XÁC ĐỊNH Aspergillus NHÓM Flavi SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRONG NÔNG SẢN BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH Aspergillus NHÓM Flavi SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN
TRONG NÔNG SẢN
BẰNG KỸ THUẬT PCR

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

NGUYỄN XUÂN DANH

Niên khóa:

2011 - 2013

Tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH Aspergillus NHÓM Flavi SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN
TRONG NÔNG SẢN
BẰNG KỸ THUẬT PCR

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. HUỲNH VĂN BIẾT

NGUYỄN XUÂN DANH

ThS. TRẦN THỊ VÂN

Tháng 12/2013


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, tôi luôn nhận đƣợc sự chỉ dẫn tận
tình của Quý Thầy Cô, sự động viên của gia đình và sự giúp đỡ của bạn bè, chính
nhờ những điều này đã giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận.
Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin gửi đến Quý Thầy Cô khoa Nông Nghiệp và Công
Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt hai năm học qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Lê Đình Đôn đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi
thực hiện khóa luận này tại Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng
trƣờng Đại Học Nông Lâm, Thành Phố Hồ Chí Minh.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy Huỳnh Văn Biết và cô Trần Thị Vân đã hết
lòng hƣớng dẫn, chỉ dạy cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.

TP.HCM, Ngày 06 Tháng 12 Năm 2013
Nguyễn Xuân Danh

i


TÓM TẮT
Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus gây nhiễn nghiêm trọng của các
nông sản vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Sự xâm nhiễm của các loại nấm này trong
nông sản có thể là gây ô nhiễm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bởi độc tố Aflatoxin
gây ung thƣ mạnh. Việc ăn phải các loại thực phẩm nhiễm Aflatoxin đƣợc ghi nhận
là một yếu tố gây nguy cơ ung thƣ biểu mô gan cho ngƣời. Trong bài báo cáo này
nghiên cứu trên một số loại nông sản nhƣ bắp, đậu phộng và cà phê nhằm kiểm tra
sự hiện diện của các loại nấm sinh Aflatoxin. Từ 45 mẫu bao gồm Bắp (15 mẫu),
Đậu Phộng (15 mẫu) và Cà Phê (15 mẫu), phân lập đƣợc 30 chủng nấm mốc. Dựa
vào hình thái khuẩn lạc và đăc điểm tế bào chi nấm Aspergillus flavus đƣợc phát
hiện, không có sự hiện diện của nấm Aspergillus parasticus. Nấm Aspergillus flavus
hiện diện trên bắp 35,33%, 36,80 % trên đậu phộng và 0 % trên mẫu cà phê.
Về đặc điểm hình thái học, chủ yêu dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi
trƣờng PDA và hình thái bào tử, nấm Aspergillus flavus có khuẩn lạc màu xanh lá
hơi vàng, bào tử đính trơn hoặc nhám.
Về phân tử, sự hiện diện của một gene aflQ (=ord1=ordA) liên quan đến con
đƣờng sinh tổng hợp Aflatoxin đã đƣợc kiểm tra (bằng phƣơng pháp PCR). Sự hiện
diện của gene này có mối tƣơng quan tới các chủng nấm mốc sinh Aflatoxin. Tất cả
các chủng nấm Aspergillus flavus phân lập đƣợc đều cho kết quả dƣơng tính với sự
hiện diện của gene aflQ.

ii

SUMMARY
Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus cause perennial infection of
agriculturally important agricultural products in tropical and subtropical areas.
Invasion of crops by these fungi may result in contamination of food and feed by
potent carcinogenic aflatoxins. Consumption of aflatoxin contaminated foods is a
recognised risk factor for human hepatocellular carcinoma. This study conducted
some agricultural products such as: peanuts, corn and coffee beans for the presence
of aflatoxigenic fungi. From a total of 45 samples comprising peanut (15), corn (15)
and coffee beans (15), 30 strains of fungi were isolated. Identification of strains by
colony morphology found to be Aspergillus flavus with no Aspergillus parasiticus
isolated. Aspergillus flavus was present in 35.33% of peanut samples, 36.80 % of
corn samples and 0 % of coffee beans samples.
On the basis of morphological characters (mainly colony color on Potato Dglucose agar and conidia orphology), Aspergillus flavus had yellow-green (yellow
is less than) colonies and smooth tofinely rough globose conidia.
Molecularly, the presence of one genes of the aflatoxin biosynthetic pathway,
aflQ (=ord1=ordA) were tested (by PCR method). The presence of genes correlate
with aflatoxigenicity. All of Asperglillus flavus isolates were positive with the
presence of aflQ (ord1).
Keywords: Asperglillus, PCR, Aflatoxin, morphological characters.

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i
TÓM TẮT .......................................................................................................................ii
SUMMARY ................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG ..........................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... viii
Chƣơng 1: GIỚI THIỆU .................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của để tài................................................................................. 2
1.3. Nội dung đề tài ......................................................................................................... 2
Chƣơng: 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3
2.1. Nhóm Aspergillus flavi sinh độc tố Aflatoxin .......................................................... 3
2.1.1. Phân loại học. ........................................................................................................ 3
2.1.2. Hình thái. ............................................................................................................... 3
2.1.3 Sinh thái .................................................................................................................. 4
2.2. Phƣơng pháp phát hiện nhóm Aspecgillus flavi ....................................................... 5
2.2.1. Dựa vào đặc điểm hình thái. .................................................................................. 5
2.2.2. Dựa trên phƣơng pháp sinh học phân tử ............................................................... 6
2.3. Độc chất Aflatoxin. ................................................................................................... 7
2.3.1 Lịch sử phát hiện aflatoxin. .................................................................................... 7
2.3.2. Công thức cấu tạo và một số tính chất vật lý của Aflatoxin .................................. 8
2.3.3. Tác hại của Aflatoxin ............................................................................................. 9
2.4. Giới thiệu về kỹ thuật PCR .................................................................................... 10
2.4.1. Khái quát về kỹ thuật PCR. ................................................................................ 10
2.4.1.1 Khái niệm .......................................................................................................... 10
2.4.1.2 Lịch sử ............................................................................................................... 10
2.3.2. Nguyên lý ............................................................................................................ 11
2.3.3. Các thành phần phản ứng. ................................................................................... 11
iv


2.3.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ...................................................................... 12
2.3.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR. ......................................................... 13
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 14

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 14
3.2. Vật liệu. .................................................................................................................. 14
3.2.1. Mẫu thực hiện. ..................................................................................................... 14
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ chính .................................................................................... 14
3.3. Phƣơng pháp. .......................................................................................................... 15
3.3.1. Phƣơng pháp định danh nấm mốc. ...................................................................... 15
3.3.2. Phƣơng pháp tách chết DNA. .............................................................................. 16
3.3.3. Phƣơng pháp PCR. .............................................................................................. 16
3.3.4. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose ................................................................. 18
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 19
4.1. Kết quả .................................................................................................................... 19
4.1.1. Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus nhóm Flavi trong nông sản ................ 19
4.1.1.1. Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus nhóm Flavi trên mẫu bắp ................ 19
4.1.1.2. Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus nhóm Flavi trên mẫu đậu phộng ..... 20
4.1.1.3. Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus nhóm Flavi trên mẫu cà phê ........... 21
4.1.2. Kết quả mô tả hình thái nấm Aspergillus flavus. ................................................. 22
4.1.3. Kết quả tách DNA nấm Aspergillus flavus. ......................................................... 24
4.1.3.1. Kết quả tách DNA mẫu nấm Aspergillus flavus phân lập từ bắp ..................... 25
4.1.3.1. Kết quả tách DNA mẫu nấm Aspergillus flavus phân lập từ hạt đậu phộng. ... 26
4.1.4. Kết quả xác định nhóm nấm Aspergillus flavus bằng phƣơng pháp PCR. .......... 26
4.1.4.1. Kết quả thử nghiệm quy trình PCR xác định Aspergillus flavus. ..................... 26
4.1.4.2. Kết quả PCR xác định Aspergillus flavus phân lập từ mẫu bắp. ...................... 28
4.1.4.3. Kết quả PCR xác định Aspergillus flavus phân lập từ mẫu đậu phộng ........... 29
4.2. Thảo Luận ............................................................................................................... 29
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 32
5.1. Kết luận................................................................................................................... 32
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHÀO ............................................................................................. 33
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 36
v

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
AFB1

Aflatoxin B1

AFB2

Aflatoxin B2

AFG1

Aflatoxin G1

AFG2

Aflatoxin G2

AFPA

Aspergillus flavus và Aspergilus parasiticus agar

CCA

Coconut cream agar

ddNTP

Dideoxyribonucleotide triphosphate.

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate.

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid.

Kb

Kilobases.

PCR

Polymer chain reaction.

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphisms

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SSCP

Single strand conformation polymorphyrism..

Ta

Annealing temperature.

Tm

Melting temperature.

UV

Ultraviolet.

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Phân loại học nấm Aspecgillus flavus ............................................................. 3
Bảng 2.2 Phân loại học nấm Aspecgillus parasiticus ..................................................... 3
Bảng 3.1 Một số mẫu nông sản tiến hành thí nghiệm ................................................... 14
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR. ........................................................................... 17
Bảng 4.1 Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus flavus trên mẫu bắp ...................... 20
Bảng 4.2 Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus flavus trên mẫu đậu phộng ........... 21

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
2.1 Aspergillus flavus.....................................................................................................3
Hình 2.2 Aspergillus parasiticus ...................................................................................3
Hình 2.3 Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2.....................8
Hình 3.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR. .............................................................17
Hình 4.1 Nấm Aspergillus flavus nhiễm trên mẫu nông sản. .....................................19
Hình 4.2 Mẫu ca phe trên môi trƣờng PDA sau 5 ngày nuôi cấy ...............................22
Hình 4.3 Nấm Aspergillus flavus trên bắp và đậu phộng ...........................................22
Hình 4.4 Khuẩn lạc Aspergillus flavus trên môi trƣờng PDA sau 5 ngày nuôi cấy ...23
Hình 4.5 Tản nấm Aspergillus flavus trên môi trƣờng PDA sau 15 ngày nuôi cấy ....23
Hình 4.6 Bông bào tử nấm Aspergillus flavus ............................................................24
Hình 4.7 Bào tử nấm Aspergillus flavus .....................................................................24
Hình 4.8 Sợi nấm Aspergillus flavus trên môi trƣờng PD broth sau 72 giờ nuôi cấy 25
Hình 4.9 Kết quả điện di DNA genome nấm Aspergillus flavus phân lập từ hạt bắp 25
Hình 4.10 Kết quả điện di DNA genome nấm Aspergillus flavus phân lập từ hạt đậu
phộng ...........................................................................................................................26
Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu bắp B.5 .............................................26
Hình 4.12 Xử lý kết quả giải trình tự với phần mềm BioEdit ....................................27
Hình 4.13 Blast ssDNA đã xử lý lên ngân hàng dữ liệu NCBI ..................................27
Hình 4.14 Kết quả blast trình tự đã giải lên ngân hang giƣ liệu NCBI ......................28
Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu nấm Aspergillus flavus phân lập từ
bắp ...............................................................................................................................28
Hình 4.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu nấm Aspergillus flavus phân lập từ
đậu phộng ....................................................................................................................29

viii


Chƣơng 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, ngày càng xuất hiện nhiều bệnh liên quan đến chất lƣợng thực
phẩm. Rất nhiều mối quan tâm xoay quanh vấn đề dinh dƣỡng, an toàn thực phẩm.
Trong đó nhiễm các chất gây hại cho ngƣời nhƣ độc tố nấm mốc, vi khuẩn, kim loại
nặng, dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật đƣợc chú trọng đặc biệt.
Nƣớc ta có khí hậu nóng ẩm, lƣợng mƣa hằng năm cao, các điều kiện bảo
quản chƣa đƣợc quan tâm gây ảnh hƣởng đến chất lƣợng nông sản. Trong điều kiện
nhƣ vậy, nấm mốc có thể phát triển sinh độc tố gây ảnh hƣởng đáng kể đến sức khỏe
ngƣời tiêu dùng, đặc biệt là gây ung thƣ. Trong đó, có thể kể đến Aflatoxin gây ung
thƣ.
Độc chất Aflatoxin đƣợc tạo ra từ các lọai nấm mốc thuộc giống Aspergillus,
trong đó chủ yếu do Aspergillus nhóm Flavi sinh ra.Vì vậy, việc nghiên cứu phát
triển các phƣơng pháp chẩn đoán nấm Aspergillus nhóm Flavi sinh độc tố Aflatoxin
có ý nghĩa cực kỳ quan trọng.
Phƣơng pháp phân tích định danh nấm Aspergillus nhóm Flavi chủ yếu dựa
vào các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào (tiêu chuẩn ngành y tế,
2003) rất dễ nhầm lẫn với các loài nấm mốc Aspergillus khác.
Hiện nay, kỹ thuật PCR dựa trên kết quả nghiên cứu hệ gen và con đƣờng
sinh tổng hợp Aflatoxin có thể xác định chính xác nấm Aspergillus nhóm Flavi.
Từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định
Aspergillus nhóm Flavi sinh độc tố Aflatoxin trong một số nông sản bằng kỹ
thuật PCR”.

1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu của để tài
Kết hợp nuôi cấy truyền thống và phƣơng pháp PCR, xác định tỉ lệ nhiễm
nấm Aspergillus nhóm Flavi trong nông sản.
1.3. Nội dung đề tài
-

Thu thập và phân lập các chủng Aspergillus nhóm Flavi từ mẫu nông sản (hạt
đậu phộng, cà phê, hạt bắp).

-

Xác nhận Aspergillus nhóm Flavi phân lập từ nông sản bằng phƣơng pháp
PCR.

2


Chƣơng: 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Aspergillus nhóm Flavi sinh độc tố Aflatoxin
2.1.1. Phân loại học
Bảng 2.1 Phân loại học nấm Aspergillus flavus

Kingdom:

Fungi

Phylum:

Ascomycota

Class:

Eurotiomycetes

Order:

Eurotiales

Family:

Trichocomaceae

Genus:

Aspergillus

Species:

A. flavus

Hình 2.1 Aspergillus flavus

Bảng 2.2 Phân loại học nấm Aspergillus parasiticus

Kingdom:

Fungi

Phylum:

Ascomycota

Class:

Eurotiomycetes

Order:

Eurotiales

Family:

Trichocomaceae

Genus:

Aspergillus

Species:

A. parasiticus

Hình 2.2 Aspergillus parasiticus

2.1.2. Hình thái
Loài Aspergillus flavus rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơi lục và dạng ít
nhiều vón cục của tán.Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần
sùi, hình thành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài.
Các thể chai hoặc đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc
3

qua một lớp thể bình trung gian (thể bình 2 lớp); đôi khi cả hai kiểu đồng thời tồn
tại. (Đặng Vũ Hồng Miên (1980).
Các bào tử có kích thƣớc khá lớn (đƣờng kính từ 5-7μm) hình cầu, màu vàng
nâu đến hơi lục, hơi sần sùi. Đôi khi A. flavus chỉ đƣợc coi là thuộc loài những loài
nấm có cuống bào tử đính xù xì và hai lớp thể bình, còn ở loài A. parasiticus thì
cuống bào tử đính nhẵn và thể bình một lớp.
2.1.3. Sinh thái
Aspergillus flavus đƣợc xem là loài đƣợc phân bố khắp mọi nơi: dƣới đất,
trên các chất hữu cơ, và các loại hạt nhất là các hạt có dầu. Từ lâu, ngƣời ta đã phát
hiện sự có mặt của nó ở dƣới đất, dù là trong rừng, ở vùng than bùn, vùng đất hoang
sa mạc, hoặc trong đất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hoặc hệ rễ lúa mì. Ngƣời ta
còn coi nó là có thể nhanh chóng xâm nhập lại đất đã khử trùng bằng hơi nƣớc. Đất
đai vùng nhiệt đới chứa nhiều loài này hơn nhiều so với đất đai vùng ôn đới. Nó
thƣờng gặp trên lúa mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì.
Bắp gạo cũng nhƣ các sản phẩm từ Bắp gạo thƣờng chứa loài này. Nó có rất
nhiều trên sợi bông và nhất là trên hạt bông, nó xâm nhập vào hạt qua các điểm hợp
hoặc nhờ những chỗ hủy hoại do côn trùng gây ra. Ngoài ra ngƣời ta còn thấy nó
trên: hạt và khô dầu tƣơng, củi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, quả cà phê, quả hồ đào
Brazin, thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hƣớng dƣơng, hạt thông, kê, ớt hạt tiêu đỏ, củ cải
đƣờng, quả lê, giăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác. Sự có mặt của các loài này
trong các thức ăn phức hợp của gia súc, ngay khi nuôi không có bắp, đậu phộng,
trên cỏ khô gia súc cũng vậy. Nếu có điều kiện thuận lợi, nó sinh sôi này nở rất
nhiều; trên lúa mì tồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2 % đến 17% bào tử của nó
chiếm từ 50-100% tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón lại
thành một lớp vỏ cứng sâu tới 0.6m. Nó cũng thƣờng có mặt trên bẹ bắp khi độ ẩm
vƣợt quá 15,5% (Đặng Vũ Hồng Miên (1980)
Nấm mốc độc Aspergillus flavus gặp nhiều ở các loại lƣơng thực, thực phẩm
khác nhau, nhƣng các loại hạt có dầu (đặc biệt là đậu phộng) thích hợp nhất cho sự

phát triển của nó, và cũng ở đậu phộng độc tố Aflatoxin hình thành mạnh nhất.
Ngƣời ta nghiên cứu hơn 1.000 mẫu đậu phộng thí nghiệm thì thấy có 3,3% số củ là
rất độc; 1kg chứa trên 0,25mg Aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của Aspergillus flavus)
và 21,7% số củ độc vừa, 75% số củ không độc. Còn trên đậu phộng khô: 42% số
4


mẫu là rất độc, 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc. Nhƣ vậy chất độc tích
lũy lại trong đậu phộng khô là do sự chế biến, hoặc do Aspergillus flavus phát triển
mạnh lên (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2003).
Bào tử của nấm A. flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nƣớc,
trong đất. Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lƣơng
thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng. Vì phạm vi
ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thƣờng rất khó
khăn. Nấm A. flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lƣơng thực nhƣ: lúa, bắp, sắn,
trên một số loại hạt làm thực phẩm nhƣ: đậu phộng, đậu, vừng, trên thực phẩm nhƣ:
các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, đậu phộng, vừng, đậu đỗ và thậm chí cả trên hoa
quả tƣơi bị dập nhƣ: thanh long, nhãn, xoài, vải. Trong quá trình xâm nhiễm, sinh
trƣởng phát triển, chúng tiết ra độc tố Aflatoxin (Đặng Vũ Hồng Miên, 1980).
Đậu Phộng là một loại hạt có tỉ lệ nƣớc: 7,4 %, protein: 28 %, lipid: 44,5 %,
glucid: 15 %. Các nhà khoa học cũng đã phân lập đƣợc ở trong đậu phộng có một
chủng nấm độc Aspergillus flavus và thấy rằng các trƣờng hợp ngộ độc trƣớc đây
đều liên quan đến nấm độc này. Nấm mốc độc này cũng có gặp ở trong một số ngũ
cốc khác nhƣng với đậu phộng có thể là môi trƣờng thuận lợi nhất cho nó phát triển.
Nấm mốc khi xâm nhập vào trong đậu phộng chúng phát triển làm cho đậu phộng bị
mốc xanh hoặc mốc vàng. Đặc biệt nấm mốc này sinh ra độc tố Aflatoxin (Dƣơng
Thanh Liêm. 2003)
2.2. Phƣơng pháp phát hiện Aspergillus nhóm Flavi
2.2.1. Dựa vào đặc điểm hình thái
Việc phát hiện nấm mốc Aspergillus nhóm Flavi thƣờng dựa vào đặc điểm

hình thái. Nếu phân loại đến giống thì rất dễ nhận biết dựa vào cuống đính bào tử,
nhƣng để phân biệt đến loài thì rất phức tạp, thƣờng dựa vào các đặc điểm sau:
- Đặc điểm đại thể: bao gồm màu sắc bào tử và sợi nấm, đƣờng kính tản nấm,
màu sắc khuẩn lạc thay đổi, sự tạo sắc tố của các giọt tiết.
- Đặc điểm vi thể: phần lớn dựa vào sự sắp xếp, hình dạng và kích thƣớc của
bọng, bào tử và hình thái cuống, sự hiện diện tế bào Hülle, và hình thái của nang bào
tử. Hơn nữa, tất cả các đặc điểm hình thái phải đƣợc xác định trong điều kiện phòng
thí nghiệm chuẩn đƣợc thực hiện bởi các chuyên gia phân tích nấm để có thể nhận diện
chính xác.
5


Thông thƣờng, dựa vào một số môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc cho nấm nhƣ
Czapek Dox agar, Potato Dextrose Agar, Malt Extract Agar để nhận diện nấm mốc
hoặc sử dụng một số môi trƣờng khác nhƣ: để nhận diện nhóm A. flavus dựa trên
đặc tính chuyển hóa màu môi trƣờng ở mặt sau đĩa thạch sang vàng cam đối với môi
trƣờng Aspergillus flavus và Aspergilus parasiticus agar (AFPA) và Coconut cream
agar (CCA) dùng để phát hiện những chủng sinh Aflatoxin, sự tạo Aflatoxin đƣợc
phát hiện bằng cách quan sát huỳnh quang màu xanh lam dƣới đèn UV. (Rahimi và
ctv, 2007)
2.2.2. Dựa trên phƣơng pháp sinh học phân tử
Phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc áp dụng rộng rãi để nhận diện các loài
A. flavus. Phần lớn thƣờng sử dụng trình tự DNA mục tiêu là một trong những phức
rDNA, thƣờng là vùng ITS1 and ITS2 bên trong vùng phiên mã và vùng thay đổi ở
đầu 5’ vùng D1-D2 của 28S rRNA. Tuy nhiên, các loài thuộc nhóm A. flavus rất khó
phân biệt dựa vào trình tự gen. Các loài A. flavus, A. parasiticus, A. oryzae and A.
sojae có trình tự tƣơng đồng cao và kích thƣớc cũng tƣơng tự nhau, trình tự DNA
của chúng tƣơng đồng từ 91 đếm 100%. Kỹ thuật phân tích Random Amplified
Polymorphic DNA (RAPD) có thể phân biệt đƣợc 2 loài A. parasiticus and A. sojae.
Do đó, để nghiên cứu A. flavus, hoặc để so sánh A. flavus với các loài Aspergillus

khác và thậm chí nghiên cứu sự khác biệt về đặc tính sinh Aflatoxin, nhiều vùng
phức hợp rDNA và các gen liên quan đến quá trình sản sinh Aflatoxin đã đƣợc thử
nghiệm dùng làm markers với những mức độ thành công khác nhau. (GonzálezSalgado và ctv, 2007)
Một số nghiên cứu dựa trên kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) dùng
để phân tích sự khác biệt trên trình tự đƣợc khuếch đại. Nhƣng sự khuếch đại trình
tự mục tiêu của PCR phải đƣợc thực hiện thêm bằng kỹ thuật Restriction Fragment
Length Polymorphisms (RFLP), Single-Strand Conformation Polymorphisms
(SSCP) thì mới dễ dàng phân biệt A. flavus với các loài khác dựa trên đoạn 600bp
tƣơng ứng với vùng khuếch đại ITS1/5.8S/ITS2 với cặp mồi ITS1-ITS4. Một số tác
giả cho rằng khi sử dụng trình tự khuếch đại lớn kết hợp với phân tích PCR-SSCP
có thể loại bỏ đƣợc khó khăn lớn khi có sự thay đổi về mặt chủng loại. Tuy nhiên,
những phân tích này không phân biệt đƣợc những chủng có sinh Aflatoxin và không
sinh Aflatoxin.(González-Salgado và ctv, 2007)
6


Chang và cộng sự (1995) đã tìm thấy gen aflR để có thể nhận biết chủng A.
flavus và A. parasiticus, nhƣng Somashekar và công sự (2004) có thể phân biệt
đƣợc riêng biệt 2 chủng A. flavus và A. parasiticus dựa trên kỹ thuật RFLP bằng
cách dùng enzyme cắt giới hạn PvuII. Multiplex PCR, sử dụng nhiều cặp mồi để
nhận diện vùng mục tiêu là bƣớc tiến nhằm phân biệt các loài này và đã thành công
khi sử dụng aflR, ver-1, omt-1 and nor-1 genes. Nhƣng phƣơng pháp này không
phân biệt đƣợc những chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin. (Erami và
ctv, 2007)
Để phân biệt đƣợc những chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin
phải sử dụng phƣơng pháp reverse transcription PCR (RT-PCR) để xem sự biểu hiện
của gen sản sinh Aflatoxin dựa vào các gen liên quan đến quá trình điều hòa và gen
cấu trúc trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin. Scherm và cộng sự (2005) đã
nghiên cứu trên 13 chủng ở cả 2 loài A. flavus và A. parasiticus và tìm thấy 3 gen
(aflD, aflQ [syn. dmtA=omtB] and aflP [syn. omtA]) có thể sử dụng để phát hiện khả

năng sinh Aflatoxin và đƣợc sử dụng làm marker để nhận diện chúng.
Do đó, thật khó để phân biệt đƣợc chủng A. flavus với các loài tƣơng tự nhƣ
A. nomius and A. parasiticus. Để có thể nhận diện và phân biệt chính xác các loài có
khả năng sinh Aflatoxin thƣờng phải kết hợp nhiều phƣơng pháp khác nhau.
2.3. Độc chất Aflatoxin
2.3.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin
Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nƣớc Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc
đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “ bệnh gà tây X” (Turkey X
disease). Sau đó, các loại gia cầm khác nhƣ vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và chết
rất nhiều. Qua điều tra ngƣời ta xác định đƣợc bệnh đó có liên quan đến một loại
độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961, ngƣời ta đã tìm ra bản chất
hoá học của chất này là Aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus. Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa
4 loại trên thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều
nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (P. Rodrigues và ctv, 2007).
Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng Aflatoxin đƣợc sinh ra
bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u gan của động vật.
Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin. Các nhà khoa học
7


cũng đã xác định đƣợc công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin.
(Dƣơng Thanh Liêm. 2003)
2.3.2. Công thức cấu tạo và một số tính chất vật lý của Aflatoxin
Công thức phân tử của 4 loại Aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2):
• AFB1: C17H12O6
• AFB2: C17H14O6
• AFG1: C17H12O7
• AFG2: C17H14O7
Ngoài 4 loại trên, Aflatoxin còn có thêm hai sản phẩm trao đổi chất là

Aflatoxin M1 và M2. M1 là 4-hydroxy Aflatoxin B1 và M2 là 4-hydroxy Aflatoxin
B2.
Tính chất vật lý của các loại Aflatoxin:
 AFB1: có điểm nóng chảy 268-269oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang
 AFB2: có điểm nóng chảy 286-289oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang
 AFG1: có điểm nóng chảy 244-246oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang
 AFG2: có điểm nóng chảy 229-231oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang

Hình 2.3 Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2

8


2.3.3. Tác hại của Aflatoxin
Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (gây chết ngƣời với liều 10 mg), độc tố
Aflatoxin còn là hoạt chất gây xơ gan, ung thƣ gan. Aflatoxin là một trong nhƣng
chất gây ung thƣ gan mạnh nhất, nếu hâp thu một lƣợng là 2,5 mg Aflatoxin trong
thơi gian 3 tháng có thể dẫn đến ung thƣ gan sau 1 năm (Lƣơng Đức Phẩm. 2002).
Aflatoxin gây ra các tác hại chính sau đây:
-

Phá vỡ tế bào gan, thận và các bộ phân khác.

-

Ức chế miễn dịch.

-

Ăn mòn thành dạ dày và thành ruột.

-

Suy dinh dƣỡng, chậm lớn và chết.

-

Gây ung thƣ gan ở ngƣời và gia súc.
Nhƣ vậy, Aflatoxin có khả năng gây ngộ độc cấp tính và mãn tính ở ngƣời và

động vật. Nghiêm trọng nhất và nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thƣ
gan.
2.4. Giới thiệu về kỹ thuật PCR
2.4.1. Khái quát về kỹ thuật PCR
2.4.1.1. Khái niệm
Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – Polymerase Chain Reaction) là
kỹ thuật khuyếch đại đoạn DNA (hàm lƣợng rất nhỏ) với tốc độ nhanh, chính xác
cao đƣợc thực hiện trên máy chu trình nhiệt (máy PCR). (Phạm Hùng Vân. 2009)
2.4.1.2. Lịch sử
Phƣơng pháp PCR là một phát minh của nhà hóa - sinh học Karl Mullis và
các cộng sự, đƣợc nhóm nghiên cứu thuộc phòng Di Truyền Ngƣời ở Cetus ứng
dụng ban đầu để khuyếch đại DNA β - globulin và chuẩn đoán trƣớc sinh bệnh thiếu
máu tế bào hình liềm. Phản ứng chuỗi PCR nhanh chóng trở thành một kỹ thuật
đƣợc ứng dụng rộng rãi nhất trong sinh học phân tử với những lý do: là một phƣơng
tiện nhanh, rẻ tiền và đơn giản để tạo ra một lƣợng tƣơng đối lớn các bản sao phân
tử DNA từ một lƣợng vật liệu DNA gốc, ngay cả khi nguồn DNA có số lƣợng tƣơng
đối thấp.
Phƣơng pháp PCR ban đầu sử dụng phân đoạn Klenow của E.coli DNA
polymerase I để kéo dài các mồi bắt cặp. Enzyme này bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao
cần để tách hai sợi DNA ra khi bắt đầu mỗi chu kỳ PCR. Cho nên enzyme mới phải

9


đƣợc bổ sung vào mỗi chu kỳ.
Sau này, việc đƣa vào sử dụng một enzyme DNA polymerase bền nhiệt (Taq
DNA polymerase, Taq polymerase) tinh sạch từ chủng Thermus aquaticus đã biến
PCR thành một phản ứng đơn giản và mạnh, có thể đƣợc tự động hóa bằng thiết bị
chu trình nhiệt (máy PCR).
Phƣơng pháp PCR đầu tiên tổng hợp DNA bằng enzyme Klenow ở 37oC cho
sản phẩm PCR không đặc hiệu.Mặc dù phân đoạn đích đặc hiệu có thể đƣợc nhân
lên hàng triệu lần, nhƣng trong hầu hết sản phẩm tổng hợp PCR lại không phải phân
đoạn này. Bằng nhân dòng sản phẩm khuyếch đại β-globin và sàng lọc các dòng đơn
với mẫu dò β-globin để phát hiện trình tự đích và với một mồi để phát hiện trình tự
khuyếch đại, tính đặc hiệu PCR đƣợc đánh giá khoảng 1%. Các mồi khác cũng đều
đặc hiệu hơn hay ít hơn. Nhƣng PCR bằng enzyme Klenow không phải là phản ứng
đặc hiệu cao. Nó cần đƣợc phân tích tiếp với mẫu dò đặc hiệu, hoặc một số trƣờng
hợp với các mồi lồng nội phân tử để phát hiện và xác định tính chất trình tự đích của
khuyếch đại.
2.3.2. Nguyên lý
Kỹ thuật tổng hợp DNA in vitro tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao
chép DNA in vivo bao gồm các bƣớc cơ bản sau: đoạn DNA cần nhân mở xoắn
thành hai mạch đơn, cần có các cặp mồi (Primer), cần nguyên liệu (dNTP), điều
kiện môi trƣờng thích hợp (buffer) và enzyme DNA polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật
PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (940C) tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với
enzyme DNA polymerase chiu nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng
hợp cùng các đoạn mồi đƣợc thiết kế chủ động. Nhờ kỹ thuật PCR mà một lƣợng
nhỏ DNA ban đầu chúng ta có thể thu hút đƣợc đủ lƣợng DNA cần thiết để tiến
hành các thí nghiệm về DNA. (Dịch giả Phạm Hùng Vân, 2009)
2.3.3. Các thành phần phản ứng
Để tiến hành phản ứng PCR, cần có các thành phần sau:

-

DNA khuôn (DNA template): có thể là DNA kép, đơn hoặc tách chiết từ các đối
tƣợng nghiên cứu. DNA khuôn phải có độ nguyên vẹn cao, tránh lẫn tạp (hệ số
OD

260/280

đạt từ 1,8 đến 2) và có số lƣợng ban đầu từ 1 đến hàng chục

nanogram.

10


-

Đoạn mồi: lựa chọn cặp mồi rất quan trọng cho phản ứng PCR. Đoạn mồi là các
oligonucleotit có độ dài từ 6 đến 30 nucleotit, có trình tự bắt cặp bổ sung với
trình tự hai đầu mạch khuôn DNA. Trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc bảo đảm
không tự bổ sung cho nhau, không có cấu trúc kẹp tóc, giàu G (guanine) và C
(canine) (chiếm trên 60%). Mồi phải đảm bảo đủ dài và bắt cặp chính xác.
Nhiệt độ mồi (Tm) không khác nhau quá lớn (sai khác <5oC). Nồng độ mồi
thƣờng khoảng 100-500 nM. Thời gian gắn mồi 30-60 giây. Nhiệt độ gắn mồi
đƣợc tính theo công thức:
+ Đối với mồi nhỏ hơn hoặc bằng 20 nucleotit:
Tm = [2(A+T) + 4(G+C)]oC
+ Đối với mồi có chiều dài lớn hơn 20 nucleotit:
Tm = 22+1,46[2(G+C) + (A+C)]oC

-

Enzyme DNA polymerase: là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các
nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp. Ngày nay ngƣời ta sử dụng
nhiều loại DNA polymerase: Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Tth
DNA polymerase… nhƣng phổ biến nhất là Taq DNA polymerase. Taq DNA
polymerase đƣợc tách chiết từ chủng vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermophilus
aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA (92oC – 94oC). Taq
DNA polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, làm cho phản ứng PCR xảy ra
nhanh, chính xác và đặc hiệu.

-

Các deoxyribonucleotit triphotphat (dNTP): gồm bốn loại dATP, dTTP, dGTP,
dCTP làm nguyên liệu tham gia phản ứng. Nồng độ tối ƣu của dNTP thƣờng
dùng từ 100-200 µM. Tuy nhiên, ở nồng độ dTNP thấp (10-100 µM) thì Taq
DNA polymerase hoạt động chính xác hơn.

-

Dung dịch đệm (buffer): thành phần làm dung dịch đệm cho phản ứng PCR
thƣờng phụ thuộc vào loại enzyme DNA polymerase sử dụng trong PCR. Ví
dụ: thành phần dung dịch đệm 10X cho phản ứng PCR khi sử dụng Taq DNA
polymerase bao gồm:
Tris –HCl 100 µM với pH = 8 ở 25oC
KCl 500 µM
Gelatin 0.01%
MgCl2 2 mM
11

Nồng độ MgCl2 có thể giao động từ 0,5 đến 5 mM. Chính ion Mg2+ có tác
dụng liên kết dNTP với DNA polymerase tăng khả năng bám nối của mồi. Ngoài ra,
Mg2+ còn là một co-factor giúp enzyme DNA polymerase hoạt động hiệu quả
2.3.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc chính:
Bƣớc 1: Biến tính
-

Là bƣớc xỷ lý nhiệt để tách DNA mạch kép thành mạch đơn dùng làm khuôn để
tổng hợp mạch mới. Nhiệt độ thƣờng là 94oC-95oC, trong 2-5 phút.

-

Lần biến tính đầu tiên phải đƣợc thực hiện hơn 1-3 phút ở 95oC nếu hàm lƣợng
G-C trên mạch khuôn là ≤ 50%.

-

Thời gian biến tính có thể lâu hơn nếu mạch khuôn giàu G-C (> 50%).

Bƣớc 2: Gắn mồi
-

Hạ nhiệt độ xuống 30oC-65oC trong khoảng 30 giây đến 2 phút. Các đoạn mồi
sẽ bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Đây là giai đoạn quan
trọng. Nhiệt độ gắn mồi phải bảo đảm đúng để khả năng gắn tốt nhất, tránh hiện
tƣợng gắn không đặc hiệu.

-

Thƣờng nhiệt độ bắt cặp tối thích hợp nhất thấp hơn 5oC so với nhiệt đô nóng
chảy của sợi kép mồi – khuôn DNA.

-

Độ dài và trình tự mồi là những yếu tố quan trọng làm thông số thiết kế để
khuyếch đại thành công. Nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của sợi
kép DNA tăng theo độ dài của mồi và hàm lƣợng GC cao. Cách tính nhiệt độ
nóng chảy Tm đã đƣợc đề cập ở trên.

-

Do vậy, nhiệt độ bắt cặp đƣợc chọn cho PCR phụ thuộc trực tiếp vào độ dài và
thành phần mồi. Ngƣời ta nên sử dụng nhiệt độ bắt cặp Ta (annealing
temperature) thấp hơn 5oC so với nhiệt độ nóng chảy Tm của cặp mồi đƣợc sử
dụng.

-

Có thể xử lý nhiệt độ bắt cặp chính xác hơn nếu Ta đƣợc tăng 1oC với mỗi chu
kỳ, thì tính đặc hiệu của khuyếch đại và hiệu suất thu sản phẩm có độ dài nhỏ
hơn 1kb đƣợc tăng lên.

Bƣớc 3: Kéo dài (tổng hợp – extending)
-

Thƣờng bƣớc tổng hợp (kéo dài) đƣợc thực hiện ở 72oC. Tốc độ tổng hợp DNA
bằng enzyme Taq DNA polymerase đạt cao nhất ở nhiệt độ này. Thời gian tổng
12

hợp phân đoạn PCR dài 2 kilobase (kb) đƣợc đề xuất là một phút. Khi tổng hợp
các phân đoạn dài hơn, thời gian tổng hợp sẽ đƣợc tăng lên một phút cho mỗi
kb.
Nhiệt độ và thời gian tổng hợp phụ thuộc vào loại enzyme, kích thƣớc đoạn

-

DNA cần tổng hợp. Trong bƣớc này, các dNTP đƣợc lắp ráp để tạo thành mạch
đơn DNA mới bổ sung với mạch khuôn bắt đầu từ mồi.
Mỗi chu kỳ của phản ứng PCR gồm 3 bƣớc nhƣ trên, lặp lại từ 25 đến 50 lần
tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu. Tuy nhiên cần lƣu ý rằng, nếu kéo dài thời gian
quá 30 chu kỳ thì khả năng sai xót sẽ tăng theo. Số lƣợng bản sao sau n chu kỳ sẽ là
a x2n (trong đó a là số đoạn khuôn). Cũng cần lƣu ý rằng, sau chu kỳ thứ nhất, nhiệt
độ tăng lên 94-95oC thì ở chu kỳ thứ hai chỉ cần 20 giây thay vì 2-5 phút nhƣ trong
chu kỳ thứ nhất. (Quỳnh Đình Thi và Nông Văn Hải, 2008)
2.3.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR
- Khuôn DNA có vai trò rất quan trọng, ảnh hƣởng rõ rệt đến hiệu quả PCR. Phản
ứng PCR tối ƣu với các đoạn khuôn hoàn toàn tinh sạch, khi các đoạn khuôn không
sạch còn lẫn protein, hiệu quả PCR giảm theo tỷ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA
khuôn.
- Enzyme DNA polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để. Tùy các đặc
tính của enzyme DNA polymerase, tùy thuộc gốc tách chiết enzyme, hiệu quả các phản
ứng PCR khác nhau. Enzyme Th polymerase có khả năng hoạt động nhƣ một enzyme
phiên mã ngƣợc, còn enzyme Taq polymerase xúc tác phản ứng khuyếch đại DNA
- Mồi là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu quả của phản ứng PCR. Chọn
mồi cần tính toán đảm bảo Tm của mồi xuôi và ngƣợc không chênh lệch nhau quá lớn,
các mồi phải có trình tự nucleotide để chỉ có thể bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các
mạch khuôn, nếu mồi bặt cặp giữa khuôn PCR không thành công. Trình tự DNA cần

khuếch đại, là trình tự nằm giữa hai mồi không lớn quá 1kb.

13


Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
-

Thời gian làm đề tài: từ ngày 15/07/2013 đến ngày 15/12/2013.

-

Địa điểm: Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Mẫu thực hiện
Các loại hạt đậu phộng, cà phê, và hạt bắp đƣợc mua từ chợ Thủ Đức, chợ

Lớn, chợ Tân Bình. Mỗi loại hạt lấy 5 mẫu khác nhau từ mỗi chợ.
Bảng 3.1 Một số mẫu nông sản tiến hành thí nghiệm

Nông sản
Chợ

Bắp

Đậu phộng

Cà phê

Chợ Thủ Đức

B.1
B.2
B.3
B.4
B.5
B.6
B.7
B.8
B.9
B.10
B.11
B.12
B.13
B.14
B.15

ĐP.1
ĐP.2
ĐP.3
ĐP.4
ĐP.5
ĐP.6
ĐP.7
ĐP.8
ĐP.9
ĐP.10
ĐP.11
ĐP.12

ĐP.13
ĐP.14
ĐP.15

CP.1
CP.2
CP.3
CP.4
CP.5
CP.6
CP.7
CP.8
CP.9
CP.10
CP.11
CP.12
CP.13
CP.14
CP.15

Chợ Tân Bình

Chợ Lớn

3.2.2. Thiết bị và dụng cụ chính
Nghiên cứu sử dụng một số thiết bị và dụng cụ của phòng thí nghiệm vi sinh
và sinh học phân tử:
-

Thiết bị: tủ ấm, bể điều nhiệt, tủ ủ, cân phân tích, tủ cấy, tủ mát, bàn đọc UV, hệ

thống điện di DNA, máy PCR.

-

Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, transfer pipette,...

14


3.3. Phƣơng pháp
3.3.1. Phƣơng pháp định danh nấm mốc
Các sợi nấm Aspergillus nhóm Flavi thƣờng tồn tại sâu bên trong hạt nông
sản, khi gặp điều kiện thích hợp sẽ phát triển ra phía ngoài bề mặt hạt. Mẫu hạt
đƣợc rửa sạch bằng nƣớc sạch, xử lý tạp nhiễm bên ngoài mẫu hạt nông sản bằng
cồn 96o trong thời gian ngắn, rửa lại bằng nƣớc cất đã hấp khử trùng. Mẫu hạt đƣợc
cấy lên môi trƣờng dinh dƣỡng để tạo điều kiện cho nấm phát triển. Nhận diện
Aspergillus nhóm Flavi qua hình thái tản nấm đặc trƣng.
Tiến Hành
Bƣớc 1: Nuôi cấy mẫu
-

Mẫu hạt nông sản đƣợc rửa sạch bằng nƣớc máy và để ráo nƣớc.

-

Chuyển mẫu hạt vào becher và phun cồn 96o thật kỹ lên bề mặt trong 30 giây.

-

Rửa lại 3 lần bằng nƣớc hấp khử trùng.

-

Làm khô mẫu trên giấy thấm khử trùng 15 – 30 phút.

-

Cấy mẫu hạt lên môi trƣờng PDA.

-

Mỗi mẫu cấy lên 10 đĩa petri, mỗi đĩa cấy 5 hạt.

-

3 - 5 ngày sau khi cấy, kiểm tra kết quả sơ bộ
Bƣớc 2: Nhận định kết quả sơ bộ

-

Đếm và ghi lại số tản nấm nghi ngờ là A.flavus (có màu xanh lục hoặc vàng lục)
ở từng đậm độ. Sau đó dùng que cấy móc lấy một ít bào tử cấy một điểm trên
đĩa thạch PDA trong 5 ngày. Không lật ngƣợc các đĩa.

-

Đếm và ghi lại số tản nấm nghi ngờ là A.parasiticus (Có mầu xanh lá cây, hơi
vàng) ở từng đậm độ. Sau đó dùng que cấy móc lấy một ít bào tử cấy một điểm
trên đĩa thạch PDA trong 5 ngày. Không lật ngƣợc các đĩa.
Bƣớc 2: Định danh

-

Từ những tản nấm trên thạch PDA tiến hành nhận xét đại thể, vi thể sau 5 ngày
nuôi cấy.

15