XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus
TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT
REAL-TIME PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: TỐNG TRẦN THẢO LY
Niên khóa: 2010 – 2014

Tháng 12 / 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus
TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT
REAL-TIME PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS.NGUYỄN QUỐC BÌNH

TỐNG TRẦN THẢO LY

KS.TRẦN THỊ THANH HƯƠNG

Tháng 12 / 2013


LỜI CẢM ƠN

Trước hết con xin cảm ơn ba mẹ đã sinh con ra và nuôi nấng, dạy dỗ con đến khi
trưởng thành như ngày hôm nay. Ba mẹ đã là người luôn động viên và giúp đỡ con
trong những lúc con khó khăn trong học tập. Và cảm ơn mọi thành viên trong gia đình
đã là động lực cho con cố gắng hơn trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn đến:
Thầy PGS.TS Lê Đình Đôn trưởng bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo đều kiện
cho em có thể thực hiện được đề tài này. Và các thầy cô trong bộ môn đã truyền đạt
kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.
Ban giám đốc Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM đã giúp đỡ và tạo đều
kiện cho em được thực hiện đề tài tại trung tâm.
TS. Nguyễn Quốc Bình và KS. Trần Thị Thanh Hương đã tận tình dạy bảo,
hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em suốt quá trình thực hiện đề tài.
Các anh chị ở Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM đã chia sẽ và động viên
những lúc em gặp khó khăn và nhiệt tình giúp đỡ em.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013
Tống Trần Thảo Ly

i

TÓM TẮT

Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus là 3 loại vi khuẩn nguy hiểm, là
tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam và các nước trên thế giới. Việc
kiểm soát sự hiện diện các vi khuẩn này trong thực phẩm là rất cần thiết để đảm bảo vệ
sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
Trong nghiên cứu này, đã thiết kế và chọn lọc được những cặp mồi đặc hiệu cho
từng chủng vi khuẩn mục tiêu. Các cặp mồi chọn được cho kết quả đặc hiệu 100% với
loài vi khuẩn mục tiêu, không có hiện tượng bắt cặp chéo với các loại vi khuẩn khác.
Quy trình định lượng các vi khuẩn mục tiêu bằng kỹ thuật real-time PCR cũng được
thiết lập thành công với độ nhạy phản ứng là 3-10 cfu/ 25g mẫu thực phẩm (R2=
0.998), độ tin cậy đạt trên 90%. Kết quả định lượng này tương đồng so với phương
pháp đếm tế bào trên đĩa thạch. Tuy nhiên, so với phương pháp nuôi cấy truyền thống,
định lượng vi sinh vật bằng phương pháp real-time PCR cho kết quả chính xác cao hơn
và rút ngắn thời gian xét nghiệm. Toàn bộ quá trình định lượng vi khuẩn bằng kỹ thuật
real-time PCR chỉ mất khoảng 30 giờ so với thời gian 5-7 ngày khi sử dụng phương
pháp truyền thống.
Kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở khoa học để phát triển kit real-time PCR
dùng trong xét nghiệm an toàn thực phẩm vừa đáp ứng được yêu cầu độ nhạy, độ
chính xác cao, và có thời gian xét nghiệm nhanh hơn phương pháp nuôi cấy truyền
thống.
Từ khóa: Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus, real-time PCR

ii


SUMMARY

Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus are 3 dangerous bacteria, is the

main cause of food poisoning in Vietnam and countries around the world. The control
of the presence of bacteria in food is necessary to ensure food safety and protect the
health of consumers.
In this study, we have designed and selected the specific mồis for each target
bacteria. The mồi pairs were selected for specificity 100% results with target bacteria,
not the phenomenon of cross-pairing with other bacteria. Process quantify target
bacteria by real-time PCR technique was also successfully established with a
sensitivity reaction is 3-10 cfu / 25g food sample (R2 = 0.998), reliability of over 90%.
The results of this real-time PCR technique similar to cell counts on agar plates.
However, quantitative microorganisms methods by real-time PCR is exactly and
rapidly.
The results of this study will be the scientific basis for developing real-time PCR
kit used in food safety testing
Key words: Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus, real-time PCR

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .................................................................................................................... i
Tóm tắt .......................................................................................................................... ii
Summary ....................................................................................................................... iii
Mục lục ......................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii
Danh sách các bảng .................................................................................................... viii
Danh sách các hình ....................................................................................................... ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1
1.2 Yêu cầu đề tài ...................................................................................................... 1

1.3 Nội dung thực hiện .............................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới và ở Việt Nam................................... 3
2.2 Các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phổ biến .............................................. 4
2.2.1 Vi khuẩn Salmonella ........................................................................................... 5
2.2.2 Vi khuẩn Shigella ................................................................................................ 6
2.2.3 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .................................................................... 7
2.3 Một số phương pháp phân tích vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm ....................... 8
2.3.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc ............................................................................... 9
2.3.2 Phương pháp Real-time PCR .............................................................................. 10
2.3.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn .................. 11
2.3.2.2 Phân tích tổng quát một phản ứng real-time PCR ............................................ 12
2.3.2.3 Tính lập lại của phản ứng real-time PCR ........................................................ 13
2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................................ 13
Chương 3 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 15

iv


3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 15
3.2 Vật liệu ................................................................................................................... 15
3.2.1 Vi khuẩn .............................................................................................................. 15
3.2.2 Vật liệu và hóa chất dùng trong phản ứng Real-time PCR ................................. 15
3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ............................................................................ 16
3.3 Dụng cụ và thiết bị ................................................................................................. 17
3.4 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 18
3.4.1 Thiết kế mồi đặc hiệu .......................................................................................... 19
3.4.2 Phương pháp trích ly DNA vi khuẩn ................................................................... 21
3.4.3 Xây dựng quy trình phản ứng real-time PCR ...................................................... 22
3.4.3.1 Sàng lọc mồi và tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của mồi ..................................... 22

3.4.3.2 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ........................................................................... 24
3.4.3.3 Dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR ............................................ 24
3.4.4 So sánh với các phương pháp truyền thống......................................................... 30
3.4.4.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn ....................................................................... 30
3.4.4.2 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn trong dịch nuôi cấy ........................... 30
3.4.4.3 Phương pháp gây nhiễm khuẩn nhân tạo vào mẫu thực phẩm ......................... 31
3.4.5 Thực hiện phản ứng real-time PCR .................................................................... 31
3.4.5.1 Chương trình real-time PCR............................................................................. 31
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 33
4.1 Kết quả thiết kế mồi trên cơ sở lí thuyết ....................................................................... 33
4.2 Kết quả xây dựng quy trình phản ứng Real-time PCR ................................................. 33
4.2.1 Sàng lọc và tối ưu nhiệt độ bắt cặp của mồi (Ta) ................................................ 33
4.2.2 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi .............................................................................. 36
4.2.3 Dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR ............................................... 40
4.2.3.1 Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu .................................................... 39
4.2.3.2 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α khả nạp ............ 39
4.2.3.3 Kết quả PCR khuẩn lạc sàng lọc dòng vi khuẩn tái tổ hợp .............................. 40
4.2.3.4 Kết quả dựng đường chuẩn............................................................................... 43
v


4.3 Kết quả định lượng sau gây nhiễm thực nghiệm bằng realtime PCR .................... 48
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 49
5.1 Kết luận................................................................................................................... 49
5.2 Đề nghị ................................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 50

vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC :

Association of Official Agriculture Chemists

BAM:

Bacteriological Analytical Manual

BC:

Bacillus

CDC:

Centers for Disease Control and Prevention

CT:

Chu kì ngưỡng

OD :

optical density

Gen ial:

invasive-associated locus

Gen invA:

invasion gen

Gen ipaH:

invasion plasmid antigen

Lis:

Listeria

PCR:

Polymerase Chain Reaction

TCVN :

Tiêu chuẩn Việt Nam

Sal:

Salmonella

Shi:

Shigella

STEC :

Shiga Toxin-Producing Escherichia coli

V:

Vibrio parahaemolyticus

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp ................................. 4
Bảng 3.1 Thành phần trong một phản ứng real-time PCR ........................................... 23
Bảng 3.2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng real-time PCR ........................................ 23
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR (sử dụng Pfu polymerase)................................. 26
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng nối.............................................................................. 27
Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng real-time PCR dựng đường chuẩn......... 30
Bảng 4.1 Các cặp mồi được thiết kế và thực hiện phản ứng PCR ............................... 33
Bảng 4.2 Các cặp mồi đặc hiệu cho Salmonella, Shigella, V. parahaemolyticus ........ 38
Bảng 4.3 Kết quả đo OD các mẫu plasmid chứng dương ............................................ 43
Bảng 4.4 Kết quả dựng đường chuẩn cho real-time PCR định lượng Salmonella....... 43
Bảng 4.5 Kết quả định lượng Salmonella từ canh khuẩn ............................................. 44
Bảng 4.6 Kết quả dựng đường chuẩn Shigella cho phản ứng real-time PCR .............. 45
Bảng 4.7 Kết quả định lượng Shigella từ canh khuẩn .................................................. 46
Bảng 4.8 Kết quả dựng đường chuẩn Vibrio parahaemolyticus cho realtime PCR..... 46
Bảng 4.9 Kết quả định lượng V. parahaemolyticus từ canh khuẩn .............................. 47
Bảng 4.10 Kết quả phát hiện các vi khuẩn ................................................................... 48

viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Con đường gây bệnh của Salmonella. ........................................................... 6
Hình 2.2 SYBR Green phát huỳnh quang khi chèn vào mạch đôi DNA .................... 11
Hình 2.3 Đường cong khuếch đại của phản ứng real-time PCR .................................. 12
Hình 3.1 Thang DNA 1kb plus..................................................................................... 16
Hình 3.2 Vector pJET1.2 .............................................................................................. 16
Hình 3.3 Sơ đồ tổng quát phương pháp nghiên cứu ..................................................... 18
Hình 3.4 Minh họa vị trí bắt cặp của các cặp mồi trên gen mục tiêu ........................... 20
Hình 3.5 Kết quả sau khi Blast trình tự mồi trên cơ sở dữ liệu NCBI ......................... 20
Hình 3.6 Sơ đồ quy trình thiết kế mồi .......................................................................... 21
Hình 3.7 Biểu đồ đường chuẩn .................................................................................... 24
Hình 3.8 Biến thiên của giá trị Ct với hiệu suất PCR khác nhau ................................. 25
Hình 4.1 Kết quả phản ứng real-time PCR các cặp mồi của vi khuẩn Salmonella ...... 34
Hình 4.2 Kết quả điện di sàng lọc mồi của Salmonella .................................................. 34
Hình 4.3 Kết quả phản ứng real-time PCR các cặp mồi của vi khuẩn Shigella. .......... 35
Hình 4.4 Kết quả điện di sàng lọc mồi của Shigella .................................................... 35
Hình 4.5 Kết quả phản ứng real-time PCR cặp mồi của V.parahaemolyticus ............. 36
Hình 4.6 Kết quả điện di sàng lọc cặp mồi V_toxR .................................................... 36
Hình 4.7 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi Sal_invA và Sal_invA1 ...................... 37
Hình 4.8 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi Shi_ial và Shi_ipaH ........................... 37
Hình 4.9 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi V_toxR .............................................. 37
Hình 4.10 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu Sal_invA, Sal_invA1, Shi_ipaH, V_toxR .... 38
Hình 4.11 Kết quả điện di để thu DNA từ gel .............................................................. 39
Hình 4.12 Kết quả chọn lọc dòng tế bào E.coli DH5α biến nạp thành công ............... 40

ix

Hình 4.13 Kết quả sàng lọc các dòng tế bào Ecoli DH5α chứa plasmid chứng
dương đoạn gen Sal- invA1 với cặp mồi vector pJET1.2 ............................................ 40
Hình 4.14 Kết quả sàng lọc các dòng tế bào Ecoli DH5α chứa plasmid chứng
dương đoạn gen Shi- ipaH với cặp mồi vector pJET1.2 .............................................. 41
Hình 4.15 Kết quả sàng lọc các dòng tế bào Ecoli DH5α chứa plasmid chứng
dương đoạn gen V-toxR với cặp mồi vector pJET1.2 .................................................. 41
Hình 4.16 Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi Sal_invA1 ................................................ 42
Hình 4.17 Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi Shi_ipaH................................................... 42
Hình 4.18 Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi V_toxR ..................................................... 42
Hình 4.19 Kết quả so sánh định lượng bằng real-time PCR và phương pháp đếm
khuẩn lạc. ...................................................................................................................... 44
Hình 4.20 Kết quả dựng đường chuẩn realtime PCR cho vi khuẩn Shigella .............. 45
Hình 4.21 Kết quả Realtime PCR dựng đường chuẩn cho Vibrio parahaemolyticus .. 47

x


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Vi khuẩn phân bố rất phổ biến trong môi trường giàu dinh dưỡng, đặc biệt là
trong thực phẩm. Việc sử dụng các thực phẩm nhiễm vi khuẩn Samonella spp,
Shigella, Vibrio parahaemolyticus… là một trong những nguyên nhân gây ngộ độc
thực phẩm với các triệu chứng nguy hiểm như gây mất thăng bằng cho người và động
vật nhiễm bệnh, nhiễm trùng huyết, viêm màng não, sảy thai, hoặc sốt nhức đầu, co
thắt dạ dày, tiêu chảy buồn nôn và ói thường gặp do nhiễm Salmonella.spp hay Vibrio
parahaemolyticus. Ngoài hậu quả trực tiếp làm giảm chất lượng cuộc sống của con
người, các thực phẩm nhiễm khuẩn này còn gián tiếp làm giảm nguồn lợi kinh tế do
không thể xuất khẩu thực phẩm nhiễm vi sinh vật ra nước ngoài, đặc biệt là thủy sản.
Hiện nay, việc phát hiện các vi khuẩn này trong thực phẩm chủ yếu được thực
hiện theo phương pháp nuôi cấy truyền thống, nhược điểm của phương pháp này là xét

nghiệm trong thời gian dài từ 5 - 7 ngày, quy trình phức tạp và độ nhạy không cao.
Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền của vi khuẩn trong thực phẩm bằng real-time
PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp nghiên cứu mới, có thể phát triển
rộng rãi vì phương pháp này cho kết quả nhanh chỉ khoảng 2 ngày cho tất cả các khâu
xét nghiệm và kết luận kết quả xét nghiệm, nhạy hơn và dễ kiểm soát quy trình hơn so
với phương pháp nuôi cấy truyền thống.
Từ yêu cầu thực tiễn trên đề tài nghiên cứu chọn 3 loại đối tượng vi khuẩn là
Samonella. spp, Shigella, Vibrio parahaemolyticus để xây dựng quy trình tạo kit realtime PCR phát hiện nhanh và định lượng chúng trong thực phẩm, từ đó kiểm soát chất
lượng và đánh giá độ an toàn thực phẩm, góp phần đảm bảo sức khỏe người dân nói
riêng và đảm bảo các lợi ích về kinh tế, nâng cao uy tín của các doanh nghiệp kinh
doanh và xuất khẩu thực phẩm của quốc gia.
1.2.Yêu cầu đề tài
Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu đối với mỗi chủng vi khuẩn mục tiêu.
Thiết lập đều kiện phản ứng real-time PCR tối ưu đối với từng vi khuẩn mục tiêu.
1


1.3. Nội dung thực hiện
Để xây dựng quy trình định lượng 3 chủng vi khuẩn Salmonella, Shigella, Vibrio
parahaemolyticus trong mẫu thực phẩm bằng kỹ thuật real-time PCR cần phải trải qua
4 bước:
Bước 1: Tách chiết DNA từ 3 chủng vi khuẩn Salmonella, Shigella, Vibrio
parahaemolyticus.
Bước 2: Thiết kế mồi đặc hiệu cho 3 chủng vi khuẩn Salmonella, Shigella, Vibrio
parahaemolyticus.
Bước 3: Xây dựng quy trình real-time PCR phát hiện 3 chủng vi khuẩn:
Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus. Gồm những công việc phải làm: sàng
lọc mồi và tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của mồi, kiểm tra độ đặc hiệu của mồi, cuối
cùng là dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR.
Bước 4: Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp Ta, kiểm tra độ đặc hiệu, kiểm tra độ nhạy so

với phương pháp đếm khuẩn lạc.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới và ở Việt Nam
Ngộ độc thực phẩm hay ngộ độc thức ăn là các biểu hiện bệnh lý xuất hiện sau
khi ăn uống phải những loại thực phẩm nhiễm khuẩn, nhiễm độc hoặc có chứa chất
gây ngộ độc hoặc thức ăn bị biến chất, ôi thiu... Người bị ngộ độc thực phẩm thường
biểu hiện qua những triệu chứng lâm sàng như nôn mửa, tiêu chảy, chóng mặt, sốt, đau
bụng... Ngộ độc thực phẩm không chỉ gây hại cho sức khỏe (có thể dẫn đến tử vong)
mà còn khiến tinh thần con người mệt mỏi.
Nguyên nhân chính dẫn đến việc ngộ độc thực phẩm thường là do ăn uống phải
thực phẩm đã bị nhiễm khuẩn (như: nhóm E. coli STEC, Salmonella, Shigella, Vibrio
cholerae, Vibrio parahaemolyticus…) hoặc các thực phẩm bị nhiễm hóa học (kim loại
nặng, độc tố vi nấm...). Theo các chuyên gia về an toàn vệ sinh thực phẩm thì ngộ độc
thực phẩm thường diễn ra vào mùa hè do vi sinh vật có nhiều điều kiện thuận lợi sinh
sôi và phát triển. Đặc biệt thực phẩm có nguồn gốc từ động vật như thịt, trứng, cá, sữa
là các chất giàu đạm, rất dễ trở thành môi trường tốt cho các vi sinh vật, nhất là vi
khuẩn gây bệnh phát triển, và khi đó thức ăn đã biến thành chất độc.
Theo số liệu được công bố vào năm 2011 của CDC (Centers for Disease Control
and Prevention), ước tính rằng mỗi năm khoảng 1 trong 6 người Mỹ (hoặc 48 triệu
người) bị bệnh, 128.000 người được nhập viện và 3.000 người chết vì bệnh do thực
phẩm, nguyên nhân gây ngộ độc là do vi khuẩn hoặc virut. Chi phí y tế dùng cho các
trường hợp ngộ độc thực phẩm vượt hơn 77 tỉ USD. Số trường hợp gây ra bởi
Salmonella chiếm 26% số ca nhập viện, và Salmonella cũng là đối tượng gây tử vong
chính. Ở Peru, dịch tả bùng phát năm 1991 đã gây thiệt hại 500 triệu USD cho ngành
chế biến xuất khẩu cá. Bộ Y tế Malaysia cũng đặc biệt quan tâm đến ngộ độc thực
phẩm gây ra bởi Salmonella, Shigella spp, Vibrio spp. Ở Pháp mỗi năm có khoảng

239.000 - 269.000 trường hợp ngộ độc thực phẩm, trong đó 51.000 - 82.000 trường
hợp gây ra bởi vi khuẩn. Thống kê cho thấy Salmonella. spp gây thương hàn chiếm
phần lớn các ca ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn (31.000 - 41.000 trường hợp).

3


Theo báo cáo từ Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm, trong năm 2012, Việt Nam đã
xảy ra 168 vụ ngộ độc thực phẩm có đến 5.541 người mắc, 4.335 người trong số đó
phải nhập viện, và có 34 ca tử vong. Nhà nước cũng phải chi trên 3 tỉ đồng cho việc
điều trị, xét nghiệm và điều tra tìm nguyên nhân. Vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân
của 70% vụ ngộ độc, có trong nhiều loại thực phẩm (đồ nguội, thịt nguội, nghêu sò, gà
chưa nấu chín, chế phẩm từ sữa sống…).
Do đó việc kiểm tra, đảm bảo chất lượng, vệ sinh thực phẩm là rất cần thiết,
nhằm giảm thiểu những thiệt hại về kinh tế và sức khỏe con người. Đề tài “ Xây dựng
quy trình định lượng vi khuẩn Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus trong
mẫu thực phẩm bằng kĩ thuật real-time PCR” của chúng tôi được nghiên cứu nhằm tạo
tiền đề xây dựng kit real-time PCR phát hiện nhanh và chính xác các vi sinh vật gây
bệnh đường ruột trên người như đã nêu trên.
2.2. Các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phổ biến
Có rất nhiều các loại vi khuẩn gây nên ngộ độc thực phẩm. Dưới đây là những
loại vi khuẩn phổ biến thường gây nên ngộ độc thực phẩm.
Bảng 1.1 Các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp
Vi khuẩn

Ủ bệnh

Cơ chế

Loại thực phẩm

Bacillus Cereus

1 – 6 giờ (ói)
8- 16 giờ
(tiêu chảy)

Do độc tố trong thực
phẩm và ruột

Gạo, bột sấy khô hâm
nóng

Camylobacter

1 - 2 ngày

Nhiễm trùng

Nước uống, tiếp xúc

E. Coli

12 -72 giờ

Độc tố trong ruột

Nước uống, thịt

Listeria

9 – 32 giờ

Nhiễm trùng

Bơ, sữa, phô mai

Samonella

12 – 36 giờ

Nhiễm trùng

Thịt, sữa, bánh, nước
uống, tiếp xúc.

Shigella

1 - 7 giờ

Nhiễm trùng

Nước, rau, quả

Vibrio parahemolyticus

8 – 30 giờ

Nhiễm trùng và độc tố ở
ruột

4

Nghêu, sò, nước


2.2.1. Vi khuẩn Salmonella
Salmonella là vi khuẩn Gram âm hình que, hiếu khí và kị khí tùy nghi, có khả
năng di động, hầu hết các loài đều có tiên mao không tạo bào tử. Chúng có khả năng
phát triển ở nhiệt độ từ 6 – 420C, nhiệt độ thích hợp nhất là từ 35 – 370C, ngưỡng pH
từ 6 - 9 và thích hợp nhất ở pH 7,2. Ở nhiệt độ 18 – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15
ngày. Salmonella có thể phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường như LB,
PCA... Đối với những loại môi trường nuôi cấy chuyên biệt như SS agar, XLD vi
khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ.
Đến nay các nhà khoa học đã xác định được 2339 serotype được chia theo hệ
thống Kaffmann White dựa trên công thức kháng nguyên O và kháng nguyên H. Ngoài
một số serotype được đặt tên như Enteritidis (S. enteritidis), Typhi (S. typhi), Paratyphi
(S. paratyphi), Typhimurium (S. typhimurium), hầu hết các serotype khác được kí hiệu
dựa vào tên kháng nguyên.
Các thực phẩm có nguy cơ nhiễm Salmonella cao là trứng, thịt, sản phẩm gia
cầm, và thủy sản. Vi khuẩn này có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện ở mât độ
106 CFU/g. Các triệu chứng thường gặp khi nhiễm Salmonella là tiêu chảy và nôn
mửa. Đặc biệt S. typhi và S. paratyphi gây nguy hiểm cho người. Theo CDC (Centers
for Disease Control and Prevention) từ năm 1996 đến năm 2002, khoảng 2 - 4 triệu ca
bị nhiễm Salmonella ở Mỹ. Ở Việt Nam tỉ lệ nhiễm Salmonella khá cao, đặc biệt trong
thực phẩm không rõ nguồn gốc (Nordstrom, 2011)
Quá trình xâm nhiễm của Salmonella được bắt đầu khi vật chủ tiêu thụ thức ăn
hay nước uống bị nhiễm khuẩn. Sau khi vượt qua được dạ dày, Salmonella xuống tới
ruột non. Sau khi xuống tới phần cuối ruột non, vi khuẩn phải xâm nhập qua lớp niêm
mạc trước khi gắn vào các tế bào biểu mô ruột. Quá trình gắn vào tế bào biểu mô ruột

được thực hiện nhờ các loại khuẩn mao trên tế bào vi khuẩn. Những nghiên cứu ở mức
hiển vi cho thấy các chủng Salmonella xâm chiếm các tế bào biểu mô thông qua quá
trình nhập bào chỉ khoảng thời gian ngắn sau khi vi khuẩn gắn vào lông tiếp xúc.
Lông tiếp xúc trên bề mặt tế bào biểu mô, bề mặt tế bào thay đổi tạo nên các
nang không bào bao quanh vi khuẩn. Các nang Salmonella được đưa vào cơ thể thông

5


qua quá trình nhập bào. Sự xâm nhập của vi khuẩn thông qua quá trình nhập bào đòi
hỏi phải có sự tổng hợp nhiều loại protein tế bào, đồng thời ngăn cản việc tái sắp xếp
bộ khung tế bào làm ngăn cản sự di chuyển của không bào mang Salmonella vào bên
trong (Nguyễn Tiến Dũng, 2010). Sự hiện diện Salmonella trong tế bào có thể dẫn đến
sự tiết cytokine, IL1β, kích thích quá trình viêm xảy ra, đồng thời thúc đẩy hiện tượng
chết theo chu trình (apoptosis) . Salmonella cũng có thể gieo rắc trở lại trong ruột . Sau
đó vi khuẩn có thể theo phân bài thải ra môi trường, hoặc vi khuẩn cũng có thể xâm
lấn trở lại biểu mô ruột, tiếp tục gieo rắc khắp cơ thể và gây bệnh.

Hình 2.1 Con đường gây bệnh của Salmonella.
Locus inv ở cụm gen SPI-1 gồm các gen giúp Salmonella xâm nhiễm được vào
các tế bào biểu mô ruột. Một vài gen thuộc locus này được biểu hiện và protein được
tiết vào môi trường tương tác với biểu mô vật chủ. Gen invA là một thành viên của
locus inv. Các đột biến trên gen invA làm giảm 500 lần khả năng xâm nhiễm vào tế
bào biểu mô ruột, nhưng không ảnh hưởng đến khả năng bám dính của các tế bào này
vào màng nhày. Gen invA được xác nhận là hiện diện ở hầu hết các chủng Salmonella
(Nguyễn Tiến Dũng, 2010).
2.2.2 Vi khuẩn Shigella
Shigela thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi khuẩn gram âm, hình que, hiếu khí và
kị khí tùy nghi, kháng acid, kháng muối, có thể tồn tại lâu trong môi trường có pH
thấp. Shigella gồm 4 loài khác nhau: S. flexneri, S. dysenteriae, S. sonnei, và S. boydii.

6


Shigella có tính chuyên biệt kí chủ cao, chỉ xâm nhiễm và tăng trưởng trên loài linh
trưởng. Trong môi trường nước, Shigella có thể tồn tại hơn 6 tháng. Vi khuẩn này có
thể gây ngộ độc khi hiện diện trong thực phẩm với mật độ rất thấp, khoảng 10 CFU/g.
Shigella cũng có thể lây trực tiếp từ người sang người, ở Mỹ Shigella là 1 trong 3 đối
tượng chính gây ra ngộ độc thực phẩm trong năm 2008 (CDC, 2008) Các trường hợp
ngộ độc thực phẩm do Shigella thường tập trung ở các nước kém phát triển, thực phẩm
được chuẩn bị trong đều kiện vệ sinh không đảm bảo. Shigella chiếm khoảng 20% số
ca ngộ độc thực phẩm. Trong đó, rau quả và hải sản là những là những thực phẩm dễ
bị nhiễm Shigella nhất ( McEntire, 2004 và Wang, 2007).
Shigella spp được truyền từ người sang người qua đường phân - miệng hoặc
bằng cách tiếp xúc cơ thể trực tiếp, hoặc gián tiếp do ăn phải thực phẩm hoặc nước bị
ô nhiễm phân người. Các triệu chứng của bệnh vi khuẩn Shigella bao gồm tiêu chảy,
phân có máu, đau bụng và sốt. Máu và mủ trong phân phát triển như một kết quả của
các cuộc xâm lược của Shigella spp vào niêm mạc đại tràng. Một loạt các adhesins cho
phép các vi khuẩn Shigella spp tiếp xúc với các tế bào niêm mạc ruột. Sau khi qua
niêm mạc, Shigella spp sử dụng invasins nhập vào tế bào biểu mô, nơi chúng thoát
khỏi không bào vào tế bào chất và nhân. Chúng tồn tại thực bào bằng cách gây
apoptosis trong các đại thực bào.
Gen mục tiêu đặc hiệu cho vi khuẩn Shigella là gen ial: invasive-associated locus
(ial), có vai trò trong khả năng định cư và xâm nhập vào tế bào ruột (Frankel,1990).
Gen ipaH: invasion plasmid antigen là plasmid chứa trình tự kháng nguyên H. có mặt
ở trên tất cả các chủng Shigella (Vargas, 1999).
2.2.3 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus)
Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình que, hai đầu không đều
nhau tạo thành hình dấu phẩy, di động, kỵ khí tùy nghi, trừ V. cholerae hiện diện ở
vùng nước ngọt. Các loài Vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần ion
Na+ để phát triển. Một số loài có khả năng gây bệnh cho người như V. cholera, V.

parahaemolyticus, V. vulnificus, V. hollisae, V. furnsii, V. mimicus, V. fluvialis, V.
alginolyticus. Ba loài vibrio gây ngộ độc chủ yếu là V. cholerae, V. parahaemolyticus,
V. vulnificus. Trong đó V. parahaemolyticus là một trong những tác nhân gây ngộ độc
7


chủ yếu nhất tại Châu Á và chiếm gần một nữa số ca ngộ độc tại Đài Loan, Nhật và
các nước Đông Nam Á. Ngộ độc do V. parahaemolyticuscó thể dẫn đến viêm dạ dày
cấp tính ở người. Nguyên nhân gây ngộ độc là do ăn hải sản tươi sống (hàu, trai) hoặc
giáp xác dù đã được nấu chín. Theo FDA, mật độ V. parahaemolyticus gây bệnh
khoảng 107 - 108 CFU/g (McEntire, 2004 và Yeung, 2004).
Gen mục tiêu đặc hiệu cho vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là gen toxR, qua
các nghiên cứu được khẳng định là có hiện diện ở tất cả các chủng Vibrio
parahaemolyticus. Gen toxR có vai trò điều hòa các trình tự độc tố, có trình tự bảo tồn
đặc trưng cho loài nên có thể được sử dụng làm gen đích xây dựng phương pháp phát
hiện nhanh Vibrio parahaemolyticus trong mẫu hải sản bằng kỹ thuật PCR (Nguyễn
Văn Duy, 2011).
2.3. Một số phương pháp phân tích vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm
Phương pháp phát hiện các vi sinh vật theo truyền thống (phương pháp chuẩn)
dựa trên việc tăng sinh (nuôi cấy hoặc lên men) trên môi trường chọn lọc và không
chọn lọc, phân lập các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường chọn lọc kết hợp với các
kiểm tra sinh hóa và kiểu huyết thanh. Bước tiền tăng sinh trên môi trường không chọn
lọc với các đều kiện tối ưu về nhiệt độ và pH nhằm phục hồi các tế bào bị tổn thương
trong quá trình chế biến và bảo quản. Bước tăng sinh chọn lọc sử dụng môi trường
chứa các yếu tố ức chế các loài khác, chỉ cho phép vi sinh vật mục tiêu phát triển. Tiếp
đó, vi sinh vật mục tiêu được phân lập trên môi trường chọn lọc dựa vào màu sắc và
hình dạng khuẩn lạc. Các khuẩn lạc phân lập được sẽ tiến hành các kiểm tra xa hơn
như kiểm tra sinh hóa và kiểu huyết thanh. Hiện nay, phương pháp phân tích vi sinh
vật (Bacteriological Analytical Manual – BAM) do FDA đưa ra được áp dụng rộng rãi
và là phương pháp chuẩn trong các phòng thí nghiệm phân tích vi sinh vật gây bệnh

trên toàn thế giới (Wang, 2007).
Bên cạnh đó, các phương pháp thử nhanh và tự động hóa trong phân tích vi sinh
vật cũng dần được sử dụng phổ biến nhằm tăng hiệu quả của việc phân tích vi sinh vật
so với phương pháp truyền thống. Các phương pháp này là kết quả của việc ứng dụng
các phương pháp vi sinh, sinh hóa, hóa lý, miễn dịch học, huyết thanh học để hoàn
thiện việc phân lập, phát hiện sớm, mô tả, và định lượng vi sinh vật cũng như sản
8


phẩm của chúng trong những mẫu nước và thực phẩm. Đồng thời, một số phương pháp
này đã được AOAC (Association of Official Agriculture Chemists) công nhận. Hầu
hết các phương pháp nhanh và nhạy dùng trong công nghiệp hiện nay đều dựa trên
phương pháp phân tích miễn dịch, phân tích nucleic acid, hoặc kỹ thuật phát quang
sinh học. Các phương pháp này có thể sử dụng độc lập hoặc phối hợp với nhau (Trần
Linh Thước, 2006).
2.3.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Đối với vi sinh vật đơn bào, ta có thể xem mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát
triển từ một tế bào ban đầu. Vì vậy đếm số khuẩn lạc có thể biết được số lượng tế bào
vi sinh vật trong thể tích ban đầu. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc được tiến hành theo các bước sau:


Bước 1: Pha loãng mẫu

Pha loãng mẫu theo TCVN 4887-89. Pha loãng mẫu cho đến khi có được đậm
độ pha loãng cần thiết đủ đếm được số khuẩn lạc trên đĩa theo dự tính.


Bước 2: Đổ đĩa

Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ
dùng 2 đĩa petri và 1 pipet vô khuẩn riêng.


Bước 3: Ủ ấm

Sau khi cấy trãi vi khuẩn trên đĩa thạch, lật sấp các đĩa petri và để vào tủ ấm ở
nhiệt độ 37 ± 1oC từ 24 đến 72 giờ. Khi đã đủ thời gian để vi khuẩn phát triển từ 1 tế
bào thành khuẩn lạc, tính kết quả bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa
nuôi cấy.


Bước 4: Tính kết quả

Chọn tất cả các đĩa có số khuẩn lạc đếm được dao động trong khoảng từ 30-300
khuẩn lạc để tính kết quả. Sự phân bố của các khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy phải hợp
lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý, phải tiến
hành lại các bước nuôi cấy. Tính kết quả như sau:

9


N

C
(n1  0,1.n2 ).d

C: số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
n1, n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2.
d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1.

Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.
Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ
thích hợp của 10).
2.3.2. Phương pháp Real-time PCR
Phương pháp Real-time PCR hay còn có tên gọi khác là Q-PCR (Quantitative
PCR) nghĩa là PCR định lượng. Thực chất đây là sự kết hợp giữa phương pháp PCR
truyền thống và kĩ thuật phát hiện tín hiệu huỳnh quang các sản phẩm khuếch đại sau
mỗi chu kì phản ứng. Phương pháp real-time PCR có độ nhạy cao, định lượng chính
xác số bản sao trong phản ứng PCR vì vậy có thể cắt giảm bớt các thí nghệm kiểm tra
sau PCR. Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện bằng cách
chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng kết thúc ngược lại phương pháp
real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình
phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về
số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang.
Trong kỹ thuật real-time PCR, chất phát huỳnh quang chính là chìa khóa kỹ thuật
được thêm vào trong mix PCR. Khi trong tube phản ứng có sản phẩm khuếch đại thì
chất phát huỳnh quang này phải làm thế nào để phát được tín hiệu huỳnh quang đúng
với lượng sản phẩm tạo thành, và không phát tín hiệu khi không có sản phẩm khuếch
đại. Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên
kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc mồi đặc
hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Thiết bị ổn nhiệt
chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang
để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo
được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ (Nguyễn Hoàng
Lộc, 2007).
10


SYBR Green màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA là một loại màu huỳnh
quang có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA và ái lực này là do khả

năng chèn của màu vào giữa sợi đôi DNA và làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng
huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
2.3.2.1. Nguyên tắc kỹ thuật real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn
Nguyên tắc của kỹ thuật là khi không có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại của
phản ứng PCR, chất huỳnh quang bị phân tán trong dung dịch mix PCR, do vậy mà
tube phản ứng sẽ không bị phát huỳnh quang hay chỉ phát huỳnh quang không đáng kể
khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Nhưng khi có sự hiện diện sản phẩm khuếch
đại của PCR thì màu huỳnh quang sẽ bị chèn vào và tập trung trên các sợi đôi DNA
của sản phẩm khuếch đại và sẽ làm cho tube phản ứng bị phát huỳnh quang khi bị
chiếu bởi nguồn sáng kích thích. SYBR Green nhận bước sóng kích thích là 490nm và
phát quang với bước sóng 530nm.

Hình 2.2 SYBR Green phát huỳnh quang khi chèn vào mạch đôi DNA
Ban đầu, ethidium bromide được sử dụng cho nguyên tắc real-time PCR này,
nhưng sau này các nhà khoa học sử dụng SYBR Green vì các ưu điểm vượt trội hơn
như màu huỳnh quang nền rất thấp, khả năng chèn vào sợi đôi cao nhưng không làm
cho sợi đôi bị gắn chặt vào nhau khi bị biến tính nhờ vậy mà ảnh hưởng ít lên hiệu quả
của PCR.

11


Real-time PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta
định lượng số bản sao khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên
một phạm vi động học lớn. Các kết quả của real-time PCR có thể là chất lượng (sự có
mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản sao của DNA). Real-time
PCR định lượng còn được biết như là qPCR. Số liệu của real-time PCR có thể đánh
giá mà không cần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên
liệu đưa vào quá trình được tăng lên. Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu
được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm

thiểu và các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ (Phạm Hùng Vân. 2009 ).
2.3.2.2. Phân tích tổng quát một phản ứng real-time PCR
Để hiểu được real-time PCR như thế nào, chúng ta bắt đầu bằng một đường cong
khuếch đại mẫu (Hình 2.3). Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x,
và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm được
khuếch đại trong tube, được trình bày ở trục y. Đường cong khuếch đại có 2 pha, một
pha hàm mũ (exponential phase) được tiếp theo bởi một pha ổn định (plateau phase).
Trong suốt pha hàm mũ, số lượng sản phẩm PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ.
Tuy nhiên, khi phản ứng diễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng làm
cho một hoặc nhiều thành phần bị hạn chế. Ở điểm này phản ứng chậm lại và đi vào
pha ổn định (các chu kỳ 28-40, Hình 2.3).

12


Hình 2.3 Đường cong khuếch đại của phản ứng real-time PCR
Đầu tiên, tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền (background), và việc tăng
tín hiệu huỳnh quang là không thể phát hiện được (các chu kỳ 1-18, Hình 2.3) cho dù
sản phẩm tích lũy theo hàm mũ. Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới
một hiệu suất cho phép phát hiện được tín hiệu huỳnh quang. Số chu kỳ để đạt được
hiệu suất này gọi là chu kỳ ngưỡng (threshold cycle, CT). Do giá trị CT được đo trong
pha hàm mũ khi các tác nhân phản ứng không bị hạn chế, nên real-time qPCR có thể
được sử dụng để tính toán chính xác và tin cậy số lượng khởi đầu của khuôn mẫu hiện
diện trong phản ứng. CT được xác định chủ yếu bởi số lượng của khuôn mẫu hiện diện
ở lúc bắt đầu phản ứng khuếch đại. Khi lượng khuôn mẫu nhiều thì chỉ cần một vài
chu kỳ khuếch đại để tích lũy sản phẩm đủ cho một tín hiệu huỳnh quang ở trên mức
độ nền. Vì vậy, phản ứng sẽ có CT thấp hơn hoặc sớm. Ngược lại, nếu lượng khuôn
mẫu lúc bắt đầu phản ứng quá ít, thì số chu kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu
huỳnh quang tăng trên đường nền. Vì vậy, phản ứng sẽ có CT cao hoặc muộn. Các
dạng quan hệ này là cơ sở định lượng của real-time PCR (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007).

2.3.2.3. Tính lặp lại của phản ứng Real-time PCR
Kết quả phản ứng PCR thường biến động, thay đổi từ lần này sang lần khác.
Nhưng phản ứng real-time PCR có tính lặp lại rất cao. Nguyên nhân sự khác biệt này
là do thời điểm phân tích kết quả. Real-time PCR phân tích kết quả theo thời gian thật,
chu kỳ ngưỡng của phản ứng luôn rơi vào pha hàm mũ là pha mà phản ứng xảy ra
13