Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang (litsea cubeba (lour ) pers )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

PHẠM NGỌC LÂM

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN
CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - Năm 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

PHẠM NGỌC LÂM

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY
MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. PHÍ QUYẾT TIẾN

PGS.TS. VŨ THU TRANG

Hà Nội - Năm 2017


LỜI CAM ĐOAN

Học viên: Phạm Ngọc Lâm
Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Người hướng dẫn : TS. Phí Quyết Tiến
PGS.TS. Vũ Thu Trang
Tên luận văn: ―Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)‖.
Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan, trong suốt quá trình nghiên cứu luận
văn thạc sĩ, dưới sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của giáo viên hướng dẫn, tôi đã tiến
hành nghiên cứu luận văn một cách trung thực, toàn bộ nội dung trong báo cáo luận
văn được tôi trực tiếp thực hiện. Tất cả các nghiên cứu không sao chép từ các báo
cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách của bất cứ tác giả nào.

Học viên

Phạm Ngọc Lâm

I


LỜI CẢM ƠN
Đối với mỗi học viên cao học, luận văn tốt nghiệp là một công trình khoa
học nhỏ nhưng mang ý nghĩa lớn, đánh dấu bước trưởng thành đầu tiên của mỗi

người trên con đường ứng dụng những kiến thức đã được học vào thực tiễn.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến, Phó
Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam và PSG.TS. Vũ Thu Trang, Phó trưởng Khoa Công nghệ thực phẩm, Viện
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà
Nội đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức quý báu để giúp tôi hoàn
thành luận văn này.
Trong thời gian thực tập và làm việc tại phòng Công nghệ Lên men - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ,
sự chỉ bảo tận tình về chuyên môn, kĩ thuật và sự động viên chân thành của tập thể
cán bộ phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tạo điều kiện
thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên khuyến khích tôi
trong suốt quá trình học tập để đạt được kết quả như ngày hôm nay.

Hà Nội, tháng 10 năm 2017
Học viên

Phạm Ngọc Lâm

II


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Các kí hiệu/ chữ viết tắt

Ý nghĩa

1

DNA

Deoxyribonucleic acid

2

FISH

Fluorescent insitu hybridization

3

IAA

Indole acetic acid

4

IC50

Inhibitory concentration 50% - Nồng
độ ức chế 50% đối tượng thử.

5

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

6

KTKS

Khuẩn ty khí sinh

7

MIC

Minimum inhibitory concentrationNồng độ ức chế tối thiểu

8

NRP

Nonribosomal peptide

9

NRPS

Nonribosomal peptide synthetase

10

PKS

Polyketide synthase

11

PKS-I

Polyketide synthase type I

12

PKS-II

Polyketide synthase type II

13

RNA

Ribonucleic acid

III


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số hoạt chất được tìm thấy ở xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu. .10
Bảng 1.2. Một số loài xạ khuẩn nội sinh hiếm được phân lập từ cây dược liệu .......16
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S
rRNA. ........................................................................................................................32
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ

các mẫu cây Màng tang tại Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ....................................35
Bảng 3.2. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của một số chủng xạ khuẩn. .......45
Bảng 3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của chủng MPT28.......................51
Bảng 3.4. Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT28 khi nuôi cấy trên các môi trường 52
Bảng 3.5. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28 sau
7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C........................................................................................53
Bảng 3.6. Nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh trưởng của chủng
MPT28. ......................................................................................................................54
Bảng 3.7. Độ tương đồng của trình tự gen 16S rRNA của xạ khuẩn MPT28 với trình
tự gen tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank..................56

IV


DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Bản đồ vị trí 34 vùng có sự đa dạng thực vật cao và việc lấy mẫu để phân
lập xạ khuẩn nội sinh.................................................................................................15
Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh lần lượt trên môi trường
ISP5 (a), SPA (b), HV (c), TA (d), STA (e), CA (f) sau 6 tuần nuôi cấy. ................34
Hình 3.2. Sự phân bố xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây Màng tang: số liệu
tổng số của 03 vùng (a); số liệu thống kê theo từng vùng (b)...................................38
Hình 3.3. Sự phân bố của xạ khuẩn nội sinh trên các loại môi trường phân lập khác
nhau. ..........................................................................................................................39
Hình 3.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh phân bố theo nhóm màu sắc khuẩn ty ở
Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ. ...............................................................................41
Hình 3.5. Biểu đồ thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 143 chủng xạ
khuẩn nội sinh. ..........................................................................................................42
Hình 3.6. Khả năng kháng vi sinh (VSV) vật kiểm định của 47 chủng xạ khuẩn nội
sinh (XKNS)..............................................................................................................43
Hình 3.7. Hoạt tính kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A) Bacillus

cereus ATCC 11778 (B) của một số chủng xạ khuẩn nội sinh. ................................44
Hình 3.8. Tỉ lệ chủng xạ khuẩn kháng ít nhất một chủng vi sinh vật kiểm định phân
bố ở Thanh Hoá, Hà Nội và Phú Thọ........................................................................47
Hình 3.9. Tỉ lệ chủng kháng ít nhất một vi sinh vật kiểm định phân bố theo vị trí rễ,
thân, lá. ......................................................................................................................49
Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc (a) trên môi trường ISP1 và bề mặt chuỗi bào tử (b)
dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần của chủng MPT28. ...........52
Hình 3.11. Điện di đồ DNA tổng số (a) và sản phẩm PCR (b) trên gel agarose 1,0%.
...................................................................................................................................55
Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại của chủng MPT28. .........................................57

V


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................2
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................. iii
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .........................................................................v
MỤC LỤC ................................................................................................................. vi
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3
1.1.

Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu ....................................3

1.1.1.

Khái niệm xạ khuẩn nội sinh ..................................................................3

1.1.2.

Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật ..........................................4

1.1.3.

Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật .......................................4

1.2. Phân lập xạ khuẩn nội sinh .......................................................................... 11
1.2.1.

Phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh ............................................. 11

1.2.2.

Môi trường phân lập .............................................................................13

1.2.3.

Các nghiên cứu cải tiến hiệu quả phân lập ...........................................13

1.3.

Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ...........................................14

1.3.1.

Đa dạng thực vật - nguồn tiềm năng về sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh 14

1.3.2. Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo phương pháp phân lập
và chủng loại ......................................................................................................18
1.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây
dƣợc liệu................................................................................................................21
1.4.1.

Kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh ..........................................................22

1.4.2. Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh và các hợp chất
trao đổi thứ cấp ...................................................................................................23
1.5.

Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ở Việt Nam .....24

1.6.

Cây Màng tang và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh ...................25

Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................28
2.1.

Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................28

2.1.1.

Mẫu Màng tang, chủng giống vi sinh vật .............................................28

2.1.2.

Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu..................................................28

VI


2.1.3.
2.2.

Môi trường nuôi cấy .............................................................................29

Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................29

2.2.1.

Thu thập và chuẩn bị mẫu .....................................................................29

2.2.2.

Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên mẫu cây Màng tang ...........................29

2.2.3.

Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
………………………………………………………………………..30

2.2.4.

Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28 ...............30

2.2.5. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trình tự gen 16S
rRNA....………………………………………………………………………..32

2.1.1.

Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................33

Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................34
3.1. Phân lập và đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại các
vùng sinh thái khác nhau ....................................................................................34
3.1.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại Thanh Hóa, Hà Nội
và Phú Thọ ..........................................................................................................34
3.1.2.
3.2.

Sự phân bố xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang ...............................37

Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội sinh
…………………………………………………………………………….42

3.2.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân bố
theo các vùng sinh thái khác nhau ......................................................................47
3.2.2. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân bố
theo vị trí trên cây ...............................................................................................49
3.3.

Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MTP28 ...............50

3.3.1.

Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 .........................................51

3.3.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn

MPT28 ………………………………………………………………………..55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................58
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................60
PHỤ LỤC ..................................................................................................................71

VII


MỞ ĐẦU
Sự xuất hiện của những vi khuẩn gây bệnh kháng nhiều loại kháng sinh cùng
với sự lây lan rộng lớn của chúng đang là mối đe dọa nghiêm trọng và thu hút mối
quan tâm hàng đầu của cộng đồng. Sự gia tăng của những tác nhân gây bệnh này đã
cho thấy nhiều loại thuốc kháng sinh hiện nay đã lỗi thời và không còn hiệu quả.
Trong khi đó, những thành công của các giải pháp thay thế như tổng hợp hóa học
vẫn còn rất hạn chế, đã tạo ra một khoảng trống trên con đường tìm ra các loại
thuốc mới. Vì vậy, cho đến nay, các nhà khoa học và các doanh nghiệp dược phẩm
trên thế giới vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau để
phát triển các loại kháng sinh mới nhằm khắc phục tình trạng kháng thuốc như hiện
nay.
Xạ khuẩn là đối tượng quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên
thế giới về độ đa dạng và các hoạt chất sinh học của chúng, đặc biệt là các chất
kháng sinh. Các loài xạ khuẩn nội sinh sống trong mô thực vật và tạo ra một số hợp
chất thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ.
Trong số các hợp chất này, các chất có hoạt tính sinh học như hoạt tính kháng
khuẩn, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng
dụng trong y học. Việc phân lập xạ khuẩn nội sinh và sàng lọc các chủng xạ khuẩn
có khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính kháng khuẩn là một hướng nghiên
cứu tiềm năng.
Cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) là một loại dược liệu phân bố ở

các nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Chúng chứa nhiều tinh dầu mà thành phần
chính là citral, có tác dụng kháng khuẩn, kháng ung thư, và chống oxy hóa. Mặc dù
tinh dầu Màng tang được sử dụng nhiều trong cuộc sống nhưng đến nay số lượng
các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang và khả năng kháng khuẩn
của chúng tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Xuất phát từ những định hướng trên,
chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học
của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)”

1


Mục tiêu của đề tài: Phân lập, đánh giá và lựa chọn các chủng xạ khuẩn nội
sinh trên cây Màng tang có khả năng kháng khuẩn cao.
Đề tài được thực hiện tại ph ng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm 3 nội dung ch nh:
-

Phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên các mẫu cây Màng tang
thu thập tại 03 vùng: Thanh Hóa, Hà Nội và Phú Thọ.

-

Sàng lọc các chủng xạ khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm
định.

-

Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng xạ
khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao.

2


Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu

1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh
Ngày nay, rất nhiều loại vi sinh vật phổ biến như vi khuẩn và nấm, xạ khuẩn
đã được tìm thấy ở các mô bên trong cây. Các vi sinh vật này sống bên trong các
mô thực vật mà không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cây chủ. Hầu hết thực vật đều có
một hoặc nhiều loài vi sinh vật sống trong mô của chúng. Các vi sinh vật sản xuất
các chất chuyển hóa thúc đẩy tăng trưởng, thuốc chống côn trùng và sâu bệnh,
kháng sinh chống lại mầm bệnh thực vật, bảo vệ cây chủ trong điều kiện stress môi
trường. Chúng cũng có tiềm năng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp có thể khai
thác ứng dụng trong các ngành công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp và các ngành
khác [71].
Thuật ngữ ―nội sinh‖ (endophyte) được đưa ra đầu tiên bởi De Bary năm
1866. Từ đó, nhiều định nghĩa khác nhau được đưa ra bởi các nhà nghiên cứu khác
nhau với một vài thay đổi. Tổng hợp các định nghĩa và các nhà khoa học đã thống
nhất là ―Sinh vật nội sinh là tập hợp những vi sinh vật sống trong các mô của thực
vật bậc cao cũng như các thực vật nhỏ mà không gây bất kỳ ảnh hưởng xấu nào cho
cây chủ‖. Chúng đã được chứng minh là nguồn sản xuất các sản phẩm tự nhiên
phong phú có nguồn hoạt tính sinh học [82].
Trong số các vi sinh vật nội sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi khả năng tổng
hợp kháng sinh ức chế vi sinh vật gây bệnh. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã
khẳng định vai trò quan trọng của xạ khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh. Xạ
khuẩn nội sinh trong mô thực vật rất đa dạng và phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai
thác các hợp chất có hoạt tính sinh học do chúng sinh ra trong nhiều lĩnh vực của

đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh được chứng minh
rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt t nh như: các chất kiểm soát sinh học, chất
kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất
k ch th ch sinh trưởng... [76]. Vì vậy, các nhà khoa học ngày càng quan tâm nghiên
cứu khảo sát đa dạng sinh học của các xạ khuẩn sống trong thực vật ở các hệ sinh
thái khác nhau nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt
tính kháng sinh nói riêng.

3


1.1.2. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật
Trước những lợi ích mà xạ khuẩn nội sinh mang lại, việc tìm hiểu về mối
quan hệ giữa xạ khuẩn và thực vật cũng như cơ chế nội sinh của chúng trong thực
vật ngày càng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Okazaki và cộng sự
(2003) đã quan sát thấy quá trình xâm nhiễm của Microbispora sp., vào bên trong
các tế bào biểu bì và Streptomyces galbus vào mầm cây đỗ quyên (Rhododendron)
bằng kính hiển vi điện tử quét [68]. Năm 2006, Watt và cộng sự đã nghiên cứu sự
có mặt của xạ khuẩn trong các mô thực vật bằng phương pháp lai huỳnh quang tại
chỗ (FISH), sử dụng đầu d đặc hiệu cho xạ khuẩn [103]. Nhiều nghiên cứu cho
rằng, các mô thực vật có những hốc thích hợp cho sự xâm nhập và sinh sống của
các vi sinh vật, tạo nên các mối quan hệ có tính cộng sinh, ký sinh hoặc gây bệnh.
Xạ khuẩn nội sinh là các quần thể vi sinh vật có nguồn gốc từ đất vùng rễ của thực
vật. Các vi sinh vật thường xâm nhập vào trong mô thực vật qua các khe hở của lỗ
khí, vết thương, lỗ hổng trên bề mặt, khu vực rễ non, biểu bì và theo các kênh dẫn
truyền nước, dinh dưỡng để đi vào các mô bên trong. Hầu hết xạ khuẩn hình thành
hệ sợi mọc trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua lỗ hở tự nhiên, các
vết thương do cơ học hoặc côn trùng. Xạ khuẩn nội sinh tổng hợp ra một số hợp
chất để thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ.
Các hợp chất chuyển hóa này đang được nghiên cứu như một nguồn tiềm năng cung

cấp các hợp chất có ứng dụng trong điều trị, kiểm soát sinh học và một số ứng dụng
khác [75].
1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật
1.1.3.1.

Ứng dụng trong công nghệ sinh học và y dược

Năm 2006, El-Shatoury và cộng sự tiến hành nghiên cứu hoạt tính chống sốt
rét của Streptomyces sp. phân lập từ Artemisia herba-alba, Echinops spinosus,
Balotta undulate và Mentha longifolia. Các tác giả đã thử nghiệm tác động gây độc
tế bào ấu trùng Artemia salina của 27 trong số 41 xạ khuẩn nội sinh. Kết quả cho
thấy, 9 chủng có khả năng ức chết và giết chết ấu trùng với tỉ lệ lên tới 100% sau 12

4


giờ, các chủng này chủ yếu thu nhận từ cây Artemisia herba-alba và Echinops
spinosus [21]. Tương tự, Tanvir và cộng sự (2014) cũng cho thấy Streptomyces
albovinaceus và S. badius được phân lập từ các loài thực vật trong họ Cúc
(Asteraceae) cũng có tiềm năng đáng kể về khả năng tiêu diệt ấu trùng muỗi (Culex
quinquefasciatus) ở giai đoạn đầu và giai đoạn 4 trong chu trình phát triển của
chúng [96]. Castillo và cộng sự (2002) đã phát hiện hợp chất munumbicins D có
hoạt tính kháng lại ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium falciparum), với giá trị IC50
(inhibitory concentration 50%) là 4,5 ng/ml. Các tác giả cũng mô tả hoạt động nổi
bật của mỗi loại munumbicins A, B, C, D kháng lại P. falciparum nằm trong phạm
vi có ý nghĩa dược lý với gía trị IC50 lần lượt là 175; 130; 6,5 và 4,5 ng/ml.
Munumbicins C và D gây sự chú ý đặc biệt với các tác giả do giá trị IC50 cực kỳ
thấp. Hơn nữa, họ cũng báo cáo rằng munumbicins B, C và D không gây bất kỳ sự
ly giải hồng cầu nào ở người với nồng độ 80 µg/ml. Do đó, để sử dụng các hợp chất
này làm thuốc chống sốt rét hoặc chống nhiễm trùng cần thêm kết quả từ những

nghiên cứu kiểm tra độc tính trên tế bào và lâm sàng [11].
Ngoài các ứng dụng về kháng sốt rét kể trên, xạ khuẩn nội sinh c n được biết
đến với việc tổng hợp các hợp chất có hoạt tính kháng viêm, ức chế tế bào ung thư.
Gần đây, một hợp chất mới có tên naphthomycin K (dẫn xuất của kháng sinh
ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) được phát hiện lần đầu tiên từ
Streptomyces sp. CS nội sinh trong cây mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) - loại cây
thuốc có tác dụng điều trị ung thư, hoạt huyết,.... Kết quả nghiên cứu cho thấy
naphthomycin K có khả năng gây độc và ức chế dòng tế bào P388 (tế bào ung thư
bạch cầu) và A-549 (tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt của người) ở nồng độ lần
lượt là 0,07 và 3,17 µM [58]. Hai hợp 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin và 5, 7dimetoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh,
được tìm thấy trong loài Streptomyces aureofaciens CMUAc130 nội sinh. Hoạt tính
kháng ung thư của hai chất này không chỉ ở việc hình thành nhóm nitric oxide,
prostaglandin E2 và tác nhân hoại tử khối u (TNF-α), mà c n cảm ứng nitric oxide
synthase và cyclooxygenase-2 trong lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào
5


RAW 264.7. Tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất và ức chế sự hình thành
TNF-α [92].
Ngoài việc đóng vai tr quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất thông
qua các enzyme thủy phân ngoại bào và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đã được
khoa học biết đến từ lâu. Gần đây, các nghiên cứu trên xạ khuẩn còn phát hiện ra
nhiều sản phẩm trao đổi chất của chúng có ý nghĩa rất quan trọng đối với sức khỏe
con người. Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất phá hủy tế bào hồng cầu
của động vật (như haemolysin ở Rhodococcus equi). Các nhà khoa học đã phát hiện
các hợp chất này từ xạ khuẩn có tiềm năng rất lớn trong việc làm tan cụcmáu đông
ở người bị bệnh tim mạch. Trong phòng thí nghiệm, việc sàng lọc các chất có hoạt
tính chống đông máu từ xạ khuẩn được tiến hành trên mẫu máu động vật như máu
ngựa, máu thỏ [78]. Một ví dụ khác là việc tạo ra các hợp chất có hoạt tính chống
các tác nhân gây oxy hóa, nhờ đó làm tăng tuổi thọ của tế bào. Nguyên lý hoạt động

của các chất chống oxy hóa tìm thấy ở xạ khuẩn cũng tương tự như axit ascorbic
(vitamin C) hay tocopherol (vitamin E). Các hợp chất này trung hòa thể oxy hóa rất
cao của các hợp chất oxy hóa (được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào
hay dưới tác dụng của tia cực tím) qua đó làm giảm tác dụng oxy hóa của chúng
[89]. Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Sri đã phân lập 65 xạ khuẩn nội sinh trên 13
cây dược liệu chữa bệnh tiểu đường như cây lô hội (Alloe vera), dây ký ninh
(Tinospora crispa), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), nghệ xanh
(Curcuma aeruginosa), rau má (Centela asiatica)... Trong đó, các chủng thể hiện
hoạt tính α-glucosidase ức chế quá trình thủy phân tinh bột thành glucose thẩm thấu
vào ruột non. Kết quả nghiên cứu trên đã tuyển chọn được chủng BWA65 có hoạt
tính ức chế α- glucosidase gấp hơn hai lần so với chất có hoạt t nh tương tự thu
được từ dịch chiết cây dây ký ninh [88].
Mặc dù ý nghĩa khoa học của các hợp chất trao đổi chất kể trên đối với sự
sinh trưởng và cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường tự nhiên c n chưa rõ ràng,
nhưng tác dụng mà chúng mang lại trong lĩnh vực công nghệ sinh học và y dược đã
được chứng minh. Chính vì lý do này, các nhà khoa học hiện nay rất quan tâm tới
6


việc nghiên cứu phân lập xạ khuẩn nội sinh và sàng lọc các hợp chất có hoạt tính
sinh học từ chúng.
1.1.3.2.

Ứng dụng trong nông nghiệp

Xạ khuẩn nội sinh có ý nghĩa rất lớn trong sản xuất nông nghiệp. Chúng là
nhân tố thúc đẩy quá trình chuyển hóa, cải thiện sự tăng trưởng cây chủ cũng như
giảm các triệu chứng bệnh do các tác nhân vi sinh vật hay stress môi trường gây ra
[71]. Các nhà khoa học cũng chứng minh khả năng k ch th ch sinh trưởng thực vật
và sinh tổng hợp hoocmon sinh trưởng thực vật của xạ khuẩn nội sinh. Năm 2013,

Dochhil và cộng sự đã sử dụng hai chủng Streptomyces sp. phân lập từ cây rau má
(Centella asiatica) để kích thích sự sinh trưởng của cây trồng và nẩy mầm của hạt.
Kết quả cho thấy, cây trồng sinh trưởng tốt hơn và khả năng nảy nầm của hạt được
nâng cao. Các chủng này có khả năng tổng hợp axit indole acetic (IAA) – một chất
k ch th ch sinh trưởng thực vật – với nồng độ đạt 71 µg/ml và 197 µg/ml [19].
Shutsrirung và cộng sự (2014) chứng minh các chủng thuộc chi Nocardiopsis có
khả năng sản xuất IAA cao nhất trong số tất cả các chi khác [86]. Trong các thử
nghiệm thực địa được thực hiện bởi El-Tarabily cộng sự (2010), các chủng
Actinoplanes campanulatus, Micromonospora chalcea và Streptomyces spiralis
được sử dụng riêng lẻ và kết hợp với nhau. Kết quả là các chủng này làm kích thích
tăng trưởng và tăng năng suất cây dưa leo [24].
Igarashi (2004) và Igarashi và cộng sự (2002) đã thu nhận axit pteridic A và
B có hoạt tính giống auxin từ Streptomyces hygroscopicus phân lập trên cây dương
xỉ (Pteridium aquilinum) làm chất k ch th ch tăng trưởng thực vật. Axit pteridic gây
ra sự hình thành rễ bất định của cây đậu thận (Phaseolus vulgaris), ở nồng độ 1 mM
hiệu quả như IAA. Ngoài ra, các tác giả nhận định rằng axit pteridic A kích thích sự
kéo dài rễ ở nồng độ 20 ppm. Tuy nhiên, sự nảy mầm của lúa đã bị ức chế khi xử lý
với IAA nồng độ 100 ppm [41, 42]. Nghiên cứu của Gangwar và cộng sự (2014)
cũng cho thấy xạ khuẩn nội sinh mà chủ yếu là Streptomyces sp. có khả năng sản
xuất IAA với hàm lượng khoảng 9,0-38,8 µg/ml [29].

7


Bên cạnh khả năng sinh tổng hợp các chất k ch th ch sinh trưởng, xạ khuẩn
nội sinh còn tổng hợp nhiều hợp chất giúp cây trồng chống lại các mầm bệnh. Xạ
khuẩn nội sinh đã thu hút sự chú ý của các nhà vi sinh vật, bởi khả năng kiểm soát
sinh học đối với mầm bệnh do khả năng tổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng vi
sinh vật gây bệnh. Nhiều nghiên cứu chứng minh đặc tính bảo vệ cây chủ của xạ
khuẩn nội sinh chống lại các vi sinh vật gây bệnh như Rhizoctonia solani,

Verticillium dahliae, Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var.
tritici, Fusarium oxysporum, Pythium aphanidermatum và Colletotrichum
orbiculare [15, 26]. Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm
trao đổi chất như chất kháng khuẩn, kháng nấm, enzyme thủy phân,
phytohormone.... Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch
đối với thực vật nhờ kích thích các thụ thể tế bào. Ví dụ như chủng S. galbus R-5
không chỉ sinh cellulase, pectinase mà còn sản xuất actinomycin X2 và
fungichromin giúp tăng cường sức đề kháng trong cây đỗ quyên, tăng cường sản
sinh jasmonate kích thích hệ thống miễn dịch [84]. Conn và cộng sự (2008) công bố
kết quả nghiên cứu gây nhiễm Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp.
EN43 trên hạt giống cây Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống
lại nấm bệnh Erwinia carotovora và F. oxysporum, kích hoạt biểu hiện gen tổng
hợp axit jasmonic, axit salicilic và etylen [14].
Xạ khuẩn nội sinh có thể tổng hợp các hợp chất kháng nấm như siderophores
và chitinase. Chitin là polysaccharide đặc trưng nhất của thành tế bào nấm. Các xạ
khuẩn nội sinh có thể phân huỷ tế bào nấm do khả năng sản xuất chitinase [25]. Vai
trò của các phân tử siderophores sinh ra bởi các xạ khuẩn nội sinh đã được quan tâm
nhiều hơn bởi những chất này tham gia vào việc kích thích sự phát triển của cây chủ
cũng như sự đối kháng với tác nhân gây bệnh ở thực vật. El-Shatoury và cộng sự
(2009) đã công bố xạ khuẩn nội sinh thu nhận được từ cây Achillea fragrantissima
có khả năng sản xuất chitinase hoặc siderophores đồng thời cũng cho thấy hoạt
động ức chế đáng kể đối với nấm gây bệnh trên cây trồng. Enzyme chitinase được
sinh ra bởi loài Actinoplanes missouriensis gây phân giải sợi nấm và giảm sự nảy

8


mầm của bào tử đ nh [22, 25]. Kết quả của El-Shatoury cộng sự (2009) đã được
Gangwar và cộng sự (2014) củng cố, các tác giả ghi nhận sản phẩm siderophores
dạng hydroxamate dao động từ 5,9-64,9 µg/ml và dạng catechol trong khoảng 11,223,1 µg/ml trong môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nội sinh phân lập từ Aloe vera,

Mentha arvensis và Ocimum sanctum [29]. Trong một nghiên cứu khác, El-Tarabily
và cộng sự (2010) đã sử dụng Actinoplanes campanulatus, Micromonospora
chalcea và Streptomyces spiralis để điều trị thành công bệnh thối cổ rễ ở cây dưa
leo trưởng thành do tác nhân là nấm Pythium aphanidermatum. Các tác giả cũng
cho rằng những dòng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm có thể sử dụng làm tác nhân
kiểm soát sinh học [24].
Năm 2004, Igarashi tìm thấy hợp chất 6-prenylindole từ Streptomyces sp.
được phân lập từ cây hành lá (Allium fistulosum) có hoạt tính kháng lại các tác nhân
gây bệnh trên thực vật như nấm Alternaria brassicicola và F. oxysporum. Hợp chất
6-prenylindole lần đầu tiên được tìm thấy là một thành phần trong cây rêu tản (lớp
Hepaticae). Đây là một ví dụ thú vị về sự phát hiện của cùng một hợp chất từ thực
vật và vi sinh vật. Tác giả cũng báo cáo hợp chất fistupyrone thu nhận từ
Streptomyces sp. có khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm A. brassicicola,
tác nhân gây ra bệnh đốm đen – một bệnh phổ biến của cây trồng họ cải
(Brassicaceae). Mặc dù fistupyrone không thể hiện hoạt tính kháng A. brassicicola
ở điều kiện in vitro, nó ức chế hoàn toàn sự xâm nhiễm của A. brassicicola khi xử
lý các cây con với nồng độ 100 ppm của hợp chất này [41]. Các nghiên cứu của
Igarashi và cộng sự (2002) cho thấy fistupyrone không ảnh hưởng đến sự phát triển
của sợi nấm nhưng có khả năng ngăn chặn nảy mầm của bào tử nấm ở nồng độ 0,1
ppm [42]. Năm 2014, Zhang và cộng sự tìm thấy bốn hợp chất mới có dẫn xuất
indole

là

3-acetonylidene-7-prenylindolin-2-one,

axit

7-isoprenylindole-3-

carboxylic, 3-cyanomethyl-6-prenylindole và axit 6-isoprenylindole-3-carboxylic từ
chủng Streptomyces sp. neau-D50, có hoạt tính kháng các loại nấm gây bệnh trên
thực vật như Colletotrichum orbiculare, Phytophthora capsici, Corynespora

9


cassiicola và F. oxysporum với các giá trị IC50 trong khoảng 30,55-89,62 µg/ml
[106].
Bảng 1.1. Một số hoạt chất được tìm thấy ở xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu.
Cây dƣợc liệu
Achillea
fragrantissima

Vị
trí

Loài xạ khuẩn

Hợp chất

Rễ,

Kibdelosporangium sp.,

Siderophores,

thân,
lá

Kitasatosporia sp.,
Nocardia sp.,
Nocardioides sp.,
Promicromonospora sp.,
Pseudonocardia sp.,

Chitinase

TLTK

[22]

Streptomyces sp.
Monstera sp.

Thân Streptomyces sp. MSU- Coronamycin
2110

[27]

Lô hội (Aloe vera),
Bạc hà (Mentha

Rễ,
thân,

[30]

arvensis), Hương
nhu tía (Ocimum

sanctum).

lá

Actinopolyspora sp.,
Micromonospora sp.,

Siderophore

Saccharopolyspora sp.,
Streptomyces sp.

catechol), Indole

(hydroxamate và

acetic acid (IAA)

Kennedia nigriscans

Thân Streptomyces sp. NRRL Munumbicins A, B,
30562
C và D

[11]

Rau má (Centella
asiatica)

Rễ,

thân,
lá

[19]

Hành hoa (Allium
fistulosum)

Lá

Streptomyces sp.

Indole acetic acid
(IAA)

Streptomyces sp. TPA0569,

Fistupyrone, 7’-

[43]

Demethylnovobioc,
Novobiocin, 6Prenylindole,
Pteridic acids A-B

Dương xỉ (Pteridium
aquilinum)
Su ối (Xylocarpus
granatum)

Thân Streptomyces
hygroscopicus TPA0451
Rễ

Clethramycin

Jishengella endophytica Alkaloids
161111

10

[43]
[111]


Riềng nếp (Alpinia
galanga)

Rễ

Microbispora sp.,
Micromonospora sp.,
Nocardia sp.,
Streptomyces sp. Tc022

Actinomycin D

[102]

Maytenu saquifolia,

Putterlickia
retrospinosa,
Putterlickia
verrucosa

Rễ,
thân,
lá

Streptomyces setonii,
Streptomyces sampsonii,
Streptomyces sp. Q21,
Streptomyces sp. MaBQuH-8

Celastramycins A

[78]

và B

Những nghiên cứu này cho thấy các chất chuyển hóa thu được từ xạ khuẩn
nội sinh ức chế nấm và các tác nhân gây bệnh thực vật có thể là những lựa chọn
thay thế tốt hơn và an toàn hơn đối với khỏe con người. Việc nghiên cứu mối liên
hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính
sinh học được sinh ra bởi xạ khuẩn giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng
ứng dụng trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng.
1.2. Phân lập xạ khuẩn nội sinh
1.2.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh
Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập xạ
khuẩn nội sinh. Takahashi và Omura (2003) nhấn mạnh rằng sự đa dạng của xạ

khuẩn phụ thuộc chủ yếu vào các phương pháp phân lập. Qua đó, quá trình xử lý
mẫu bằng khử trùng bề mặt là một bước quan trọng được sử dụng nhiều nhất trong
các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh [95]. Ngoài ra, kết quả phân lập xạ
khuẩn nội sinh trên thực vật còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm:
loài cây chủ, tuổi của cây chủ và loại mô, phân bố địa lý và môi trường sống, mùa
lấy mẫu, hóa chất khử trùng bề mặt, môi trường phân lập và điều kiện nuôi cấy [28].
Nhìn chung, quy trình phân lập xạ khuẩn nội sinh bắt đầu từ việc thu gom
các bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa, quả,... được xử lý tươi hoặc bảo quản ở
nhiệt độ 4°C cho đến khi tiến hành phân lập (trong vòng 24 giờ). Các mẫu được rửa
sạch bằng nước máy để loại bỏ đất, bụi bẩn, và các mô chết, sau đó được khử trùng
11


bề mặt bằng cách sử dụng một hoặc nhiều chất khử trùng khác nhau. Hóa chất được
sử dụng để khử trùng bề mặt phổ biến nhất bao gồm ethanol và một chất oxy hóa
mạnh hoặc chất khử trùng thông thường như NaOCl 2-5% (w/v) và chlorine trong
2-4 phút [71]. Dochhil (2013) sử dụng kết hợp sodium chlorate (NaClO3) 5%,
sodium thiosulfate (Na2S2O3) 2,5%, ethanol 75% và natri bicarbonate (NaHCO3)
10% làm các chất khử trùng mẫu để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm. Hiệu
quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt
như Tween 20 và Tween 80, có tác dụng làm tăng hiệu quả tác động của chất khử
trùng với bề mặt thực vật [19]. Trong quá trình khử trùng bề mặt, nếu loại mẫu thực
vật dễ bị hóa chất xâm nhập vào trong thì các mô bên trong sẽ bị khử trùng, do đó
ảnh hưởng lớn đến kết quả phân lập [36]. Các mẫu sau khi xử lý hóa chất được rửa
sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó được cắt thành các mảnh nhỏ (1 cm đối với
thân hoặc rễ và 1 cm2 đối với lá) hoặc nghiền vụn và cấy vào các môi trường thích
hợp. Trong một số nghiên cứu, các mô thực vật sau khi khử trùng bề mặt được
ngâm và đồng nhất hoàn toàn trong đệm phosphate hoặc môi trường thích hợp. Sau
đó, các dung dịch này được pha loãng theo thứ tự từ 10-1 đến 10-5 và cấy trải trên
môi trường thạch thích hợp để thu nhận các xạ khuẩn nội sinh. Trong quá trình phân

lập, một vấn đề mà các nhà nghiên cứu thường gặp phải trong hai tuần đầu tiên nuôi
cấy là vi khuẩn và nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật thường phát triển mạnh
hơn xạ khuẩn. Để khắc phục vấn đề này, môi trường phân lập thường được được bổ
sung các kháng sinh như axit nalidixic, nystatin và cycloheximide (50 hoặc 100
µg/ml) để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm nội sinh. Sau khi nuôi ở nhiệt
độ 26 ± 2°C trong 15-30 ngày, các khuẩn lạc đặc trưng của xạ khuẩn mọc trên các
đĩa môi trường. Các khuẩn lạc này được chọn lọc và tiến hành cấy trên môi trường
thích hợp để tinh sạch. Hiệu quả của phương pháp khử trùng bề mặt được kiểm tra
bằng cách cấy nước rửa mẫu cuối cùng vào một đĩa môi trường phân lập và nuôi
cấy cùng điều kiện với các đĩa môi trường chứa mẫu khác [71].

12


1.2.2. Môi trường phân lập
Thành phần môi trường là một yếu tố quan trọng quyết định đến kết quả
phân lập và phát hiện các loài xạ khuẩn mới [68]. Có nhiều loại môi trường dùng để
phân lập xạ khuẩn nội sinh đã được mô tả bởi các tác giả như: starch casein,
glycine–glycerol [51], starch casein nitrit (SCNA), chitin-vitamin B, humic acid
vitamin B agar (HV) [39], tap water-yeast extract (TWYE) [17], yeast extract
casamino acid (YECA), synthetic, Gausse cải biên [64]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra
rằng sử dụng môi trường bao gồm axit humic và vitamin để phân lập xạ khuẩn hiếm
gặp thường cho hiệu quả cao [47]. Bên cạnh đó, một số môi trường được bổ sung
axit amin (arginine, asparagine, và proline) làm nguồn nitơ và cellulose, natri
propionat, natri succinat và xylan như các nguồn cacbon, cũng cho hiệu quả phân
lập cao đối với một số loại xạ khuẩn hiếm gặp [75]. Zhao và cộng sự (2011) đã
nhấn mạnh sự cần thiết về việc sử dụng các phương pháp và môi trường phân lập
mới để phát hiện và nghiên cứu về sự đa dạng của các loài xạ khuẩn nội sinh trong
cây dược liệu [109].
1.2.3. Các nghiên cứu cải tiến hiệu quả phân lập

Đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về việc cải biến môi trường cũng như
phương pháp phân lập để tăng hiệu quả phát hiện các loài xạ khuẩn được công bố.
Năm 2014, Machavariani và cộng sự đã cải biến phương pháp xử lý mẫu bằng cách
sử dụng dung dịch các chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc thực vật là heceroauxin
và zircon, giúp phát hiện và tăng số lượng các xạ khuẩn hiếm được thu nhận từ các
cây dược liệu [60]. Năm 2012, Li và cộng sự đã sử dụng nhiều phương pháp khác
nhau để phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua
L.) và nhận thấy sự đa dạng của xạ khuẩn phân lập được ở mỗi phương pháp có sự
khác nhau rõ rệt về chủng loại. Cụ thể là, phương pháp 1: mẫu được nghiền nhỏ rồi
cấy lên 6 môi trường khác nhau, kết quả thu được một lượng lớn các xạ khuẩn thuộc
chi Amycolatopsis, Blastococcus và Glycomyces; phương pháp 2: mẫu được nghiền
nhỏ rồi đồng nhất trong nước cất vô trùng, sau đó lọc lấy dịch và cấy lên 6 môi

13


trường khác nhau, thu được một lượng lớn xạ khuẩn thuộc chi Promicromonospora,
Pseudonocardia, Rhodococcus; phương pháp 3: mẫu được nghiền nhỏ sau đó sấy ở
85°C để chọn lọc các chủng chịu nhiệt, thu được các xạ khuẩn thuộc chi
Streptosporangium,

Actinomadura,

Microbispora,

Nonomuraea

và

Phytomonospora [55]. Một số phương pháp mới như sử dụng enzyme để xử lý mẫu

và ly tâm để làm giàu tế bào xạ khuẩn cũng đã được nghiên cứu. Các phương pháp
này có thể phát hiện được hầu hết các xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật và đặc
biệt hữu ích cho việc phân lập xạ khuẩn hiếm gặp [44]. Tuy vậy, trong tương lai,
một số phương pháp xử lý mẫu tiên tiến cần được thiết kế và nghiên cứu để tăng
hiệu quả phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu [71].
1.3.

Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật

1.3.1. Đa dạng thực vật - nguồn tiềm năng về sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh
Các nhà sinh vật học bảo tồn đã nghiên cứu, dữ liệu hóa và phân loại các loài
thực vật đặc hữu trong những vùng sinh thái có độ tập trung đặc biệt cao. Đây là
những hệ sinh thái trên cạn có t nh đa dạng sinh học cao nhất, chứa 1500 loại thực
vật (0,5% trên tổng số 300 000 loài trên thế giới). Những vùng này trở thành tâm
điểm của sự đa dạng thực vật được biết đến là những nơi có phân bố các loài đặc
hữu. Hiện tại, Tổ chức Bảo tồn Quốc tế xác định có 34 vùng đa dạng thực vật cao
(Hình 1.1) [66].
Trong số 34 vùng có sự đa dạng thực vật cao, chỉ một số t được lựa chọn để
lấy mẫu cho việc phân lập xạ khuẩn nội sinh và đánh các chất có hoạt tính sinh học,
mặc dù việc nghiên cứu nấm nội sinh đã được tiến hành sớm hơn [90]. Cơ sở của
việc chọn loài thực vật để nghiên cứu xạ khuẩn chủ yếu dựa vào các cây dược liệu
truyền thống, đặc hữu của bản địa và điều kiện sinh thái của vùng. Vùng nhiệt đới
Andes là một nơi có độ đa dạng thực vật cao hàng đầu, ở đây chứa tới 6,7% loài
thực vật đặc hữu trong số 44% trên toàn cầu [65]. Loài Streptomyces MSU-2110
duy nhất tổng hợp kháng sinh peptide coronamycin đã được phân lập từ cây
Monstera sp. thuộc khu vực này [26]. Năm 2009, Bascom-Slack và cộng sự phân
14


lập được 14 chủng với tiềm năng sinh tổng hợp kháng sinh cao từ 300 mẫu thực vật

thu thập tại khu vực Lake Titicaca của vùng này [9]. Một số địa điểm như rừng
nhiệt đới Xishuangbanna thuộc tỉnh Vân Nam, cao nguyên Panxi tỉnh Tứ Xuyên
phía Tây Nam Trung Quốc và các khu bảo tồn thiên nhiên của tỉnh Phúc Kiến phía
Đông Nam Trung Quốc là những khu vực tiềm năng của các cây dược liệu quan
trọng vì ở đó có điều kiện địa lý độc đáo và lượng mưa dồi dào. Nhiều nghiên cứu
về xạ khuẩn nội sinh từ cây dược liệu truyền thống trong y học cổ truyền Trung
Quốc được thu thập từ các vùng này và các xạ khuẩn hiếm thu nhận được đã công
bố [55, 75, 77, 109]. Một số lượng nhỏ cây dược liệu của bán đảo Malayan và hai
vùng có độ đa dạng sinh học cao ở Ấn Độ là khu vực Himalaya và Western Ghats –
những khu vực có nhiều loài đặc hữu - đã được lấy mẫu để phân lập xạ khuẩn nội
sinh [6, 70, 110].

Hình 1.1. Bản đồ vị trí 34 vùng có sự đa dạng thực vật cao và việc lấy mẫu để phân
lập xạ khuẩn nội sinh.
Các khu vực rừng mưa nhiệt đới đại diện cho những vùng giàu có và đa dạng
sinh học trên trái đất. Rừng mưa nhiệt đới Xishuangbanna ở Tây Nam- Trung Quốc
là đại diện thích hợp, khu vực này chứa 16% đa dạng thực vật của Trung Quốc với
3000 loài đặc hữu. Xạ khuẩn nội sinh với tiềm năng khai thác các chất có hoát tính
15


sinh học cao đã được phân lập từ khu vực này [66]. Năm 2009, Qin và cộng sự đã
lấy mẫu 90 loài dược liệu để tiến hành nghiên cứu và cho thấy sự đa dạng của xạ
khuẩn nội sinh ở vùng này. Ngoài các loài thuộc chi Streptomycetes,
Nonstreptomycetes, Pseudonocardia, Nocardiopsis và Micromonospora đã được
báo cáo, còn phát hiện các loài thuộc chi hiếm như Lentzea, Tsukamurella,
Gordonia, Dietzia, Kineosporia, Janibacter, Kineococcus, Dactylosporangium,
Nonomuraea, Herbidospora và Glycomyces spp. . Sự đa dạng của xạ khuẩn đã được
đánh giá có liên quan đến điều kiện địa lý trong rừng mưa nhiệt đới tại thời điểm
lấy mẫu [75] . Nhiều loài dược liệu lần đầu tiên được nghiên cứu và báo cáo về sự

phân lập. Do đó, các loài thực vật ở rừng nhiệt đới được cho là một nguồn tiềm
năng của các loài xạ khuẩn hiếm và nhiều loài mới (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Một số loài xạ khuẩn nội sinh hiếm được phân lập từ cây dược liệu [66].
Vùng lấy
mẫu

Cây dƣợc liệu

Xạ khuẩn

Cát LâmNhân sâm (Panax
Trung Quốc ginseng)

Leifsonia ginsengi sp. nov.

Vân NamCơm cháy (Sambucus
Trung Quốc adnata)

Glycomyces sambucus sp. nov.

Vị
trí
Rễ
Thân

Cercidiphyllum
japonicum

Rhodococcus cercidiphylli sp. nov.

Lá

Dietzia cercidiphylli sp. nov.

Rễ

Vối thuốc (Schima sp.)

Dietzia schmiae

Gió bầu (Maytenus
austroyunnanensis)

Saccharopolyspora endophytica sp.
nov.
Glycomyces mayteni sp. nov.
Streptomyces mayteni sp. nov.

Rễ

Plantactinospora mayteni gen. nov., sp.
nov.
Nonomuraea antimicrobica sp. nov.
Actinomadura flavalba sp. nov.

Lá

Thân

Jiangella alba sp. nov.

Pseudonocardia tropica sp. nov.

Thân

Lôi công thằng
(Trypterygium wilfordii)

Kineosporia mesophila sp. nov.

Thân

Trypterygium

Saccharopolyspora tripterygii sp. nov.

Thân

16