xác định một số corticoid trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng hptlc

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐỨC MƯỜ

LÊ ĐỨC MƯỜI

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CORTICOID
TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐỨC MƯỜI
Mã sinh viên : 1301279

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CORTICOID
TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG HPTLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. NCS.Ths. Đào Thị Cẩm Minh
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất

2. Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã
nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, sự ủng hộ
của gia đình và bạn bè.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến PGS. TS.
Nguyễn Thị Kiều Anh và NCS. Ths. Đào Thị Cẩm Minh, là những người trực tiếp hướng
dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện
và hoàn thành khóa luận. Đặc biệt, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS. TS.
Phạm Thị Thanh Hà đã động viên, nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn
Hóa phân tích - Độc chất đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt thời gian làm thực nghiệm tại bộ môn. Tôi cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo và
các anh chị cán bộ Viện công nghệ dược phẩm quốc gia đã tạo điều kiện hỗ trợ về thiết bị
trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo đại
học cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy
dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm và
tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2018

Lê Đức Mười

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

3

1.1. Tổng quan các thuốc tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược

3

1.1.1. Trên thế giới

3

1.1.2. Tại Việt Nam

4

1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

5

1.2.1. Tác dụng

5

1.2.2. Tác dụng không mong muốn

6

1.2.3. Chỉ định

6

1.2.4. Cấu trúc, tính chất vật lý

6

1.3. Một số nghiên cứu phát hiện corticoid trộn trái phép trong chế phẩm đông
dược
8
1.3.1. Trên thế giới

8

1.3.2. Tại Việt Nam

10

1.4. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

11

1.4.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

11

1.4.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

13

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

17
17

2.1.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

17

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

17

2.1.3. Đối tượng nghiên cứu

18

2.2. Phương pháp nghiên cứu

18

2.2.1. Thu thập mẫu

18

2.2.2. Xử lý mẫu

19

2.2.3. Khảo sát điều kiện sắc ký

19


2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng

20

2.2.5. Ứng dụng phân tích các mẫu thu thập được

20

2.3. Phương pháp xử lý số liệu

20

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

21

3.1. Xây dựng phương pháp phân tích

21

3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký

21

3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

23

3.2. Thẩm định phương pháp

28

3.2.1. Độ chọn lọc

28

3.2.2. Độ thích hợp hệ thống

29

3.2.3. Khoảng tuyến tính

29

3.2.4. Độ đúng và độ chính xác

30

3.2.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

32

3.3. Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực

33

3.4. Bàn luận

38

3.4.1. Về lựa chọn phương pháp

38

3.4.2. Về lựa chọn điều kiện sắc ký

39

3.4.3. Về xử lý mẫu

39

3.4.4. Về thẩm định phương pháp

40

3.4.5. Về ứng dụng của phương pháp

41

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

43

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

AR
BETA
AOAC
CHCl3
DEXA
EtOAc
EtOH
H
HPLC
HPTLC

Tiếng anh hoặc tên khoa học
Association of Official Analytical
Chemists
Analytical Reagent

Tiếng việt

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính
thống
Thuốc thử phân tích
Betamethason

Cloroform
Dexamethason acetat
Ethyl acetat
Ethanol
Hiệu suất
High Performance Liquid
Chromatography
High Performance Thin Layer
Chromatography

HYRO
Health Sciences Authority
(Singapore)
International Conference on
ICH
Harmonisation
LC-MS/MS Liquid chromatography – mass
spectrometry/mass spectrometry
LOD
Limit of Detection
LOQ
Limit of Quantitation
MeOH
Methanol
Non-Steroidal Anti-Inflammatory

NSAID
Drug
PREL
PREN
QT
RSD
Relative Standard Deviation
S/N
Signal/noise
SD
Standard Deviation
TLC
Thin Layer Chromatography
TPCN

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Hydrocortison acetat

HAS

Hội nghị hòa hợp Quốc tế
Sắc ký lỏng hai lần khối phổ
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Thuốc giảm đau chống viêm không
steroid
Prednisolon
Prenison
Quy trình

Độ lệch chuẩn tương đối
Tín hiệu/nhiễu
Độ lệch chuẩn
Sắc ký lớp mỏng
Thực phẩm chức năng


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Cấu trúc, tính chất vật lý của các thuốc corticoid .............................................. 7
Bảng 1.2. Các nghiên cứu xác định một số corticoid trong chế phẩm đông dược .............. 8
Bảng 1.3. So sánh một vài thông số giữa HPTLC và TLC ............................................... 13
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ..................................................... 17
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát dung môi rửa loại tạp (n=2) .................................................. 24
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=2) ............................................................. 26
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống (n=6) ........................................... 29
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic .................. 30
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày (n=6) ......... 31
Bảng 3.6. Kết quả LOD và LOQ của các chất phân tích .................................................. 33
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá các mẫu dương tính ............................................................... 38


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Sơ đồ cơ chế chống viêm của glucocorticoid ...................................................... 6
Hình 1.2. Quy trình phân tích và các thiết bị trong HPTLC ............................................. 15
Hình 3.1. Kết quả khảo sát thành phần dung môi pha động.............................................. 21
Hình 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ hệ dung môi ................................................................... 22
Hình 3.3. Phổ hấp thụ UV của các chất phân tích ............................................................. 23
Hình 3.4. Kết quả khảo sát dung môi rửa loại tạp ............................................................. 24
Hình 3.5. Kết quả khảo sát dung môi chiết trên nền viên nén........................................... 27
Hình 3.6. Sơ đồ xử lý mẫu phân tích ................................................................................. 27

Hình 3.7. Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp HPTLC............................... 28
Hình 3.8. Sắc ký đồ analog đánh giá độ chọn lọc của phương pháp trên nền viên nén .... 28
Hình 3.9. Sắc ký đồ analog xác định LOD trên nền viên nén ........................................... 33
Hình 3.10. Sắc ký đồ phân tích các chế phẩm đông dược trên thị trường ........................ 35
Hình 3.11. Kết quả so sánh phổ của các mẫu nghi ngờ dương tính với phổ chuẩn
dexamethason acetat .......................................................................................................... 36
Hình 3.12. Kết quả so sánh phổ các mẫu nghi ngờ dương tính với phổ chuẩn
betamethason ..................................................................................................................... 37
Hình 3.13. Kết quả so sánh phổ của mẫu nghi ngờ dương tính với phổ chuẩn prednison 37


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sử dụng thuốc và thực phẩm chức năng (TPCN) có nguồn gốc từ đông dược thay
thế cho các chế phẩm có nguồn gốc tổng hợp hóa dược đang là một xu thế phổ biến ở
Việt Nam và trên thế giới. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% người dân ở
các nước đang phát triển sử dụng thường xuyên các thuốc cổ truyền trong chăm sóc sức
khỏe. Dân số sử dụng thuốc đông dược để điều trị ban đầu chiếm 90% dân số của
Ethiopia, chiếm 75% dân số của Mali, chiếm 70% ở Myannar, chiếm 70% ở Rawanda,
chiếm 60% ở Tanzania và chiếm 60% ở Uganda. Ở Châu Âu, doanh thu đem lại từ các
sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược lên đến hơn 3,7 tỷ Euro hằng năm [28].
Chế phẩm đông dược có nguồn gốc từ thực vật, động vật và khoáng vật. Chúng
thường được quảng cáo là "tự nhiên" với người tiêu dùng, được nhiều người ưa chuộng,
tin dùng vì sự an toàn, ít tác dụng phụ hơn so với các chế phẩm dược thông thường. Mặc
dù các chế phẩm đông dược đã được sử dụng từ lâu, nhưng ít người có kiến thức đầy đủ
về an toàn và hiệu quả của chúng. Ngoài ra, chúng không được quản lý tốt và có sẵn ở các
cửa hàng thực phẩm sức khỏe, trong siêu thị và cả trên mạng internet. Do đó nhiều cơ sở
sản xuất chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên đã pha trộn trái phép các chất tổng hợp nhằm
đánh lừa người sử dụng bằng hiệu quả nhanh chóng của chúng [28]. Nhiều nghiên cứu
khác nhau đã được báo cáo các trường hợp các chế phẩm đông dược có trộn lẫn không
khai báo các thuốc hóa dược khác nhau [34]. Điển hình các nhóm hoạt chất thường được

trộn trái phép là thuốc giảm glucose máu, thuốc chống viêm glucocorticoid, thuốc giảm
đau và thuốc chống viêm không steroid, thuốc hạ huyết áp, thuốc giảm béo, thuốc ức chế
phosphodiesterase – 5 [28], [36]. Trong đó, chiếm tỷ lệ cao nhất là nhóm thuốc giảm đau
chống viêm và được báo cáo chủ yếu từ các nghiên cứu ở Trung Quốc, Singapore,
Pakistan, Nam Phi và Ấn Độ [37].
Bên cạnh tác dụng nhanh chóng do các nhóm thuốc này mang lại thì chúng cũng
mang lại nhiều tác hại nguy hiểm cho người dùng. Sử dụng corticoid trong thời gian dài
có thể gây hội chứng cushing, loét dạ dày tá tràng, tình trạng loãng xương, suy giảm chức
năng tuyến thượng thận,...[10], [26].
Việc phát hiện các corticoid trong các chế phẩm đông dược gặp nhiều khó khăn do
hàm lượng thấp của chất cần phân tích, sự phức tạp của mẫu thử. Hiện nay ở Việt Nam và
1


trên thế giới đã có một số nghiên cứu phát hiện các thuốc corticoid trộn trái phép vào chế
phẩm đông dược bằng các phương pháp như TLC [10], [32]; HPLC [9], [6], [35]; LC –
MS [27]; LC – MS/TOF [37]. Phương pháp HPTLC với ưu điểm phân tích được đồng
thời nhiều mẫu, độ đặc hiệu cao nhưng chi phí lại thấp; là phương pháp cần thiết để phân
tích nhanh, đồng thời nhiều mẫu để xác định sự có mặt của corticoid trộn trái phép trong
chế phẩm đông dược [28], [38]. Tại Việt Nam, tác giả Lê Đào Khánh Long đã xác định 5
corticoid: betamethason, dexamethason, hydrocortison, prednison và prednisolone trộn
trái phép trong chế phẩm đông dược bằng TLC. Tuy nhiên, việc phát hiện các corticoid
bằng bước sóng 254 nm hay thuốc thử hóa học có thể dẫn đến những trường hợp dương
tính giả; quy trình chiết các chất có nhiều giai đoạn, tốn thời gian và dung môi [10].
Từ các thực tế trên, nhằm phát triển một phương pháp phân tích có thể xác định
đồng thời nhiều tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược với độ tin cậy cao, chi
phí thấp, góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện và xác định các tân dược trộn lẫn trong
chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định một số corticoid trộn trái
phép trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC”. Với mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời betamethason, dexamethason acetat,

hydrocortison acetat, prednisolon và prednison trộn lẫn trong chế phẩm đông dược
bằng phương pháp HPTLC.
2. Ứng dụng phương pháp HPTLC để xác định betamethason, dexamethason acetat,
hydrocortison acetat, prednisolon và prednison (nếu có) trộn lẫn trong các chế
phẩm đông dược lưu hành trên thị trường.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan các thuốc tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược
1.1.1. Trên thế giới
Hiện nay, tình trạng chế phẩm đông dược bị trộn trái phép các tân dược đang diễn ra
phổ biến, đây đang là vấn đề của nhiều nước trên thế giới, không chỉ riêng Việt Nam.
Điển hình các nhóm thuốc tân dược hay được trộn là nhóm thuốc giảm glucose máu,
thuốc glucocorticoid, thuốc giảm đau, chống viêm không steroid để điều trị viêm khớp, dị
ứng, hen xuyễn; thuốc hạ huyết áp; thuốc giảm béo; thuốc ức chế phosphodiesterase-5 để
điều trị rối loạn chức năng sinh lý [28], [36]. Trong đó, phổ biến nhất là pha trộn với các
steroid tổng hợp và NSAIDs. Các corticoid thường được tìm thấy nhất bao gồm
dexamethason, hydrocortison, prednisolon, betamethason, cortison, và triamcinolon [37].
Trong những năm 1997 - 2002, việc trộn trái phép các thuốc tân dược vào các thuốc
cổ truyền Trung Quốc đã được quan tâm, phát hiện. Có nhiều báo cáo chỉ ra rằng một số
đáng kể các chế phẩm cổ truyền có thuốc tân dược mà không công bố, trong đó có nhóm
corticoid [23], [30], [31]. Tại Anh, nghiên cứu của H. M. Ramsay và các cộng sự đã khảo
sát 24 chế phẩm kem dược liệu điều trị eczema trên 19 bệnh nhân nhi từ 2001 đến 2002,
đã phát hiện năm loại kem có số đăng ký, chứa clobetason propionat; 13 trong số 17 loại
kem không có số đăng ký, chứa các corticoid: clobetason proprionat (4 chế phẩm),
clobetason proprionat + hydrocortison (1 chế phẩm), betamethason valerat (2 chế phẩm),
clobetason butyrat (3 chế phẩm), và hydrocortison (2 chế phẩm) [33].
Tại Thái Lan, Chutima Limmatvapirat và cộng sự đã dùng phương pháp TLC phát

hiện các corticoid trộn trong chế phẩm đông dược, tỷ lệ chế phẩm phát hiện có chứa
dexamethason hay prednisolon từ năm 2007 đến năm 2011 lần lượt là 28,57%; 10,39%;
3,33%; 4,41% và 6,95% [32]. Tại Hàn Quốc, nghiên cứu của So-Hyun Cho và cộng sự đã
khảo sát 294 chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp
trên thị trường từ năm 2010 đến năm 2013. Kết quả cho thấy có 30% mẫu khảo sát phát
hiện có trộn 6 dược chất giảm đau chống viêm như dexamethason, betamethason,
cortison-2-acetat, prednisolon-2-acetat, prednison, prednisolon. Trong đó dexamethason
(45,1%); cortison-21-aceat và prednison-21-acetat (16,2%); betamethason (14,5%) [22].
Tại Ấn Độ, Akash A. Savaliya và cộng sự đã tiến hành định tính 25 dược chất trong đó có
3


các thuốc giảm đau, chống viêm steroid bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ thời gian bay
(LC-MS/TOF) và phát hiện 11/58 mẫu đông dược có chứa dexamethason với hàm lượng
trung bình 0,2 mg/liều [37].
Ở Singapore, tại bệnh viện Đa khoa Singapore, vào tháng 4 năm 2014, một bệnh
nhân nữ 67 tuổi bị ban xuất huyết giảm tiểu cầu tự phát do dùng một loại thảo dược bổ
sung chữa đau khớp có trộn các thành phần dược phẩm không khai báo, một trong số đó
là betamethason-17-valerat. Cơ sở dữ liệu trực tuyến về các sản phẩm bất hợp pháp của
Ủy ban Khoa học Sức khỏe Singapore (HSA) và kho lưu trữ thông cáo báo chí tại
Singapore cho thấy nhiều sản phẩm được bán dưới vỏ bọc thuốc y học cổ truyền hoặc
thảo dược, được phát hiện là bị pha trộn với corticoid không khai báo trong giai đoạn
2009 - 2015. Tất cả các sản phẩm này chủ yếu là mua từ người bán hàng rong ở nước
ngoài, người bán hàng rong địa phương hoặc mua từ bạn bè; tính hợp pháp của các cơ sở
sản xuất chưa được biết. Các sản phẩm này phần lớn được chỉ định để giảm đau và hầu
hết đã được phát hiện do các tác dụng phụ hoặc giảm đau “thần kỳ” được báo cáo bởi
người tiêu dùng [24].
Có thể thấy các corticoid có nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng và trên thế giới vẫn
ghi nhận nhiều trường hợp trộn thuốc nhóm này trong chế phẩm đông dược. Việc người
bệnh dùng các chế phẩm đông dược trộn lẫn tân dược giảm đau chống viêm kéo dài có

thể tích lũy và gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm. Để bảo vệ quyền lợi và sức khỏe cho
người sử dụng, đề tài được tiến hành nhằm đưa ra giải pháp phát hiện và xác định nhanh
chóng, hiệu quả nhóm thuốc này trong chế phẩm đông dược.
1.1.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, việc trộn trái phép các corticoid vào chế phẩm đông dược cũng đã
được quan tâm, phát hiện từ lâu. Năm 2005, sản phẩm nang mềm Tăng phì hoàn của
công ty Dược phẩm WELIP - sản xuất tại Malaysia, nhập khẩu bởi công ty Cổ phần
Dược liệu TW2, đã bị Cục Quản lý Dược ra công văn thu hồi [4]. Ở hội nghị Kiểm
nghiệm năm 2010, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã báo cáo thuốc Khu Phong,
Truy Phong Tê Thấp Thủy có trộn betamethason và một mẫu chế phẩm điều trị Gout có
trộn dexamethason aceat, đều thuộc của cơ sở sản xuất thuốc y học cổ truyền Hinh Hòa
[17].
4


Tuy việc trộn trái phép corticoid đã bị cơ quan chức năng để ý từ lâu, nhưng từ đó
đến nay vẫn còn tồn tại tình trạng trộn trái phép corticoid vào chế phẩm đông dược. Năm
2011, Lê Đào Khánh Long và các cộng sự đã phát hiện trong 26 mẫu đông dược lấy từ
thị trường phát hiện có 7 mẫu (22%) có betamethason hoặc dexamethason acetat [10].
Trịnh Thị Quy đã tiến hành phân tích 12 mẫu khảo sát thì phát hiện có 3 mẫu trộn trái
phép dexamethason và dexamethason acetat [15]. Năm 2017, nghiên cứu của Trần Thị
Hoàng Chi và cộng sự đã khảo sát 8 mẫu chế phẩm đông dược thì có 6 mẫu dương tính
với dexamethason acetat và betamethason với hàm lượng trong khoảng 0,029 mg – 0,130
mg/g chế phẩm [5]. Các sản phẩm có trộn corticoid của các nghiên cứu trên chủ yếu là
sản phẩm thuốc gia truyền, không có số đăng ký, gây khó khăn cho cơ quan chức năng để
xử lý, do đó có thể gây tác hại lớn cho những người sử dụng.
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
Hormon vỏ thượng thận gồm 3 loại: Mineral corticoid (có tác dụng trao đổi chủ yếu
lên chất khoáng), glucocorticoid (có tác dụng chủ yếu lên trao đổi hydrat carbon) và các
steroid sinh dục. Glucocorticoid tự nhiên do vùng bó vỏ thượng thận sản xuất ra gồm 2

chất hydrocortison và cortison. Glucocorticoid tổng hợp gồm rất nhiều chất khác nhau
được nghiên cứu biến đổi công thức để cải thiện tác dụng, kéo dài thời gian tác dụng và
giảm tác dụng phụ [3].
1.2.1. Tác dụng
Ở nồng độ sinh lý các chất này cần cho cân bằng nội môi, tăng sức chống đỡ của cơ
thể với stress và duy trì các chức năng khác của cơ thể như tác dụng trên chuyển hóa, trên
các cơ quan và tuyến, ức chế miễn dịch,… Trong đó tác dụng chống viêm, chống dị ứng
hay được áp dụng trong điều trị một số bệnh mãn tính như thấp khớp, hen phế quản, viêm
xoang,… [2], [3].

5


Hình 1.1. Sơ đồ cơ chế chống viêm của glucocorticoid
1.2.2. Tác dụng không mong muốn
Phù, loét dạ dày tá tràng, suy thượng thận, tác dụng trên sự tăng trưởng của trẻ em,...
Những tác dụng này thường gặp ở những người dùng thuốc lâu dài hoặc dùng quá liều.
Tác dụng không mong muốn hay gặp:
- Suy tuyến thượng thận do khi dùng thuốc, glucocorticoid từ ngoài vào cơ thể sẽ làm
ức chế tuyến thượng thận bài tiết, dẫn đến tình trạng suy giảm khả năng bài tiết
glucocorticoid của chính cơ thể người đó. Lúc đó cơ thể hay mệt mỏi, nôn ói, nặng hơn
nữa có thể gây huyết áp thấp hay tụt huyết áp.
- Tăng cân do giữ muối nước, cơ thể bệnh nhân mập ra, bụng to, chân tay teo lại, da
mỏng dễ bầm máu, nứt da bụng,...
- Loét dạ dày tá tràng, loãng xương.
- Gây hại cho thai nhi.
- Làm trẻ em chậm phát triển chiều cao [2].
1.2.3. Chỉ định
Điều trị thay thế khi vỏ thượng thân không tiết đủ hormon, các bệnh tự miễn, dị ứng,
sốc phản vệ, hen phế quản, viêm cơ khớp, viêm da,...[3].

1.2.4. Cấu trúc, tính chất vật lý

6


Bảng 1.1. Cấu trúc, tính chất vật lý của các thuốc corticoid [2], [7]
Tên chất
Betamethason

Công thức hóa học,cấu trúc hóa học
C22H29FO5 (M= 392,5)

Tính tan, liều dùng
Tính tan: Không tan trong
nước, ít tan trong ethanol

(BETA)

96%,

rất

ít

tan

trong

methylen clorid.
Hấp thụ UV với max = 238,5

nm/ethanol 96%
Liều dùng: 0,5 – 5 mg/ngày.
Dexamethason

C24H31FO6 (M= 434,5)

Tính tan: Không tan trong

acetat

nước, tan tốt trong aceton,

(DEXA)

cồn, hơi tan trong methylen
clorid.
Hấp thụ UV với max = 238,5
nm/ethanol 96%
Liều

dùng:

0,75

–

9

mg/ngày.
Hydrocortison

C23H32O6 (M= 404,503)

Tính tan: Không tan trong

acetat

nước, khó tan trong ethanol

(HYRO)

và methylen clorid.
Hấp thụ UV với max = 241,5
nm/ethanol 96%
Liều dùng: 5 – 50 mg/ngày.

Prednisolon

C21H28O5 (M= 360,45)

Tính tan: Không tan trong
nước, hơi tan trong ethanol

(PREL)

và methylen clorid.
Hấp thụ UV với max = 243,5
nm/ethanol 96%
Liều dùng: 5 – 60 mg/ngày.
7

Prednison

C21H26O5 (M= 358,43)

Tính tan: Không tan trong

(PREN)

nước, khó tan trong ethanol
96% và methylen clorid.
Hấp thụ UV với max = 238
nm/ethanol 96%.
Liều dùng: 5 – 30 mg/ngày.

1.3. Một số nghiên cứu phát hiện corticoid trộn trái phép trong chế phẩm đông dược
1.3.1. Trên thế giới
Nghiên cứu phát hiện và xác định các thuốc tân dược trộn trái phép trong chế phẩm
đông được đã và đang thu hút được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới. Nhiều phương
pháp phân tích khác nhau đã được ứng dụng như TLC; HPLC, LC-MS/MS. Các phương
pháp phổ biến xác định các corticoid trộn trong chế phẩm đông dược đã được tổng hợp
trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Các nghiên cứu xác định một số corticoid trong chế phẩm đông dược
Dạng

Hoạt chất

Phương pháp

bào chế

(LOD)

xử lý mẫu

Viên

Dexamethason

Phương pháp phân tích

Chiết trực tiếp

TLC [32]

nang, bột, (0,5 mg/ml)

Dung môi: MeOH

Bản mỏng: Silica gel 60 F254

viên nén,

Tác động: Siêu âm

Hệ dung môi triển khai:

Prednisolon

Dicloromethan – methanol (9:1)

trà túi lọc (0,5 mg/ml)

Phát hiện vết: soi UV (254 nm)
Chiết trực tiếp

TLC – spectrophotodensitometry

phẩm

Dung môi: Ethanol

[39]

đông

Tác động: Lắc

Bản mỏng: Silica gel F 254

Bột chế

Dexamethason

dược

Hệ dung môi triển khai: Cloroform
- methanol (9:1)
Phát hiện: Soi UV (254 nm)

Viên nén

Dexamethason

Chiết trực tiếp
8

HPLC [35]


(129 ng/ml)

Dung môi: H2O

Cột: Cyano (250 × 4,6 mm; 5

Tác động: Siêu âm

μm)
Pha động: Acid phosphoric 0,1% và
acetonitril (80:20) (gradient)
Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

Viên

Dexamethason

Chiết trực tiếp

UHPLC-Q-Orbitrap HRMS [40]

nang

Betamethason

Dung môi: MeOH

Cột: C18 (100 × 2,1 mm, 1,9 μm)

Prednison

Tác động: Lắc

Pha động: hệ A: 0,1% formic acid –

Hydrocortison

xoáy, siêu âm, ly

H2O và hệ B: 0,1% formic acid và

Prednisolon

tâm

acetonitril (gradient)

(Đều 1 ng/ml)

Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

Viên

Dexamethason

Chiết trực tiếp

LC-MS/TOF [37]

nang,

(35 ng/ml)

Dung môi: MeOH

Cột: C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm)

viên nén,

– nước (80 : 20)

Pha động: MeOH và amoni

bột dược

Tác động: Siêu âm, acetat 0,01M (gradient)

liệu

ly tâm

Tốc độ dòng: 1 ml/phút

Chiết trực tiếp

LC-MS/MS [18]

nang, bột, Methyl-

Dung môi: MeOH

Cột: C18 (50 × 4,6 mm; 3,0 μm)

viên nén,

Tác động: Siêu âm

Pha động: Acid formic 1% và ACN

Viên

Prednisolon

prednisolon

dung dịch

(gradient)
Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút

Viên

Betamethason

Chiết trực tiếp

LC-MS/MS [20]

nang,

(0,1 ng/ml)

Dung môi: MeOH

Cột: Superspher 100 RP-18 (125 ×

viên nén,

Hydrocortison

hoặc isopropanol :

3 mm; 4 µm),

bột, dung

(0,3 ng/ml)

dicloromethan

Pha động: ACN và đệm amoni

dịch

Prednisolon

(1:9).

format 10 mM (pH 3,0) (gradient)

(0,05 ng/ml)

Tác động: Siêu âm,

Prednison

lắc quay, ly tâm

(0,1 ng/ml)
9


Như vậy, các thuốc corticoid trộn trái phép trong chế phẩm đông dược đã được phân
tích ở nhiều nước trên thế giới với nhiều phương pháp khác nhau nhưng chưa có nhiều
nghiên cứu áp dụng phương pháp HPTLC. Các corticoid thường được phân tích là:
betamethason, dexamethason, hydrocortison, prednisolon và prednison. Phương pháp
TLC có LOD của các chất cao (0,5 mg/ml), còn với các phương pháp như HPLC, LC –
MS//MS có LOD các chất thấp (0,05 - 129 ng/ml) nhưng sử dụng cột sắc ký, dung môi
pha động đắt tiền và thời gian phân tích dài.

1.3.2. Tại Việt Nam
Trước thực tế đặt ra, nhiều nhóm nghiên cứu tại Việt Nam đã xây dựng các phương
pháp phát hiện corticoid trộn trái phép trong chế phẩm đông dược. Lê Đào Khánh Long
và cộng sự tiến hành định tính đồng thời 5 corticoid: Betamethason, dexamethason,
prednison, prednisolon và hydrocortison trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương
pháp TLC. Nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết siêu âm kết hợp với chiết phân bố
lỏng – lỏng để chiết corticoid ra khỏi chế phẩm. Nghiên cứu xây dựng được 5 hệ dung
môi để tách các corticoid ra khỏi hỗn hợp. Phát hiện bằng thuốc thử xanh tetrazolium và
thuốc thử H2SO4/cồn có formaldehyd [10].
Gần đây, đã có một số nghiên cứu tiến hành định tính, định lượng các thuốc
corticoid trên hệ thống HPLC. Trần Thị Hoàng Chi và cộng sự đã tiến hành định tính,
định lượng dexamethason acetat và betamethason trộn trái phép trong chế phẩm đông
dược bằng HPLC. Điều kiện sắc ký gồm cột C18 (250 × 4,6 mm; 5 μm), pha động gồm
nước và acetonitril (55:45), bước sóng phát hiện 240 nm, điều nhiệt cột 30oC. LOD
dexamethason acetat và betamethason đều là 0,5 µg/ml [5].
Trịnh Thị Quy đã tiến hành phân tích 3 glucocorticoid (dexamethason, prednisolon
acetat, dexamethason acetat) trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp
HPLC - DAD. Điều kiện sắc ký là cột C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm), bước sóng 240 nm, pha
động acetonitril – nước (35:65). LOD của dexamethason, prednisolon acetat,
dexamethason acetat lần lượt là 0,45; 0,43 và 0,41 µg/ml [15].
Đào Văn Đôn và cộng sự đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời dexamethason
acetat, betamethason và prednisolon bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột sắc ký
Gemini C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm), detector UV, pha động acetonitril - nước (45:55), tốc
10


độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl. Quy trình có thể ứng dụng để kiểm tra các
chế phẩm đông dược trên thị trường; tuy nhiên, chỉ giới hạn với 3 chất dexamethason
acetat, betamethason và prednisolon [6].
Nguyễn Quang Nam đã tiến hành phát hiện nhanh một số corticoid pha trộn trái

phép trong chế phẩm đông dược bằng kĩ thuật khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực tiếp.
Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện vận hành thiết bị khối phổ Quatromicro API ở cả 2 chế
độ ghi ESI (+) và ESI (-) từ đó xác định điều kiện chung áp dụng cho định tính phát hiện
các corticoid [14]. Một nghiên cứu khác của Đào Thị Cẩm Minh, Thái Khoa Bảo Châu và
cộng sự đã xây dựng quy trình phát hiện đồng thời một số thuốc giảm đau, chống viêm
trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC - MS/MS. Nghiên cứu sử dụng cột
Restek Ultra II C18 (100 mm × 2,1 mm; 1,9 µm), tốc độ dòng: 0,3 ml/phút. Thời gian
phân tích 12 phút. LOD của betamethason, dexamethason acetat, hydrocortison acetat,
prednisolon và prednison lần lượt là 0,23 ng/ml; 0,46 ng/ml; 0,61 ng/ml; 0,30 ng/ml và
0,23 ng/ml [12]. Đây là những phương pháp hiện đại để phát hiện các chất trộn trái phép
trong chế phẩm đông dược.
Có thể thấy tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện corticoid trộn trái phép
trong chế phẩm đông dược bằng TLC, LC - MS/MS và đặc biệt là HPLC. Tuy nhiên,
chúng tôi chưa tìm được nhóm nghiên cứu nào sử dụng phương pháp HPTLC để định
tính, định lượng corticoid trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược.
Hiện nay, phương pháp phân tích HPTLC là một phương pháp hiện đại đang từng
bước được ứng dụng tại Việt Nam. Đã có một số nghiên cứu ứng dụng HPTLC để xác
định các thuốc giảm đau, chống viêm; ức chế men phosphodiesterase - 5 trộn trái phép
trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC [8], [11]. Nhận thấy HPTLC là kĩ thuật phân
tích có độ nhạy cao hơn TLC, ít sử dụng dung môi đắt tiền như phương pháp HPLC hay
LC – MS, có khả năng phân tích đồng thời nhiều mẫu nhưng chưa được ứng dụng trong
nước để phân tích các corticoid trong chế phẩm đông dược. Do đó, trong đề tài này,
chúng tôi sử dụng HPTLC để xác định 5 corticoid trộn trái phép trong chế phẩm đông
dược.
1.4. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
11


Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật sắc ký dùng để tách các chất trong hỗn hợp

nhiều thành phần, được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trên đó đã có
hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10 - 30 µm,
được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất, dày khoảng 250 µm trên giá đỡ
làm bằng thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là
silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex,... trong đó được dùng
phổ biến nhất là silica (SiO 2 ) và nhôm oxyd.
Pha động thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký. Cơ chế tách có thể là hấp phụ,
phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế, tùy
thuộc vào tính chất của hai pha. Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2 - 3 dung
môi. Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn. Các chất phân tích sẽ di
chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng
được tách riêng, có vị trí khác nhau trên bản mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ
di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf. Trị số này được tính bằng tỷ lệ
giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và quãng đường di chuyển của pha
động [1], [7].
Rf = dR /dM
dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên
cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
Rf : có giá trị dao động giữa 0 và 1.
TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu điểm như:
thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh, phát hiện được tất cả các chất kể cả
các chất không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm xuất phát); thực hiện tách dễ
dàng các mẫu có nhiều thành phần. Có thể thực hiện sắc ký đồng thời 10 - 20 mẫu
hoặc hơn, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn. Phương pháp này cho phép bán
định lượng nhanh các thành phần trong thuốc nên thường dùng để đánh giá nhanh
chất lượng của thuốc. Ngoài ra, phương pháp cho phép cung cấp hình ảnh sắc ký đồ
làm dấu vân tay cho mỗi thuốc, do đó thích hợp cho việc kiểm tra độ tinh khiết của
thuốc và phát hiện thuốc giả [1].
12

1.4.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
1.4.2.1. Khái niệm
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tiên tiến của TLC.
HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp, đảm bảo độ tin cậy, độ lặp lại cao
nhất các số liệu đưa ra. Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại
và kiểm soát chặt chẽ. Các bước của quá trình tiêm mẫu, khai triển, nhận diện vết
được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể
gặp trong quá trình phân tích. Một vài thông số giữa HPTLC và TLC được so sánh
trong Bảng 1.3.
Bảng 1.3. So sánh một vài thông số giữa HPTLC và TLC [19], [38]
Tham số

HPTLC

TLC

Kỹ thuật

Tự động/ Bán tự động

Thủ công

Kích thước hạt trung bình

5 - 6 µm

10 - 30 µm

Độ dày lớp pha tĩnh

100 µm

250 µm

Hiệu lực tách

Cao

Thấp hơn

Thời gian phân tích

Nhanh

Chậm hơn

Dụng cụ tiêm mẫu

Kim tiêm

Mao quản, pipet

Sai số tiêm mẫu

0,5 - 2%

2 - 10%

Thể tích tiêm

0,1 - 500 µL

1 - 10 µL

Kích thước vết

Kiểm soát được

Không kiểm soát được

Dải bước sóng phát hiện

200 - 800 nm

254 nm, 365 nm hoặc ánh
sáng thường

Phân tích phổ

Có

Không

Giới hạn phát hiện

100 – 500 pg

1 – 5 ng

1.4.2.2. Thiết bị và nguyên vật liệu dùng trong hệ thống
- Bản mỏng: Sử dụng bản mỏng có kích thước 20x10 cm, được phủ đều lớp mỏng các
hạt có đường kính trung bình 5 - 6 µm giúp tăng độ phân giải và độ nhạy. Các tấm
HPTLC cần được bảo quản trong các điều kiện thích hợp. Trước khi sử dụng, các tấm cần
được kiểm tra dưới ánh sáng trắng và UV để phát hiện hư hỏng và các tạp chất hấp phụ.
13


Bản mỏng được sấy ở 110oC trong 30 phút để hoạt hóa trước khi sử dụng. Ngoài ra, các
bản mỏng này còn được khuyến khích rửa bằng methanol (có thể là hỗn hợp methanol ethyl acetat hay chính dung môi pha động) để tăng khả năng lặp lại của kết quả.
- Thiết bị chấm mẫu tự động (Linomat 5): Quá trình phun mẫu được tiến hành tự động
hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ
và được chấm thành “dải” với độ rộng có thể điều chỉnh.
- Thiết bị khai triển tự động (ADC2): Bộ phận kiểm soát độ ẩm và hệ thống kín của
thiết bị giúp kiểm soát chặt chẽ độ ẩm, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa
các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Bản mỏng cũng sẽ
được sấy trước và sau khi khai triển trong thiết bị.
- Thiết bị thu nhận và xử lý kết quả (Scanner): Máy scanner được kết nối với hệ thống
phần mềm máy tính, có hệ thống đèn với bước sóng từ 200 – 800 nm, tốc độ quét là 20
mm/s. Máy quét không chỉ ghi lại sự hiện diện của các vết, nó cũng có thể định lượng
cường độ ánh sáng phản xạ từ các vết trên bên mỏng, do đó có thể giúp phân tích định
tính và định lượng các vết trên bản mỏng [19], [38].
1.4.2.3. Quá trình phân tích bằng HPTLC

14


Hình 1.2. Quy trình phân tích và các thiết bị trong HPTLC [38]
1.4.2.4. Ưu, nhược điểm của HPTLC

✓ Ưu điểm
-

Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng, do bộ phận scanner có thể ghi lại

phổ hấp thụ của chất, nên định tính đặc hiệu hơn so với TLC thông thường, định lượng
chính xác hơn so với chụp ảnh và đo mật độ màu của vết.
- Trong một lần khai triển sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng lúc, tiết
kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao. Thời gian và chi phí cho mỗi lần
phân tích thấp.
- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc ký,
khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao,
hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích.
- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước như lọc và khử khí, lượng dung môi
pha động tiêu thụ cho mỗi mẫu thấp.
15


- Về mặt kỹ thuật, rất đơn giản để tìm hiểu và vận hành.
- Pha tĩnh có độ chọn lọc cao để tách các thành phần trong hỗn hợp nhiều chất [38].
✓ Nhược điểm
Nền mẫu đông dược rất phức tạp, thành phần đa dạng, các thành phần trong dược
liệu có thể xuất hiện tại vị trí phát hiện chất phân tích nên có thể xảy ra hiện tượng dương
tính giả hoặc âm tính giả khi phương pháp không đáp ứng về độ nhạy [38].
1.4.2.5. Ứng dụng của HPTLC
HPTLC là một phương pháp kỹ thuật tiên tiến, đang có ứng dụng tích cực trong
phân tích định tính và định lượng một loạt các hợp chất, đặc biệt với các thảo dược, thực
phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc thảo dược [38].

16

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
ST
T

Nguyên vật liệu

Tiêu
chuẩn

Nguồn gốc
Chất chuẩn

1
2
3

Betamethason
Dexamthason
acetat
Hydrocortison
acetat

4

Prednisolon

5

Prednison

6
7
8
9
10
11
12

Cloroform
Ethyl acetat
Ethanol tuyệt đối
Methanol
Ethanol 96%
Ether dầu hỏa
N – hexan

Chuẩn
QG
Chuẩn
QG
Chuẩn
QG
Chuẩn
QG
Chuẩn

QG
AR
AR
AR
AR
AR
AR
AR

Chuẩn VKNTTW
SKS: 0214124.01; HL: 100,42%; Độ ẩm: 0,52%
Chuẩn VKNTTW
SKS: 0200014; HL: 99,7%; Độ ẩm: 0,1%
Chuẩn VKNTTW
SKS: 0198038; HL: 99,2%; Độ ẩm: 0,1%
Chuẩn VKNTTW
SKS: 0296024; HL: 99,94%; Độ ẩm: 0,2%
Chuẩn VKNTTW
SKS: WS.0217235.02; HL: 99,19%; Độ ẩm 0,13%
Dung môi
Việt Nam
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
...

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

-

Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200
(Thuỵ Sỹ): bộ phận chấm bán tự động, bộ phận khai triển tự động. Phần mềm điều
khiển winCATs: Quét bản mỏng, thu nhận các vết sắc ký đồ, xử lý dữ liệu trên máy
tính.

-

Bản mỏng TLC và HPTLC silica gel 60 F254 của Merck (Đức)

-

Cân phân tích XPE105 Mettler Toledo (d=0,01mg) (Thụy Sĩ)

-

Cân phân tích Sartorius TE 214S (d=0,1 mg) (Đức).

-

Máy lắc xoáy Labinco BV L46 (Hà Lan)

-

Máy siêu âm D-78224 Singen/Htw (Đức)
17