi nấm cộng sinh. Các nấm
này cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho cây lan cho tới khi chúng có thể tự sản
xuất ra "thức ăn".
Protocorm:Protocorm (protocorm like body) là thuật ngữ được đặt ra đầu tiên bởi
nhà quản lý Melchoior Treub của vườn Bách Thảo Bogor, Indonesia (hiện nay là
Vườn Kebun Raya), ông dùng từ này để chỉ ra một giai đoạn phát triển của rêu. Sau
đó, Noel Bemard dùng protocorm cho các cây họ lan vào những năm 1899 – 1910.
Hiện nay, protocorm dùng để mô tả cấu trúc hình cầu nhỏ của lan (Dương Công Kiên,
2002).Protocorm là một cơ quan dự trữ nhỏ được hình thành từ phôi đang nẩy mầm.
Phôi này bao gồm một đỉnh sinh trưởng và một lá mầm.
Protocorm like body là một thuật ngữ thích hợp để chỉ những cấu trúc giống với
protocorm và có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh của
chồi bất định. Thuật ngữ này được Morel sử dụng trong bài báo tiếng Anh của ông về
nuôi cấy chồi đỉnh.
Trong nuôi cấy mô ở cây lan, PLB là một thể thường gặp và là cấu trúc tái sinh
cơ quan của lan. Do có đặc điểm dễ dàng nuôi cấy nên PLB thường được dùng làm
nguồn nguyên liệu nhân nhanh (Dương Công Kiên, 2002).
2.2. Giới thiệu sơ lược về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
2.2.1.

Phân loại

Giới: Bacteria

Bộ: Rhizobiales

Ngành: Proteobacteria

Họ: Rhizobiaceae

Lớp: Alphaproteobacteria

Giống: Agrobacterium

4


Danh pháp của các loài Agrobacterium được đặt tên dựa trên các đặc điểm gây
bệnh của plasmid:
-

Agrobacterium tumefaciens: gây khối u trên cây phong lữ, cà chua, thuốc lá…
Agrobacterium rhizogenes: gây bệnh rễ tơ trên cây đậu nành, cà chua…
Agrobacterium rubi: gây bệnh mụn ở mía.
Agrobacterium vitis: gây bệnh ghẻ khối u ở nho.
Agrobacterium radiobacter: bao gồm tất cả các loài không gây bệnh.
Nhóm Agrobacterium tumefaciens được sử dụng nhiều nhất trong chuyển gen. Vi

khuẩn gram âm Agrobacterium tumefaciens là một vi khuẩn gây bệnh, trong vòng đời
của mình vi khuẩn thực hiện việc biến nạp di truyền vào trong tế bào thực vật. Việc
biến nạp di truyền này tạo thành các u sần trên cây chủ làm ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng bình thường của cây. Bệnh do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens gây ra tác
động quan trọng đến nông nghiệp tuy nhiên nó chỉ tác động trên cây hai lá mầm.

Hình 2.2: Vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi

()
2.2.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Agrobacterium
Agrobacteriumtumefaciens là vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước 2,5 – 3,0
x 0,7 -0,8mm, dạng đơn bào, không sinh bào tử, có vỏ và lông roi. Khuẩn lạc tròn nhỏ,
màu trắng kem, có rìa nhẵn và đều đặn, và có màu xanh da trời nhạt sau đó đậm dần
trên môi trường chỉ thị.
Khi xâm nhiễm vào cây,A. tumefaciens sẽ di chuyển khắp hệ thống rễ làm giảm
khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của rễ, tuy nhiên đối với cây trưởng thành thì tác
động không nhiều.

5


Vi khuẩn A. tumefaciens không có khả năng khử arginine, không phân giải
gelatin, có thể phân giải các loại đường, tinh bột, tryptophan, tạo NH3 và H2S, khử
oxydase. Agrobacterium không thể gây khối u (chuyển T-DNA) ở nhiệt độ trên 290C
và khoảng pH bazơ. Lý do là hệ thống protein Vir đặc biệt là VirA rất nhạy cảm với
nhiệt độ, chúng bất hoạt ở 290C và biến tính ở 320C. Hiệu suất chuyển gen cao nhất ở
220C và khoảng pH từ 5,2 – 5,7 điều này được giải thích do thụ thể nhận biết ký chủ
của Agrobacterium (ChvE-VirA) được hoạt hóa bằng proton của hợp chất phenolic và
nó bị bất hoạt trong môi trường bazơ. Một khi protein VirA bị bất hoạt thì tế bào vi
khuẩn sẽ mất khả năng hoạt hóa toàn bộ hệ thống protein Vir dẫn đến mất khả năng
chuyển gen (Nguyễn Công Nghiệp, 2002).
Agrobacterium tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách
chuyển một đoạn DNA của nó vào tế bào thực vật. Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất
với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách
có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn.
Để khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà
khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-DNA và thay thế
vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của

T-DNA và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA. Nó sẽ
được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
2.2.3. Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens có chứa nhiễm sắc thể và một plasmid lớn kích
thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây
bị nhiễm A .tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất là các khối u được hình
thành ở ngay vị trí lây nhiễm. Sự hình thành khối u sau đó có thể được tiếp tục mà
không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A.
tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid xâm nhập vào hệ gen của cây
bị bệnh (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2007; Gelvin, 2003).

6


Hình 2.3
2 Cấu trúcc tế bào vi khuẩn
k
Agrobbacterium
2.2.3.1 Cấu trúcc và chức năng
n
của Tii-plasmid
Trong thếế giới động--thực vật đềều tồn tại cáác thể plasm
mid. Đó là các vòng DNA
D
ộc lập. Ở vii khuẩn và động-thực
đ
vật,
v plasmidd liên quan
n tới yếu tố giới

tự do sinh sản độ
tính của
c tế bào, đến khả năăng chống cchịu các looại kháng siinh. Đặc điiểm quan trrọng
của pllasmid là ch
húng có thểể liên kết vvào nhiễm sắc
s thể nhưnng cũng có thể tồn tại bên
ngoài nhiễm sắc thể một cácch độc lập ((Hình 2.3).

H
Hình
2.4 Cấấu trúc của Ti-Plasmid
T
nh thành kh
hối u, T-DN
NA được chhuyển vào tếế bào thực vật
v và hợp nhất
n
Trrong khi hìn
với bộộ gen. T-DN
NA ổn địnhh trong bộ ggen. Lai Ti--plasmid vớ
ới DNA củaa khối u đã cho
thấy T-DNA tro
ong tế bàoo thực vật là tương ứng song song với T-DNA trrong
Ti-plaasmid của Agrobacteri
A
ium. Kết quuả này chứ
ứng tỏ khônng có sự sắắp xếp lại vị
v trí
của T--DNA trong
g lúc khối u được tạo tthành.Một hoặc

h
nhiều bbản sao củaa T-DNA cóó thể
7


có mặặt ở các đoạạn lặp nối tiiếp.Chúng ccũng có thể tách ra và liên
l kết vớii các vùng khác
k
nhau của DNA thực
t
vật.Vịị trí hợp nhhất của T-D
DNA vào DN
NA thực vậật là hoàn toàn
t
ngẫu nhiên (Bùi Chí Bửu và
v Nguyễn Thị Lang, 2004; Nguuyễn Quangg Thạch và ctv,
2005)).
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng
d
A. tum
mefaciens gây độc, có kích
k
thướcc khoảng 2000-250 kb. Chúng đượ
ợc duy trì ổn
ổ định tronng Agrobaccterium ở nhiệt
n
độ dư
ưới 300C. Bằng
B
phươnng pháp laai DNA-DN

NA và lập bản
b đồ chuuỗi kép di hợp
(heterroduplex maapping), nggười ta đã xxác định đượ
ợc Ti-plasm
mid có 4 vùnng tương đồồng.
Kết qu
uả phân tíchh di truyền cho thấy vùùng T-DNA
A (transferreed DNA) vàà vùng gây độc
(virulence) liên quan
q
đến sự
ự hình thànnh khối u trong khi haii vùng khácc liên quan đến
sự tiếp hợp và sự
ự tái bản của plasmidd trong Agro
obacterium (Nguyễn Quan
Q
Thạchh và
ctv, 20005).

2 Vị trí Tii-plasmidtroong tế bào vi
v khuẩn
Hình 2.5
2.2.3.2 Cấu trúcc và chức năng
n
của T--DNA
T-DNA làà một đoạn DNA có kíích thước 25
2 kb, trongg đó chứa gen
g mã hóa cho
sinh tổng hợp auuxin, cytokiinin, opine và các genn gây khối uu. Nhờ khả năng có thhể tự
tổng hợp

h auxin, cytokinin mà
m các tế kkhối u của thực
t
vật bị nhiễm có thể
t tăng trư
ưởng
invitro
o mà không
g cần bổ suung các chấất điều hòa tăng trưởngg. Trong Tii-plasmid, vị
v trí
của T-DNA
T
đượ
ợc giới hạnn bằng bờ phải (RB- Right Borrder) và bờ
ờ trái (LB-Left
Bordeer). Ngoài T-DNA,
T
trêên Ti-plasm
mid còn có các vùng D
DNA mã hóóa cho việcc tái
8


sinh plasmid, cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine
(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Opine là các amino acid bất thường được vi khuẩn sử dụng như nguồn dinh
dưỡng (nguồn carbon và nitơ) để sản sinh nhanh chóng. Bản chất của opine tùy thuộc
vào kiểu plasmid vi khuẩn và được quy định bởi Ti-plasmid. Những chủng vi khuẩn
khác nhau sẽ mang các dang Ti-plasmid khác nhau, do đó sẽ sản xuất các dạng opine
khác nhau.

Hình 2.6 Cấu trúc các dạng opine
(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)
Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng một
đoạn liên tục dài 22kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-DNA là một đoạn gen
liên tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá những enzyme
cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u như tms1, tms2,
tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và
cytokinine.

9


Trong cácc vùng DNA
A của Ti-plaasmid, ngoàài T-DNA được nghiênn cứu nhiều hơn
cả là vùng DNA
A phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản
S phẩm hoạt
h
động của các geen nằm troong vùng vvir dưới tácc động kíchh thích củaa các hợp chất
phenool tiết ra từ vết thương
g là một loạt các proteein đặc hiệu như VirE
E2, VirB, VirD,
V
VirD22,… Các prrotein này nhận
n
biết cáác vết thươnng ở các câyy chủ thích hợp (hầu hết là
cây hai lá mầm), kích thíchh sản sinh ra
r các đoạn
n T-DNA, bbao bọc chee chở các đoạn

đ
DNA này và giúúp chúng tiếếp cận với hệ gen củaa cây chủ m
một cách ann toàn (Bùi Chí
Bửu và
v Nguyễn Thị
T Lang, 2004;
2
Gelviin, 2003).
2.3. Tổng
T
quan về
v virus kh
hảm vàng
2.3.1 Đặc điểm hình
h
thái và
v cấu trúc
Họ: Flexiv
viridae
Giống
g: Potexviruus
Tên khoa
k
học: Cyymbidium mosaic
m
virus (CyMV)
Hay còn gọi
g là viruss khảm vànng, được mô
m tả lần đầầu tiên bởi Jensen. Đâây là
g loại virus quan

q
trọng và phổ biếnn nhất gây nhiễm
n
các loại
l lan trênn thế
một trrong những
giới. Phần tử virus có dạng sợi, không màng
m
bao, dài 480 nm, rộng 13
nm(N
Navalinskienne và ctv, 20
005)

Hình 2.7 Hình dạng
d
của viirus CyMV
v ctv, 20055)
(Navaalinskiene và
Bộ gen củaa CyMV chhứa RNA mạch
m
đơn, sợi
s dương, có
c mũ chụpp ở đầu 5’ vvà đuôi
polyA ở đầu 3’. Tổ chứcc bộ gen được
đ
bảo tồn cao vvà bao gồm
m 3 vùng: RdRp
(RNA--dependent RNA po
olymerase – RNA polymerase
p

e phụ thuuộc RNA),, TGB
(triple--gene-block
k – nhóm geen ức chế bộộ ba) và CP
P (coat proteein – proteinn vỏ). RNA
A bộ gen
có chiềều dài 6227 nucleotide không tínhh đuôi poly A ở đầu tậnn cùng 3’(W
Wong và ctv,, 1994).
10


Tương tự như các virus khác trong nhóm potexvirus, bộ gen của CyMV có 5
khung đọc mở (ORFs 1-5) mã hóa cho ba loại protein khác nhau: RdRp
(RNA-deppendent RNA polymerase - trọng lượng phân tử 160 KDa), TBG
(triple-genne-block - trọng lượng phân tử 26 KDa/ 13 KDa/ 10 KDa) và CP (protein vỏ trọng lượng phân tử 24 KDa). Ngoại trừ khung đọc mở ORF4, tất cả các khung đọc mở
của các protein mã hóa ở giống Potexvirus đều chứa các motif phổ quát. Các protein
được mã hóa bởi CyMV có mức độ tương đồng cao với các protein tương ứng của các
thành viên khác trong nhóm potexvirus(Wong và ctv, 1994).
Trình tự nucleotide vùng 5’ không mã hóa (noncoding region - NCR) của CyMV
và tất cả các thành viên khác của nhóm đều khởi đầu bằng GAAAA và CyMV là virus
có vùng 5’ NCR ngắn nhất trong tất cả các ptexvirus. Dựa trên sự so sánh về phát sinh
loài của RdRp và protein vỏ cho thấy CyMV có mối liên hệ gần với các virus như
PAMV, NMV, WC1MV và SMYEaV(Wong và ctv, 1994).

Hình 2.8 Cấu trúc bộ gen của virus CyMV
2.3.2. Tác hại, triệu chứng và biểu hiện của CyMV trên lan
2.3.2.1 Tác hại
Virus tạo rất nhiều điều bất thường có thể làm thay đổi hình thức và dáng vẻ từ
chóp rễ tới đỉnh ngọn. Hai ảnh hưởng dễ thấy nhất là sự chuyển sang màu vàng và sự
chết mô. Các triệu chứng này có thể xảy ra riêng biệt hay cùng một lúc. Các ảnh
hưởng này thay đổi nhiều không những tùy thuộc vào giống lan mà còn tùy thuộc vào

nòi virus, nơi điều kiện môi trường như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm và dinh
dưỡng.Virus tấn công gây bệnh trong một cây thường tồn tại ở đó trong suốt cuộc đời
của cây, ở những cây sinh sản sinh dưỡng, sự tồn tại dai dẳng của virus có thể sẽ tạo ra
những cây con nhiễm virus. CyMV không những làm đổi màu trong các mô cây mà
11


còn làm cho cây cằn cỗi mất sinh lực, giảm năng suất và chất lượng hoa.
2.3.2.2 Triệu chứng

Hình 2.10 Triệu chứng khảm vàng
trên lá lan Hồ điệp

Hình 2.9 Triệu chứng vệt hoại tử trên
hoa lan Dendrobium sonia

CyMV gây ra hiện tượng vàng lá thể khảm đi kèm với sự hóa đen và chết của
những vùng lá dọc theo gân lá (Moran và Knoxfield, 1999). Sự hoại tử lá gây ra bởi
CyMV có lẽ là bệnh virus phổ biến nhất trên nhiều loại lan. Cây bị nhiễm virus có các
đốm và vệt mô chết kéo dài, màu nâu đến đen, không đều trên cả 2 mặt của các lá già.
Các lá có triệu chứng này thường lão hóa nhanh và khô (University of Illinois, 1990).
Ở các giống lan Phalaenopsis, Cattleya, Dendrobium và nhiều giống khác, virus gây
ra các đốm hoại tử đen và các kiểu đường hoại tử với các vết lõm xuống trên lá
(Marais, 2000). Triệu chứng trên hoa thường ít biểu hiện nhưng hoa có thể nở với hình
dạng kém phát triển. Nếu lá chết trước khi trưởng thành, hoa thường có kích thước
nhỏ và số lượng hoa ít (University of Illinois, 1990). Trong trường hợp có triệu chứng,
trên hoa có thể xuất hiện các vệt hoại tử trong một vài ngày khi hoa đang nở. Tuy
nhiên, các triệu chứng trên hoa thường chỉ biểu hiện sau khoảng 2 tuần và đặc biệt dễ
dàng nhận thấy trên hoa Cattleya trắng (Marais 2000). Ngoài ra, virus này còn tạo ra
mảng màu (thường đậm hay nhạt hơn màu hoa) trên hoa Cattleya (Moran và

Knoxfield, 1999).
2.3.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen trên hoa lan
Đã có một số công trình công bố dùng phương pháp chuyển gen gián tiếp
thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và chuyển gen trực tiếp bằng súng
bắn gen để chuyển gen vào một số loại lan. Các gen được chuyển bao gồm gen kháng
12


thuốc trừ cỏ (bar), gen chỉ thị gus A, gen kháng kanamycin nptII, gen kháng
hygromycin hph, gen knox, gen CymMV-CSCP, gen mã hóa vỏ virus, gen phát sáng
gfp từ sứa biển, gen phát sáng lục từ đom đóm, ... Có thể tóm tắt một số kết quả
nghiên cứu tiêu biểu như sau:
Đối với các nghiên cứu trong nước.
Năm 2007, Võ Phan Mi Sa và cộng sự nghiên cứu chuyển gen phát sáng gfp
vào của PLB lan Dendrobium Burana White thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens, sử dụng chủng LBA 4404 chứa plasmid pCAMBIA 1303 mang gen
gfp5, gen gusA và gen hph, đã nhận được một số dòng cây chuyển gen. Kết quả cho
thấy các dòng lan chuyển gen sinh trưởng bình thường trên môi trường có
hygromycin 30mg/l, nhuộm xanh với thuốc thử GUS và có sự phát sáng màu xanh lục
khi được xử lý bằng tia UV sóng dài (của đèn cực tím) hoặc sóng lam của hệ thống
kính hiển vi huỳnh quang.
Năm 2008, Trần Lê Lưu Ly và cộng sự nghiên cứu chuyển gen trên lan hồ điệp
(Phalaenopsis amabilis L.) bằng phương pháp bắn gen, sử dụng hệ thống máy bắn
gen BiolisticTM PDS-1000/He để biến nạp plasmid pBAR-GUS (chứa gen uidA và
bar) và Agrobacterium tumefaciens, sử dụng chủng A. tumefaciens C58pGV2260
mang plasmid p35SGUS-INT chứa gen uidA và nptII. Kết quả cho thấy biểu hiện
GUS tối ưu ở nồng độ acetosyringone 50 µM sau 4 ngày đồng nuôi cấy với thí
nghiệm chuyển gen gián tiếp. Tỷ lệ biểu hiện GUS cao nhất được ghi nhận ở khoảng
cách bắn 6 cm, nồng độ tungsten/DNA plasmid là 500 μg/0,5 μg đối với phương pháp
chuyển gen trực tiếp.

Đối với các nghiên cứu ở nước ngoài.
Năm 2002, Men và cộng sự nghiên cứu chuyển gen trên 2 loài lan
Dendrobium phalaenopsis và Dendrobium nobile bằng phương pháp chuyển gen trực
tiếp, sử dụng hệ thống máy bắn gen BiolisticTM PDS-1000/He để biến nạp plasmid
(pCAMBIA1301 ). Kết quả cho thấy tỷ lệ biểu hiện GUS cao nhất được ghi nhận ở
nồng độ tungsten/DNA plasmid là 500 μg/0,5 μg.
Năm 2003, Men và cộng sự nghiên cứu chuyển gen trên lan Dendrobium bằng
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Kết quả cho thấy biểu hiện GUS tối ưu khi
13


PLBs được đồng nuôi cấy với A. tumefaciens, ở nồng độ 100  acetosyringone
(AS), thời gian đồng nuôi cấy 2-3 ngày. PLBs được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc
có chứa 30 mg/l hygromycin và 250 mg/l cefotaxime.
Năm 2005, Sjahril và cộng sự nghiên cứu chuyển gen wasabi vào lan
Phalaenopsis bằng vi khuẩn Agrobacterium để kháng lại bệnh thối mềm do vi khuẩn
Erwinia carotovora gây ra. Kết quả cho thấy hầu hết các cây chuyển gen đều có khả
năng kháng mạnh với Erwinia carotovora.
Năm 2006, Chin và cộng sự nghiên cứu chuyển gen gián tiếp vào PLBs
Cymbidium. Kết quả cho thấy biểu hiện GUS tối ưu ở nồng độ acetosyringone 100
µM. Và cũng trong nghiên cứu này, sự hiện diện của mục tiêu đã được kiểm tra bằng
phương pháp PCR.
Năm 2010, Shrestha và cộng sự nghiên cứu chuyển gen gián tiếp thông qua vi
khuẩn Agrobacterium vào PLB của lan Vanda. Kết quả cho thấy cây lan Vanda
chuyển gen tái sinh thành công sau khi đồng nuôi cấy PLB với vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens chủng EHA101.
Cũng trong năm 2010, Advina và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa protein phát
quang sinh học (GFP) bằng cách chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium
tumefaciens vào lan Phalaenopsis Violacea . Kết quả đã tối ưu hóa được các yếu tố
quan trọng ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào lan Phalaenopsis violacea bằng

Agrobacterium chủng EHA 105 và EHA 101 và ghi nhận chủng EHA 105 cho khả
năng biểu hiện gen GFP cao hơn so với hủng EHA 101.
Năm 2011 Semiarti và cộng sự đã thiết lập phương pháp chuyển gen với tần
xuất chuyển gen cao trên các giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Indonesia
bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Kết quả cho thấy Protocorm trên môi
trường có chứa dịch trích cà chua phát triển tốt hơn môi trường có chứa nước dừa.
Protocorm sau khi chuyển gen tái tạo rễ trên môi trường có bổ sung dịch trích cà chua
sẽ được chuyển sang môi trường chọn lọc có chứa kanamycin có tần xuất chuyển gen
cao (7-17 %). Rễ cây sau khi chuyển gen phân tích sinh học phân tử thấy tần xuất
chuyển gen gfp từ 0-14%.

14


2.4. Cơ chế chuyển gen thông qua Agrobacterium
Chuyển nạp gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng
DNA tái tổ hợp vào bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu. Những thành tựu của kỹ
thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển
nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới như kháng sâu
bệnh hại, thuốc diệt cỏ…
Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau
như sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm,
chuyển gen thông qua con đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen
nhờ vi khuẩn A. tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay.
Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen còn được
gọi là phương pháp chuyển gen gián tiếp.
Sau khi xâm nhiễm, Agrobacterium gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền
của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u.
Khả năng này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của
tế bào thực vật.

Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải
tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện
nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình
thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận
chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận
chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2
glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế
bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA
(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA
từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt
T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc,
tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực
vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào gen của cây chủ. Thực chất
15


chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào gen tế bào thực vật, mà không
còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir)
và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên,
chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản
phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn
truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi
động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được
phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol như acetosyringone giải
phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục
phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các
gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó,
khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của
T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn.

Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi áp xuất thẩm thấu của
màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được
gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn.
Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính
là sự tiếp hợp giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA
đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất trong gen tế
bào thực vật được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác.
Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các
nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và
thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ
trái của T-DNA và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của
T-DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào
thực vật. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra
đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc
biệt. Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến nạp, giai
đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi
trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến
16