Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn dichlomethane loài dó đất (balanophora fungosa subsp indica (arn ) b hansen)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
……&&&……

NGUYỄN THỊ HẢI

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
PHÂN ĐOẠN DICHLOMETHANE
LOÀI DÓ ĐẤT (BLANNOPHORA
FUNGOSA SUBSP. INDICA
(ARN.) B. HANSEN)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

HÀ NỘI - 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
……&&&……

NGUYỄN THỊ HẢI

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
PHÂN ĐOẠN DICHLOMETHANE
LOÀI DÓ ĐẤT (BLANNOPHORA
FUNGOSA SUBSP. INDICA
(ARN.) B. HANSEN)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

TS. BÙI HỮU TÀI

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thiện đƣợc khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực
không ngừng của bản thân, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy
giáo PGS.TS Nguyễn Văn Bằng và các thầy cô khoa hóa học, trƣờng đại học
sƣ phạm Hà Nội 2 đã luôn quan tâm và tận tình truyền đạt những kiến thức
quý báu cho em trong suốt thời gian qua.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Bùi Hữu Tài ngƣời đã trực
tiếp hƣớng dẫn, cùng các thầy cô phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa
sinh Biển-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt
nghiệp này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể gia đình, bạn
bè, những ngƣời vẫn luôn quan tâm, động viên và đồng thời là chỗ dựa tinh
thần giúp em hoàn thành tốt nhiệm vụ đƣợc giao trong suốt thời gian học tập
và quá trình nghiên cứu thực hiện khóa luận tốt nghiệp vừa qua.
Hà nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Thị Hải


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt

Viết đầy đủ (Tiếng Anh)

Viết đầy đủ (Tiếng Việt)

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance

Cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon

1H-NMR

Cộng hƣởng từ hạt nhân proton

Proton Nuclear Magnetic

13

Resonance
CC

Column chromatography

Sắc kí cột

DEPT

Distortionless Enhancement

Distortionless Enhancement by

by Polarisation Transfer

Polarisation Transfer

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Dimethyl sulfoxide

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

ESI-MS

Electrospray Ionization Mass

Phổ khối lƣợng ion hóa phun

Spectrometry

mù điện

EtOAc

Ethyl acetate

Etyl axetat

HMBC

Heteronuclear mutiple Bond

Tƣơng tác dị hạt nhân qua

Connectivity

nhiều liên kết

High-performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC

Chromatography
HR-ESI-

High Resolution Electrospray

Phổ khối lƣợng phân giải cao

MS

Ionization Mass Spectrometry

ion hóa phun mù điện

HSQC

Heteronuclear Single-

Tƣơng tác dị hạt nhân qua 1

Quantum Coherence

liên kết

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lƣợng

RP-18

Reserve phase C-18

Chất hấp phụ pha đảo C-18

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

TMS

Tetramethylsilane

Tetramethylsilane


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về cây Dó đất ......................................................................... 3
1.1.1. Thực vật học .......................................................................................... 3
1.1.2. Mô tả cây Dó đất ................................................................................... 5
1.1.3. Phân bố và sinh thái .............................................................................. 6
1.1.4. Bộ phận dùng ........................................................................................ 6
1.1.5. Tính vị và công dụng ............................................................................. 6
1.1.6. Thành phần hóa học .............................................................................. 6
1.1.7. Hoạt tính sinh học ............................................................................... 11
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp chiết mẫu thực vật ..................................... 12
1.2.1. Chọn dung môi chiết ........................................................................... 13
1.2.2. Quá trình chiết .................................................................................... 14
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký ........................................................ 15
1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký .......................................... 16

1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký ........................................................... 16
1.3.3. Phân loại phương pháp sắc ký ............................................................ 16
1.3.3.1. Sắc ký cột.......................................................................................... 17
1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng ............................................................................... 17
1.4. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ ........ 18
1.4.1. Phổ hồng ngoại (IR) ............................................................................ 19
1.4.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)................................................... 19
1.4.2.1. Phổ 1H-NMR .................................................................................... 20
1.4.2.2. Phổ 13C-NMR ................................................................................... 20
1.4.2.3. Phổ DEPT ........................................................................................ 20
1.4.2.4. Phổ 2D-NMR .................................................................................... 20


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .............................................................................................. 22
2.1. Mẫu thực vật........................................................................................... 22
2.2. Các phƣơng pháp phân lập các hợp chất................................................ 22
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ...................................................................... 22
2.2.2. Sắc ký cột (CC).................................................................................... 22
2.3. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất. ................................ 22
2.4. Dụng cụ và hóa chất ............................................................................... 23
2.4.1. Dụng cụ ............................................................................................... 23
2.4.2. Hóa chất ............................................................................................. 23
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ........................................... 24
3.1. Phân lập các hợp chất ............................................................................. 24
3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất ..................................... 27
3.2.1. Hợp chất BF1 ...................................................................................... 27
3.2.2. Hợp chất BF2 ...................................................................................... 27
3.2.3. Hợp chất BF3 ...................................................................................... 27
CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ....................................................... 29

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF1 (Isolariciresinol) ........... 29
4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF2 (Salicifoliol) .................. 34
4.3. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF3 (Dihydroconiferyl
alcohol).......................................................................................................... 37
KẾT LUẬN ................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 42


DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF1 và hợp chất tham khảo .... 33
Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF2 và hợp chất tham khảo .... 37
Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo .... 40


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ cây Dó đất..................................... 24
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất BF1 – BF3 ..................................... 26
Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora ................................. 4
Hình 1.2. Một số hình ảnh về loài B. fungosa subsp. indica .......................... 5
Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF1 ................................................ 29
Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF1 ............................................... 30
Hình 4.1.3. Phổ HSQC của hợp chất BF1 .................................................... 31
Hình 4.1.4. Phổ HMBC của hợp chất BF1 ................................................... 32
Hình 4.1.5. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất
BF1 ..................................................................................................... 32
Hình 4.2.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất BF2 ........................................... 34
Hình 4.2.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF2 ............................................... 34
Hình 4.2.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF2 ............................................... 35
Hình 4.2.4. Phổ HSQC của hợp chất BF2 .................................................... 36

Hình 4.3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF3 ................................................ 38
Hình 4.3.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 ............................................... 38
Hình 4.3.3. Phổ HSQC của hợp chất BF3 .................................................... 39
Hình 4.3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo BF3a
............................................................................................................ 40


MỞ ĐẦU
Là một quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam
có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực
vật bậc cao khác nhau. Thiên nhiên thuận lợi là điều kiện cho sự phát triển đa
dạng của hệ thực vật. Thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dƣỡng cho
con ngƣời mà còn là những phƣơng thuốc chữa bệnh hết sức quý giá. Việc
nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ nguồn thực vật
này để ứng dụng trong Y học, nông nghiệp và các mục đích khác nhau trong
cuộc sống của con ngƣời là một trong những nhiệm vụ quan trọng và đang
đƣợc các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc quan tâm.
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, nền Y học cổ
truyền dân tộc với các phƣơng thuốc đông y cùng với y học hiện đại đã và
đang có những đóng góp to lớn trong việc phòng và chữa bệnh cho con ngƣời,
nâng cao chất lƣợng cuộc sống. Chính vì vậy việc nghiên cứu hóa học của các
loài cây thuốc có ý nghĩa vô cùng quan trọng nhằm làm cơ sở khoa học cho
việc sử dụng nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất và mang lại giá trị sử
dụng và hiệu quả kinh tế của dƣợc liệu.
Cây Dó đất (hay còn gọi là Tỏa dƣơng, Nấm ngọc cẩu) có tên khoa học
là Balanophora fungosa subsp. indica là loại cây sống ký sinh, đƣợc dùng
trong một số bài thuốc dân gian với tác dụng bổ máu, kích thích ăn ngon
miệng, phục hồi sức khỏe nhanh,..... Hiện nay, chúng là loài bị săn tìm ráo riết
để phục vụ cho những bài thuốc tăng cƣờng sinh lực nên có thể dẫn đến nguy
cơ cạn kiệt, một số loài thuộc chi dó đất đã nằm trong sách đỏ của Việt Nam.

Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học và phát hiện các hoạt chất
của loài dó đất mang nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn, vừa tạo cơ sở giải
thích công dụng dân gian của loài, vừa tạo cơ sở để đánh giá hiệu quả kinh tế
của nó.

1


Xuất phát từ thực tiễn trên, tôi lựa chọn và thực hiện đề tài “Khảo sát
thành phần hóa học phân đoạn dichlomethane loài Dó đất (Balanophora
fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)” nhằm tìm hiểu kĩ hơn về hóa học
của loài dó đất, góp phần nâng cao kiến thức bản thân, đồng thời có cách nhìn
khái quát về vấn đề nghiên cứu.
Nhiệm vụ của đề tài là:
1. Xử lý mẫu và tạo dịch chiết
2. Phân lập các hợp chất từ phân đoạn dichlomethane loài dó đất.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Dó đất
1.1.1. Thực vật học
Theo khóa phân loại thực vật, chi Balanophora hay còn gọi là chi Dó đất
có vị trí phân loại nhƣ sau:
+ Ngành: Mộc lan – Magnoliphyta
+ Lớp: Hai lá mầm – Magnoliopsida
+ Bộ: Đàn hƣơng – Santalales
+ Họ: Dó đất, Dƣơng đài – Balanophoraceae

+ Chi: Dó đất – Balanophora
Các loài thuộc chi Balanophora là một loại thực vật hạt kín sống trong
khu vực cận nhiệt đới. Họ Dó đất bao gồm các loại thực vật thân thảo, sống
một năm hay nhiều năm, ký sinh bắt buộc, đáng chú ý vì sự phát triển thất
thƣờng và các mối quan hệ không rõ ràng vật chủ-vật ký sinh. Các loài cây
này thông thƣờng đƣợc tìm thấy trong các khu rừng ẩm ƣớt, mọc trên rễ các
cây khác và có cụm hoa nằm trên mặt đất với bề ngoài tổng thể trông giống
nhƣ nấm, bao gồm vô số hoa nhỏ, màu nâu, hồng hay hơi tía. Các cụm hoa
phát triển bên trong phần ngầm dƣới đất dạng củ của cây, trƣớc khi tách khỏi
nó và xuất hiện trên bề mặt. Phần ngầm dƣới đất gắn với vật chủ, trông giống
nhƣ củ, to cỡ nhƣ quả dứa và không phải là rễ hoàn hảo. Các loài thực vật này
không có diệp lục. Lá suy giảm nhiều hay không có. Nếu có thì các lá này
dƣới dạng màng nhầy.
Trên thế giới, chi Balanophora đã ghi nhận có khoảng 120 loài, phân
bố ở vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới Châu Á và Châu Úc [21]. Chi Dó đất ở
Việt Nam có khoảng 7 loài, trong đó có một số loài thƣờng gặp và đƣợc sử
dụng làm thuốc nhƣ: Balanophora fungosa, B. laxiflora, B. latisepala, B.

3


polyandra, B. cucphuongensis. Nhiều loài thuộc chi Dó đất đƣợc các nhà
khoa học nghiên cứu sử dụng làm thuốc chữa bệnh nhƣ: trĩ nội, trĩ ngoại, làm
thuốc tăng cƣờng sinh lực,..... Ở Việt Nam ngƣời dân tộc miền núi thƣờng
dùng cụm hoa làm thuốc bổ, có tác dụng mạnh gân cốt, giúp cơ thể cƣờng
tráng, chữa đau bụng, nhức mỏi chân tay. Ngƣời dân thƣờng dùng dƣới dạng
thuốc sắc nƣớc hoặc ngâm rƣợu [2].

B. cucphuongensis

B. Fungosa

B. latisepala

B. polyandra

B. laxiflora
Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora

4


1.1.2. Mô tả cây Dó đất
Dó đất có tên khoa học là Balanophora fungosa subsp. indica, thuộc họ
Dó đất – Balanophoraceae.
Tên gọi khác: Xà cô, Dƣơng đài, Nấm ngọc cẩu, Chu ca ra.
Dó đất là thực vật có hoa đặc biệt, sống kí sinh trên rễ của nhiều loại
cây gỗ lớn trong rừng ẩm, không có diệp lục, thân thoái hóa thành một củ
nhỏ, có kích thƣớc và hình dạng khác nhau, thƣờng gồm nhiều thùy, sần sùi,
màu nâu sẫm, không có lá hay chỉ có lá vẩy, đến khi sinh sản thì cụm hoa của
nó mới lộ ra trên mặt đất. Tùy từng loài, cây Dó đất có hoa đơn tính cùng gốc
hay khác gốc. Cụm hoa đực dài hình trụ, trụ hoa ở gốc có lá không có diệp
lục, bao hoa có 4-7 thùy; nhị có 4-7 bao phấn hình móng ngựa. Cụm hoa cái
ngắn, hình thoi hay hình trứng dài 5-7 cm, mang rất nhiều hoa cực nhỏ, không
có bao hoa. Thụ phấn nhờ côn trùng. Mùa hoa thƣờng vào tháng 11 đến tháng
2 năm sau. Hoa rất thơm, tỏa hƣơng vào chiều tối và sáng sớm [1].

Hình 1.2. Một số hình ảnh về loài B. fungosa subsp. indica
5

1.1.3. Phân bố và sinh thái
Cây Dó đất mọc dải rác trong các rừng cây lá rộng, nơi ẩm, ở độ cao
500 – 2600 m, nó sống ký sinh trên rễ của nhiều loại cây thân gỗ, kể cả cây gỗ
dây leo, nhƣ các loài Cissus, Tetrastigma trong họ Nho và nhiều loại cây họ
Đậu ở các vùng rừng núi Hòa Bình, Lào Cai, Lâm Đồng, Khánh Hòa.....
1.1.4. Bộ phận dùng
Theo các bài thuốc dân gian, Dó đất đƣợc sử dụng cả cây. Có thể ngâm
rƣợu hoặc sắc nƣớc uống.
1.1.5. Tính vị và công dụng
Tính vị: Có vị ngọt, có tác dụng giảm nhẹ tác hại rƣợu đối với tế bào gan.
Công dụng: Dó đất là loài giàu dƣợc tính. Có tác dụng dƣợc lí rất đa dạng
nhƣ: giảm đau, kháng viêm, giải độc rƣợu, hạ đƣờng huyết,....
1.1.6. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần
hóa học chính của các loài thuộc chi Balanophora là các hợp chất dạng
polyphenol có chứa nhiều các nhóm caffeoyl, coumaroyl, galloyl,… Các công
trình nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài thuộc chi Balanophora
bắt đầu vào giữa thế kỉ 20, khởi đầu với công bố phân lập một số hợp chất
triterpen từ loài B. japonica [23].
Tiếp sau đó, Mitsumara và cộng sự của ông đã thông báo phân lập và
xác định đƣợc một hợp chất neo-lignan, balanophonin (3), và 10 hợp chất
khác (4-13) từ loài B. japonica [4].

6


Một nghiên cứu khác về thành phần hóa học loài B. japonica đã đƣợc
công bố trong khoảng thời gian này, Jiang và cộng sự ngƣời Nhật đã phân lập
và xác định cấu trúc của 34 hợp chất phenolic (19-52) có cấu trúc hóa học đặc

biệt chỉ gồm một đơn vị đƣờng liên kết qua cầu ester với các nhóm phenolic
acid khác nhau gồm caffeic acid, coumaroic acid, galloic acid và
hexahydroxydiphenoic acid [7].

7


Tuy chƣa có các nghiên cứu về phân tích định lƣợng, các hợp chất 19-52
đã có sự phân lập đƣợc với hiệu suất 0.0012-0.7069% (các hợp chất
19,20,22,24-27) so với khối lƣợng mẫu khô từ phần dƣới mặt đất và hiệu suất
0.0014-0.2231% (các hợp chất 19-21, 23, 28-52) từ phần trên mặt đất loài B.
japonica [7].
Tiếp đó, Jiang và cộng sự tiếp tục công bố ba hợp chất balanophotanin
A-C (53-55), các lignan glycoside (56-59); balanophotanin D-G (60-63) từ
loài B. japonica [8, 9]. Các kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đã phát
hiện hợp chất balannophotnanin E diệt tế bào ung thƣ gan tốt nhất, với giá trị
IC50 là 4.22 μM [9].

8


Trong thí nghiệm về sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa (theo phƣơng
pháp DPPH) của các dịch chiết từ các cây thuốc truyền thống, Wang và cộng
sự đã phát hiện dịch chiết 80% acetone từ loài B. polyandra thể hiện khả năng
thu dọn gốc tự do mạnh. Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài này đã
phân lập đƣợc 2 hợp chất, balapolyphorin A-B (64-65), cùng với 20 hợp chất
dạng lignan hoặc phenolic (9, 20, 35, 37, 41, 42, 50-52, 54, 57, 66-74). Các
hợp chất này cũng đã đƣợc đánh giá hoạt tính DPPH, hầu hết các hợp chất
đều thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do với giá trị thu dọn 50% số lƣợng gốc
tự do DPPH (SC50) từ 8.4-68.3 µM [19].

Từ hoa loài Balanophora laxiflora, Ho và cộng sự đã tiến hành nghiên
cứu các thành phần chống oxi hóa bằng hệ thống HPLC kết hợp DPPH. Trong
số các hợp chất phát hiện đƣợc, 5 hợp chất bao gồm: caffeic acid (6), 1-O-(E)caffeoyl-β-D-glucopyranose (20), 1-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose
(19), 1-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose
(46), và 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose
(52) đƣợc xác định là thành phần chống oxi hóa chính của loài này [5]. Một
nghiên cứu khác của She cũng về tác dụng chống oxi hóa đã phân lập và xác
định cấu trúc của 2 hợp chất, balaxiflorins A- B (75, 76) cùng 17 hợp chất

9


phenolic khác (6, 20, 35, 37, 41, 48, 49, 52, 58, 68, 70, 71, 74, 77-80) [15].
Các hợp chất phenolic có chứa nhóm galloyl, cafeoyl, và (S)hexahydroxydiphenoyl (81-89) cũng đƣợc phát hiện thấy có trong thành phần
hóa học của loài B. tobiracola [18].

Từ loài B. harlandii, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc
của hợp chất, 1-O-[(E)-p-coumaroyl]-3-O-galloyl-β-D-glucopyranose (90) và
18 hợp chất (7, 20, 30, 37, 42, 68, 71, 81-83, 86, 87, 91-96). Các hợp chất này
đã đƣợc đánh giá hoạt tính chống oxi hóa DPPH, kết quả cho thấy một số hợp
chất mang khung dihydrochalcone và tannin thể hiện hoạt tính tốt nhất với
giá trị SC50 trong khoảng 8.2-16.2 µM [20].

10


Từ loài B. involucrata, Luo và cộng sự phân lập đƣợc ba hợp chất
phenolic đã biết (11, 71, 72) [12]. Một nghiên cứu khác về thành phần hóa
học loài B. papuana của các nhà khoa học Nhật Bản, Hosoya và cộng sự đã

phân lập đƣợc 2 hợp chất khác có khung dihydrochalcone, papuabalanols A-B
(97, 98). Các hợp chất này đã đƣợc đánh giá hoạt tính hạ huyết áp và ức chế
enzyme tyrosinase [6]. Kết quả cho thấy, hợp chất 97 (100 µM) phát hiện có
tác dụng làm giãn mạch trong khi hợp chất 98 lại có tác dụng ức chế hoạt
động của enzym tyrosinase (33-79%) ở các nồng độ thử nghiệm 12.5, 25, và
50 µM.

Từ kết quả tổng quan các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các nghiên
cứu chủ yếu xuất phát từ các nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản và
Trung Quốc. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Balanophora chủ yếu
là các hợp chất dạng lignan hoặc các phenolic có chứa các nhóm galloyl,
caffeoyl, và hexahydroxydiphenoyl. Tuy vậy, cho đến nay gần nhƣ chƣa có
nghiên cứu về hóa học loài B. fungosa subsp. indica.
1.1.7. Hoạt tính sinh học
Các công bố về hoạt tính sinh học của chi Balanophora có thể khái
quát bao gồm: hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính ức chế hoạt động của
enzyme tyrosinase/α-glucosidase. Trong đó, đáng kể nhất là các công bố về
hoạt tính chống oxi hóa. Ngoài ra, một số hoạt tính khác của các hợp chất phân

11


lập từ chi Balanophora cũng đƣợc nhắc đến nhƣ diệt tế bào ung thƣ, kháng virus
HIV, giãn mạch, ức chế hoạt động của enzyme PTP1B trên chuột [21].
a) Hoạt tính chống oxi hóa
Cho đến nay, khá nhiều các công bố chứng minh rằng các hợp chất
phân lập đƣợc từ chi Balanophora có hoạt tính chống oxi hóa mạnh. Phần
lớn các nghiên cứu này thực hiện dựa trên khả năng thu dọn gốc tự do DPPH.
Các tác giả cũng chỉ ra rằng, những hợp chất dạng tanin, hay hợp chất chứa
nhiều nhóm galloyl, catechol thƣờng thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt hơn

cả [15, 19, 20].
b) Ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase, α-glucosidase
Tyrosinase là một enzyme xúc tác cho qua trình oxi hóa tổng hợp ra
melanin, một yếu tố quan trong quyết định sắc tố da. Sự sản sinh quá nhiều
melanin sẽ dẫn đến sạm da, đen da, và đẩy nhanh quá trình lão hóa da. Ngoài
ra, melanin cũng là yếu tố gây ra các vết sạm, nám trên hoa quả. Do đó các
chất ức chế sự hoạt động của enzyme tyrosinase ngoài ý nghĩa ứng dụng làm
trắng da trong mỹ phẩm, nó còn giúp cải thiện chất lƣợng của thực phẩm
trong ngành công nghiệp thực phẩm. Trong nghiên cứu tìm kiếm các chất có
nguồn gốc thiên nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase,
dịch chiết EtOH 50% từ loài B. fungosa thể hiện hoạt tính tốt với giá trị IC50
15.0 µg/mL. Tiếp đó, nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học loài B.
fungosa cho thấy hợp chất phenolic 1-O-(E)-caffeoyl-3-O-galloyl4,6-(S)HHDP-β-D-

glucopyranose và 1-O-(E)-caffeoyl-3,4,6-tri-O-galloyl-β-D-

glucopyranose là những chất thể hiện hoạt tính [14].
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp chiết mẫu thực vật
Mẫu cây sau khi thu hái về đem rửa sạch, để ráo nƣớc sau đó làm khô,
tùy thuộc vào đối tƣợng chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, không
phân cực, chất có độ phân cực trung bình,…) mà ta lựa chọn dung môi và hệ
dung môi khác nhau.

12


1.2.1. Chọn dung môi chiết
Chiết suất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất tan
có trong cây, chủ yếu là các chất đang nghiên cứu, sau đó tách chúng ra khỏi
phần không tan của cây. Chính vì vậy, cần phải có sự hiểu biết về những đặc

tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây đƣợc chiết, từ đó lựa chọn
dung môi thích hợp cho sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành
chất mong muốn.
Dung môi dùng cho các quá trình chiết phải đƣợc lựa chọn rất cẩn thận.
Dung môi phải hòa tan những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ
dàng đƣợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không
độc, không dễ bốc cháy và giá thành phù hợp. Nếu dung môi có lẫn các tạp
chất có thể gây ảnh hƣởng tới hiệu quả và chất lƣợng của quá trình chiết vì
vậy những dung môi này nên đƣợc chƣng cất để đƣợc dạng sạch trƣớc khi sử
dụng. Thƣờng có lẫn một số chất dẻo trong các dung môi nhƣ các
diankinphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar, tributyl phosphat trong quá trình sản
xuất hoặc trong quá trình bảo quản (dung môi trong các thùng chứa nhựa).
Methanol và chlorofrom thƣờng chứa dioctylphtalat [di-(2etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này làm sai lệch kết quả phân lập
trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm
sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom, metylen clorit và
methanol là những dung môi thƣờng đƣợc lựa chọn trong quá trình chiết sơ
bộ một phần của cây nhƣ: lá, thân, rễ, hoa,... Chlorofrom có thể gây tổn
thƣơng cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần thao tác khéo léo,
cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen cloritits
độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hidrocacbon thế clo. Ngƣời ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ

13


thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào.
Ngƣợc lại chlorofrom lại có độ phân cực thấp hơn, nó có thể rửa giải
các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa

phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, các chất
này cũng bị hòa tan đồng thời khi chiết bằng ancol. Trong quá trình chiết sơ
bộ ngƣời ta thƣờng dùng dung môi cồn trong nƣớc.
Ngƣời ta thƣờng ít khi sử dụng nƣớc để thu đƣợc dịch chiết thô từ cây
mà thay vào đó là dung dịch nƣớc của methanol. Đietyl ete hiếm khi đƣợc
dùng cho các quá trình chiết thực vật và nó sẽ bay hơi, bốc cháy và rất độc,
đồng thời nó có xu hƣớng tạo thành peoxit dễ nổ. Peoxit của đietyl ete dễ gây
phản ứng oxi hóa với các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol nhƣ các
carotenoid. Axeton cũng có thể tạo thành axetoit nếu 1,2-sis-diol có mặt trong
môi trƣờng axit. Quá trình chiết dƣới điều kiện axit hoặc bazơ thƣờng đƣợc
dùng với quá trình phân tách đặc trƣng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng
axit- bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn.
Sau khi chiết dung môi đƣợc cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ
không quá 30-40oC, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt
độ cao hơn.
1.2.2. Quá trình chiết
Bằng cách lặp đi lặp lại việc chiết một vài lần, ta có thể tách hoàn toàn
chất cần tinh chế vào dung môi đã chọn, sau đó cất loại dung môi và cất lấy
chất tinh khiết ở nhiệt độ và áp suất thích hợp. Đây là phƣơng pháp đƣợc sử
dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều
công sức và thời gian. Tuy nhiên, trong quá trình chiết một mẫu thực vật chỉ
thực hiện qua ba lần dung môi vì khi đó cặn thu đƣợc hầu nhƣ không còn
chứa những chất giá trị nữa và bình chiết ngâm không đƣợc sử dụng nhƣ

14


phƣơng pháp chiết liên tục bởi mẫu đƣợc ngâm với dung môi trong máy chiết
khoảng 24 giờ, sau đó lấy chất chiết ra. Việc kết thúc quá trình chiết đƣợc xác
định bằng một vài cách nhƣ:

- Với các ankaloid ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này
bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trƣng nhƣ tác nhân
Đragendroff và tác nhân Maye.
- Các flavonoid thƣờng là những chất màu vì vậy dịch chảy ra mà
không có màu thì chứng tỏ đã rửa hết chất này trong quá trình chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và
sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình
chiết.
Ngƣời ta cũng thƣờng chiết một chất từ hỗn hợp rắn bằng một dung
môi hoặc hỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dùng đặc biệt đƣợc gọi
là bình chiết Xoclet. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc hóa hơi. Dung môi
tinh khiết đƣợc đun nóng, cho bay hơi liên tục chảy vào bình chứa hỗn hợp
cần chiết tách, dung môi sẽ hòa tan chất rắn cần tinh chế và nhờ một ống
xiphong, dung dịch chảy suống bình cầu bên dƣới, dung môi nguyên chất lại
tiếp tục đƣợc cất lên. Phƣơng pháp này tiết kiệm đƣợc dung môi và hiệu quả
tƣơng đối cao.
Nhƣ vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì mà ngƣời ta lựa
chọn dung môi phù hợp và thực hiện quá trình chiết hợp lí để đạt đƣợc hiệu
quả cao.
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký
Phƣơng pháp sắc ký là một phƣơng pháp phổ biến và hữu hiệu nhất.
hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các
chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng.

15


1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phƣơng pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa trên sự
phân chia khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc và

không hòa tan lẫn nhau: pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh các
cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tƣơng ứng với tính
chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…). Tốc độ di chuyển của các chất
trong pha động khi tiếp xúc mật thiết một pha tĩnh có sự khác nhau là do khả
năng bị hấp phụ và phản hấp phụ hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của
các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn
qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Từ các
đặc điểm trên mà ngƣời ta có thể tách các chất nhờ quá trình sắc ký.
1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký
Phƣơng pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
hai pha dộng và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ
đơn phân tử đặc biệt langmuir mô tả sự phụ thuộc của lƣợng chất bị hấp phụ lên
pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần)

n

n α .bC
1+bC

Trong đó:
nα

{
1.3.3. Phân loại phương pháp sắc ký
Phƣơng pháp sắc ký là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng khá phổ biến và
rộng rãi. Tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh hay pha động hay cách thức
triển khai sắc ký mà ngƣời ta phân loại thành các phƣơng pháp sắc ký khác

16

nhau nhƣ: sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký cột, sắc
ký, sắc ký lớp mỏng,… Tùy theo mục đích nghiên cứu và đối tƣợng cần phân
lập ngƣời ta lựa chọn những phƣơng pháp sắc ký phù hợp.
1.3.3.1. Sắc ký cột
Sắc ký cột là phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phân lập các hợp chất hữu
cơ từ nguồn tự nhiên. Trong phƣơng pháp này, pha tĩnh là những hạt có kích
thƣớc tƣơng đối lớn (50-150 μm), đƣợc nạp trên các cột thủy tinh. Mẫu chất
cần phân tích đƣợc đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh
che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đƣợc đặt
phía trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phía bên dƣới cột đƣợc hứng vào
những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Pha tĩnh đƣợc nạp lên cột sắc ký
theo hai phƣơng pháp khác nhau là nạp ƣớt hoặc nạp khô.
Phƣơng pháp nạp khô, chất hấp phụ đƣợc đƣa trực tiếp vào cột khi
còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp
xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột
trong suốt.
Phƣơng pháp nạp ƣớt, chất hấp phụ đƣợc hòa tan trong dung môi chạy
cột trƣớc với lƣợng dung môi tối thiểu. Sau đó đƣa dần vào cột đến khi đủ
lƣợng cần thiết. Khi chuẩn bị cột phải lƣu ý không đƣợc để bọt khí bên trong
(nếu có bọt khí gây nên hiện tƣợng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách)
và cột không bị nứt, gãy, dò.
1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) hay còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu
vào hiện tƣợng hấp phụ. Trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn
hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ ví dụ:
silicagel, oxit alumin,… Pha tĩnh đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ
lên trên nền phẳng nhƣ tấm kính hay tấm nhôm. Do chất hấp phụ đƣợc tráng

17