Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến gen germi (o methtrasferase) sinh dẫn xuất kháng sinh demethyl dihydrochalcomycin từ chủng streptomyces SP KCTC 0041BP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

Nguyễn Thị Phương Thảo

Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến gen gerMI
(O-methyltransferase) sinh dẫn xuất kháng sinh Demethyldihydrochalcomycin từ chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
GS. TS. Hoàng Đình Hòa
TS. Tạ Thị Thu Thủy

Hà Nội – Năm 2017


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên tác giả luận văn : Nguyễn Thị Phương Thảo
Đề tài luận văn: “Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến gen gerMI (Omethyltransferase) sinh dẫn xuất kháng sinh Demethyl-dihydrochalcomycin từ
chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP”
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số SV: CA160051
Tác giả, Người hướng dẫn khoa học và Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác
giả đã sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hội đồng ngày 31/10/2017 với
các nội dung sau:

- Bổ sung tổng quan về gen gerMI
- Bổ sung cơ chế tiếp hợp vi khuẩn, xạ khuẩn
- Chỉnh sửa lại phần phương pháp nghiên cứu
- Bổ sung trình tự DNA các đoạn gen vào phần Phụ lục
- Chỉnh sửa các lỗi chính tả, một số thuật ngữ
Hà Nội, Ngày 30 tháng 11 năm 2017
Giáo viên hướng dẫn

GS. TS. Hoàng Đình Hòa

TS. Tạ Thị Thu Thủy
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS. TS. Lê Thanh Hà

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Phương Thảo


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng em với sự giúp đỡ
của tập thể các nhà khoa học. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực
và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Em xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã
được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2017
Tập thể giáo viên hướng dẫn

GS.TS. Hoàng Đình Hòa

TS. Tạ Thị Thu Thủy

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Phương Thảo


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Viện Đào tạo
Sau đại học – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Khoa Công nghệ Sinh học - Viện
Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo GS.TS. Hoàng Đình Hòa –
Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội, cô giáo TS. Tạ Thị Thu
Thủy – Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn các anh chị kỹ thuật viên – Viện Hóa học các hợp
chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi
điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài này.
Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân,
cùng toàn thể bạn bè đã động viên, cổ vũ, khích lệ em trong thời gian thực hiện luận
văn.
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân đã có nhiều cố gắng,
nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên em rất mong nhận được
những góp ý của quý thầy – cô.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2017
Học viên cao học

Nguyễn Thị Phương Thảo


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chú thích

Amp

Ampicillin

Apr

Apramycin

bp

Base paire

C

Carbon

CKS

Chất kháng sinh

Cm

Chloramphenicol

DHC

Dihydrochalcomycin

DMI

Downstream MI

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxyribonucleotides

ORFs

Open reading frames

RNA

Ribonucleic Acid

Gr+

Gram dương

Gr-

Gram âm

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

Kb

Kilobase

Neo

Neomycin

Neor

Gen kháng neomycin

PCR

Polymerase Chain Reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Tet

Tetracycline

TLC

Thin layer chromatography

IPTG

Isopropyl-thio-β-galactoside

UMI

Upstream MI


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.Cấu trúc của DHC ........................................................................................7
Hình 1.2. Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn
thành cấu trúc kháng sinh DHC ................................................................................10
Hình 1.3. Sinh tổng hợp đường khử ở vi sinh vật .....................................................13
Hình 1.4. Dự đoán chức năng gen gerMI trong con đường sinh tổng hợp DHC......14
Hình 1.5. F plasmid ...................................................................................................18
Hình 1.6. Quá trình tiếp hợp ở vi khuẩn ...................................................................18
Hình 1.7. Cơ chế của quá trình trao đổi chéo của xạ khuẩn .....................................20
Hình 2.1. plasmid pFDNEO-S ..................................................................................22
Hình 2.2. vector pGEM-T Easy ................................................................................22

Hình 2.3. Vector pGEM 7+ .......................................................................................23
Hình 2.4. Vector pKC1139 .......................................................................................23
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra tách DNA tổng số xạ khuẩn ..........................................41
Hình 3.2. PCR nhân đoạn UMI, DMI từ DNA tổng số xạ khuẩn .............................42
Hình 3.3. Biến nạp vector pGEM-T-UMI và pGEM-T-DMI vào E. coli XL1 Blue 43
Hình 3.4. Cắt pGEM-T-UMI bằng EcoRI và KpnI, cắt pGEM-T-DMI bằng HindIII
và KpnI. .....................................................................................................................44
Hình 3.5. Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEM 7+-UMI.........................................45
Hình 3.6. Tinh sạch đoạn UMI và pGEM 7+ sau khi cắt bằng EcoRI và KpnI ........45
Hình 3.7. PCR kiểm tra biến nạp vector pGEM 7+-UMI vào E. coli XL1 Blue bằng
cặp mồi UMI-F và UMI-R ........................................................................................46
Hình 3.8. Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEM 7+-UMI-DMI ...............................47
Hình 3.9. PCR kiểm tra biến nạp vector pGEM 7+-UMI-DMI vào E. coli XL1 Blue
bằng cặp mồi DMI-F và DMI-R ...............................................................................48
Hình 3.10. Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEM 7+-UMI-Neor-DMI.....................49


Hình 3.11. Tinh sạch đoạn gen Neor .........................................................................49
Hình 3.12. Cắt kiểm tra pGEM 7+-UMI-Neor-DMI bằng KpnI................................50
Hình 3.13. Quy trình tạo vector đột biến gen gerMI.................................................51
Hình 3.14. Kiểm tra biến nạp vector pKC-UMI-Neor-DMI vào tế bào E. coli XL1
Blue ...........................................................................................................................52
Hình 3.15. Cắt kiểm tra pKC-UMI-Neor-DMI biến nạp trong E. coli XL1 Blue bằng
BamHI .......................................................................................................................52
Hình 3.16. Kiểm tra biến nạp vector pKC-UMI-Neor-DMI vào E. coli
ET12567/pUZ8002 ...................................................................................................53
Hình 3.17. PCR kiểm tra biến nạp vector pKC-UMI-Neor-DMI vào E. coli
ET12567/pUZ8002 ...................................................................................................54
Hình 3.18. Khuẩn lạc riêng rẽ phát sinh từ chủng M1-5 sau tiếp hợp trên môi
trường R2YE - Apr 100µg/ml (1) và R2YE - Neo 60µg/ml (2) ...............................56

Hình 3.19. Khuẩn lạc riêng rẽ phát sinh từ chủng M1-2 sau tiếp hợp trên môi trường
R2YE – Apr 100µg/ml (1) và R2YE – Neo 60µg/ml (2) .........................................56
Hình 3.20. PCR kiểm tra tiếp hợp của chủng M1-2-5 và M1-5-14 ..........................57
Hình 3.21. So sánh trình tự DNA từ Genbank và trình tự DNA chèn vào genome
của dòng tế bào từ kết quả giải trình tự .....................................................................59
Hình 3.22. Thử hoạt tính kháng khuẩn của chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP
và chủng đột biến M1-5-14 .......................................................................................60
Hình 3.23. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. KCTC 0041BP ban đầu và chủng đột biến M1-5-14 ...................61
Hình 3.24. Các mẫu kháng sinh sau khi chạy cột sắc ký với tỷ lệ
Methanol:Chloroform từ 1:99 đến 10:90 ..................................................................62
Hình 3.25. Kết quả TLC 10 mẫu sắc ký cột tương ứng 10 tỷ lệ dung môi khảo sát
Methanol:Chloroform (1:99) → (10:90) ...................................................................63


Hình 3.26. Kết quả TLC phủ thạch mẫu sắc ký với tỷ lệ Methanol:Chloroform
(5:95) .........................................................................................................................63
Hình 3.27. Phân tích HPLC và MS sản phẩm DHC từ chủng wild type .................64
Hình 3.28. Phân tích HPLC và MS sản phẩm kháng sinh từ chủng đột biến
S.sp.ΔM1-5................................................................................................................65


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp
DHC ............................................................................................................................8
Bảng 2.1. Dụng cụ, thiết bị dùng trong đề tài ...........................................................28
Bảng 3.1. Thử hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP ban
đầu và chủng đột biến M1-5-14 ................................................................................60
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng đột
biến M1-5-14 và chủng wild type .............................................................................61

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4
1.1. Xạ khuẩn .......................................................................................................... 4
1.1.1. Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên .......................................................... 4
1.1.2. Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP ............................................... 5
1.2. Kháng sinh DHC .............................................................................................. 6
1.2.1. Cấu trúc của DHC ..................................................................................... 6
1.2.2. Vai trò và hoạt tính sinh học ..................................................................... 7
1.2.3. Các nghiên cứu về DHC ............................................................................ 7
1.3. Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh ..................................................... 12
1.3.1. Vai trò và hoạt tính sinh học ................................................................... 12
1.3.2. Con đường sinh tổng hợp đường khử ở vi sinh vật ................................. 12
1.3.3. Một số nghiên cứu về gốc đường khử ...................................................... 13
1.4. Gen gerMI (O-methyltransferase) .................................................................. 13
1.5. Vector tách dòng và vector đột biến .............................................................. 14
1.5.1. Vector tách dòng ...................................................................................... 15
1.5.2. Vector đột biến ......................................................................................... 15
1.6. Tiếp hợp và đột biến gen ở xạ khuẩn ............................................................. 17
1.6.1. Cơ chế quá trình tiếp hợp gen ................................................................. 17
1.6.2. Cơ chế đột biến gen của xạ khuẩn ........................................................... 19
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................21
2.1. Thiết bị, hóa chất, vật liệu .............................................................................. 21
2.1.1. Vật liệu ..................................................................................................... 21
2.1.2. Môi trường ............................................................................................... 24


2.1.3. Hóa chất................................................................................................... 25

2.1.4. Thiết bị ..................................................................................................... 28
2.2. Các phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 29
2.2.1. Phương pháp thiết kế mồi ........................................................................ 29
2.2.2. Phương pháp PCR ................................................................................... 30
2.2.3. Phương pháp tạo tế bào khả biến ............................................................ 30
2.2.4. Phương pháp chuyển gen vào tế bào vi khuẩn ........................................ 31
2.2.5. Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn ............................... 31
2.2.6. Phương pháp điện di trên gel agarose .................................................... 32
2.2.7. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose ........................................... 33
2.2.8. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn ........................................ 33
2.2.9. Phương pháp nối DNA ............................................................................ 33
2.2.10.Phương pháp tiếp hợp ............................................................................. 34
2.2.11.Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc sau tiếp hợp ....................................... 35
2.2.12.Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ xạ khuẩn ................................. 36
2.2.13.Phương pháp tách chiết kháng sinh thô .................................................. 37
2.2.14.Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh ........................................... 37
2.2.15.Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC ........................................................ 38
2.2.16.Phương pháp sắc ký cột .......................................................................... 39
2.2.17.Phương pháp LC-MS ............................................................................... 40
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................41
3.1. Tách dòng đoạn UMI, DMI ........................................................................... 41
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP ...... 41
3.1.2. PCR nhân đoạn UMI, DMI ...................................................................... 41
3.1.3. Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn UMI, DMI trong vector pGEM-T Easy...... 42


3.2. Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn UMI và DMI trong vector pGEM 7+ ........ 45
3.2.1. Ghép nối đoạn UMI vào vector pGEM 7+ ............................................... 45
3.2.2. Ghép nối đoạn DMI vào vector pGEM 7+-UMI ...................................... 47
3.3. Tạo vector tái tổ hợp chứa đoạn UMI, DMI và gen Neor trong vector pGEM 7+ .. 49

3.4. Tạo vector đột biến gen gerMI trong vector pKC1139 .................................. 51
3.4.1. Ghép nối đoạn gen UMI-Neor-DMI vào vector pKC1139, biến nạp vào tế
bào E. coli XL1 Blue........................................................................................... 51
3.4.2. Biến nạp vector đột biến gen gerMI vào E. coli ET 12567/pUZ8002 ..... 53
3.5. Lựa chọn dòng tế bào xạ khuẩn đã tiếp hợp trao đổi vật chất di truyền ........ 54
3.5.1. PCR lựa chọn dòng tế bào có trao đổi chéo sau tiếp hợp ....................... 56
3.5.2. Giải trình tự gen của dòng tế bào trao đổi chéo DNA ............................ 58
3.6. Đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP
đột biến .................................................................................................................. 59
3.6.1. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc .... 59
3.6.2. Phân tích hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC và phủ thạch ....... 60
3.7. Thu nhận và phân tích dẫn xuất kháng sinh bằng sắc ký ............................... 62
3.7.1. Điều kiện thích hợp thu nhận dẫn xuất kháng sinh ................................. 62
3.7.2. Phân tích dẫn xuất bằng sắc ký HPLC và Mass...................................... 63
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...............................................................66
4.1. Kết luận .......................................................................................................... 66
4.2. Đề xuất ........................................................................................................... 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................67


MỞ ĐẦU
Từ xa xưa, các bệnh nhiễm khuẩn đã là một trong những nỗi kinh hoàng đối
với con người. Những trận đại dịch đã từng làm thay đổi sức mạnh của cả một đoàn
quân thiện chiến, thậm chí dẫn đến sự diệt vong của một đế chế hùng mạng. Chính
điều đó đã thôi thúc các nhà khoa học trên thế giới phải tìm ra được một chất có khả
năng phòng chống và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1928, Alexander
Fleming phát hiện ra penicillin – chất kháng sinh (CKS) có nguồn gốc từ nấm
Penicillium nhưng phải hơn 10 năm sau, năm 1941- penicillin mới chính thức được
sử dụng trong y học và đã cứu sống được bệnh nhân nhiễm trùng máu đầu tiên,
cũng từ đó kỷ nguyên CKS bắt đầu. Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất

của nhân loại trong thế kỷ XX.
Hiện nay cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin thì công nghệ sinh
học cũng được coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế giới.
Trong đó phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin
và các hoạt chất ứng dụng trong y học cũng như các lĩnh vực khác phục vụ đời sống
con người đang có những phát triển vượt bậc.
Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh
sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình. Trong số hơn 10.000
CKS được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra, khoảng 8.000 chất là
kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp trên 80% [13].
Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm cho hiện tượng
kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển và ngày càng lan rộng. Việc sử dụng một số
chất kháng sinh để chữa trị một số loại bệnh đã không còn mang lại hiệu quả như
mong muốn. Số lượng các vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày càng gia tăng.
Chính vì vậy, việc tìm kiếm ra những CKS mới luôn thu hút sự quan tâm của nhiều
nhà khoa học.

1


Dihydrochalcomycin (DHC) là kháng sinh thuộc nhóm macrolide 16C, được
sử dụng trong điều trị nhiễm trùng đường hô hấp. Nhiều nhà khoa học đã và đang
quan tâm nghiên cứu về loại kháng sinh này bởi nhiều ưu điểm vượt trội của nó như
ít độc, dung nạp tốt, thải trừ nhanh, đặc biệt có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh và
chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc.
DHC là sản phẩm trao đổi chất bậc 2 của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.
KCTC 0041BP, có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gr- (Gram âm) và Gr+
(Gram dương) bằng cách liên kết vào tiểu phần 50S của ribosome, ngăn cản quá
trình sinh tổng hợp protein của vi khuẩn. Trong 31 gen tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp kháng sinh DHC, gen gerMI được dự đoán có chức năng mã hóa cho

enzyme O-methyltransferase xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm OH tại vị trí C3
của đường dTDP-4,6-dideoxyglucose tạo gốc đường D-chalcose trong cấu trúc
kháng sinh DHC.
Tuy gen gerMI có vai trò quan trọng như vậy nhưng chưa có những nghiên
cứu cụ thể. Trên cơ sở đó, nhằm tìm ra con đường sinh tổng hợp kháng sinh
dihydrochalcomycin, làm tiền đề cho nghiên cứu sản xuất kháng sinh này ứng dụng
trong chữa bệnh, em đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn
đột biến gen gerMI (O-methyltransferase) sinh dẫn xuất kháng sinh Demethyldihydrochalcomycin từ chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP”.
Mục tiêu của đề tài:
- Tạo chủng đột biến gen gerMI từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC
0041BP bằng phương pháp tiếp hợp, chủng đột biến có khả năng sinh tổng hợp dẫn
xuất của Dihydrochalcomycin.
- Tách chiết dẫn xuất kháng sinh Demethyl-dihydrochalcomycin từ chủng
xạ khuẩn đột biến.
- Chứng minh chức năng gen gerMI tham gia vào con đường sinh tổng hợp
kháng sinh DHC.

2


Nội dung thực hiện:
- Tách dòng đoạn UMI (upstream MI), DMI (downstream MI) từ DNA tổng
số xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP.
- Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn UMI, DMI và gen Neor
- Tạo vector đột biến gen gerMI trong vi khuẩn Escherichia coli ET12567/
pUZ8002
- Lựa chọn dòng tế bào xạ khuẩn đã tiếp hợp trao đổi vật chất di truyền
- Đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn đột biến
- Thu nhận và phân tích dẫn xuất kháng sinh từ chủng đột biến bằng sắc ký

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Xạ khuẩn

1.1.1. Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất
rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí
cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của xạ
khuẩn phụ thuộc khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000 mầm xạ
khuẩn, chiếm 9 ÷ 45% tổng số vi sinh vật [20].
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình
thành chất kháng sinh, 60 ÷ 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng
sinh CKS.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có
tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [2]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các
loại

xạ

khuẩn

hiếm

như

Micromonospora

actinomadura,

Actinoplanes,

Streptoverticillium, Streptosporangium…Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã
cung cấp nhiều CKS có giá trị đang dùng trong y học như gentamycine,
tobramycine, vancomycine, rovamycine. Nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh chất
kháng sinh.
Ngoài ra, xạ khuẩn còn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa và
phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững trong đất như cenlulose, tinh
bột, chất mùn kitin, keratin…góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự
nhiên. Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ
như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12); một số axit hữu cơ như lactic acid,
acetic acid; amino acid như glutamic acid, methionine, tryptophan, lysine. Một số
khác có khả năng tạo thành các chất kích thích sinh trưởng thực vật.
Xạ khuẩn được dùng rộng rãi trong các ngành công nghiệp lên men, chế tạo
các sản phẩm lên men hoặc ứng dụng các men do xạ khuẩn sinh ra nhiều như

4


proteinase, amylase, cellulase, kitinase…
Tuy nhiên bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số xạ khuẩn lại sinh ra các
chất độc kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng cũng như sự phát triển
của hệ vi sinh vật có ích trong đất, một số khác lại là nguyên nhân gây ra một số
bệnh khó chữa ở người và gia súc [6]. Hai nhóm xạ khuẩn quan trọng là tác nhân
gây bệnh ở người là Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao và Corynebacterium
diphtheria gây bệnh bạch hầu.

1.1.2. Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP
Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500 loài,
có tỷ lệ G, C cao (69 ÷ 73%) trong DNA. Một phần rất lớn các chất kháng sinh
được sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài thuộc chi
Streptomyces trong đó được biết đến nhiều nhất là streptomycin, erythromycin và
tetracyclin [15].
Streptomyces là chi xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm
1943 [20]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện chi này có
hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh.
Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP thuộc chi Streptomyces, là chủng
sản sinh ra kháng sinh DHC. Chủng được phân lập từ mẫu đất tại Hàn Quốc, đồng
thời cấu trúc hóa học của DHC cũng được xác định bởi nhóm nghiên cứu Kim và
cs, 1996.
Khi sinh trưởng trên môi trường ISP2 cho khuẩn lạc không lớn, có kích
thước từ 1-5 mm. Khuẩn lạc rắn chắc và đâm sâu vào trong bề mặt cơ chất, bề mặt
khuẩn lạc thường được bao phủ bởi một lớp các khuẩn ty khí sinh dạng nhung dày.
Đặc điểm nổi bật của loài xạ khuẩn này là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không hình thành vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử).
Hệ sợi mảnh, đường kính sợi dao động trong khoảng từ 0,2-2 µm.
Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP sinh sản vô tính bằng bào tử.
Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào

5


tử có hình thẳng hoặc lượn sóng. Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử
bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục,
hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 μm. Bề mặt bào tử trơn nhẵn.
Màng bào tử có nếp nhăn trên môi trường ISP2.
Khi nuôi chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP trên môi

trường lỏng dịch nuôi có màu đen và có mùi đặc trưng của đất do chủng được
phân lập từ đất.
Chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP có thể sinh trưởng trong dải nhiệt độ
25 ÷ 32°C, thích hợp nhất ở 28 ÷ 30°C.
Độ pH thích hợp cho sự phát triển của chủng là khoảng 6 ÷ 9. Ở pH thấp hơn
6 hoặc cao hơn 9 thì chủng phát triển kém hoặc không phát triển. Chủng
Streptomyces sp. KCTC 0041BP hình thành sắc tố melanin trên môi trường thạch
tyrosine [4]. Có khả năng đồng hóa tốt với một số loại đường như cellobiose, Dglucose, D- mannose, maltose…
Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP sinh kháng sinh có khả năng ức
chế vi khuẩn Gr+ và vi khuẩn Gr- . Tuy nhiên, kháng sinh này có khả năng ức chế cao
hơn đối với vi khuẩn Gr+. Điều này được giải thích bởi vi khuẩn Gr- có lớp thành tế
bào dày và nhiều lớp hơn so với vi khuẩn Gr+, vì vậy chúng ít chịu ảnh hưởng bởi
kháng sinh hơn. Trong các vi khuẩn Gr+ được nghiên cứu, khả năng ức chế vi sinh
vật của xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP lên vi khuẩn Bacillus cereus là lớn
nhất (D = 21,33 mm), tiếp theo là vi khuẩn Bacillus subtilis (D = 19,50 mm) [4].
1.2.

Kháng sinh DHC

1.2.1. Cấu trúc của DHC
DHC thuộc nhóm kháng sinh macrolide 16C, là sản phẩm trao đổi chất bậc 2
của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP, được tách chiết lần đầu tiên
và xác định cấu trúc năm 1996.
Về cấu trúc, kháng sinh DHC cấu tạo gồm nhân lactone nối với 2 gốc đường là
mycinose và chalcose thông qua liên kết O-glucosid tại vị trí C5 và C20 [17] (hình 1.1).

6


Hình 1.1.Cấu trúc của DHC

1.2.2. Vai trò và hoạt tính sinh học
Qua nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, kháng sinh DHC đã biểu hiện hoạt
tính kháng khuẩn rất mạnh có thể ức chế và tiêu diệt cả vi khuẩn Gr- và Gr+. Chủng
xạ khuẩn tạo ra DHC đã được phân lập, đồng thời cấu trúc hóa học của chúng cũng
được xác định bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc, kháng sinh này được xác định là
chất dẫn xuất của kháng sinh chalcomycin đã được xác định trước đó bởi nhóm
nghiên cứu khác [8], [13]. Mặc dù toàn bộ cơ chế tác dụng của DHC chưa được
nghiên cứu hoàn toàn đầy đủ nhưng một số nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính sinh
học của DHC hoàn toàn tương tự như hoạt tính của kháng sinh chalcomycin và
mycinamycin [11].
Nghiên cứu về cấu trúc tinh thể phóng xạ để xác định cơ chế hoạt động của
kháng sinh, nhóm của Hansen đã chứng minh được cấu trúc nhân macrocyclic
lacton của kháng sinh này hình thành phức hệ và gắn với tiểu phần lớn của
ribosome vi khuẩn tại điểm tách chuỗi polypeptide ra khỏi tâm hoạt động của
enzyme peptidyltransferase. Từ đó kháng sinh này có hoạt tính ức chế sinh tổng hợp
protein của vi khuẩn [12], [14].
1.2.3. Các nghiên cứu về DHC
1.2.3.1.

Lập thư viện gen và giải trình tự nhóm gen sinh tổng hợp DHC

Qua thời gian nghiên cứu cấu trúc DHC, kháng sinh này được xác định cấu
trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR – Nuclear Magnetic
Resonance) và được phân loại thuộc nhóm kháng sinh PKS loại I. Nhóm nghiên

7


cứu Jaishi và cs, 2006 đã tách và lập được thư viện gen, tách được nhóm gen tham

gia vào con đường sinh tổng hợp DHC từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC
0041BP. Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75,5kb đã
được xác định trong đó có chứa 23 ORFs chứa thông tin di truyền, mã hóa cho các
gen tham gia con đường sinh tổng hợp DHC. Đồng thời các gen này cũng được dự
đoán cấu trúc (Bảng 1.1). Trình tự các gen này đã được đăng bản quyền trên
GenBank với mã số AY118081 [10].
Bảng 1.1. Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp DHC
Tên
Ger1
Ger2
Ger3
Ger4
GerA
GerB
GerMI
GerN
GerR
GerPI
GerPII
GerG
GerD
GerE
GerF
GerMII
GerPIII
GerH
GerKI
GerMIII
GerTI
GerR

GerS1
GerS2
GerS3
GerS4
GerS5
GerY
GerTII
GerK2
Ger29

Số amino
acid
608
684
331
308
334
381
271
485
823
401
407
274
323
295
196
255
420
73

326
403
418
280
439
1976
3734
1618
1357
404
425
248
580

Dự đoán chức năng trong nhóm gen sinh tổng hợp
Transferase protein
Hypothetical protein
Hypothetical protein
Conserved hypothetical protein
Oxidoreductase
3,4-dehydratase like protein
O-methyltransferase
NDP-4,6- dideoxyhexose 3,4-enoyl reductase
Beta glucosidase
Cytochrome P450 hydroxylase
Cytochrome P450 hydroxylase
Type II thioesterase
dTDP-glucose 4,6- dehydratase
Alpha-D-glucose-1-phosphate thymidyltransferase
NDP-hexose 3-epimerase

3-O-methyltransferase
Cytochrome P450
Ferredoxin
dTDP-hexose 4-ketoreductase
2-O-methyltransferase
Glycosyltransferase
rRNA methyltransferase
PKS[LM(KSQ,AT,ACP)M1(KS,AT,KR,ACP),
M2(KS,AT,DH,KR,ACP)]
PKS [M3(KS,AT,DH,KR,ACP)]
PKS[M4(KS,AT,KR*,ACP),M5(KS,AT,DH,ER,KR,ACP)]
PKS [M6(KS,AT,KR,ACP)]
PKS [M7(KS,AT,ACP), TEI]
NDP-hexose-3,4-isomerase
Glycosyltransferase
Post-PKS reductase
Putative transcriptional regulator

8

PKS[LM


1.2.3.2.

Tách và dự đoán chức năng nhóm gen tham gia sinh tổng hợp đường Dchalcose và D-mycinose

Các gen tham gia sinh tổng hợp đường khử D-chalcose và D-mycinose đã
được xác định và giải trình tự từ pGERI-5 cosmid. So sánh độ tương đồng về trình
tự các chuỗi amino acid của các gen trong cosmid với trình tự amino acid của các

gen đã biết trên ngân hàng gen thế giới GenBank. Các gen tham gia sinh tổng hợp 2
gốc đường khử này đã được dự đoán cấu trúc, từ đó dự đoán được con đường sinh
tổng hợp gốc đường này (hình 1.2).
Trong con đường sinh tổng hợp, dTDP-4-keto-6-deoxyglucose là gốc đường
trung gian cho quá trình tổng hợp cả 2 gốc đường chalcose và mycinose, được tổng
hợp từ glucose-1-phosphate với hoạt tính xúc tác của các enzyme GerD có chức
năng là dTDP-glucose synthase và GerE có chức năng là dTDP-glucose 4,6dehydartase.
-

Quá trình sinh tổng hợp đường D-chalcose bắt đầu từ gốc đường trung gian

4-keto-6-deoxyglucose với hoạt tính xúc tác của các enzyme 3,4-isomerase (GerY)
để tạo đồng phân, tiếp theo là phản ứng loại nhóm OH bởi 3,4-dehydratase (GerB)
và phản ứng khử của enzyme 3,4-enoylreductase (GerN) để tạo ra 3-keto-4,6dideoxyglucose. Sản phẩm tại vị trí 3-keto sẽ được chuyển thành 3'-OH nhờ
enzyme 3-ketoreductase (GerKII) tạo dTDP-4,6-dideoxyglucose. Tiếp đó, gốc
đường này được chuyển đến nối với nhân macrolide tại vị trí C5 nhờ hoạt tính xúc
tác của chalcosylglycosyltransferase (GerTII) và cuối cùng methyl hóa nhóm -OH
tại vị trí C3 nhờ hoạt động của enzyme O-methyltransferase (GerMI) tạo gốc đường
D-chalcose.
-

Gốc đường D-mycinose đã được nghiên cứu trong cấu trúc kháng sinh

tylosin vì vậy con đường sinh tổng hợp đã được chứng minh trong các nghiên cứu
về kháng sinh này [9]. Phản ứng sinh tổng hợp được bắt đầu từ dTDP-4-keto-6deoxyglucose để tạo thành dTDP-D-allose với xúc tác của hai enzyme 3-epimerase
(GerF) và 4-ketoreductase (GerKI). Tiếp theo là phản ứng gắn gốc đường allose
vào nhân macrolacton tại vị trí C20 nhờ hoạt tính xúc tác của glycosyltransferase

9

(GerTI).Cuối cùng hai enzyme 2-O-methyltransferase (GerMIII) và 3-Omethyltransferase (GerMII) xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm OH tại vị trí C2, C3
tạo gốc đường D-mycinose.
Bước cuối cùng hoàn thành cấu trúc kháng sinh DHC với hoạt động của
enzyme hydroxylase (GerPI) xúc tác gắn nhóm OH vào vị trí C8, và enzyme
epoxidase (GerPII) với chức năng tạo vòng lacton tại vị trí C12-C13 của vòng
dihydromacrolacton [17].

Hình 1.2. Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn thành
cấu trúc kháng sinh DHC

1.2.3.3.

Sinh tổng hợp dTDP-6-deoxy-β-D-allose, chứng minh chức năng của
dTDP-4-keto-6-deoxyglucose reductase (GerKI)

Trong nghiên cứu này nhóm nghiên cứu Thuy và cs, 2007 đã chứng minh
vai trò của gen GerKI trong sinh tổng hợp D-mycinose. GerKI mã hóa cho enzyme
4-ketoreductase, tham gia phản ứng xúc tác chuyển gốc đường 4-keto-6deoxyglucose thành 6-deoxy-D-allose. Cùng với kết quả này sản phẩm được tạo
thành đó là dTDP-6-deoxy-D-allose đã được xác định cấu trúc bằng phân tích NMR
và HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao). Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học

10


rất quan trọng bởi vì đây là đường khử hoàn toàn mới lần đầu tiên được tổng hợp
nhờ phản ứng enzyme invitro và nhờ đó đã tìm ra phương pháp sinh tổng hợp một
gốc đường quan trọng [17].
1.2.3.4.

Chứng minh chức năng của gen GerTI và GerTII (glycosyltransferases )
bằng phương pháp gây đột biến gen

Theo kết quả nghiên cứu của Thuy và cs, 2010 chức năng của gen GerTI và
GerTII đã được sáng tỏ bằng phương pháp đột biến gen để tạo chủng đột biến
không có chứa GerTI và GerTII. Chức năng của gen này là mã hóa cho sinh tổng
hợp enzyme glycosyltransferase. Các enzyme này tham gia vận chuyển và gắn gốc
đường mycinose và chalcose vào nhân macrolacton. Phân tích đánh giá sản phẩm
trung gian từ chủng đột biến, nhóm nghiên cứu còn chứng minh được bước cuối
cùng của quá trình hình thành kháng sinh và thu được hợp chất có hoạt tính sinh học
mới [17].
1.2.3.5.

Nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường
khử dTDP-6-deoxy-D-allose

Kết quả nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong tế bào vi khuẩn E. coli
BL21(DE3) đã chứng minh chức năng của gen GerF mã hóa cho enzyme dTDP-4keto-6-deoxyglucose 3-epimerase, xúc tác tạo đồng phân quang học chuyển vị trí OH ở vị trí C3 của đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose, tham gia vào chuyển hóa
đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose thành đường dTDP-6-deoxy-D-allose trong quá
trình sinh tổng hợp đường khử D-mycinose trong cấu trúc kháng sinh DHC. Kết quả
enzyme GerF được biểu hiện thành công trên E. coli BL21 (DE3) có khối lượng phân
tử là 38kDa, đồng thời xác định được điều kiện thích hợp để biểu hiện gen GerF và
enzyme này được sinh ra ở dạng tan là ở 26oC, trong 8h, nồng độ IPTG 10mmol [5].

11


1.3.

Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh

1.3.1. Vai trò và hoạt tính sinh học
Đường khử là gốc đường được tìm thấy rất nhiều trong cấu trúc của tế bào vi
khuẩn, tế bào nấm, các chất có hoạt tính sinh học và trong thành phần cấu trúc của
rất nhiều thuốc kháng sinh hay các chất chống ung thư [16].
Về cấu tạo, đường khử là các chất mà trong phân tử chúng có một hay nhiều
hơn một nhóm hydroxyl (-OH) được thay thế bởi nguyên tử hydro (H) hay các
nhóm chức khác như amino, methyl, alkyl. Các loại đường khử này có thể tồn tại ở
dạng đường đơn hay đường đa hoặc phân nhánh và là dẫn xuất của các sản phẩm
trao đổi chất bậc 2 trong các hợp chất tự nhiên [17].
Trong các hợp chất có hoạt tính sinh học đường khử đóng vai trò quan trọng
đối với việc xác định hoạt tính của các chất này. Có rất nhiều các nghiên cứu đã
chứng minh rằng các chất có hoạt tính sinh học sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính nếu
như gốc đường trong cấu trúc bị loại bỏ.
Trong cấu trúc tế bào vi sinh vật, đường khử tham gia cấu tạo lớp
peptidoglycan là thành phần cấu trúc nên thành tế bào của nhiều loại vi sinh vật, đặc
biệt là một số vi khuẩn Gr+ hoặc hình thành lớp lipopolysaccharide trong cấu trúc
màng tế bào của nhóm vi khuẩn Gr-.
1.3.2. Con đường sinh tổng hợp đường khử ở vi sinh vật
Đa số đường khử thuộc nhóm 6-deoxyhexose. Cho đến nay, có hơn 70 chất
đường khử có cấu tạo khác nhau đã được xác định, và số lượng nhóm gen tham gia
vào sinh tổng hợp 6-deoxyhexose ngày càng tăng. Trong đó, 6-deoxyhexose được
tổng hợp chủ yếu từ D-glucose, qua 4-keto-6-deoxyglucose như một tiền chất trung
gian. Dưới chức năng sinh học của hai enzyme NDP-D-hexose synthase và NDP-Dhexose-4,6-dehydratase, xúc tác chuyển hóa glucose-1-phosphate thành NDP-4keto-6-deoxyglucose. Đường trung gian này sẽ có thể trải qua một vài biến đổi nữa
để tạo một số lượng lớn các chất 6-deoxyhexose khác nhau.

12


Hình 1.3. Sinh tổng hợp đường khử ở vi sinh vật

Trong đó: Nhóm OH tại vị trí cacbon số 2, 3, 4 và 5 của chuỗi cacbon hexose
có thể bị thay thế bởi nguyên tử H, nhóm -CH3, nhóm -CHO, nhóm -CO tạo các cấu
trúc đường khử khác nhau.
1.3.3. Một số nghiên cứu về gốc đường khử
-

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gốc đường khử trong nhóm kháng sinh

macrolide như: erythromycin, tylosin, pikromycin đóng vai trò gắn các kháng sinh
này với các enzyme tham gia tổng hợp protein của vi khuẩn [12].
-

Việc nghiên cứu vai trò của gốc đường đã chỉ ra rằng: nếu mất đi gốc đường

khử trong cấu trúc tế bào của một số vi sinh vật sẽ gây ức chế sự sinh trưởng của tế
bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật [19].
-

Theo Binod và cộng sự năm 2009, xu hướng nghiên cứu hóa dược hiện nay

trên thế giới đó là nghiên cứu tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay
gốc đường cũ của một nhóm kháng sinh bằng gốc đường mới. Kháng sinh thế hệ
mới sẽ có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránh được hiện tượng kháng thuốc của vi
khuẩn, đồng thời khả năng thải trừ thuốc trong cơ thể sẽ nhanh hơn.
1.4.

Gen gerMI (O-methyltransferase)
Gen gerMI thuộc nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng

13