NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BẠC NITRAT (AgNO3) LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) NUÔI CẤY in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BẠC NITRAT (AgNO3)
LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY
SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
NUÔI CẤY in vitro

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN VIỆT CƯỜNG

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BẠC NITRAT (AgNO3)

LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY
SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
NUÔI CẤY in vitro

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. DƯƠNG TẤN NHỰT

NGUYỄN VIỆT CƯỜNG

ThS. NGUYỄN BÁ NAM

MSSV: 09126023

Tháng 6/2013


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, đầu tiên, em xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến Thầy
– PGS.TS. Dương Tấn Nhựt, người đã hướng dẫn, tạo mọi điều kiện và tận tình giúp
đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy – PGS.TS. Lê Đình Đôn, Trưởng Bộ Môn Công
nghệ Sinh học, trường đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp
đỡ cho em hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho em thực hiện khóa luận này.
Em xin cảm ơn các Thầy, Cô thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học, trường đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và các Thầy, Cô khác đã chỉ dạy cho em trong suốt thời

gian trên giảng đường đại học. Đặc biệt, em muốn gửi lời cảm ơn đến cô – KS. Tô Thị
Nhã Trầm, cố vấn học tập lớp DH09SH, cô đã chỉ dạy, giúp đỡ em trong suốt thời gian
em học tập tại trường.
Xin chân thành cảm ơn cô Phượng, anh Luận, chị Hiền, anh Huy, anh Chiến, chị
Hương và chị Cương là cán bộ nhân viên Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống
cây trồng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian thực tập tại phòng. Đặc biệt,
em xin cảm ơn anh – ThS. Nguyễn Bá Nam, người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và
chỉ bảo tận tình cho em trong thời gian làm khóa luận.
Cảm ơn chị Linh, chị Yến, anh Cương, anh Tâm, chị Ngân, anh Tài, chị Sương,
anh Tùng, anh Biên, chị Hạnh, chị Hoàng, anh Hiếu, anh Sang, chị Thủy, chị Thùy
Anh và Mạnh Cường đã chia sẻ, động viên và nhiệt tình giúp đỡ Cường trong suốt thời
gian qua.
Cường cũng xin gửi lời cảm ơn và lời chúc thân ái nhất đến tập thể lớp DH09SH.
Mong rằng, mọi thành viên trong lớp mình luôn mạnh khỏe, thành công và hạnh phúc.
Cuối cùng, con xin dành tình cảm thiêng liêng nhất gửi tới bố mẹ – người đã cho
con cuộc sống này. Em cũng xin cảm ơn các anh chị cùng các cháu. Gia đình mình đã
luôn dõi theo, ủng hộ, giúp đỡ và động viên con trên mỗi bước con đi. Gia đình mãi là
chỗ dựa vững chắc và là nơi hạnh phúc nhất của con.
Đà Lạt, ngày 15 tháng 6 năm 2013
Nguyễn Việt Cường
i


TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của bạc nitrat (AgNO3) lên sự sinh trưởng và phát
triển của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro” do
Nguyễn Việt Cường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh thực hiện tại
phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng thuộc viện Nghiên cứu Khoa học
Tây Nguyên, thời gian từ tháng 12/2012 đến tháng 6/2013.
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một loài sâm đặc hữu của

Việt Nam. Sâm Ngọc Linh có nhiều công dụng trong việc tăng cường thể lực, chống
stress, trị suy nhược và chống oxi hóa. Tuy nhiên, do phân bố trong tự nhiên rất hẹp và
thời gian sinh trưởng dài nên việc sử dụng sâm Ngọc Linh còn hạn chế. Việc nhân
giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được nhiều tác giả nghiên cứu
nhưng cũng gặp phải khó khăn do sự tích lũy ethylene trong bình nuôi cấy kín làm ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. Dựa trên các nghiên cứu trong và
ngoài nước, AgNO3 đã được sử dụng trong nghiên cứu này nhằm hạn chế ảnh hưởng
của ethylene lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh.
Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 ở các nồng độ khác nhau lên sự
tăng sinh mô sẹo, khả năng nhân chồi và tạo rễ in vitro sâm Ngọc Linh cũng như ảnh
hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên khả năng nhân chồi
và tạo rễ của loài cây này.
Sau thời gian thực hiện, nghiên cứu đã đạt được một số kết quả khả quan. Mô sẹo
tăng sinh tốt trên môi trường SH bổ sung 0,2 mg/l TDZ; 0,1 mg/l 2,4-D và 15 mg/l
AgNO3 với trọng lượng tươi gấp 1,8 lần so với đối chứng (không bổ sung AgNO3). Số
chồi sâm Ngọc Linh in vitro tăng gấp đôi trong môi trường SH bổ sung 0,1 mg/l BA,
0,5 mg/l NAA; 1 mg/l than hoạt tính và 8 mg/l AgNO3. Nồng độ AgNO3 thích hợp
nhất để sâm Ngọc Linh tạo rễ in vitro là 2 mg/l trên môi trường SH bổ sung 1 mg/l
NAA và 1 g/l than hoạt tính. Một điều đáng chú ý là nuôi cấy thoáng khí không thích
hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh.

ii


SUMMARY
This thesis, entitled “Effects of Silver Nitrate (AgNO3) on the Growth and
Development of Ngoc Linh Ginseng (Panax Vietnamensis Ha et Grushv.) cultured in
vitro”, is formulated by myself, Nguyen Viet Cuong, a student of Nong Lam
University, Ho Chi Minh City. The related field research was conducted at Plant
Molecular Biology and Plant Breeding Department, Tay Nguyen Institute for

Scientific Research.
Ngoc Linh ginseng (Panax Vietnamensis Ha et Grushv.) is an endemic species of
Vietnam. Ngoc Linh Ginseng has been shown to have many effects such as fitness
promotion, anti-stress, anti-depressant and anti-oxidant. However, due to its restricted
native habitat and the considerable length of time it takes to grow, Ngoc Linh ginseng
supply is limited. In addition, micropropagation of this species has been widely
studied, but researchers have encountered many difficulties due to the ethylene
accumulation in poorly ventilated flasks, which inhibits the plant growth and
development. Therefore, in the present study, the use of AgNO3 was applied in order
to minimize the effect of ethylene accumulation on Ngoc Linh ginseng growth and
development.
Effects of various concentrations of AgNO3 and different types of ventilation of
the culture vessel headspace on callus and shoot proliferation, and root formation of
Ngoc Linh ginseng were investigated.
After 8 weeks of culture, the best callus proliferation was achieved on SH
medium supplemented with 0.2 mg/l TDZ, 0.1 mg/l 2.4-D and 15 mg/l AgNO3. The
results also showed that SH medium supplemented with 1.0 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA,
1 g/l active charcoal and 8 mg/l were suitable for shoot proliferation. The most
successful rooting of shoot was obtained on SH medium with 1.0 mg/l NAA, 1.0 g/l
active charcoal and 2 mg/l AgNO3. Ventilation culture system proved ineffective in
promoting the growth and development of Ngoc Linh ginseng.
Key words: callus proliferation, development, growth, Panax Vietnamensis Ha et
Grushv., rotting, shoot proliferation, silver nitrate (AgNO3), ventilation.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................i 

Tóm tắt ............................................................................................................................ ii 
Summary ........................................................................................................................ iii 
Mục lục .......................................................................................................................... iv 
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. vi 
Danh sách các bảng ...................................................................................................... vii 
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii 
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1 
1.1.  Đặt vấn đề ...............................................................................................................1 
1.2.  Yêu cầu ...................................................................................................................2 
1.3.  Nội dung thực hiện .................................................................................................2 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3 
2.1.  Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................................................3 
2.1.1.  Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................................ 3 
2.1.2.  Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................... 3 
2.1.3.  Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................... 4 
2.1.4.  Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................... 5 
2.1.5.  Hệ thống nuôi cấy thoáng khí ............................................................................... 5 
2.1.6.  Môi trường trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................................... 6 
2.1.7.  Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ................................................................ 8 
2.1.8.  Sơ lược về vai trò của ethylene và bạc nitrat trong nuôi cấy mô thực vật ......... 11 
2.2.  Giới thiệu cây sâm Ngọc Linh ..............................................................................15 
2.2.1.  Phân loại ............................................................................................................. 15 
2.2.2.  Đặc điểm hình thái .............................................................................................. 17 
2.2.3.  Đặc điểm sinh thái và sự phân bố của sâm Ngọc Linh ...................................... 17 
2.2.4.  Thành phần và dược tính của sâm Ngọc Linh .................................................... 18 
2.2.5.  Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh ............................................... 19 
2.2.6.  Một số nghiên cứu có liên quan.......................................................................... 20 

iv

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................22 
3.1.  Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................22 
3.2.  Vật liệu và điều kiện nuôi cấy ..............................................................................22 
3.2.1.  Nguồn mẫu ......................................................................................................... 22 
3.2.2.  Môi trường nuôi cấy ........................................................................................... 22 
3.2.3.  Điều kiện nuôi cấy .............................................................................................. 22 
3.2.4.  Trang thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 22 
3.3.  Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................22 
3.3.1.  Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh ...................... 22 
3.3.2.  Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro .......... 23 
3.3.3.  Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro ....... 24 
3.3.4.  Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên
khả năng nhân chồi và tạo rễ ở sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro ...................... 24 
3.3.5.  Phương pháp thu nhận số liệu ............................................................................ 25 
3.4.  Xử lý số liệu ..........................................................................................................26 
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................27 
4.1.  Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh ........................27 
4.2.  Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro ............29 
4.3.  Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro .........33 
4.4.  Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên khả 
năng nhân chồi và tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro .................................................36 
4.4.1.  Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên
khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro ....................................................... 36 
4.4.2.  Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên
khả năng tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro ............................................................. 39 
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................43 
5.1.  Kết luận .................................................................................................................43 
5.2.  Đề nghị ..................................................................................................................43 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................44 

PHỤ LỤC ......................................................................................................................51 

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

:

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

ABA

:

Abscisic acid

BA

:

6-Benzylaminopurine

ctv

:

cộng tác viên

Đ/C

:

Đối chứng

EDTA

:

Ethylenediaminetetraacetic acid

GA3

:

Gibberellic acid

IAA

:

Indole-3-acetic acid

IBA

:

Indole-3-butyric acid

NAA

:

-Naphthaleneacetic acid

PGRs

:

Plant Growth Regulators

RNA

:

Ribonucleic acid

SH

:

Schenk và Hildebrandt, 1972

TCL

:

Thin Cell Layer

TDZ

:

Thidiazuron

UV

:

Ultraviolet

vi


         DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh .................................... 23
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro ................................... 23
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro ................................ 24
Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm nhân chồi và tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro .................... 25
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh .............. 28
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro ...... 31
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro....... 34
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi sâm Ngọc Linh ......... 38
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự tạo rễ sâm Ngọc Linh ................ 41

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên ............................................................ 16
Hình 2.2 Sâm Ngọc Linh ........................................................................................... 16
Hình 4.1 Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh ................... 28
Hình 4.2 Khí khổng ở lá của chồi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro ......................... 31
Hình 4.3 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng nhân chồi ở sâm Ngọc Linh ............ 32
Hình 4.4 Khí khổng ở lá cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro ................................. 34
Hình 4.5 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ ở sâm Ngọc Linh ................... 35
Hình 4.6 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi sâm Ngọc Linh ........ 36
Hình 4.7 Khí khổng ở lá của chồi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro .......................... 38
Hình 4.8 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy sự tạo rễ của sâm Ngọc ........................ 40
Hình 4.9 Khí khổng ở lá cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro. ................................. 41

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) được biết đến trên thế giới
với tên gọi Vietnamese ginseng, là một loài sâm đặc hữu của Việt Nam. Sâm Ngọc
Linh chứa saponin với hàm lượng cao nhất trong các loại sâm hiện nay giúp cho loài
sâm này không chỉ có các tác dụng dược lý thông thường mà còn có nhiều công dụng
trong việc tăng cường thể lực, chống stress, trị suy nhược và chống oxi hóa (Dong và
ctv, 2007). Do đó, sâm Ngọc Linh đã trở thành một loại dược liệu quý không chỉ ở
Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng sâm Ngọc Linh
vẫn còn hạn chế do loài sâm này phân bố trong tự nhiên rất hẹp và có thời gian sinh
trưởng dài (5 – 7 năm) (Thanh và ctv, 2007). Đồng thời, việc khai thác quá mức đã
khiến sâm Ngọc Linh được xếp vào danh sách 250 loài bị đe dọa tuyệt chủng thuộc
sách Đỏ Việt Nam (Nhut và ctv, 2011). Vì vậy, việc nhân giống và bảo tồn loài sâm

này là rất cần thiết.
Hiện nay, sâm Ngọc Linh có thể được nhân giống bằng hạt, đầu mầm thân rễ
(Triệu Văn Hùng, 2007) hay sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Trong đó,
kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phương pháp hiệu quả nhất để nhân nhanh
sâm Ngọc Linh trong thời gian ngắn mà vẫn đảm bảo chất lượng của cây giống. Tuy
nhiên, một trong những khó khăn của việc nhân giống cây sâm Ngọc Linh cũng như
nhiều loài thực vật khác bằng kỹ thuật nuôi cấy mô là sự tích lũy ethylene trong bình
nuôi cấy kín. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy ethylene tích lũy nhiều trong bình nuôi
cấy gây ức chế sự hình thành mô sẹo từ rễ khoai lang (Chalutz và de Vay, 1969), ngăn
cản sự hình thành chồi ở cây thuốc lá (Huxter và ctv, 1981), ức chế sự tạo rễ từ lá cây
cà chua (Coleman và ctv, 1980) và gây ra hiện tượng vàng lá ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển của thực vật. Do đó, các hiện tượng này cần được nghiên cứu để
tìm biện pháp khắc phục.
Sử dụng bạc nitrat (AgNO3) để khắc phục hiện tượng tích lũy ethylene là biện
pháp đã được áp dụng nhiều và thành công nhất. Thông qua sự ức chế hoạt động của
ethylene, AgNO3 có thể kích thích sự tái sinh cây con ở Brassica campestris ssp.
chinensis (Chi và Pua, 1989), kích thích sự hình thành phôi vô tính ở cây cà rốt
1


(Roustan và ctv, 1990), kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo cây lúa (Adkins và ctv,
1993), ngăn chặn sự già hóa (Beyer và ctv, 1976a), giảm hiện tượng thủy tinh thể ở
cây hướng dương (Mayor và ctv, 2003) và cây hoa đồng tiền (Nguyễn Thị Kim Yến và
ctv, 2012). Tuy nhiên, AgNO3 vẫn chưa được áp dụng trên đối tượng cây sâm Ngọc
Linh.
Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của bạc nitrat
(AgNO3) lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis
Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro” được thực hiện với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng
của AgNO3 lên sự nhân nhanh mô sẹo, khả năng nhân chồi và tạo rễ cây sâm Ngọc
Linh in vitro.

1.2. Yêu cầu


Xác định được nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho
sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh in vitro.



Xác định được nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy thích hợp nhất giúp
tăng khả năng nhân chồi cây sâm Ngọc Linh in vitro.



Xác định được nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy thích hợp nhất giúp
tăng khả năng tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro.



Xác định được ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí lên khả năng nhân
chồi và tạo rễ cây sâm Ngọc Linh in vitro.

1.3. Nội dung thực hiện


Chuẩn bị môi trường cấy chuyền mẫu sâm Ngọc Linh nhằm tạo nguồn mẫu ban
đầu cho thí nghiệm.



Bố trí các thí nghiệm nhằm xác định nồng độ AgNO3 thích hợp cho sự tăng sinh

mô sẹo, khả năng nhân chồi và tạo rễ cây sâm Ngọc Linh in vitro. Sau thời gian
nuôi cấy, thu thập số liệu, chụp hình và ghi nhận kết quả.



Chọn nghiệm thức tốt nhất của hai thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ AgNO3
đến khả năng nhân chồi và tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro để thực hiện thí
nghiệm ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí lên khả năng nhân chồi và
tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro. Sau thời gian nuôi cấy, thu thập số liệu, chụp
hình kết quả.



Lựa chọn hình ảnh, xử lý số liệu, viết khóa luận tốt nghiệp.
2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều
kiện vô trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng,
vitamin, các hormone tăng trưởng và đường. Kỹ thuật này cho phép tái sinh chồi hoặc
cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ (Dương Công
Kiên, 2002).
2.1.2. Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.2.1 Ưu điểm
Phương pháp nuôi cấy mô hay nhân giống in vitro có ý nghĩa to lớn trong nghiên
cứu lý luận sinh học thực vật cơ bản, mở ra khả năng tìm hiểu sâu sắc về bản chất của

sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh đặc tính
của cơ thể với các hợp quần của chúng khi tách ra khỏi cơ thể, từ đó rút ra quy luật về
môi tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế, ta đã tách và nuôi cấy được mô
phân sinh (meristem), sau đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo
(callus), từ mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Trong tiến trình tạo
cây từ mô sẹo, ta có thể gây ra những thay đổi có định hướng ở mức độ tế bào.
Nuôi cấy mô cho phép tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một
cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh
trưởng, phát triển và mối quan hệ giữa chúng với môi trường bên ngoài. Từ đó tìm ra
các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của thực vật theo chiều hướng mong muốn.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và nghiên
cứu mối quan hệ giữa kí sinh và kí chủ. Như vậy, nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải
quyết một cách cơ bản, từ đó giúp tìm ra cơ chế miễn dịch thực vật, phục vụ tốt hơn
cho công tác phòng bệnh ở thực vật. Một khi con người hoàn toàn làm chủ được cơ
chế này thì các biện pháp phòng chống bệnh sẽ được hoàn thiện, hiệu quả và đỡ tốn
kém hơn nhiều (Nguyễn Đức Lượng, 2006).

3


Nhân giống in vitro cho phép tạo một quần thể lớn và đồng nhất trong một thời
gian ngắn với diện tích thí nghiệm nhỏ và điều kiện hóa lý kiểm soát được; tạo được
nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây mà không thực hiện được ngoài thiên nhiên;
tạo ra cây con trẻ hóa và phát triển mạnh hơn những cây được nhân giống bằng
phương pháp nhân giống cổ điển; tạo dòng cây sạch bệnh bằng cách nuôi cấy mô phân
sinh (meristem) hay nuôi cấy phôi tâm (nucellar embryo); bảo quản được một số lượng
cây lớn trong một diện tích nhỏ, thích hợp để xây dựng ngân hàng giống và sản xuất
các hợp chất thức cấp có hoạt tính sinh học ở quy mô công nghiệp.
2.1.2.2 Nhược điểm
Bên cạnh những thuận lợi kể trên, phương pháp nhân giống in vitro còn có những

bất lợi như tốn thời gian và công sức mà giá thành lại cao hơn các phương pháp nhân
giống cổ điển. Kiểu gene thực vật không ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy.
Thường xảy ra đột biến dinh dưỡng. Mức độ đột biến càng cao khi số lần cấy càng
nhiều, đặc biệt khi tạo chồi bằng mô sẹo (Takayama, 1991). Tiến tình nhân giống phức
tạp vì bao gồm nhiều giai đoạn liên quan nhau trước khi có thể đem ra vườn ươm
trồng. Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện. Hạn
chế nghiêm trọng nhất trong vi nhân giống là tỷ lệ sống sót của cây thấp sau khi được
chuyển ra vườn ươm vì sự khác biệt lớn giữa điều kiện in vitro và ex vitro. Tất cả
những khó khăn trên được xem như trở ngại to lớn cho việc ứng dụng rộng rãi kỹ thuật
vi nhân giống các giống thực vật có chất lượng cao.
2.1.3. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống
cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay, phương pháp nhân giống vô tính thực
vật in vitro đã trở thành phổ biến.
Phương pháp nuôi cấy mô còn có triển vọng sử dụng rộng rãi trong Công nghệ
Sinh học. Bằng phương pháp này chỉ sau một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo được
một lượng sinh khối lớn, có hoạt chất sinh học như alkaloic, glycoside, các steroid
(dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm
sự sinh trưởng của vi khuẩn trong công nghiệp.

4


2.1.4. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào thực vật là áp dụng kỹ
thuật sản xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng.
Những lợi ích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm
nghiệp gồm có kiểm soát được dịch bệnh cây trồng; kiểm soát được chất lượng giống
thông qua kiểm soát kiểu gene của giống đem vào sản xuất; kiểm soát được toàn bộ kỹ
thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch; tạo ra sự đồng đều về giống, từ đó tạo ra

sự đồng nhất của sản phẩm cuối cùng. Do đó, năng suất lao động tăng lên, chất lượng
sản phẩm đồng nhất, thuận lợi cho việc cơ giới hóa nông nghiệp.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông
nghiệp và lâm nghiệp. Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong ngành
trồng trọt.
2.1.5. Hệ thống nuôi cấy thoáng khí
2.1.5.1 Một số hệ thống nuôi cấy thoáng khí
Hệ thống nuôi cấy “Culture Pack”
“Culture Pack” (CP, kích thước 7,5 × 7,5 × 10,5 cm) là từ vật liệu film Neoflon
PFA (dày 25 m, công ty TNHH Daikin, Nhật Bản). Sử dụng giá thể rockwool (RW,
16 lỗ cắm của công ty Grodan Rockwool Multiblock AO 18/30, Grodania A/S, Đan
Mạch). Thể tích môi trường 100 – 120 ml. Đây là hệ thống thoáng khí được sử dụng
trên nhiều đối tượng: dâu tây, bạch đàn, chuối, lan ý, địa lan và lan hồ điệp (Nguyễn
Phúc Huy, 2006).
Hệ thống nuôi cấy “Miracle Pack”
“Miracle Pack” (MP, kích thước khung 108 × 108 × 130 mm) là hệ thống nuôi
cấy được cải tiến từ CP, có thể đặt đèn chiếu lên trên. MP gồm film Neoflon PFA
được giữ cố định bởi khung làm bằng polycarbonate. Hệ thống MP RW sử dụng RW
có 25 lỗ cắm và được đậy lại bằng nắp (Nguyễn Phúc Huy, 2006).
Hệ thống nuôi cấy có lỗ thoáng khí
Hệ thống nuôi cấy thoáng khí sử dụng hộp nhựa Magenta GA 7 (Mỹ) và hộp
nhựa tròn khoan 1 đến 2 lỗ đường kính 0,5 cm ở nắp hộp. Dán kín các lỗ đã khoan
bằng màng MillisealR (Công ty TNHH Millipore, Nhật Bản), kích thước lỗ 0,5 m,
đường kính 1,8 mm (Nguyễn Quốc Thiện, 2004).

5


Mục đích sử dụng hệ thống nuôi cấy thoáng khí
Thông thường, đậy kín bình nuôi cấy ngăn ngừa được sự xâm nhiễm của các vi

sinh vật và sự thoát hơi nước quá mức. Tuy nhiên, hình dạng bình nuôi cấy kín làm ảnh
hưởng đến thành phần các khí. Ví dụ tích lũy nước quá mức ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng của mô như sự kéo dài của chồi, sự nảy chồi, gia tăng trọng lượng tươi. Sự khác
nhau về sinh trưởng của cây Chenpodium rubum in vitro trong các loại bình nuôi cấy là
do thành phần không khí khác nhau (hàm lượng CO2, ethylene) đã được chứng minh.
Những thông số về trao đổi khí trong bình có thể biểu diễn bằng số lần trao đổi
khí trong 1 giờ (N). N trong bình nuôi cấy kín là không đổi. Đối với hệ thống nuôi cấy
kín sử dụng màng film polypropylene, N có thể tăng từ 3 đến 6 lần (Kozai và
Sekimoto, 1988).
Sử dụng hệ thống nuôi cấy thoáng khí cải thiện được hiện tượng thủy tinh thể ở
cây hoa bibi (Dillen và Buysens, 1989), cây hoa cẩm chướng (Harkkaart và Versluijs,
1983) và để nâng cao sự sinh trưởng của cây dâu tây (Kozai và Sekimoto, 1988).
Như vậy mục đích của việc sử dụng hệ thống nuôi cấy thoáng khí để tăng cường
khả năng trao đổi khí trong bình nuôi cấy và môi trường ngoài nhằm tăng hàm lượng
CO2 lên mức tối ưu trong bình nuôi cấy nhằm tăng khả năng quang hợp của cây in
vitro (Tanaka, 1991), giảm nồng độ khí ethylene và các độc tố (de Proft và ctv, 1985),
giảm hàm lượng O2 trong bình nuôi cấy xuống khoảng 10% (Tanaka, 1991), giải quyết
vấn đề thủy tinh thể của cây con in vitro và hình thành hệ rễ thứ cấp trong giai đoạn in
vitro, điều này cũng góp một phần cải thiện tỷ lệ sống sót của cây khi đưa ra vườn
ươm (Nhut và ctv, 2002)
2.1.6. Môi trường trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro là thành phần môi
trường nuôi cấy. Tùy theo mục đích thí nghiệm thành phần môi trường sẽ thay đổi,
nhưng nhìn chung đều có các thành phần sau: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng,
vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Ngoài ra, người ta còn bổ sung
các chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA…) và một số chất có
thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,… (Nguyễn Đức Lượng
và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).

6

Khoáng đa lượng
Nhu cầu khoáng trong nuôi cấy in vitro không khác nhiều so với cây trồng trong
điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg, Fe.
Khoáng vi lượng
Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên
cứu. Có rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối
với sự phát triển của mô và tế bào như Fe, Mn, B, Zn, Cu, Co, I, Mo.
Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào
và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát
triển. Các vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là thiamine (B1), acid
nicotinic (PP), biotin, acid folic, acid ascorbic (C), panthothenic acid, vitamin E
(tocophenol), riboflavin và p-aminobenzoic acid (B6)
Carbon và nguồn năng lượng
Trong nuôi cấy in vitro, nguồn cacbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các
chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối và thường được bổ sung vào môi
trường dưới dạng đường đa và đường đơn. Hiện nay, người ta thường sử dụng sucrose
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định
Bổ sung nhiều chất hữu cơ khác nhau vào trong môi trường nuôi cấy thường
mang lại kết quả tốt cho sự tăng trưởng của mô. Các chất bổ sung này là: dịch chiết
nấm men (yeast extract), dịch chiết mầm lúa mạch (malt extract), casein hydrolysate,
pepton, dịch chiết khoai tây, dịch chiết chuối.
Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung
các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào –
đây là nguồn nitrogen hữu cơ và được hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ.
Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có 3 ảnh hưởng là hút các hợp
chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hoặc các chất làm đen môi trường.

7


Yếu tố làm đặc môi trường
Agar là chất thường được sử dụng nhất để tạo môi trường đặc hay môi trường
bán lỏng để nuôi cấy mô thực vật. Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng
gel và tan ra ở nhiệt độ 60C đến 100C và đặc lại khi nhiệt độ giảm xuống 45C nên
agar ổn định trong tất cả điều kiện nhiệt độ môi trường nuôi cấy và không bị phân hủy
bởi enzym thực vật. Độ cứng của agar được quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và
độ pH (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Các hormone thực vật (phytohormones) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
(PGRs) đóng vai trò then chốt trong kiểm soát sự sinh trưởng, biệt hóa, phát triển và
sinh sản của thực vật, ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý ở các nồng độ khác nhau.
Tế bào mô trong hệ thống TCL sẽ phụ thuộc vào môi trường nhiều hơn, nhạy cảm hơn
với các PGRs bên ngoài (Dương Tấn Nhựt, 2006).
2.1.7.1 Auxin
Auxin là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N. Auxin gồm
hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh được tổng hợp bởi thực vật và auxin tổng hợp
do con người tạo ra. Các loại auxin thông dụng thường dùng: IAA, IBA, NAA, 2,4-D.
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào
nồng độ và sự kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng khác. Auxin tác động lên sự
kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự tiếp nối cho sự tăng tính đàn hồi của thành tế bào và
cho phép nước xâm nhập vào trong tế bào; sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế
bào tự kéo dài ra. Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể
hiện bằng sự phóng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm
giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+. Auxin còn tác động lên sự

chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp RNA ribosome. Auxin kích thích sự phân
chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mô sẹo và rễ bất định. Auxin
cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi soma trong môi trường
nuôi cấy mô sẹo.
Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng.
Chúng được tổng hợp từ lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa và ở trên
các quả còn non. Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự
phân cực rõ ràng được thấy rõ trên các thực vật còn non. Nhưng trong quá trình vận
8


chuyển này, chúng bị oxy hóa do hoạt động của auxin – oxydases, điều này cho thấy
nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng. Như vậy, auxin hiện
diện với nồng độ vừa đủ ở mức độ các điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo
cho sự nhân giống và kéo dài tế bào. Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành
rễ từ các đoạn cắt.
2.1.7.2 Cytokinin
Các cytokinin có liên quan tới sự phát triển thực vật và điều hòa sự phân chia tế
bào. Cùng với auxin, các cytokinin cần cho sự phân chia và biệt hóa tế bào ở nhiều
loài thực vật; người ta cũng đã chứng minh sự liên quan của chúng trong tất cả các giai
đoạn của chu trình tế bào (tại các thời điểm chuyển tiếp từ G2 sang M và từ G1 sang
S). Trong nuôi cấy mô, chúng cũng cảm ứng sự phát triển lục lạp và hình thành chồi.
Cytokinin có vai trò kiểm soát quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng ở một số loài, làm
chậm sự lão hóa mô và thúc đẩy sự hình thành cơ quan chồi, bật chồi bên, phát triển
lục lạp, mở rộng lá, tạo khối u và hiện tượng mô phân sinh ngọn phát triển ngang và ức
chế sự kéo dài tế bào ở thân và rễ (Dương Tấn Nhựt, 2006).
Quá trình kích thích sự hình thành và tăng nhanh chồi đã đạt được thành công
bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào trên môi trường có bổ sung hàm lượng
cytokinin cao.
Nhìn chung nồng độ auxin cao và cytokinin thấp thích hợp cho sự ra rễ, ngược

lại auxin thấp và cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành chồi (Heide, 1965). Các
đoạn cắt khi được xử lý ở nồng độ cytokinin cao khó ra rễ hơn các đoạn được xử lý ở
nồng độ cytokinin thấp (Okoro và ctv, 1978). Cytokinin tổng hợp ức chế sự hình thành
rễ của các đoạn cắt từ thân (stem cutting) (Pierik và ctv, 1975). Tuy nhiên, cytokinin ở
nồng độ thấp, dùng trong giai đoạn cắt của cây đậu (mung bean) và cây thu hải đường
sẽ thúc đẩy sự hình thành rễ, trong khi ở nồng độ cao thì ức chế. Sử dụng cytokinin
cho các đoạn cắt của cây đậu sau giai đoạn khởi đầu hình thành rễ sẽ không gây ức chế
đến sự phát triển của rễ (Bollmark và ctv, 1986).
Các đoạn cắt từ lá thể hiện mối quan hệ giữa auxin và cytokinin vì các đoạn cắt
hình thành cả chồi và rễ. Ở nồng độ cao (13 mg/l), cytokinin thúc đẩy sự hình thành
chồi và ức chế sự hình thành rễ của các đoạn cắt từ lá cây Begonia trong điều kiện vô
trùng. Trong khi đó, auxin ở nồng độ cao có tác động ngược lại. Ở nồng độ thấp (2

9


mg/l), auxin thúc đẩy sự hình thành chồi. Ngoài ra, ở nồng độ thấp (0,8 mg/l),
cytokinin kích thích sự hình thành rễ.
Nồng độ cytokinin quá cao sẽ tạo ra một số lượng lớn chồi bất định nhưng giảm
chất lượng của chồi mới. Các kinh nghiệm trong việc nhân giống cây trồng cho thấy
chất lượng chồi bất định rất quan trọng trong sự tái sinh cây mới từ các đoạn cắt.
2.1.7.3 Gibberellin
Gibberellin là một nhóm lớn các hợp chất là diterpenoid có bốn vòng. Ngày nay,
người ta đã phát hiện hơn 60 loại Gibberellin khác nhau trong thực vật. Trong số các
loại Gibberellin, Gibberellin A3 (GA3) là phổ biến nhất và có hoạt tính cao nhất.
Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là sườn gibbane,
được trích ra từ thực vật, vi sinh vật và được đánh số sau chữ GA. Hoạt động của mỗi
hợp chất phụ thuộc vào khả năng di chuyển qua mô hoặc sự biến đổi nó thành một
dạng hoạt động khác. Acid gibberellic (GA3) và hỗn hợp giữa GA3 và GA7 là những
Gibberellin duy nhất có giá trị thương phẩm do chúng thường được sử dụng.

Gibberellin có tác dụng gây phản ứng kéo dài tế bào thân cây, nhưng với mức độ
sâu sắc và mạnh mẽ hơn nhiều so với auxin. Phản ứng kéo dài thân chủ yếu do tăng
trưởng tế bào chứ không phải phân chia tế bào. Cũng như auxin, gibberellin tác động
lên hầu như toàn bộ các quá trình sinh trưởng và phát triển. Qua tác động của
gibberellin, một lần nữa chúng ta nhận thấy trạng thái cân bằng của các hormone sinh
trưởng là tính chất đặc trưng quan trọng của mối tương quan hợp lý trong sinh trưởng
và phát triển. Được dẫn truyền theo cả hướng gốc và hướng ngọn theo cả phloem và
xylem, gibberellin gây nên hàng loạt các phản ứng trong toàn bộ cơ thể thực vật.
Các tác động đặc thù của gibberellin bao gồm phá vỡ trạng thái lùn di truyền của
cây do tác dụng kéo dài đốt thân, phá vỡ trạng thái ngủ của hạt ngũ cốc thông qua tác
dụng kích thích sinh tổng hợp amylase, proteinase và các enzyme thủy phân để huy
động các chất dinh dưỡng dự trữ trong hạt giống, kích thích ra hoa ở những cây ưa
lạnh và phụ thuộc vào quang chu kỳ, kích thích đậu quả và phát triển quả, một trong số
điều kiện có thể ngăn chặn sự lão hóa.
Người ta chưa rõ gibberellin có ảnh hưởng trực tiếp đến tổng hợp RNA hay
không, mặc dù đã phát hiện mối liên quan giữa gibberellin với tổng hợp RNA và
protein trong tế bào.

10


2.1.7.4 Abscisic Acid (ABA)
Abscisic acid (ABA) đóng vai trò như một chất kìm hãm sự tăng trưởng của thực
vật, gây ra trạng thái ngủ của hạt, hóa già và rụng lá. ABA còn có vai trò điều hòa sự
đóng mở khí khổng, điều khiển sự hấp thu nước và các ion của rễ.
Trong nuôi cấy mô, ABA đôi khi còn điều khiển sự phát sinh hình thái của mẫu
cấy. ABA thường kìm hãm sự tăng trưởng của mô sẹo. Tuy nhiên, trong một vài thí
nghiệm, người ta nhận thấy ABA lại có khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô
sẹo. Hàm lượng ABA tự nhiên có liên quan đến trạng thái trưởng thành của mô
(Tanimoto và ctv, 1995). ABA cần thiết cho sự tăng trưởng bình thường của phôi

soma và chỉ trong môi trường có ABA thì phôi soma mới phát triển và có cấu trúc
tương tự như phôi hợp tử.
2.1.7. Sơ lược về vai trò của ethylene và bạc nitrat trong nuôi cấy mô thực vật
2.1.8.1 Ethylene
Hầu hết các phần khác nhau của cơ thể thực vật bậc cao có thể sản sinh ra
ethylene, tuy nhiên tốc độ hình thành khí đó phụ thuộc vào kiểu mô, giai đoạn phát
triển của cơ thể thực vật.
Ethylene gây ra sự chín trái, sự lão hóa và sự rụng lá, quả, hoa; cảm ứng sự giãn
của tế bào theo hướng bên; cảm ứng ra rễ và lông hút,…
Ethylene kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo. Như phôi của Ginkgo biloba sẽ
nảy mầm trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật nếu như miệng
ống nghiệm được đậy bằng nút bông gòn, còn nếu nuôi trong ống nghiệm có cùng loại
môi trường nhưng miệng ống nghiệm được đậy bởi parafin thì sẽ có sự tạo mô sẹo vì
có thể lượng ethylene sinh ra từ phôi không thoát được ra bên ngoài nên gây sự tạo mô
sẹo (Webb và ctv, 1986). Sự gia tăng lượng ethylene sinh ra do tác động của 2,4-D
trong môi trường nuôi cấy, nó sẽ có tác dụng kích thích sự tăng trưởng độc lập với
auxin cùng hiện diện (Mackenzie và Street, 1970). Đồng thời có một mối liên hệ giữa
tốc độ sinh ra ethylene và tốc độ tăng trưởng của mô sẹo thuốc lá (Huxter và ctv,
1979), thược dược (Gavinlertvatana và ctv, 1982) và cà chua (Mukund và ctv, 1988).
Tuy nhiên trong thí nghiệm nuôi cấy rễ khoai lang, Chalutz và de Vay (1969)
nhận thấy ethylene có tác dụng ức chế sự hình thành mô sẹo, làm tăng sự hóa bần ở
những tế bào tại vị trí vết thương và dường như nó ảnh hưởng ít nhiều đến sự phân
chia liên tục của những tế bào chưa phân hóa.
11


Ethylene ngăn cản sự hình thành chồi trong suốt năm ngày đầu tiên của quá trình
khởi tạo chồi, nhưng sau đó thúc đẩy sự khởi tạo lá (Huxter và ctv, 1981).
Ethylene vừa có tác dụng kích thích vừa có tác dụng kìm hàm sự ra rễ từ mẫu cấy
in vitro. Như sự tạo rễ của mẫu lá cây cà chua bị ức chế nếu có ethylene (Coleman và

ctv, 1980). Fabijan và ctv (1981) cho rằng ethylene cản sự tạo rễ trong những ngày đầu
tiên của quá trình cảm ứng ra rễ từ trụ hạ diệp Helianthus, nhưng sau đó nó lại kích
thích quá trình này.
2.1.8.2 Bạc nitrat (AgNO3)
Bạc nitrat có tác dụng ngăn chặn hoạt động của ethylene (Beyer, 1976a). Ion bạc
có khả năng đặc biệt trong việc ngăn chặn hoạt động của ethylene ngoại sinh trong các
hiện tượng sinh lý, lão hóa và chậm phát triển (Beyer, 1976b). Điều này có thể ứng
dụng trong nuôi cấy mô. Bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy giúp cải thiện đáng
kể sự tái sinh mô thực vật một và hai lá mầm (Beyer, 1976b; Purnhauser và ctv, 1987;
Songstad và ctv, 1988; Chi và Pua, 1989). Cơ chế chính xác của hoạt động AgNO3
trên thực vật chưa rõ ràng. Tuy nhiên, có một vài bằng chứng cho thấy sự can thiệp
của cơ chế đó lên bộ máy thụ cảm ethylene (Beyer, 1976b). Trong những năm gần
đây, AgNO3 đã được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô để ức chế hoạt động
ethylene vì khả năng hòa tan trong nước và không có độc tố ở nồng độ nhất định
(Beyer, 1976a). Rất nhiều các báo cáo cho thấy ứng dụng của AgNO3 trong nuôi cấy
mô cũng như các lĩnh vực khác. Sau đây là một số ứng dụng chính của AgNO3 (Kumar
và ctv, 2009).
Tác động của bạc nitrat lên sự phát sinh phôi soma
Về mặt lý thuyết, mỗi tế bào thực vật sống đều có khả năng hình thành phôi
soma. Phôi soma được hình thành từ tế bào sinh dưỡng thực vật. Các ứng dụng của
quá trình này bao gồm: nhân giống vô tính tạo cây trồng đồng nhất về mặt di truyền,
loại bỏ virus, cung cấp các nguồn mô để chuyển gen, tái sinh tạo cây hoàn chỉnh từ tế
bào đơn gọi là protoplasts và phát triển công nghệ hạt giống nhân tạo. Các chất điều
hòa sinh trưởng thực vật có thể được dùng để kích thích hình thành mô sẹo và sau đó
tạo ra phôi gián tiếp từ mô sẹo hoặc trực tiếp từ các mô nguyên vẹn. Tỷ lệ các chất này
để tạo ra mô sẹo hoặc hình thành phôi rất khác nhau ở các loại thực vật. Việc sử dụng
các AgNO3 cải thiện sinh phôi ở một số loài thực vật như buffalograss (Fei và ctv,
2000), cà phê (Coffe sp.) (Fuentes và ctv, 2000), cà rốt (Nissen, 1994), vân sam trắng
12

(Kong và Yeung, 1994), Triticum durum (Fernandez và ctv 1999) và Zea mays L.
(Vain Hort và ctv, 1989; Songstad và ctv, 1991).
Tác động của bạc nitrat lên cảm ứng tạo chồi và tái sinh chồi
Bạc nitrat có khả năng thúc đẩy nhân chồi ở các loài thực vật khác nhau. Sự hình
thành chồi in vitro đã được cải thiện bằng cách bổ sung bạc nitrat trong môi trường
nuôi cấy. Ganesh và Sreenath (1996) nhận thấy sự nảy mầm in vitro của chồi đỉnh ở
loài Coffea dưới ảnh hưởng của AgNO3. Việc bổ sung các N6-benzyladenine và
AgNO3 tăng cường đáng kể tỷ lệ nảy mầm. Ở nồng độ thấp, AgNO3 làm chậm sự lão
hóa dẫn đến cải thiện sự phát triển và tăng sinh ở cây cà phê vối (Coffea canephora)
(Fuentes và ctv, 2000). Bạc nitrat thúc đẩy sự phát triển của chồi C. arabica và C.
canephora (Giridhar và ctv, 2003). Sự tái sinh chồi củ cải Trung Quốc đã được cải
thiện khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 0,34 g/l AgNO3 (Pua và ctv, 1996).
Brassica đáp ứng kém với các thao tác nuôi cấy mô (Narasimhulu và Chopra, 1988).
B. campestris sản xuất ethylene ở mức độ cao gây ra sự sinh trưởng phát triển bất
thường của cây trong điều kiện nuôi cấy mô (Lentini và ctv, 1988), và cũng ức chế tái
sinh chồi trong ống nghiệm (Chi và ctv, 1990; Palmer, 1992; Pua và Chi, 1993). Các lá
mầm và trụ dưới lá mầm của 7 giống thuộc các chi B. campestris spp. chinensis, spp.
pekinensis và spp. parachinensis được cải thiện sự tái sinh chồi trên môi trường nuôi
cấy bổ sung chất kích thích sinh trưởng và AgNO3.
Tác động của các tiền chất của ethylene như 1-aminocyclopropane-1-carboxylic
acid (ACC), silver thiosulfate và aminoethoxyvinylglycine (AVG) lên nuôi cấy tạo
chồi nách đã được thử nghiệm trên loài yellow passionfruit (Passiflora edulis) (Reis và
cvt, 2003). Sự tái sinh cơ quan được đánh giá qua số chồi hình thành trên mỗi mẫu,
diện tích lá trung bình và chiều cao chồi. Khi hoạt động và sự tổng hợp của ethylene bị
ức chế, số chồi và diện tích lá tăng lên rõ rệt. Điều này cho thấy hiệu quả của AgNO3
trong sự phát triển in vitro của chồi bên.
Sự ức chế hoạt động của ethylene của AgNO3 đã kích thích sự tái sinh chồi từ lá
mầm ở cây Helianthus annus (Chraibi và ctv, 1991). Ở nhiều loài cây, khả năng tái
sinh của tế bào và mô giảm khi số lần cấy chuyền tăng lên (Ogura và Shimada, 1978).

Hiện tượng này xuất hiện ở cây Pennisetum americanum và được Plus cũng ctv (1993)
giải quyết hiệu quả bằng cách bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy nhằm khôi

13


phục khả năng tái sinh. AgNO3 làm tăng tỷ lệ tái sinh chồi ở cây silk tree (Albizzia
julibrissin) và Nicotiana plumbaginifolia.
Sự bổ sung putrescine và AgNO3 ảnh hưởng lên sự hình thành hình dạng của rau
diếp xoăn (Chichorium intybus) (Bais và ctv, 2000). Putrescine và AgNO3 cảm ứng
nhân chồi và ra hoa in vitro. Cây rau diếp xoăn, thường ra hoa 2 năm 1 lần, có thể
được kích thích để ra hoa trong thí nghiệm nghiên cứu sự thụ phấn in vitro và phát
triển của hạt (Bais và ctv, 2000).
Bạc nitrat cho thấy tác động có hiệu quả trong việc tái sinh và nhân giống vô tính
một vài loài cây công nghiệp quan trọng như đậu phộng (Pestana và ctv, 1999), đậu
đũa (Brar và ctv, 1999), Brassica sp. (Eapen và George, 1997), Capscicum sp. (Hyde
và Philips, 1996), dưa hấu (Lim và Song, 1993), dưa leo (Mohiuddin và ctv, 1997), lựu
(Naik và Chand, 2003), white marrygold (Misra và Datta, 2001), cây sắn (Zang và ctv,
2001), thuốc lá cảnh (Gavinlertvatana và ctv, 1980).
Tác động của bạc nitrat lên sự ra rễ in vitro
Decalepis hamiltonii Wight thuộc họ Asclepiadaceae, là một loại cây bụi leo bản
địa của bán đảo Deccan và các khu rừng của Western Ghats ở Ấn Độ. Loài này được
sử dụng như một loại gia vị ẩm thực do rễ của nó có mùi thơm. Vì vậy, tạo rễ in vitro
là một vấn đề lớn trong nuôi cấy mô ở loài cây này. Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự
hình thành rễ in vitro của Decalepis hamiltonii đã được nghiên cứu. Bổ sung 6,8 mg/l
AgNO3 sẽ kích thích rễ mọc và kéo dài (Reddy và ctv, 2001).
Vani là một cây gia vị quan trọng có giá trị thương mại. Ảnh hưởng của AgNO3
lên sự ra rễ và nảy chồi đã được nghiên cứu ở cây Vanilla planifolia (Giridhar và ctv,
2001). Số lượng chồi tối đa và chiều dài chồi cao nhất đã đạt được trên môi trường chứa
4,3 mg/l AgNO3. Bạc nitrat không chỉ cảm ứng nhân chồi nhưng cũng kích thích ra rễ ở

mẫu vani. Các cây con thu được trên môi trường chứa 6,8 mg/l AgNO3 có tỷ lệ sống sót
100%. Bạc nitrat cũng kích thích ra rễ và ra hoa in vitro trên cây gỗ thuốc hiếm, Rotula
aquatica Lour. Ngâm chồi trong dung dịch chứa NAA (0,45 mg/l) và AgNO3 (2 mg/l) là
giải pháp để cải thiện hiệu quả sự ra rễ ở loài này (Sunandakumari và ctv, 2004).
Tác động điều chỉnh biểu hiện giới tính của bạc nitrat
Sự ức chế hoạt động ethylene của AgNO3 đã được sử dụng để ngăn chặn sự phát
triển của hoa cái và tạo ra hoa đực (Beyer, 1976b; Takahashi và Jaffe, 1984). Dâu tằm
(Morus alba L.) là cây đơn tính khác gốc. Hoa lưỡng tính không xuất hiện trong điều
14


kiện tự nhiên (Thomas, 2004). Bằng cách xử lý chồi cắt với AgNO3, hoa lưỡng tính có
thể được tạo ra ở cây cái. Phân tích mô học của những bông hoa lưỡng tính cho thấy cả
noãn và túi phấn trong cùng một hoa (Thomas, 2004). Hoa lưỡng tính cũng đã gây ra ở
dưa chuột bằng cách xử lý AgNO3 (Stankovic và Prodanovic, 2002). Ethylene và auxin
thúc đẩy sự hình thành của hoa cái trong khi giberelin thúc đẩy sự hình thành của hoa
đực (Mohan Ram và Jaiswal, 1970). Tăng cường đặc tính của giới cái bằng auxin có thể
xảy ra thông qua sự cảm ứng sinh tổng hợp ethylene (Takahashi và Jaffe, 1984).
Ethylene có liên quan với biểu hiện giới tính ở thực vật và các cây đơn tính khác gốc tạo
ra nhiều ethylene hơn các cây đơn tính cũng gốc (Rudich và ctv, 1972). Theo đó,
AgNO3 có thể là hợp chất tiềm năng để điều chỉnh các biểu hiện giới tính ở thực vật.
Tác động của bạc nitrat lên sự chín của quả
Ethylene đóng một vai trò quan trọng trong việc khởi xướng và thúc đẩy quá
trình chín. Xử lý cà chua với các ion bạc đã cho thấy tác động ức chế hoạt động của
ethylene và sự chín của quả (Hobson và ctv, 1984). Hơn nữa, nếu các ion bạc đã được
áp dụng ở các giai đoạn chín ngay sau giai đoạn bẻ gãy liên kết cellullar, sự chín có
thể ngăn chặn (Tucker và Brady, 1987).
Tác động của bạc nitrat lên sự rụng lá
Ethylene kích thích rụng lá ở cây bông bị chặn bởi các ion bạc (Beyer, 1976b).
Nếu không có AgNO3, tất cả các lá sẽ rụng vào ngày thứ 7. Cây được xử lý với nồng

độ AgNO3 ngày càng tăng và được đặt trong ethylene sẽ rụng ít lá hơn. Xử lý với 25
mg/l AgNO3 giảm thời gian rụng lá 100% xuống 2 ngày. Xử lý AgNO3 cũng làm chậm
ảnh hưởng của ethylene. Thí nghiệm tương tự khác với các cây bông trưởng thành đã
chứng minh một khả năng của AgNO3 trong việc ngăn chặn hiện tượng rụng trái non
và hoa (Beyer, 1976b).
2.2. Giới thiệu cây sâm Ngọc Linh
2.2.1. Phân loại
2.2.1.1 Lịch sử phát hiện
Ngày 19 tháng 3 năm 1973, Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang (được biết có
cả Nguyễn Thị Lê) đã phát hiện và thu được những mẫu sâm Ngọc Linh đầu tiên ở núi
Ngọc Linh, độ cao từ 1500 – 2200 m, thuộc địa phận của tỉnh Kon Tum hiện nay. Hai
tác giả đặt tên cho cây thuốc này là “sâm đốt trúc” – Panax arculeatus (Đào Kim Long
và Nguyễn Châu Giang, 1991). Những tiêu bản đầu tiên này hiện đã không còn.
15