Khóa luận tốt nghiệp :phân lập, khảo sát đặc tính sinh học của mầm bệnh và một số vi khuẩn thường gặp trên gà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA THÚ Y

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
“PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MẦM BỆNH GÂY
BỆNH CRD (Chronical Respiratory Disease) VÀ MỘT SỐ VI KHUẨN
THƯỜNG GẶP TRÊN ĐƯỜNG HÔ HẤP CỦA GÀ BẢN ĐỊA
TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC, VIỆT NAM”
SINH VIÊN

:

TRẦN THỊ NHUẬN

LỚP

:

TYA - K53

NGƯỜI HƯỚNG DẪN

:

TS. NGUYỄN BÁ HIÊN

BỘ MÔN

:

VSV-TN

HÀ NỘI - 2012


ĐẶT VẤN ĐỀ

NỘI DUNG
BÁO CÁO

NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT LUẬN


ĐẶT VẤN ĐỀ


Tính cấp thiết của đề tài
Chăn nuôi gia cầm là nghề chăn nuôi truyền thống và chiếm vị

trí quan trọng trong ngành chăn nuôi ở Việt Nam. Hiện nay, đời
sống nhân dân đã được nâng cao, nhu cầu thị trường thiên về các
giống gia cầm địa phương có dạng thơm ngon: gà Móng, gà Hồ,
gà Đông Tảo, gà Chọi, gà Ri…
Tuy nhiên, chăn nuôi phát triển thì dịch bệnh lại trở thành một
vấn đề đáng phải quan tâm. Một trong những bệnh truyền nhiễm
phổ biến ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển chăn nuôi các
giống gia cầm bản địa là bệnh Viêm đường hô hấp mạn tính ở gà

hay còn gọi là bệnh CRD (Chronic – Respiratory – Disease) do
Mycoplasma gallisepticum (MG) gây ra .


Trước đây, CRD xuất hiện trên gà công nghiệp với tỷ lệ khá

cao, gà bản địa ít mắc. Ngày nay, do nhiều yếu tố như: chăn
nuôi tập trung theo phương thức công nghiệp, môi trường ô
nhiễm, vấn đề quản lý dịch bệnh chưa tốt, điều kiện khí hậu
thích hợp cho bệnh bùng phát và lây lan… Vì vậy, CRD lan
sang và lưu hành với tỷ lệ ngày càng lớn trong đàn gà bản địa
gây thiệt hại không nhỏ.

“Phân lập, khảo sát đặc tính sinh học của mầm bệnh gây
bệnh CRD (Chronic Respiratory Disease) và một số vi khuẩn
thường gặp trên đường hô hấp của gà bản địa tại một số tỉnh
phía Bắc, Việt Nam”.


Mục đích đề tài

Phân lập, giám
định một số đặc
tính sinh học của
M.gallisepticum
trên gà bản địa.

Xác định được một
số vi khuẩn hiếu
khí thường gặp ở

đường hô hấp của
gà khỏe và gà nghi
mắc CRD.


ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


ĐỐI TƯỢNG

M.gallisepticum và một số vi khuẩn hiếu khí
thường gặp ở đường hô hấp của gà bản địa.


NỘI DUNG
Phân lập, giám định một số đặc tính sinh học của
M.gallisepticum gây bệnh trên gà bản địa.
Xác định số loại và số lượng vi khuẩn hiếu khí ở đường hô
hấp của gà khỏe và gà mắc bệnh CRD.

Giám định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn
phân lập được.


Là dịch hầu họng, khí phế
quản, phổi của gà khỏe và gà
nghi mắc CRD, chết do mắc
CRD của các đàn gà bản địa
thuộc địa bàn nghiên cứu

Nguyên
liệu, Dụng
cụ, Hóa
chất

Panh, kéo, dao mổ, tăm bông
vô trùng, phiến kính, đèn cồn,
que cấy, hộp lồng…
Tủ lạnh, tủ ấm, tủ ấm CO2, tủ
sấy, nồi hấp, máy nhân gen…
Môi trường phân lập MG: Mt
Frey.
Môi trường nước thịt, thạch
thường, thạch máu,
MacConkey... và các loại đường
dùng cho pư sinh hóa…


Môi trường nước thịt (Mycoplasma Broth-MB)

MÔI TRƯỜNG
FREY
-môi trường phân lập
Mycoplasma

Môi trường thạch (Mycoplasma Agar-MA)

Chế Frech Yeast Extract 25%

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1

2

3

Phản ứng
ngưng kết
nhanh trên
phiến kính.

Định lượng
số lượng vi
khuẩn hiếu
khí.

Phân lập và
giám định đặc
tính sinh hóa
của
M.gallisepticum

Phương
Phương pháp
pháp xử
xử lý
lý số
số liệu

liệu
Excel
Excel 2007,
2007, Minitab,
Minitab, WinEpiscope
WinEpiscope 2.0
2.0


Quy trình phân lập, giám định Mycoplasmatại bộ môn VSV - TN

Mẫu bệnh phẩm
Nghiền (1gr mẫu+5ml BHI),
lọc qua màng lọc 0,45µm

Cắt nhỏ (1gr mẫu+5ml BHI),
đảo đều đến khi hỗn dịch sánh đều

Hút 100 100µl hỗn dịch vào ống môi trường MB (1 ml)  trộn đều
rồi hút 100µl sang các ống MB tiếp theo đến ống thứ 5 (pha loãng đến 1/100000)
Sau1 – 2 ngày môi trường không chuyển màu
 nuôi tiếp đến 5 – 7 ngày

Sau 1 – 2 ngày môi trường chuyển màu
 nhiễm khuẩn
Sau 5-7 ngày lọc qua màng lọc 0,45 µm

Môi trường chuyển màu vàng

Cấy chuyển sang môi trường MA và MB

Khuẩn lạc điển hình giống Mycoplasma

Chuyển vào nước thịt PPLO 3 – 5 ngày  mọc
Tiến hành các PƯ sinh hóa

PCR

Chia vào các lọ nhỏ + 50% Glycerol
giữ ở -80C



Kết quả phân lập Mycoplasma từ mẫu bệnh phẩm
của gà nghi mắc CRD
Bảng 4.1. Kết quả phân lập Mycoplasma
từ bệnh phẩm gà nghi mắc CRD
Kết quả nuôi cấy trên các môi trường
Giống gà

Số
mẫu
kiểm
tra

Mycoplasma Broth
(MB)

Mycoplasma Agar
(MA)

Số mẫu
(+)

Tỷ lệ (%)

Số mẫu
(+)

Tỷ lệ (%)

Gà Ri pha

17

9

52,94

8

47,06

Gà Hồ

20

11

55,00

8

40,00

Gà Đông Tảo

91

47

51,65
51,08

38

41,76
41,73

Gà Móng

11

4

36,36

4

36,36

Dương tính

Âm tính

Hình 4.1. Mycoplasma trên môi trường nước thịt (MB)


Dương tính

Âm tính

Hình 4.2. Mycoplasma trên môi trường thạch (MA)

Hình 4.3. Khuẩn lạc Mycoplasma dưới kính hiển vi quang học (x40)


Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật hóa học của
Mycoplasma phân lập được từ bệnh phẩm

Chỉ tiêu

Số mẫu
kiểm tra

Số mẫu
dương tính

Tỷ lệ

(%)

Phản ứng Urease

58

0

0

Khuẩn lạc hình trứng ốp

58

58

100

Gây ngưng kết hồng cầu gà

58

36

62,07

Lên men đường Glucose

58

32

55,17

Lên men đường Manose

58

28

48,28

Arginine

58

0

0

TTC (Tetrazolium chlorid)

58

28

48,28


Hình 4.4. Kết quả PCR đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi MG-14F

và MG-13R để phát hiện Mycoplasma gallisepticum

 M: Marker ADN;
 giếng 1: Đối chứng dương (MG chủng

ATCC 19610);
 giếng 2: MS chủng ATCC 27399;
 giếng 3: virus Newcastle(Lasota);
 giếng 4: Vi khuẩn E.coli;
 giếng 5: Vi khuẩn P.multocida;
 giếng 6: Vi khuẩn Salmonella.
 Sản phẩm PCR có kích thước là 185 bp

 Cặp mồi đặc hiệu với Mycoplasma gallisepticum


Bảng 4.3. Kết quả giám định M. gallisepticum từ môi trường phân lập
bằng phương pháp PCR

Kết quả PCR
Môi trường

Số mẫu
kiểm tra

Số mẫu
dương tính

Tỷ lệ
(%)

Mycoplasma Broth

12

12

100

Mycoplasma Agar

12

12

100

Tổng hợp

24

24

100


Kết quả giám định Mycoplasma gallisepticum
trong môi trường phân lập bằng phương pháp PCR

M: Marker ADN;

giếng 1: Đối chứng dương (MG

chủng ATCC 19610);
giếng 2, 3, 4, và 5 là 4 mẫu
dương tính với MG được kiểm
tra từ môi trường phân lập.
Sản phẩm PCR có kích thước là
185 bp.


Kết quả phát hiện Mycoplasma gallisepticum từ bệnh
phẩm bằng phương pháp PCR

M: Marker AND;
giếng 1: đối chứng dương (MG

chủng ATCC 19610);
 giếng 2, 3, và 4: các mẫu
dương tính với MG từ bệnh
phẩm là phổi và khí quản.
Sản phẩm PCR có kích thước là
185 bp.


Bảng 4.4. Kết quả chẩn đoán Mycoplasma gallisepticum
từ bệnh phẩm bằng phương pháp PCR
Kết quả PCR
Loại bệnh phẩm

Số mẫu

kiểm tra

Số mẫu
dương tính

Tỷ lệ
(%)

Phổi

21

10

47,6

Khí quản

11

5

45,4

Tổng hợp

32

15

46,8


Bảng 4.6. Kết quả xác định số loại và số lượng vi khuẩn hiếu khí
thường gặp trên đường hô hấp gà nghi mắc CRD

Chỉ tiêu

Số
mẫu
kiểm
tra

Biến
động số
loại vi
khuẩn

Mẫu
bệnh
phẩm

Số loại
vi
khuẩn
trung
bình

Tổng số vi khuẩn hiếu khí
(x106 VK/g)

Ít nhất

Nhiều
nhất

Trung
bình

4,38

3,00
Phổi

20

2-4

3,00
3,20

1,97

6,62

4,38
5,51

Khí quản

20

2-4

3,20

2,16

13,68

5,51

Dịch họng

20

4-5

4,75
4,75

3,25

15,21

6,49
6,49


Bảng 4.6. Kết quả xác định số loại và số lượng vi khuẩn hiếu khí
thường gặp trên đường hô hấp gà khỏe

Chỉ tiêu

Số
mẫu
kiểm
tra

Biến
động số
loại vi
khuẩn

Mẫu
bệnh
phẩm

Số loại
vi
khuẩn
trung
bình

Tổng số vi khuẩn hiếu khí
(x106 VK/g)
Ít nhất

Nhiều
nhất

2,60

Trung
bình

1,13

Phổi

20

2-3

2,6
3,20

0,07

1,54

1,13
1,31

Khí quản

20

2-4

3,2

0,22

2,75

1,31

Dịch họng

20

3-5

4,25
4,25

0,49

5,24

2,76
2,76