Nghiên cứu phát hiện một số đột biến gen ty thể trên bệnh nhân cơ não người việt nam

Nghiên cứu phát hiện một số đột biến gen ty
thể trên bệnh nhân cơ não người Việt Nam
Trương Thị Huệ
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS Chuyên ngành: Hóa sinh học; Mã số 62 42 30 15
Người hướng dẫn: PGS. TS. Phan Tuấ n Nghiã ; PGS. TS. Nguyễn Thi ̣Vân Anh
Năm bảo vệ: 2013

Abstract. Thu thập mẫu bệnh phẩm và tách chiết DNA tổng số từ các bệnh nhân nghi
bị bệnh do rối loạn ty thể đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Thiết kế
mồi đặc hiệu và lựa chọn enzyme giới hạn phù hợp cho việc sàng lọc phát hiện đột
biến gen ty thể bằng kỹ thuật PCR-RFLP. Xây dựng cách thức phát hiện một số đột
biến gen ty thể phổ biến và áp dụng cách thức thiết lập được để sàng lọc các đột biến
này ở người Việt Nam, nghiên cứu đột biến gen ty thể ở mức độ gia đình. Định lượng
số bản sao mang đột biến bằng phương pháp real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh
quang cải tiến, tìm hiểu sự liên quan giữa mức độ không đồng nhất và tình trạng bệnh
lý của một loại đột biến gen ty thể.
Keywords. Hóa sinh học; Đột biến gen; Bệnh cơ não; Người Việt Nam.

Content
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ty thể là bào quan có mă ̣t trong h ầu hết các tế bào nhân chu ẩn với chức năng chính là
sản xuất năng lượng dưới dạng ATP cho tế bào. Ty thể tạo ra năng lượng bằng cách oxy hóa
các acid hữu cơ và acid béo thông qua quá trình phosphoryl hóa oxy hóa xảy ra bên trong ty
thể. ATP là nguồn năng lượng lớn được sử dụng cho tất cả các quá trình trao đổi chất cần thiết
bên trong tế bào.


Ty thể có hệ gen riêng, có cấu trúc sợi đôi, DNA mạch vòng với kích thước 16.569 bp,
gồm 37 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide của chuỗi vận chuyển điện tử, 22 RNA vận

chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome (rRNA) khác nhau liên quan đến hoạt động chức năng
của ty thể. So với DNA của nhân tế bào thì DNA của ty thể dễ bị tổn thương do ty thể là một
môi trường giàu chất oxy phản ứng và do thiếu cơ chế sửa chữa hiệu quả dẫn đến nhiều đột
biến xuất hiện trong hệ gen ty thể. Năm 1988, Wallace và tập thể đã công bố đột biến điểm
đầu tiên trên hệ gen ty thể người gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo
Leber (Leber’s hereditary optic neuropathy - LHON). Sự mất đoạn mtDNA cũng được tìm
thấy ở mô cơ của bệnh nhân liệt cơ mắt ngoài tiến triển mãn tính (chronic progressive external
ophthalmoplegia - CPEO) và hội chứng Kearns-Sayre (KSS) cũng được phát hiện vào cùng
năm 1988. Cho đến nay, hơn 300 đột biến khác nhau trong hệ gen ty thể người đã được xác
định, trong đó có hơn 200 đột biến có khả năng gây bệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác
nhau.
Gần như tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp,
do đó những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hưởng
đến nhiều loại tế bào, nhiều loại mô và tổ chức. Các bệnh do đột biến gen ty thể có thể khởi
phát ở mọi lứa tuổi với diễn biến khác nhau. Mức độ nghiêm trọng của bệnh ty thể tăng theo
độ tuổi và tỷ lệ DNA ty thể (mtDNA) đột biến có mặt trong các mô bị tác động. Biểu hiện lâm
sàng do các rối loạn ty thể thay đổi rất lớn, có thể liên quan đến nhiều cơ quan phức tạp hoặc
đặc trưng cho từng mô. Các triệu chứng lâm sàng hay thấy ở não, cơ, mắt và giác quan. Các
triệu chứng đó có thể kết hợp với nhau trong các hội chứng riêng biệt như hội chứng KSS, hội
chứng não giật cơ kèm theo sợi cơ đỏ xé rách (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres –
MERRF), hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai biến mạch (mitochondrial
encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes – MELAS) hoặc viêm não tủy cấp di
truyền theo Leigh (hội chứng Leigh). Tuy nhiên các triệu chứng đó cũng có thể không nằm
trong một bệnh cảnh cụ thể nào, một vài đột biến thể hiện kiểu hình tương tự nhau làm cho
việc chẩn đoán bệnh dựa trên lâm sàng trở nên rất khó khăn. Vì vậy bệnh do đột biến gen ty
thể khó có được những chẩn đoán chính xác nếu chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng và các
chỉ tiêu cận lâm sàng. Hiện nay, phân tích DNA là những phương pháp hiện đại nhất cho phép
phát hiện nhanh và chính xác các đột biến gen gây bệnh. Nghiên cứu các đột biến trong hệ
gen ty thể cho phép phát hiện ra nguyên nhân của nhiều bệnh khác nhau.
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh do đột biến gen ty

thể. Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động lâm sàng, mô bệnh học, cơ chế phát sinh và


biểu hiện bệnh nên sự sai sót trong hệ gen ty thể ở nhiều bệnh nhân vẫn chưa được phát hiện
và không có phương pháp điều trị hiệu quả.
Ở Việt Nam, bệnh do đột biến gen ty thể còn ít được nghiên cứu, cho đến nay chỉ mới
có một vài công trình mang tính chất khởi đầu trong phát hiện bệnh ty thể ở mức độ gen và
protein. Đặc biệt, chưa có công trình nào đi sâu nghiên cứu mức độ không đồng nhất
(heteroplasmy) của đột biến gen ty thể cũng như sự liên quan giữa mức độ không đồng nhất
với triệu chứng lâm sàng của bệnh.
Đề tài luận án của chúng tôi được đặt ra với mục tiêu áp dụng và thiết lập phương
pháp phân tích chính xác và xác định mức độ không đồng nhất một số đột biến gen ty thể ở
các bệnh nhân người Việt Nam nhằm góp phần vào công tác khám và điều trị các bệnh do rối
loạn hệ gen ty thể.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Xây dựng được cách thức phát hiện một số đột biến gen ty thể phổ biến và sàng lọc các đột
biến gen ty thể này ở bệnh nhân cơ não (encephalomyopathy).
- Thiết lập được phương pháp xác định mức độ không đồng nhất của một loại đột biến gen ty
thể (MELAS) để bước đầu tìm hiểu mối liên quan giữa mức độ không đồng nhất và tình trạng
bệnh lý.
3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu của đề tài:
Các bệnh nhân nghi bị bệnh do rối loạn ty thể đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi
Trung ương.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Thu thập mẫu bệnh phẩm và tách chiết DNA tổng số từ các bệnh nhân nghi bị bệnh
do rối loạn ty thể đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương.
- Thiết kế mồi đặc hiệu và lựa chọn enzyme giới hạn phù hợp cho việc sàng lọc phát
hiện đột biến gen ty thể bằng kỹ thuật PCR-RFLP.
- Xây dựng cách thức phát hiện một số đột biến gen ty thể phổ biến và áp dụng cách

thức thiết lập được để sàng lọc các đột biến này ở người Việt Nam, nghiên cứu đột biến gen ty
thể ở mức độ gia đình.


- Định lượng số bản sao mang đột biến bằng phương pháp real-time PCR sử dụng mẫu
dò huỳnh quang cải tiến, tìm hiểu sự liên quan giữa mức độ không đồng nhất và tình trạng
bệnh lý của một loại đột biến gen ty thể.
4. Địa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cứu của luận án được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
5. Đóng góp mới của đề tài
- Đã thiết lập được cách thức phát hiện 15 loại đột biến điểm trong hệ gen ty thể ở
người Việt Nam bao gồm: các đột biến T3271C và T3291C (hội chứng MELAS); A8344G và
T8356C (hội chứng MERRF); G11778A, G3460A và T14484C (hội chứng LHON);
T8993G/C và T9176G (hội chứng Leigh), A1555G (hội chứng điếc) và các đột biến G4298A,
T10010C, T14727C, T14728C và T14709C (hội chứng cơ não nói chung).
- Thiết lập được phương pháp phát hiện và định lượng mức độ không đồng nhất của đột biến
A3243G thuộc hội chứng MELAS và bước đầu cho thấy mối liên quan giữa mức độ không
đồng nhất và tình trạng bệnh lý.
- Là công trình đầu tiên phát hiện thấy đột biến mới T14727C trên gen MTTE mã hóa cho
tRNAGlu ở bệnh nhân cơ não.
6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài
Cách thức phát hiện các đột biến gen ty thể đã được tạo ra trong nghiên cứu này có thể
dễ dàng phát triển thành các quy trình để áp dụng vào việc xét nghiệm bệnh do rối loạn ty thể
ở các bệnh viện.

Reference
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu Tiếng Việt
1.

Lê Đức Hinh, Lê Văn Thính, Nguyễn Vượng, Trần Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Bích
Nhi, Phan Văn Chi (2007), “Hội chứng MELAS”, Y học lâm sàng 18, tr. 27-31.

2.

Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phạm Vân Anh, Phan Văn Chi (2006), “Phân
tích hệ protein huyết thanh của bệnh nhân mang đột biến A3243G trong gen tRNALeu ty
thể”, Y học Việt Nam 4, tr. 24-28.


3.

Trần Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Bích Nhi, Lê Đức Hinh, Phan Văn Chi (2007), “Báo
cáo trường hợp: một bệnh nhân MELAS Việt Nam mang đột biến A3243G hệ gen
tRNALeu ty thể”, Tạp chí Y học Việt Nam 1, tr. 4-9.

4.

Trịnh Lê Phương, Chu Văn Mẫn, Phan Tuấn Nghĩa (2009), “Phát hiện đột biến gen
A3243G của hội chứng MELAS bằng phương pháp PCR-RFLP cải tiến”, Tạp chí Di
truyền và ứng dụng 4, tr. 6-9.

5.

Lê Thị Bích Thảo, Đỗ Quỳnh Hoa, Nguyễn Bích Nhi, Nông Văn Hải, Phan Văn Chi,
Phạm Thị Vân Anh, Ninh Thị Ứng (2004), “Xác định đột biến A3243G trên gen
tRNALeu ty thể từ các bệnh nhân mắc bệnh ty thể”, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học
toàn quốc. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, tr. 463-465.

II. Tài liệu Tiếng Anh
6.

Aharoni S. , Traves T.A., Melamed E., Cohen S., Silver E.L. (2010), “MELAS
syndrome associated with both A3243G-tRNALeu mutation and multiple mitochondrial
DNA deletions”, J. Neurol. Sci. 296, pp. 101–103.

7.

Akagi M., Inui K., Tsukamoto H., Sakai N., Muramatsu T., Yamada M., Matsuzaki K.,
Goto Y., Nonaka I., Okada S. (2002), “A point mutation of mitochondrial ATPase 6
gene in Leigh syndrome”, Neuromuscul. Disord. 12, pp. 53-55.

8.

Alston C.L., Lowe J., Turnbull D.M., Maddison P., Taylor R.W. (2010), “A novel
mitochondrial tRNAGlu (MTTE) gene mutation causing chronic progressive external
ophthalmoplegia at low levels of heteroplasmy in muscle”, J. Neurol. Sci. 98, pp. 140144.

9.

Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G., deBruijin M.H., Coulson A.R., Drouin J.,
Eperon I.C., Nierlich D.P., Rose B.A., Sanger F., Schreier P.H., Smith A.J.H., Staden
R., Young I. G. (1981), “Sequence and organization of the human mitochondrial
genome”, Nature 290, pp. 457-465.

10. Andreu A.L., Bruno C., Dunne T.C., Tanjik K., Shanske S., Sue C.M., Krishna S.,
Hadjigeorgiou G.M., Shtilbans A., Bonilla E., DiMauro S. (1999), “A nonsense
mutation (G15059A) in the cytochrome b gene in a patient with exercise intolerance and
myoglobinuria”, Ann. Neurol. 45, pp. 127-130.

11. Andreu A.L., Hanna M.G., Reichmann H., Bruno C., Penn A.S., Tanji K. Panllotti F.,
Iwata S., Bonilla E., Lach B., Morgan-Hughes J., Dimauro S. (1999), “Exercise
intolerance due to mutations in the cytochrome b gene of mitochondrial DNA”, New
Engl. J. Med. 341, pp. 1037-1044.


12. Ayed I.B., Chamkha I., Mkaouar-Rebai E., Kammoun T., Mezghani N., Chabchoub I.,
Aloulou H., Hachicha M., Fakhfakh F. (2011), “A Tunisian patient with Pearson
syndrome harboring the 4.977 kb common deletion associated to two novel large-scale
mitochondrial deletions”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 411, pp. 381-386.
13. Bai R.K., Wong L.J.C. (2004), “Detection and quantification of heteroplasmic mutant
mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutation system quantitative
PCR analysis: A single-step approach”, Clin. Chem. 50, pp. 996–1001.
14. Ballinger S.W., Schurr T.G., Torroni A., Gan Y.Y., Hodge J.A., Hassan K., Chen K.H.,
Wallace D.C. (1992), “Southeast Asian mitochondrial DNA analysis reveals genetic
continuity of ancient Mogoloid migrations”, Genetics 130, pp. 139-152.
15. Baughman J.M., Mootha V.K. (2006), “Buffering mitochondrial DNA variation”,
Nature Genet. 38, pp. 1232 – 1233.
16. Berdanier C. D. (2005), Mitochondria in healthy and disease, CRC Press.
17. Black G.C.M., Morten K., Laborde A., Poulton J. (1996), “Leber's hereditary optic
neuropathy: heteroplasmy is likely to be significant in the expression of LHON in
families

with

the

3460

ND1

mutation”,

Br.

J.

Ophthalmol.

80, pp. 915-917.
18. Boulet L., Karpati G., Shoubridge E.A. (1992), “Distribution and threshold expression
of the tRNALys mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and
ragged-red fibers (MERRF)”, Am. J. Hum. Genet. 51, pp. 1187-1200.
19. Budowle B., Chakraborty R., Giusti A.M., Eisenberg A.J., Allen R.C. (1991), “Analysis
of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE”, Am. J.
Hum. Genet. 48, pp. 137-144.
20. Calvaruso M.A., Willemsen M.A., Rodenburg R.J., Brand M.V.D., Smeitink J.A.M.,
Nijtmans L. (2011), “New mitochondrial tRNAHIS mutation in a family with lactic
acidosis and stroke-like episodes (MELAS)”, Mitochondrion 11, pp. 778-782.
21. Chinnery P.F., Brown D.T., Andrews R.M., Singh-Kler R., Riordan-Eva P., Lindley J.,
Applegarth D.A., Turnbull D.M., Howell N. (2001), “The mitochondrial ND6 gene is a
hot spot for mutations that cause Leber’s hereditary optic neuropathy”, Brain. 124, pp.
209-218.
22. Chinnery P.F. (2002), “Inheritance of mitochondrial disorders”, Mitochondrion 2, pp.
149-155.
23. Chinnery P.F. (2006) “Mitochondrial DNA in Homo Sapiens”, Nucleic Acids Mol.
Biol. 18, pp. 3-11.


24. Cao Y., Ma Y., Zhang Y., Li Y., Fang F., Wang S., Bu D., Xu Y., Pei P., Li L., Xiao Y.,

Wua H, Yang Y., Zou L., Qi Y. (2010), “Detection of eight frequently encountered
point mutations in mitochondria in Chinese patients suggestive of mitochondrial
encephalomyopathies”, Mitochondrion 10, pp. 330–334.
25. De Coo I.F., Renier W.O., Ruitenbeek W., Ter Laak H.J., Bakker M., Schagger H., Van
Oost B.A., Smeets H.J. (1999), “A 4-base pair deletion in the mitochondrial cytochrome
b gene associated with parkinsonism/Melas overlap syndrome”, Ann. Neurol. 45, pp.
130-133.
26. Deschauer M., Wieser T., Neudecker S., Lindner A., Zierz S. (1999), “Mitochondrial
A3243G mutation (MELAS mutation) associated with painful muscle stiffness”,
Neuromuscul. Disord. 9, pp. 305-307.
27. Du W., Li W., Chen G., Cao H., Tang H., Tang X., Jin Q., Sun Z., Zhao H., Zhou W.,
He S., Lva Y., Zhao J., Zhang X. (2009), “Detection of known base substitution
mutations in human mitochondrial DNA of MERRF and MELAS by biochip
technology”, Biosen. Bioelectron. 24, pp. 2371-2376.
28. Enns G.M., Bai R.K., Beck A.E., Wong L.J. (2006), “Molecular–clinical correlations in
a family with variable tissue mitochondrial DNA T8993G mutant load”, Mol. Genet.
Metab. 88, pp. 364–371.
29. Fan H., Civalier C., Booker J.K., Gulley M.L., Prior T.W, Farber R.A. (2006),
“Detection

of

common

disease-causing

mutations

in

mitochondrial

DNA

(Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis with stroke-like episodes MTTL1
A3243G and myoclonic epilepsy associated with ragged-red fibers MTTK A8344G) by
real-time polymerase chain reaction”, J. Mol. Diagn. 8, pp. 277-281.
30. Fawcett D.W. (1981), The Cell, W. B. Saunders Company, NewYork.
31. Gal A., Komlosi K., Maasz A., Pentelenyi K., Remenyi V., Ovary C., Valikovics A.,
Dioszeghy P., Bereczki D., Melegh B., Molnár M.J. (2010), “Analysis of mtDNA
A3243G mutation frequency in Hungary”, Cent. Eur. J. Med. 5, pp. 322-328.
32. Genasetti A., Valentino M.L., Carelli V., Vigetti D., Viola M., Karousou E.G., d’Eril
G.V.M., De Luca G., Passi A., Pallotti F. (2007), “Assessing heteroplasmic load in
Leber’s hereditary optic neuropathy mutation G3460A/MT-ND1 with a real-time PCR
quantitative approach”, J. Mol. Diagn. 9, pp. 538-545.
33. Glatz C., D’Aco K., Smith S., Sondheimer N. (2011), “Mutation in the mitochondrial
tRNAVal causes mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like
episodes”, Mitochondrion 11, pp. 615–619.


34. Goto Y., Nonaka I., Horai S. (1990), “A mutation in the tRNALeu(UUR) gene
associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies”, Nature
348, pp. 651-653.
35. Gropman A.L. (2001), “Diagnosis and treatment of childhood mitochondrial diseases”,
Pediatr. Neurol. 1, pp. 185-194.
36. Gropman A.L. (2004), “The neurological presentations of childhood and adult
mitochondrial

disease:

established

syndromes

and

phenotypic

variations”,

Mitochondrion 4, pp. 503–520.
37. Guan

M.X.

(2011),

“Mitochondrial

12S

rRNA

mutations

associated

with

aminoglycoside ototoxicity”, Mitochondrion 11, pp. 237–245.

38. Gvozdjáková A. (2008), Mitochondrial medicine, Springer Science + Business Media
B.V.
39. Handoko H. Y., Lum J. K., Rismalia G., Kartapradja H., Sofro A. S. M., Marzuki S. (2001),
“Length variations in the COII-tRNALys intergenic region of mitochondrial DNA in
Indonesian populations”, Hum. Biol. 73, pp. 205-223.
40. Holt I.J. (2003), Genetics of mitochondrial disease, Oxford University Press Inc.,
NewYork.
41. Horvath R., Kemp J.P., Tuppen H.A.L., Hudson G., Oldfors A., Marie S.K.N., Moslemi
A.R., Servidei S., Holme E., Shanske S., Kollberg G., Jayakar P., Pyle A., Marks H.M.,
Holinski-Feder E., Scavina M., Walter M.C., Coku J., Gunther-Scholz A., Smith P.M.,
McFarland R., Chrzanowska-Lightowlers Z.M.A., Lightowlers R.N., Hirano M.,
Lochmuller H., Taylor R.W., Chinnery P.F., Tulinius M.,

DiMauro S. (2009),

“Molecular basis of infantile reversible Cyt c oxidase deficiency myopathy”, Brain 132,
pp. 3165–3174.
42. Houten B.V., Woshner V., Santos J.H. (2006), “Role of mitochondrial DNA in toxic
responses to oxidative stress”, DNA Repair 5, pp. 145–152.
43. Ida H., Rennert O.M., Iwasawa K., Kobayashi M., Eto Y. (1999), “Clinical and genetic
studies of Japanese homozygotes for the Gaucher disease L444P mutation”, Hum.
Genet. 105, pp. 120-126.
44. Ivanova R., Astrinidis A., Lepage V., Djoulah S., Wijnen E., Vu-Trieu A., Hors J.,
Charron D. (1999), “Mitochondrial DNA polymorphism in the Vietnamese population”,
Eur. J. Immunogenet. 26, pp. 417- 422.
45. Jacobi F.K., Meyer J., Pusch C.M., Wissinger B. (2001), “Quantitation of heteroplasmy
in mitochondrial DNA mutations by primer extension using VentR ®(exo-) DNA
polymerase and RFLP analysis”, Mut. Res. 478, pp. 141–151.

46. Keightley J.A., Anitori R., Burton M.D., Quan F., Buist N.R., Kennaway N.G. (2000),
“Mitochondrial encephalomyopathy and complex III deficiency associated with a stopcodon mutation in the cytochrome b gene”, Am. J. Hum. Genet. 67, pp. 1400-1410.
47. Kim D.S., Jung D.S., Park K.H., Kim I.J., Kim C.M., Lee W.H., Rho S.K. (2002),
“Histochemical and molecular genetic study of MELAS and MERRF in Korean
patients”, J. Korean Med. Sci. 17, pp. 103-112.
48. Kirby D.M., Milovac T., Thorburn D.R. (1998), “A failse -positive diagnosis for the
common MELAS (A3243G) mutation caused a novel variant (A3426G) in the ND1
gene mitochondria DNA”, Mol. Diagn. 3, pp. 211-216.
49. Kolesnikova O.A., Entelis N.S., Mireau H., Fox T.D., Martin R.P., Tarassov I.A.
(2000), “Suppression of mutations in mitochondrial DNA by tRNAs imported from the
cytoplasm”, Science 289, pp. 1931-1933.
50. Legros F., Chatzoglou E., Frachon P., Ogier De Baulny H., Laforet P., Jardel C.,
Godinot C., Lombes A. (2001), “Functional characterization of novel mutations in the
human cytochrome b gene”, Eur. J. Hum. Genet. 9, pp. 510-518.
51. Letertre C., Perelle S., Dilasser F., Arar K., Fach P. (2003), “Evaluation of the
performance of LNA and MGB probes in 5’ nuclease PCR assays” Mol. Cell Probes 17,
pp. 307-311.
52. Liu V.W.S., Shi H.H., Cheung A.N.Y., Chiu P.M., Leung T.W., Nagley P., Wong L.C.,
Ngan H.Y.S. (2001), “High incidence of somatic mitochondrial DNA mutations in
human ovarian carcinomas”, Cancer Res. 61, pp. 5998-6001.
53. Liu C.S., Cheng W.L., Chen Y.Y., Ma Y.S., Pang C.Y., Wei Y.H. (2005), “High
prevalence of the COII/tRNALys intergenic 9-bp deletion in mitochondrial DNA of
Taiwanese patients with MELAS or MERRF syndrome”, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1042,
pp. 82-87.
54. Loeb L.A., Wallace D.C., Martin G.M. (2005), “The mitochondrial theory of aging and
its relationship to reactive oxygen species damage and somatic mtDNA mutations”, Nat.
Acad. Sci. 102, pp. 18769-18770.
55. Lorenzoni P.J., Scola R.H., Kay C.S.K., Arndt R.C., Freund A.A., Bruck I., Santos
M.L.S.F., Lineu C., Werneck L.C. (2009), “MELAS-Clinical features, muscle biopsy
and molecular genetics”, Arq. Neuropsiquiatr. 67, pp. 668-676.

56. Lu C.Y., Tso D.J, Yang T., Jong Y.J., Wei Y.H. (2002), “Detection of DNA mutations
associated with mitochondrial diseases by Agilent 2100 bioanalyzer”, Clin. Chimica.
Acta 318, pp. 97-105.


57. Lu J., Wang D., Li R., Li W., Ji J., Zhao J., Ye W., Yang L., Qian Y., Zhu Y., Guan
M.X. (2006), “Maternally transmitted diabetes mellitus associated with the
mitochondrial tRNALeu(UUR) A3243G mutation in a four-generation Han Chinese
family”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, pp. 115–119.
58. Ma Y., Fang F., Yang Y., Zou L., Zhang Y., Wang S., Xu Y., Pei P., Qi Y., (2009),
“The study of mitochondrial A3243G mutation in different samples”, Mitochondrion 9,
pp. 139-143.
59. Ma Y. , Fang F., Cao Y., Yang Y., Zou L., Zhang Y., Wang S., Zhu S., Xu Y., Pei P.,
Qi Y. (2010), “Clinical features of mitochondrial DNA m.3243A>G mutation in 47
Chinese families”, J. Neurol. Sci. 291, pp. 17–21.
60. Mancuso M., Ferraris S., Nishigaki Y., Azan G., Mauro A., Sammarco P., Krishna S.,
Tay S.K.H., Bonilla E., Romansky S.G., Hirano M., DiMauro S. (2005), “Congenital or
late-onset myopathy in patients with the T14709C mtDNA mutation”, J. Neurol. Sci.
228, pp. 93-97.
61. Martin-Kleiner I., Gabrilovac J., Bradvica M., Vidovi T., Cerovski B., Fumic K., Borani
M. (2006), “Leber’s hereditary optic neuroretinopathy (LHON) associated with
mitochondrial DNA point mutation G11778A in two Croatian families”, Coll. Antropol.
30, pp.171–174.
62. Mashima Y., Saga M., Hiida Y., Oguchi Y., Wakakura M., Kudoh J., Shimizu N.
(1995), “Quantitative determination of heteroplasmy in Leber's hereditary optic
neuropathy by single-strand conformation polymorphism”, Invest. Ophthalmol. Vis.
Sci. 36, pp. 1714-1720.
63. Masoro E.J., Austad S.N. (2006), Handbook of the biology of aging, 6th Edition,
Academic Press, USA.
64. McFarland R., Schaefer A.M., Gardner J.L., Lynn S., Hayes C.M., Barron M.J., Walker

M., Chinnery P.F., Taylor R.W., Turnbull D.M. (2004), “Familial myopathy: new
insights into the T14709C mitochondrial tRNA mutation”, Ann. Neurol. 55 (4), pp. 478484.
65. Mezghania N., Mkaouar-Rebaia E., Mnif M., Charfi N., Rekik N., Youssef S., Abid
M., Fakhfakha F. (2010), “The heteroplasmic m.14709TNC mutation in the tRNAGlu
gene in two Tunisian families with mitochondrial diabetes”, J. Diab. Compl. 24, pp.
270-277.
66. Miller F.J., Losenfeldt F.L., Zhang C., Linnane A.W., Nagley P. (2003), “Precise
determination of mitochondrial DNA copy number in human skeletal and cardiac
muscle by a PCR-based assay”, Nucleic Acids Res. 31, pp. 1-7.


67. Mimaki M., Hatakeyama H., Ichiyama T., Isumi H., Furukawa S., Akasaka M., Kamei
A., Komaki H., Nishino I., Nonaka I., Goto Y. (2009), “Different effects of novel
mtDNA G3242A and G3244A base changes adjacent to a common A3243G mutation in
patients with mitochondrial disorders”, Mitochondrion 9, pp. 115–122.
68. Mkaouar-Rebai E., Chaari W., Younes S., Bousoffara R., Sfar M.T., Fakhfakh F.
(2009), “Maternally inherited Leigh syndrome: T8993G mutation in a Tunisian family”,
Pediatr. Neurol. 40, pp. 437-442.
69. Montero M., Alonso M.T., Albillos A., Cuchillo-Ibanez I., Olivares R., Villalobos C.,
Alvares J. (2002), “Effect of inositol 1,4,5-triphosphate receptor stimulation on
mitochondrial (Ca2+) and secretion in chromaffin cells”, Biochem. J., 365, pp. 451-459.
70. Moraes C.T., Atencio D.P., Oca-Cossio J., Diaz F. (2003), “Techniques and pitfalls in
the detection of pathogenic mitochondrial DNA mutations”, J. Mol. Diagn. 5, pp. 197208.
71. Musumeci O., Andreu A.L., Shanske S., Bresolin N., Comi G.P., Rothstein R., Schon
E.A., and DiMauro S. (2000),

“Intragenic inversion of mtDNA: A new type of

pathogenic mutation in a patient with mitochondrial myopathy”, Am. J. Hum. Genet.
66, pp. 1900-1904.

72. Naviaux R.K. (2004) “Developing a systematic approach to the diagnosis”,
Mitochondrion 4, pp. 351-361.
73. Nelson D.L., Cox M.M. (2008), Lehninger principles of biochemistry, Worth
publishers, Inc.
74. Nigou M., Parfait B., Clauser E., Olivier J.L. (1998), “Detection and quantification of
the A3243G mutation of mitochondrial DNA by ligation detection reaction”, Mol. Cell.
Probes 12, pp. 273-282.
75. Nogueira C. , Nunes J., Evangelista T., Fattori F., Tessa A., Pereira C., Santorelli F. M.,
Vilarinho L. (2007), “A new mtDNA-tRNAGlu mutation (T14728C) presenting a lateonset mitochondrial encephalomyopathy”, Mitochondrion 7, pp. 396-398.
76. Ohkubo K., Yamano A., Nagashima M., Mori Y., Anzai K., Akehi Y., Nomiyama R.,
Asano T., Urae A., Ono J. (2001), “Mitochondrial gene mutations in the
tRNALeu(UUR) region and diabetes: prevalence and clinical phenotypes in Japan”,
Clin. Chem. 47, pp. 1641–1648.
77. Pereira C., Nogueira C., Barbot C., Tessa A., Soares C., Fattori F., Guimaraes A. ,
Santorelli F.M., Vilarinho L. (2007), “Identification of a new mtDNA mutation
(14724G>A) associated with mitochondrial leukoencephalopathy”, Biochem. Biophys.
Res. Commun. 354, pp. 937–941.


78. Perucca-Lostanlen D., Taylor R.W., Narbonne H., de Camaret B.M., Hayes C.M.,
Saunieres A., Paquis–Flucklinger V., Turnbull D.M., Vialettes B., Desnuelle C. (2002),
“Molecular and functional effects of the T14709C point mutation in the mitochondrial
DNA of a patient with maternally inherited diabetes and deafness”, Biochim. Biophys.
Acta 1588, pp. 210–216.
79. Polyak K., Li Y., Zhu H., Lengauer C., Willson J. K., Markowitz S.D., Trush M.A.,
Kinzer K.W., Vogelstein B. (1988), “Somatic mutations of the mitochondrial genome in
human colorectal tumours”, Nat. Genet. 20, pp. 291-293.
80. Poulton J., Macaulay V., Marchington D.R. (1998), “Mitochondrial Genetics ’98 is the
bottleneck cracked ?”, Am. J. Hum. Genet. 62, pp. 752-757
81. Pulkes T., Hanna M.G. (2001), “Human mitochondrial DNA diseases”, Adv. Drug

Deliv. Rev. 49, pp. 27-43.
82. Rahman S., Poulton J., Marchington D., Suomalainen A. (2001), “Decrease of A3243G
mtDNA mutation from blood in MELAS syndrome: a longitudinal study”, Am. J. Hum.
Genet. 68, pp. 238–240.
83. Redd A.J., Takezaki N., Sherry S.T., McGarvey S.T., Sofro A.S., Stoneking M. (1995),
“Evolutionary history of the COII/tRNALys intergenic 9 base pair deletion in human
mitochondrial DNAs from the Pacific”, Mol. Biol. Evol. 12, pp. 604-615
84. Reeve A.K., Krishnan K.J. Turnbull D. (2008), “Mitochondrial DNA mutations in
disease, aging and neurodegeneration”, Ann. NY Acad. Sci. 1147, pp. 21-29.
85. Robinson B.H. (2006), “Lactic acidemia and mitochondrial disease”, Mol. Genet.
Metab. 89, pp. 3-13.
86. Rotig A., Lebon S., Zinovieva E., Mollet J., Sarzi E., Bonnefont J.P., Munnich A.
(2004), “Molecular diagnostics of mitochondrial disorders”, Biochim. Biophys. Acta
1659, pp. 129-135.
87. Sacconi S., Salviati L., Gooch C., Bonilla E., Sahnske S., Dimauro S. (2002), “Complex
neurologic syndrome associated with the G1606A mutation of mitochondrial DNA”,
Arch. Neurol. 59, pp. 1013-1015.
88. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977), “DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors”, Biochemistry 74 (12), pp. 5463-5467.
89. Schneider A., Marechal-Drouard L. (2000) “Mitochondrial tRNA import: are there distinct
mechanisms?”, Cell Biol. 10, pp. 509-513.
90. Schon E.A., Rizzuto R., Moraes C.T., Nakase H., Zeviani M., DiMauro S. (1989), “A
direct repeat is a hostpot for large-scale deletion of human mitochondrial DNA”,
Science 244, pp. 346-349.


91. Shanske S., Pancrudo J., Kaufmann P., Engelstad K., Jhung S., Lu J., Naini A.,
DiMauro S., De Vivo D.C. (2004), “Varying loads of the mitochondrial DNA A3243G
mutation in different tissues: implications for diagnosis”, Am. J. Med. Genet. 130A, pp.
134-137.

92. Shanskea S., Wong L.J.C. (2004), “Molecular analysis for mitochondrial DNA
disorders”, Mitochondrion 4, pp. 403-415.
93. Singh R., Ellard S., Hattersley A., Harries L.W. (2006), “Rapid and sensitive real-time
polymerase chain reaction method for detection and quantification of A3243G
mitochondrial point mutation”, J. Mol. Diagn. 8, pp. 225-230.
94. Solano A., Playán A., López-Pérez M.J., Montoya J. (2001), “Genetic diseases of
human mitochondrial DNA”, Salud. Publica. Mex. 43, pp. 151-161.
95. Suzuki Y., Wada T., Sakai T., Ishikawa Y., Minami R., Tachi N., Saitoh S. (1998),
“Phenotypic variability in a family with a mitochondrial DNA T8993C mutation”,
Pediatr. Neurol. 19, pp. 283-286.
96. Tajima H., Sueoka K., Moon S.Y., Nakabayashi A. Sakurai T., Murakoshi Y.,
Watanabe H., Iwata S., Hashiba T., Kato S., Goto Y., Yoshimura Y. (2007), “The
development of novel quantification assay for mitochondrial DNA heteroplasmy aimed
at preimplantation genetic diagnosis of Leigh encephalopathy”, J. Assist. Reprod.
Genet. 24, pp. 227-232.
97. Tanahashi C., Nakayama A., Yoshida M., Ito M., Mori N., Hashizume Y., (2000)
“MELAS with the mitochondrial DNA 3243 point mutation: a neuropathological
study”, Acta. Neuropathol. 99, pp. 31–38.
98. Tanno Y., Yoneda M., Nonaka I., Tanaka K., Miyatake T., Tsuji S. (1991),
“Quantitation of mitochondrial DNA carrying mutation in MERRF patients tRNALys”,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, pp. 880-885.
99. Taylor R.W., Morris A.A.M, Hutchinson M., Turnbull D.M. (2002), “Leigh disease
associated with a novel mitochondrial DNA ND5 mutation”, Eur. J. Hum. Genet. 10,
pp. 141-144.
100. Taylor R.W., Turnbull D.M. (2005), “Mitochondrial

DNA mutations in human

disease”, Nature Genet. 6, pp. 389-402.
101. Ueki I., Koga Y., Povalko N., Akita Y., Nishioka J., Yatsuga S., Fukiyama R.,

Matsuishi T. (2006), “Mitochondrial tRNA gene mutations in patients having
mitochondrial disease with lactic acidosis”, Mitochondrion 6, pp. 29-36.


102. Vassilina A.S., Vadim B.V., Thomas D., Catherine H., Dominique R., Catherine G.
(2002), “A Russian family of Slavic origin carrying mitochondrial DNA with a 9-bp
deletion in region V and a long C-stretch in D-loop”, Mitochondrion 1, pp. 479-483.
103. Wang X. (2001), “The expanding role of mitochondria in apoptosis”, Genes Dev. 15,
pp. 2922–2933.
104. Wallace D.C., Singh G., Lott M.T., Hodge J.A., Schurr T.G., Lezza A.M., Elsas L.J.,
Nikoskelainen E.K. (1988), “Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's
hereditary optic neuropathy”, Science 242, pp. 1427-1430.
105. Watkins W.S., Bamshad M., Dixon M.E., Rao B.B., Naidu J.M., Reddy P. G., Prasad
B.V.R., Das P.K, Reddy P.C., Gai P.B., Bhanu A., Kusuma Y.S., Lum J.K., Fischer P.,
Jorde L.B. (1999), “Multiple origins of the mtDNA 9-bp deletion in populations of
South India”, Am. J. Phys. Anthropol. 109, pp. 147-158.
106. White H.E., Durston V.J., Seller A., Fratter C., Harvey J.F., Cross N.C.P. (2005),
“Accurate detection and quantitation of heteroplasmic mitochondrial point mutations by
pyrosequencing”, Genet. Test. 9, pp. 190-199.
107. Wibrand F., Ravn K., Schwartz M., Rosenberg T., Horn N., Vissing J. (2001),
“Multisystem disorder associated with a missense mutation in the mitochondrial
cytochrome b gene”, Ann. Neurol., 50, pp. 540-543.
108. Yao Y.G., Watkins W.S. , Zhang Y.P. (2000), “Evolutionary history of the mtDNA 9bp deletion in Chinese populations and its relevance to the peopling of east and
southeast Asia”, Hum. Genet. 107, pp. 504-512.
109. You Y., Moreira B.G., Behlke M.A., Owczarzy R. (2006), “Design of LNA probes that
improve mismatch discrimination”, Nucleic Acids Res. 34, pp. 1-11.
110. Yu Q., Zhang Y., Wang Z., Yang Y. , Yuan Y., Niu S., Pei P., Wang S, Ma Y., Bu D.,
Zou L., Fang F., Xiao J., Sun F., Zhang Y., Wu Y., Wang S., Xiong H., Wu X. (2007),
“Screening of common mitochondrial mutations in Chinese patients with mitochondrial
encephalomyopathies’, Mitochondrion 7, pp. 147–150.

111. Zeviani M., Donato S.D. (2004), “Mitochondrial disorders”, Brain 127, pp. 2153–
2172.
112. Zhao L., Young W.Y., Li R., Wang Q., Qian Y., Guan M.X. (2004), “Clinical
evaluation and sequence analysis of the complete mitochondrial genome of three
Chinese patients with hearing impairment associated with the 12S rRNA T1095C
mutation”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, pp. 1503-1508.
113. Zhou X., Zhang H., Zhao F., Ji Y., Tong Y., Zhang J., Zhang Y., Yang L., Qian Y., Lu
F., Qu J., Guan M.X. (2010), “Very high penetrance and occurrence of Leber’s


hereditary optic neuropathy in a large Han Chinese pedigree carrying the ND4
G11778A mutation”, Mol. Genet. Metab. 100, pp. 379–384.
114. Zhuo G., Feng G., Leng J., Yu L., Jiang Y. (2010), “A 9-bp deletion homoplasmy in
women with polycystic ovary syndrome revealed by mitochondrial genome-mutation
screen”, Biochem. Genet. 48, pp. 157-163.