“PHÂN lập, TUYỂN CHỌN CHỦNG nấm mốc ASPERGILLUS ORYZAE có KHẢ NĂNG SINH ENZYME PROTEASE CHỊU MUỐI, CHỊU ph”

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

--------------&--------------

KIM THỊ LUYẾN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

“PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC
ASPERGILLUS ORYZAE CÓ KHẢ NĂNG SINH
ENZYME PROTEASE CHỊU MUỐI, CHỊU pH”

Hà Nội, 1 – 2018


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
--------------&--------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
“PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC
ASPERGILLUS ORYZAE SINH ENZYME PROTEASE
CHỊU MUỐI, CHỊU pH”

Người thực hiện : Kim Thị Luyến
MSV

: 591634

Lớp

: CNTPA

Khóa

: 59

Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoàng Anh
Bộ môn

: Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm

Hà Nội, 1 - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là
trung thực và chưa hề được sử dụng. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này
đã được cảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong khóa luận này đã được ghi rõ
nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 8 tháng 1 năm 2018
Sinh viên

Kim Thị Luyến

i


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp của tôi, ngoài sự cố
gắng và kiên trì của bản thân tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt tình của các
thầy cô giáo, gia đình, bạn bè cũng như cán bộ công nhân viên các đơn vị trong và
ngoài khoa.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và sâu sắc đến TS.Nguyễn Hoàng Anh,
giảng viên khoa Công Nghệ Thực Phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thầy là
người rất ân cần, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS.Phạm Thị Dịu, KS.Nguyễn Thị Hồng,
phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ thực phẩm đã giúp đỡ tôi rất
nhiều trong lúc làm khóa luận để tôi có kết quả tốt hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ thực
phẩm đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã quan tâm,
động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 8 tháng 01 năm 2018
Sinh viên

Kim Thị Luyến

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC

ii

iii

DANH MỤC BẢNG

iv

DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC VIẾT TẮT

vii

PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ

1

1.1. Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................................1
1.2. Mục tiêu chung......................................................................................................2
1.3. Mục tiêu cụ thể......................................................................................................2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1. Tổng quan về enzyme protease............................................................................3
2.1.1. Đặc điểm chung của enzyme protease
2.1.2. Phân loại

3

3

2.1.3. Cơ chế tác dụng

4

2.1.4. Ứng dụng của protease

5

2.1.5. Nguồn thu nhận enzyme protease 6
2.2. Nấm mốc Aspergillus oryzae.................................................................................7
2.2.1. Các đặc điểm chung của Aspergillus oryzae

7

2.2.2. Khả năng sinh enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae
2.2.3. Ứng dụng của A.oryzae

8

9

PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

11

3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu....................................................11
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu

11

3.1.2. Môi trường, hóa chất sử dụng
3.1.3. Thiết bị sử dụng

11

12

3.1.4. Thời gian nghiên cứu

13

3.1.5. Địa điểm ngiên cứu 13
3.2. Nội dung nghiên cứu...........................................................................................13
3.3. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................13

iii


3.3.1. Phân lập nấm mốc A.oryzae sinh enzyme protease

13

3.3.2. Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme protease 14
3.3.3. Xác định hoạt tính enzyme protease

14

3.3.4. Xác định thời gian sinh enzyme protease 16
3.3.5. Phương pháp xác định khả năng chịu muối của enzyme protease sinh ra bởi nấm

mốc A.oryzae17
3.3.6. Phương pháp xác định độ bền muối của enzyme protease

17

3.3.7. Phương pháp xác định độ bền pH của enzyme protease 17
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

18

4.1. Kết quả phân lập được.......................................................................................18
4.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc A.oryzae phân lập được............19
Kết quả quan sát trên kính hiển vi thấy hình thái bào tử có hình tròn, màu vàng nâu và
sợi trong suốt.

20

4.3. Xác định khả năng sinh protease từ A.oryzae phân lập được bằng phương
pháp định tính............................................................................................................20
4.4. Xác định hoạt tính của protease.........................................................................21
4.5. Xác định thời gian sinh enzyme protease..........................................................22
4.6. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên hoạt tính và sự ổn định của enzyme
protease....................................................................................................................... 23
4.6.1. Ảnh hưởng của NaCl lên hoạt tính enzyme protease

23

4.6.2. Xác định độ bền muối của protease24
4.7. Xác định độ bền pH của enzyme protease từ HN2, NA2.................................24
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26

5.1. Phần kết luận.......................................................................................................26
5.2. Kiến nghị.............................................................................................................26
TÀI LIỆU THAM KHẢO 27
PHỤ LỤC

29

iv


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Các mẫu phân lập được.......................................................................11
Bảng 3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu....................................................12
Bảng 3.3. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm..............................................12
Bảng 3.4. Các bước tiến hành định lượng enzyme protease...............................15
Bảng 3.5. Các bước xây dựng đường chuẩn tyrosine..........................................15
Bảng 3.6. Thể tích Tyrosin tương ứng với nồng độ Tyrosin..............................16
Bảng 4.1. Kết quả phân lập từ mẫu tương và nước mắm....................................18
Bảng 4.2. Đặc điểm hình thái của một số mẫu phân lập được............................19
Bảng 4.3. Hoạt độ của enzyme protease sinh ra từ chủng nấm mốc NA2, HD4......22

v


DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Đường chuẩn Tyrosin..........................................................................16
Hình 3.2. Một số hình ảnh của nấm phân lập được.............................................18
Hình 4.1. Vòng phân giải casein của enzyme protease sinh ra từ ba chủng

HN2, NA2, HD4...................................................................................21
Hình 4.2. Hoạt tính enzyme của các chủng nấm mốc NH2, NA2......................22
Hình 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính protease từ HN2, NA2
..............................................................................................................23
Hình 4.4. Độ bền muối của enzyme protease ở nồng độ muối 24% NaCl..........24
Hình 4.5. Độ bền pH của enzyme protease HN2, NA2.......................................25

vi


DANH MỤC VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT TẮT

TÊN ĐẦY ĐỦ

PDA

Patota Dglucose Agar

A.oryzae

Aspergillus oryzae

TCA

Trichloroacetic acid

BCG

Bromocresol Green

vii


PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ
sinh học, các chế phẩm enzyme được sử dụng ngày càng nhiều và được sử dụng trong
hầu hết các lĩnh vực kinh tế. Enzyme đã từng bước làm thay đổi và nâng cao một số
quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế...đáp ứng
nhu cầu ngày càng cao của xã hội. Hàng năm, lượng enzyme sản xuất ra trên thế giới
khoảng trên 300 000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD được phân bố trong các lĩnh
vực khác nhau. Phần lớn enzyme được sử dụng ở mức độ công nghiệp đều thuộc loại
enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là những
enzyme thủy phân được sử dụng cho việc phân hủy các cơ chất tự nhiên (Đặng Thị
Thu và cộng sự, 2012).
Protease là một enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và phổ biến trong nhiều
lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học và nghiên cứu khoa học…
Trong công nghệ thực phẩm, protease là enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit trong
phân tử protein và cơ chất tương tự. Nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết
este và vận chuyển amino axit. Enzyme protease được sử dụng trong sản xuất thịt, sản
xuất sữa, nước mắm, tương, công nghiệp da…(Nguyễn Thị Hiền và cộng sự, 2012)
Enzyme protease được thu được từ nhiều nguồn, trong đó có nấm mốc
Aspergillus oryzae. Hiện nay Aspergillus oryzae được sử dụng để sản xuất nhiều các
loại sản phẩm như nước tương, nước mắm, súp miso, rượu sake...Ở Việt Nam,
Aspergillus oryzae chủ yếu để sản xuất nước mắm, tương và Aspergillus oryzae trong
sản xuất thủ công lại có độ an toàn không cao bởi loại nấm tốt và không độc như
Asperglllus oryzae rất dễ lẫn với loại mốc nguy hiểm khác. Đặc biệt nấm sợi

Aspergillus oryzae có hình thái, màu sắc gần giống với Aspergillus flavus, nhưng
Aspergillus oryzae không sản sinh độc tố gây ung thư như Aspergillus flavus (Nguyễn
Lân Dũng, 2007). Chính vì thế, việc phân lập, tuyển chọn chủng nấm Aspergillus
oryzae có khả năng sinh protesae chịu muối và chịu pH là vô cùng quan trọng trong
những sản phẩm có nồng độ muối cao, giàu protein, ứng dụng trong nhiều sản phẩm

1


như: nước mắm, tương,...Hiện nay, ở Việt Nam những nghiên cứu về enzyme protease
có khả năng chịu muối và pH kiềm còn hạn chế.
Chính vì những lý do trên mà chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập, tuyển chọn
chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh protease chịu muối, chịu pH”.
1.2. Mục tiêu chung
Phân lập, tuyển chọn và xác định được chủng Aspergillus oryzae có trong tương,
nước mắm sinh protease chịu muối, chịu pH”.
1.3. Mục tiêu cụ thể
Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh
enzyme protease từ các mẫu tương và nước mắm.
Xác định đặc tính của enzyme protease có khả năng chịu muối, chịu pH kiềm.

2


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về enzyme protease
Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và
amino acid. Protease có vai trò to lớn và được sử dụng rộng rãi trong các ngành nghề
khác nhau như: y học, kỹ thuật phân tích, công nghệ gen, bảo vệ môi trường, đặc biệt

là ngành công nghệ thực phẩm. Hiện nay, công nghệ thu nhận protease, tìm tòi nghiên
cứu về khả năng ứng dụng của enzyme protease ngày càng chú trọng và quan tâm.
Trong những năm gần đây giá trị enzyme công nghiệp thế giới đạt khoảng 1 tỷ
USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%) và protease là một trong ba
nhóm enzyme lớn nhất sử dụng ( Vũ Ngọc Bội, 2000).
Ở Việt Nam có nhiều công trình công bố về nghiên cứu sử dụng protease, chủ
yếu tập trung vào các protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ được
nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây.
2.1.1. Đặc điểm chung của enzyme protease
Enzyme protease hay peptidase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt các
mối liên kết peptid trong các phân tử polypeptid, protein và một số cơ chất khác tương
tự thành các amino acid tự do và các peptid phân tử thấp (Đồng Thị Thanh Thu, 2003).
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật
đến động vật và thực vật. So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có
chứa đặc điểm khác biệt. Trước hết protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp
bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng, hình dạng phân tử nên
rất khó tách ra được dưới dạng phân tử đồng nhất. Cũng do đó, phức hệ gồm nhiều
enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản
phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.
2.1.2. Phân loại
Protease được chia thành hai loại: edopeptidase và exopeptidase.
Dựa vào vị trí tác động mạch polypeptide exopeptidase chia thành hai loại
(Barrett, 1994):

3


+ Amonipeptidase: xúc tác thủy phân peptide ở đầu N của chuỗi polypeptide để giải
phóng ra một tripeptid, một dipeptide hoặc một amino acid.

+ Cacboxypeptidase: xúc tác thủy phân peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide giải
phóng ra một dipeptide hoặc một amino acid.
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase chia thành các loại sau
(Đặng Thị Thu và cộng sự, 2012):
+ Serin proteinase: là những protein chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm
hoạt động có vai trò quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme gồm
trymotripsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrysin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như
subtilisin carlsberg, subtilisin BPN. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở
vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Syteine proteinase: chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm
các protein thực vật như papain, bromelin…Các cystenin proteinase thường hoạt động
ở pH trung tính có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: thuộc nhóm pepsin là các enzyme tiêu hóa như pepsin,
chymosin, cathepsin, renin. Nhóm này chứa nhóm cacbonxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo protein: được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc
cao hơn. Chúng hoạt động mạnh ở pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng
của EDTA.
Có thể phân loại theo pH một cách đơn giản như sau (Nguyễn Đức Lượng, 2004):
+ Protease acid: pH 2-4 như pepsin, renin…
+ Protease trung tính: pH 7-8 như tryssin, chymmotrysin…
+ Protease kiềm: pH 9-11như papain, bromelain…
2.1.3. Cơ chế tác dụng
Protease là enzyme xúc tác quá trình thủy phân protein, quá trình xúc tác bắt
đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất thành hợp chất trung gian.
E (enzyme) + S (cơ chất) → ES (hợp chất trung gian)

4

2.1.4. Ứng dụng của protease
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghệ thực phẩm, công
nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp...
Trong công nghệ thực phẩm:
+ Công nghiệp chế biến thịt: protease được sử dụng làm mềm thịt, thịt có hương vị tốt
hơn, chất lượng của các loại thịt được nâng cao và thời gian chín của thịt được rút
ngắn nhiều lần ( Lê Mỹ Hồng, 2005).
+ Trong sản xuất nước mắm: protease được sử dụng để rút ngắn thời gian làm và cải
thiện hương vị nước mắm.
+ Trong công nghiệp sữa: protease được sử dụng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính
làm đông tụ sữa của chúng, trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánh quy... protease
làm giảm thời gian trộn tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.
+ Trong sản xuất bia: protease giúp tăng tỉ lệ nguyên liệu thay thế, giảm thời gian lên
men, hiệu suất thu hồi tăng và nâng cao hiệu quả kinh tế.
Trong công nghiệp thuộc da:
+ Rút ngắn thời gian, làm mềm, số lượng lông thu được lớn hơn, không cần sử lý thêm.
Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa:
+ Công dụng của protease là phân hủy hết vết bẩn dạng protein trên vải.
+ Enzyme có những tác dụng sau khi dùng trong chất tẩy rửa: Giúp tăng hiệu quả của
việc giặt tẩy, giảm thời gian giặt nhờ khả năng phân hủy vết bẩn nhanh, giảm năng
lượng tiêu thụ do có thể giặt ở nhiệt độ thấp, giảm lượng nước tiêu thụ do hiệu quả giặt
rửa cao, giảm ảnh hưởng đối với môi trường vì enzyme là chất có thể phân hủy sinh
học, tăng độ trắng và chất chống bám bẩn trở lại.
Trong sản xuất tơ tằm:
+ Sợi sau khi kéo kén thường có khoảng 30% xerixin. Muốn tách xerixin phải nấu
trong dung dịch xà phòng, một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên lụa sẽ làm giảm khả
năng đàn hồi của lụa. Để tách lượng xerixin còn lại người ta thường dùng chế phẩm
protease từ nấm mốc, vi khuẩn.
Trong sản xuất hương phẩm, mỹ phẩm:

+ Dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu bì da đã chết tách ra, da non và mới
sẽ xuất hiện trên bề mặt, sự phát triển của lông, tóc chậm lại.

5


Trong y học:
+ Trong công nghiệp y học, protease cũng được sử dụng để sản xuất các môi trường
dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác.
+ Dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc, vì
protease sẽ tiêu hủy các protein đệm mà không gây ảnh hưởng đến chất kháng độc.
+ Ứng dụng chữa một số bệnh về đường tiêu hóa.
2.1.5. Nguồn thu nhận enzyme protease
Hiện nay chúng ta sử dụng ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận
protease: động vật, thực vật và vi sinh vật (Lê Văn Việt Mẫn, 2006).
a, Thu nhận enzyme protease từ động vật
Thông thường protease động vật có từ tuyến tiêu hóa: pepsin từ niêm mạc dạ
dày và dịch vị của động vật bậc cao. Chymosin có trong ngăn thứ tư dạ cỏ của bê non
dưới năm tháng tuổi. Protease từ động vật ít được sử dụng do sản xuất bị hạn chế và
nguồn thu nhận enzyme không nhiều.
b, Thu nhận enzyme protease từ thực vật
Từ các thực vật bậc cao người ta cũng thu được một số chế phẩm enzyme quan
trọng như: Papain thu từ nhựa quả đu đủ xanh, Bromelin từ thân cây dứa,...Cũng giống
như nguồn thu nhận enzyme protease từ động vật, lượng enzyme thu được từ các
nguyên liệu thực vật cũng không nhiều so với nguyên liệu tiêu hao.
c, Thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật
Hai nguồn nguyên liệu từ thực vật và động vật không thể dùng nguyên liệu sản
xuất với quy mô lớn do nhưng hạn chế về nguyên liệu và công nghệ. Vì vậy dùng
nguyên liệu vi sinh vật sẽ khắc phục được hạn chế trên như:
+ Nguồn nguyên liệu vô hạn;

+ Hệ enzyme phong phú;
+ Hoạt tính mạnh;
+ Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọn giống;
+ Vi sinh vật sinh sản với tốc độ nhanh;
+ Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ tiền;
Thu nhận enzyme từ vi sinh vật có thể từ vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc.

6


- Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm
59% được sử dụng. Protease của thực vật hay động vật chỉ chứa một trong hai loại
endopeptidase hoặc axopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên,
do đó protease có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các
liên kết peptid trong phân tử protein.
Trong các chủng, vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh nhất protease là
Bacillus subtilis, B. Mesetericus, thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó B. Subtilis có khả năng tổng hợp protease cao nhất (Nguyễn
Trọng Cẩn và cộng sự, 1998).
- Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi...các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease:
acid, kiềm, trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease có khả năng thủy
phân protein ở pH 2,5-3 (Nguyễn trọng Cẩn và cộng sự, 1998)
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti... cũng có
khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa để sản xuất phomat.
- Xạ khuẩn
Về tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc.

Tuy nhiên, người ta đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp như:
Streptomyces, s. fradiae, S. trerimosus...(Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998).
Các chế phẩm xạ khuẩn được biết nhiều đó là protease được tách chiết từ S.
grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết
peptide của nhiều protein thành acid amin.
Protease từ s. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng
trong công nghệ chế biến thịt.
2.2. Nấm mốc Aspergillus oryzae
2.2.1. Các đặc điểm chung của Aspergillus oryzae
A.oryzae (thuộc chi Aspergillus, họ Tricomomacae, bộ Eurotiales, lớp
Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới Nấm và là nấm đa bào (Kitamoto,

7


2002). Nấm mốc A.oryzae là một trong những loại nấm mốc có khả năng sinh trưởng
và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất khác nhau. Quan sát trên kính hiển vi ở
vật kính 10 và 40 cho thấy đặc điểm hình thái của A.oryzae như: cơ thể sinh trưởng là
một hệ sợi rất mảnh, chiều ngang 5 - 7µm, phân nhánh nhiều và có vách chia sợi có
các cuống đính bào tử (dài 1 -2 mm) nên có thể quan sát bằng mắt thường, ở đó có cơ
quan sinh sản vô tính, phía cuống đính 1 bào tử phồng lên gọi là bọng, bọng đỉnh giá
có hình quả lê, hình chùy hoặc hình cầu, đường kính từ 22 - 50µm, cuống sinh bào tử
nhẵn hoặc sần sùi, kích thước từ 500 – 2500 µm. Bào tử trần hình cầu đến hình trứng,
nhẵn đến có gai nhẹ, đường kính 4 – 8,5 µm, có vàng lục hay màu vàng hoa cau.
Nấm Aspergillus oryzae sinh ra các enzyme amylase, invertase, maltoase,
protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin.
Để đảm bảo cho A.oryzae sinh trưởng, phát triển tốt và có khả năng sinh
enzyme nhiều thì:
+ Độ ẩm môi trường: độ ẩm tốt nhất cho hình thành enzyme là 55-60%, độ ẩm thích
hợp cho hình thành bào tử là 45%.

+ Độ ẩm môi trường: độ ẩm cho phép là 80-100%.
+ Hàm lượng oxi: môi trường nuôi cấy cần thoáng khí.
+ Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp là 28-32°C
+ pH: pH thích hợp là 5.5-6.5
A.oryzae tiết ra môi trường các enzyme có khả năng phân giải cơ chất hữu cơ
để làm dinh dưỡng. Vì vậy để nấm mốc sinh trưởng, phát triển tốt thì môi trường phải
đảm bảo có đầy đủ năng lượng, các vật liệu xây dựng tế bào, sinh tổng hợp enzyme và
khả năng sinh bào tử cao (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982).
2.2.2. Khả năng sinh enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae
Enzyme protease tạo ra từ nấm mốc A.oryzae chịu bền ở nhiệt độ cao từ 2060°C trong đó nhiệt độ tối thích là 45-50°C và độ bền pH từ 2-7 với pH tối thích là 56. Các yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình sinh enzyme protease của A.oryzae (Nguyễn
Đức Lượng, 2004):
- pH ban đầu của môi trường: pH tối ưu cho hoạt tính protease cao nhất là 4-5.
- Nhiệt độ môi trường nuôi cấy nấm mốc A.oryzae: Nhiệt độ tốt nhất để nấm mốc tạo
enzyme protease hoạt tính cao nhất là 30°C.

8


- Thành phần môi trường nuôi cấy: Thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng
nhiều đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease. Môi trường nuôi cấy trong
phương pháp nuôi cấy bề mặt cho hoạt tính enzyme cao nhất là 75% cám, 20% trấu,
5% gelatin.
- Thời gian nuôi cấy: Sự tạo thành enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm mốc
A.oryzae bắt đầu sinh bào tử ( Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.2.3. Ứng dụng của A.oryzae
a, Ứng dụng của A.oryzae trong công nghệ thực phẩm
A.oryzae được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm
như nước mắm, bia, bánh kẹo… và trong công nghiệp sản xuất các enzyme (amylase,
protease, lipase…).
Trong ngành công nghệ sản xuất nước quả: enzyme glucanase và pectinase sẽ

phá hủy hoàn toàn màng tế bào, làm giảm độ nhớt và tăng độ đồng nhất các loại nước
quả có thịt quả tốt hơn.
Trong công nghệ sản xuất bia: các chế phẩm enzyme amylase, protease và
glucanase được sử dụng để ngăn chặn sự tào thành các diaxetyl, giúp rút ngắn thời
gian lên men bia.
Trong công nghệ sản xuất cà phê: sử dụng kết hợp phức hệ enzyme cellulase
và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và tăng khả năng trích ly dịch quả trong sản xuất
cà phê.
b, Ứng dụng của A.oryzae trong các lĩnh vực khác
Trong đời sống, A.oryzae được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất.
Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy: các loại enzyme được bổ sung
trong khâu nghiền bột, tẩy trắng, và xeo giấy có vai trò quan trọng, gỗ được xử lý với
các endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả
năng khuếch tán hóa chất vào trong gỗ và hiệu quả khử ligin.
Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: bổ sung enzyme β- glucanase
trực tiếp cho vào thức ăn sẽ cho phép tăng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.
Trong công nghệ sản xuất dung môi hữu cơ: bổ sung enzyme phá hủy thành tế
bào như cellulase, hemicellulase giúp tăng lượng đường tạo ra dẫn tới tăng hiệu suất
thu hồi rượu lên 1,5% (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2012).
Trong công nghệ xử lý nước thải và sản xuất phân bón vi sinh: sản xuất
enzyme cellulase thủy phân cellulose trong rác thải. Vì vậy, nước thải của nhà máy
giấy, cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung chế phẩm chứa hệ cellulase đem
lại hiệu quả cao (Trần Đình Toại, 2007).
9


PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu tương từ Hải Dương, Hà Nội, Thanh Hóa và các mẫu nước mắm từ Hải
Phòng, Nghệ An được sử dụng để phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae.
Bảng 3.1 Các mẫu phân lập được
STT

Tên mẫu

1

Tương bần

2

Nước mắm

Địa điểm lấy mẫu
Hải Dương
Hà Nội
Thanh Hóa
Hải Phòng
Nghệ An

Kí hiệu
HD
HN
TH
HP
NA

Số mẫu

6
4
5
3
2

3.1.2. Môi trường, hóa chất sử dụng
Môi trường nuôi cấy nấm mốc PDA (g/l) : khoai tây (200), agar (20), glucose
(20), casein (5), nước cất.
Môi trường định tính enzyme protease (g/l): Casein (10), agar (15),
promocresol green (PCG) (10 ml/l), nước cất.
Hóa chất sử dụng:

10


Bảng 3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

3.1.3. Thiết bị sử dụng

Thành phần
TCA
Casein
Glucose
BCG
Folin
NaCl
NaOH
Acid Boric
Na2CO3
CH3COOH
K2HPO4
H3PO4

Xuất xứ
ẤN Độ
Ấn Độ
Ấn Độ
Ấn Độ
Ấn Độ
Ấn Độ
Ấn Độ
Ấn Độ
Ấn Độ
Ấn Độ
Ấn Độ
Ấn Độ

Bảng 3.3. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm
STT
Thiết bị
1
Bể ổn nhiệt (Water Bath JSWB 22T)
2
Cân phân tích
3
Tủ cấy Air stream CESCO
4
Máy lắc ổn nhiệt (Eppendort Thermomixer Comfot)
5
Máy li tâm (Mikro 2204 Hettich)
6
Máy khuấy từ (IKA RH basic 2)
7
Máy voltex (Maxit mix II)
8
Nồi hấp ALP
9
Tủ nuôi cấy (Orbital incubator Shaker gyromax TM 727)
10
Máy quang phổ (UV 1800)
11
Máy đo pH (Thermo Scientific)
12
Tủ sấy Memmert
13
Màng lọc protein Thermo Scientific TM Pierce
3.1.4. Thời gian nghiên cứu

Xuất xứ
Hàn Quốc
Mỹ
Singapore
Đức
Đức
Đức
Mỹ
Nhật
Mỹ
Nhật
Singapore
Mỹ
Đức

Nghiên cứu được thực hiện trong thời gian 8/2017 – 1/2018.
3.1.5. Địa điểm ngiên cứu
Phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ thực phẩm, khoa Công
nghệ thực phẩm – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập chủng nấm mốc Aspergillus oryzae sinh protease từ các mẫu tương
và nước mắm.

11


- Tuyển chọn các chủng nấm mốc A.oryzae có khả năng sinh enzyme protease
ngoại bào có đặc tính chịu muối
- Tuyển chọn các chủng nấm mốc A.oryzae sinh enzyme protease có khả năng

chịu pH.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phân lập nấm mốc A.oryzae sinh enzyme protease
Phương pháp phân lập nấm mốc Aspegillus oryzae được thực hiện theo phương
pháp của Bùi Xuân Đồng (2004):
Cân chính xác 1g mẫu cho vào bao PE vô trùng, cho thêm 9ml nước cất để pha
loãng. Tiến hành đồng nhất. Khi đó ta được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1
Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette
vô trùng, hút 1 ml dung dịch 10-1 cho vào 9 ml nước cất vô trùng đồng nhất, ta thu được
độ pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện cho đến khi đạt độ loãng cần thiết.
Dùng micropipette hút 0,1 dung dịch đã pha loãng vào đĩa thạch có chứa môi
trường PDA. Dùng que cấy trang đều cho tới khi bề mặt khô. Ủ ở nhiệt độ phòng
trong 5-7 ngày.
Quan sát sự phát triển của nấm mốc, cấy chuyền những khuẩn lạc khác nhau về
hình thái vào đĩa môi trường PDA khác nhau. Ủ ở nhiệt độ 27-32°C trong 5-7 ngày.
Cấy chuyền tiếp nhiều lần cho đến khi thu được ở mỗi đĩa pettri là dòng khuẩn
lạc hoàn toàn thuần chủng.
Quan sát khuẩn lạc: hình dạng có khuẩn lạc tâm lồi, rìa thấp dần, lớp tơ với màu
sắc khuẩn lạc ban đầu có màu vàng lục nâu, sợi tơ hình thành bào tử có màu nâu.
3.3.2. Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme protease
Phương pháp thu dịch enzyme thô: Các chủng thuần chủng ở trên được nuôi
cấy trong môi trường Potato Dextrose bằng cách lắc 200rpm ở 30°C trong 4 ngày. Sau
4 ngày nuôi cấy, một số lượng lớn các quả cầu nấm đã xuất hiện trong bình nuôi. Sau
đó lọc và ly tâm ta được enzyme thô.
Tiến hành xác định khả năng sinh enzyme protease bằng phương pháp khuếch
tán trên thạch theoVijayaraghavan và cộng sự (2013):
- BCG (Bromocresol Green) là một chất chỉ thị màu phụ thuộc vào pH; pH <
3.8 có màu vàng; pH 3.8-5,4 màu xanh lá cây; pH > 5,4 có màu xanh nước biển. Khi

12

BCG được bổ sung trên môi trường thạch casein có pH=7 nên sẽ có màu xanh nước
biển. Khi có mặt của protease thì protease sẽ thủy phân casein hình thành vùng trong
suốt trên đĩa thạch, những vùng còn lại sẽ có màu xanh nước biển do bromocerol gắn
với các protein chưa bị thủy phân.
- Tiến hành:
+ Sử sụng môi trường Casein Agar Plate 0.0015% BCG để phát hiện hoạt động
phân giải protein của nấm mốc, đục lỗ thạch với đường kính 3mm.
+ Dùng micropipette nhỏ vào mỗi lỗ thạch 100 µl dịch enzyme thô thu được, ủ
ở 37°C trong 24 giờ.
+ Nếu môi trường bị thủy phân sẽ có vòng tròn xung quanh lỗ màu trong suốt.
Dùng thước đo đường kính đường phân giải.
3.3.3. Xác định hoạt tính enzyme protease
Hoạt tính của enzyme protease được xác định theo phương pháp của sigma:
Nguyên tắc: Sau khi ủ enzyme protease với cơ chất casein ta ngưng hoạt động
của enzyme và tủa protein chưa bị thủy phân bằng Trichloacetic acid (TCA). Định
lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, dựa vào đường
chuẩn tyrosin để xác định đơn vị hoạt độ enzyme.
Định nghĩa một đơn vị hoạt độ protease: Một đơn vị hoạt độ enzyme sẽ thủy
phân ra một lượng axit amin tương đương 1µM Tyrosin trong 1 phút ở điều kiện pH
7.5 nhiệt độ 37°C.

13


Các bước tiến hành:
Bảng 3.4: Các bước tiến hành định lượng enzyme protease
Hóa chất
Casein (0.65%)

Test 1 (ml)
Test 2 (ml)
Test 3(ml)
5
5
5
Đặt trong bể ổn nhiệt ở 37°C trong 5 phút
Enzyme lần 1
2
0.7
0.5
Lắc nhẹ để trộn đều ống, ủ ở 37°C trong 10 phút
TCA
5
5
5
Enzyme lần 2
0
0.3
0.5
Lắc nhẹ để trộn đều ống, ủ ở 37°C trong 30 phút

Blank
5
0
5
1

Lọc dung dịch qua màng lọc 0.45 µl

Hút 2 ml dung dịch đã lọc chuyển sang ống mới
Dịch lọc
2
2
2
Na2CO3
5
5
5
Thuốc thử Folin
1
1
1

2
5
1

Trộn dung dịch và ủ ở 37°C trong 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, sau đó đo
ở bước sóng 660 nm, đối chiếu với đường chuẩn để suy ra lượng Tyrosine tương ứng.
Xây dựng đường chuẩn:
+ Chuẩn bị dung dịch Tyrosine 1.1mM (tương đương 0,2mg/ml).
+ Xây dựng đường chuẩn theo công thức sau.
Bảng 3.5. Các bước xây dựng đường chuẩn tyrosine
Tyrosine (ml)
Nước cất (ml)
Na2CO3 (ml)
Folin (ml)

Ống 1

0,05
1,95
5
1

Ống 2
0,1
1,9
5
1

Ống 3
0,2
1,8
5
1

Ống 4
0,4
1,6
5
1

Ống 5
0,5
1,5
5
1

Blank

0
2
5
1

Trộn dung dịch và ủ ở 37 0C trong 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng và lọc
qua giấy lọc. Sau đó đo ở bước sóng 660nm và xây dựng đường chuẩn 2 thông số: giá
trị Abs660 và nồng độ Tyrosine
Bảng 3.6. Thể tích Tyrosin tương ứng với nồng độ Tyrosin
Ống 1
Ống 2
Ống 3
Ống 4
Ống 5
Thể tích (ml)
0.05
0.1
0.2
0.4
0.5
Nồng độ(µM)
0.055
0.111
0.221
0.442
0.553
Kết quả cho thấy: Đường chuẩn có phương trình y= 1.5683x + 0.0009 trong đó:
y là độ hấp phụ ở bước sóng 660nm; x là nồng độ Tyrosin (µM).

14

Hình 3.1. Đường chuẩn Tyrosin

Trong đó:
- T: Là số µM Tyrosine tương ứng được giải phóng ra
- 11:Tổng thể tích phản ứng enzyme (ml)
- 2: Thể tích dùng để đo cường độ quang khi trộn với F-C (ml)
- 1: Thể tích enzyme dùng cho phản ứng (ml)
- 10: Thời gian phản ứng (phút)
3.3.4. Xác định thời gian sinh enzyme protease
Các chủng nấm mốc sinh enzyme protease có hoạt tính cao được đem đi ủ trong
tủ lắc 200 rpm ở 300C.
Sau đó dịch enzyme thô thu được bằng cách ly tâm ở 9600 vòng, 10 phút, 4 0C
ở các thời điểm 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h được đem đi xác định hoạt tính của enzyme theo
mục 3.3.3.
Thời điểm chủng nấm mốc sinh enzyme có hoạt tính cao nhất được chọn đi để
xác định các đặc tính tiếp theo.

15


3.3.5. Phương pháp xác định khả năng chịu muối của enzyme protease sinh ra bởi
nấm mốc A.oryzae
Xác định nồng độ muối tối ưu của enzyme protease sinh ra bởi nấm mốc
A.oryzae được thực hiện dựa trên phương pháp của Wang và cộng sự (2013):
Muối được bổ sung vào cơ chất casein để được cơ chất có nồng độ casein
0.65% và các nồng độ muối khác nhau là 0%, 4%, 8%, 12%, 16%, 24%. Sau đó các
dung dịch casein có chứa muối ở nồng độ khác nhau được sử dụng để xác định hoạt
tính của enzyme.

Nồng độ muối tối ưu sẽ được sử dụng để xác định độ bền muối của enzyme
protease.
3.3.6. Phương pháp xác định độ bền muối của enzyme protease
Xác định độ bền muối của enzyme protease sinh ra bởi nấm mốc A.oryzae
được thực hiện dựa trên phương pháp của Wang và cộng sự (2013):
Khoảng thời gian khác nhau 0h, 0.5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h. Sau đó mang đi xác
định hoạt tính còn lại của enzyme protease theo phương pháp sigma theo mục 3.3.3.
3.3.7. Phương pháp xác định độ bền pH của enzyme protease
Xác định độ bền pH của enzyme protease sinh ra bởi nấm mốc A.oryzae được
thực hiện dựa trên phương pháp của Nguyễn Hoàng Anh và cộng sự (2012), được mô
tả như sau:
Xác định độ bền pH bằng cách ủ enzyme trong pH tối ưu ở nhiệt độ 30 0C ở các
thời gian khác nhau 0, 0.5h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h. Sau đó enzyme được lấy ra để xác
định hoạt tính còn lại của enzyme theo phương pháp sigma như mục 3.4.3.

16