Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen α globin gây bệnh hemoglobin h

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
------------------***-------------------

NGÔ THỊ TUYẾT NHUNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN
ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. TRƯƠNG QUỐC PHONG

HÀ NỘI - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận văn “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện
đột biến trên gen α globin gây bệnh Hemoglobin H” là công trình nghiên cứu của
tôi cùng nhóm nghiên cứu tại khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi
Trung Ương do BS Ngô Diễm Ngọc là trưởng nhóm. Tôi đã nhận được sự đồng ý
của trưởng nhóm và tất cả các thành viên trong nhóm nghiên cứu về việc công bố các
nội dung thực hiện và kết quả thu được. Các nội dung nghiên cứu và kết quả được
trình bày trong luận văn là trung thực và rõ ràng.

Xác nhận của trưởng nhóm nghiên cứu

Học viên

Ngô Thị Tuyết Nhung

i


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS. Trương Quốc Phong,
trưởng phòng thí nghiệm Proteomics- Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ
sinh học- Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình
nghiên cứu để hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn BS. Ngô Diễm Ngọc, trưởng khoa Di truyền và
Sinh học phân tử- Bệnh viện Nhi Trung Ương đã tạo đạo điều kiện cho em hoàn
thành nghiên cứu này.
Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực
phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong quá
trình học tập và rèn luyện.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình
đầy động viên khích lệ của tập thể cán bộ nhân viên khoa Di truyền và Sinh học phân
tử, tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn
quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bước trên con đường học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 09 Năm 2017
Học viên

Ngô Thị Tuyết Nhung

ii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii
MỤC LỤC .................................................................................................................. 1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......................................... 4
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... 6
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. 6
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 9
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 11
1.1.Lịch sử nghiên cứu bệnh Alpha Thalassemia .................................................... 11
1.1.1. Thế giới ....................................................................................................... 11
1.1.2.Việt Nam ...................................................................................................... 13
1.2.Cấu trúc phân tử Hemoglobin ở người bình thường ........................................... 14
1.2.1.Cấu trúc phân tử Hemoglobin ...................................................................... 14
1.2.2.Các dạng Hemoglobin trong cơ thể ............................................................. 15
1.3.Bệnh Alpha Thalassemia..................................................................................... 17
1.3.1. Khái niệm chung về bệnh Alpha Thalassemia. .......................................... 17
1.3.2.Dịch tễ học bệnh α Thalassemia .................................................................. 17
1.3.3. Đặc điểm lâm sàng bệnh α thalassemia. ..................................................... 18
1.3.3.1. Người mang gen α thalassemia. ....................................................... 19
1.3.3.2. α thalassemia thể nhẹ. ...................................................................... 19
1.3.3.3. Bệnh Hemoglobin H (HbH). ............................................................ 19
1.3.3.4. Hội chứng phù thai Hemoglobin Bart’s (Hb Bart’s). ...................... 19
1.4.Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen α globin. .................................................. 20
1.4.1. Cụm gen α globin........................................................................................ 20
1.4.2. Gen α globin. .............................................................................................. 21
1.5. Chẩn đoán bệnh Alpha Thalassemia .................................................................. 22
1.5.1. Xét nghiệm huyết đồ cơ bản ....................................................................... 22
1.5.1.1. Xét nghiệm công thức máu .............................................................. 22

1.5.1.2. Điện di Hemoglobin ......................................................................... 22
1


1.5.2.Chẩn đoán bằng sinh học phân tử ................................................................ 23
1.5.2.1. Kỹ thuật lai đặc hiệu ........................................................................ 24
1.5.2.2. Kỹ thuât khuếch đại alen đặc hiệu (Amplification refractory mutation
system- ARMS PCR) .................................................................................... 24
1.5.2.3.Kỹ thuật xử lý enzym cắt giới hạn (restriction fragment length
polymorphism analysis- RFLP PCR) ........................................................... 25
1.5.2.4. Kỹ thuật GAP-PCR .......................................................................... 25
1.5.2.5. Kỹ thuật giải trình tự gen ................................................................. 25
1.5.2.6. Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex
ligation dependent probe amplification - MLPA) ......................................... 26
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 28
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 28
2.2.Hoá chất sử dụng ................................................................................................. 28
2.3.Trang thiết bị ....................................................................................................... 28
2.4.Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 29
2.4.1. Tách chiết ADN .......................................................................................... 29
2.4.1.1. Tách chiết ADN từ máu ngoại vi[54] .............................................. 29
2.4.1.2.Tách chiết ADN từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy ....................... 30
2.4.1.3. Xác định nồng độ ADN tổng số ....................................................... 30
2.4.2. Phương pháp PCR sàng lọc 5 đột biến thường gặp trên gene HBA ........... 31
2.4.2.1.Phản ứng Mutiplex Gap PCR sàng lọc đột biến SEA, α3.7, α4.2 .... 31
2.4.2.2.Phản ứng C-ARMS PCR sàng lọc đột biến HbCS, HbQS ............... 33
2.4.3. Phương pháp điện di trên Agarose ............................................................. 34
2.4.3.1. Nguyên tắc ....................................................................................... 34
2.4.3.2. Quy trình .......................................................................................... 34
2.4.4. Phản ứng PCR khuếch đại toàn bộ gene HBA1, HBA2 ............................. 36

2.4.5. Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................................ 37
2.4.6. PCR mồi đơn............................................................................................... 37
2.4.7.Tinh sạch bằng BigDye X ............................................................................ 39
2.4.8. Phân tích trình tự gene ................................................................................ 39
2.4.9. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật Multiplex Gap- PCR và ........ 39
2


2.5.Vấn đề đạo đức nghề nghiệp………………………………………........42
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 41
3.1. Đánh giá quy trình kỹ thuật sử dụng để phát hiện đột biến gen  globin.......... 41
3.2. Kết quả xác định đột biến gen  globin trên 47 bệnh nhân HbH ...................... 44
3.2.1. Kết quả xác định 5 đột biến mất đoạn thường gặp bằng kỹ thuật Multiplex
Gap- PCR và C-ARMS PCR ................................................................................ 44
3.2.2. Kết quả xác định đột biến điểm hiếm gặp dạng mất đoạn bằng kỹ thuật giải
trình tự gen trên bệnh nhân HbH .......................................................................... 47
3.2.2.1. Đột biến điểm c.2delT (p.Met1Argfs) trên gen 2 .......................... 47
3.2.2.2. Đột biến điểm c.92 GA (p.Arg31Lys) trên gen 2 ...................... 48
3.2.2.3.Đột biến điểm c.426 AT(p.Ter142Tyr)- Hb Pakse trên gen 2 ... 50
3.2.2.4. Đột biến điểm c.81GT(p.Glu27Asp)- Hb Hekinan trên gen 1 .. 51
3.2.3. Tổng hợp kết quả về tỷ lệ các đột biến trên gen α globin của bệnh nhân HbH
............................................................................................................................... 52
3.3. Kết quả chẩn đoán trước sinh ............................................................................. 54
3.4. Đối chiếu kết quả chẩn đoán trước sinh ............................................................. 56
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 58
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 60

3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ý nghĩa

Viết tắt
/
-/

4 gen hoạt động, người bình thường
Dị hợp tử +-thal, người mang gen α+-thalassemia
(Silent Carrier)

--/

Dị hợp tử 0-thal, người mang gen α0-thalassemia (Cis)
( thalassemia trait)

-/-

Đồng hợp tử +-thal, người mang gen α0-thalassemia
(Trans)( thalassemia trait)

-3.7

Đột biến mất đoạn 1 gen lệch phải 3.7kb

-4.2

Đột biến mất đoạn 1 gen lệch trái 4.2kb

--SEA

Đột biến mất đoạn 2 gen dạng South East Asia

-HbCS

Đột biến điểm Hb Constant Spring (TAA>CAA)

-HbQS

Đột biến điểm Hb Quong Sze (CTG>CCG)

-c.2delT

Đột biến điểm ATG>A-G codon ATG gen 2

-c.92 G>A

Đột biến điểm AGG>AAG codon 31 gen 2

-c.426 A>T

Đột biến điểm TAA>TAT, Hb Pakse

-c.81G>T

Đột biến điểm GAG>GAT codon 27 gen 1, Hb Hekinan

(2β2)

Hemoglobin A

(2δ2)

Hemoglobin A2

(ζ2ε2)

Hemoglobin Gower1

(2ε2)

Hemoglobin Gower2

(ζ2γ2)

Hemoglobin Porland

(2γ2)

Hemoglobin F

β4

Hemoglobin H

γ4

Hemoglobin Bart’s

C-ARMS-PCR

Combine-Amplification Refractory Mutation SystemPolymerase Chain Reaction
4


CO2

Carbon dioxide

CO

Carbon monoxide

GAP-PCR

GAP Polymerase Chain Reaction (PCR khoảng cách)

Hb

Hemoglobin

HGB (g/dL)

Khối lượng hemoglobin (g/dL)

HCT (%)

Hematocrit (%)

HPFH

Hereditary persistence of fetal hemoglobin, Hội chứng tồn
dư huyết sắc tố bào thai di truyền

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

MLPA

Multiplex ligation dependent probe amplification

MCV (fL)

Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu

MCH (pg)

Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung
bình hồng cầu (pg)

O2

Oxygen

PCR

Polymerase Chain Reaction

RBC (1012/L)

Red Blood Cells, số lượng hồng cầu

TIF

Thalassemia International Foundation, Hiệp hội Thalassemia
quốc tế

WHO

World Health Organization, Tổ chức y tế thế giới

5


DANH MỤC HÌNH
Hình1.1: Sơ đồ cấu tạo phân tử Hemoglobin . ..........................................................14
Hình 1.2: Chức năng vận chuyển oxy của phân tử Hemoglobin. .............................15
Hình 1.3: Các chuỗi globin ở giai đoạn trước sinh, và sau sinh. ..............................16
Hình 1.4: Hội chứng phù thai do Hb Bart’s . ............................................................20
Hình 1.5: Cấu trúc cụm gen α globin ........................................................................20
Hình 1.6: Cấu trúc vùng MCS-R trong cụm gen α globin .......................................21
Hình 1.7: Cấu trúc gen α globin ................................................................................22
Hình 1.8: Điện di Hemoglobin bằng kỹ thuật HPLC ................................................23
Hình 2.1: Sơ đồ qui trình xác định đột biến  globin gây bệnh Hemoblobin H.......29
Hình 2.2: Nguyên lý của kỹ thuật GAP-PCR ..........................................................31
Hình 2.3: Nguyên lý của kỹ thuật C- ARMS-PCR ..................................................33
Hình 3.1: (A) Điện di sản phẩm Multiplex GAP-PCR, (B) Điện di sản phẩm CARMS-PCR cho 20 mẫu không có đột biến gen  globin .......................................41
Hình 3.2: Điện di sản phẩm PCR của:(A) Kỹ thuật Mutiplex GAP-PCR, (B) Kỹ thuật

C-ARMS-PCR của 20 mẫu có đột biến gen  globin. ..............................................42
Hình 3.3: Điện di sản phẩm PCR của 3 đột biến mất đoạn thường gặp trên gen 
globin của các bệnh nhân HbH bằng kỹ thuật Multiplex GAP PCR .......................44
Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 đột biến -HbCS và -HbQS bằng kỹ
thuật C-ARMS- PCR.................................................................................................45
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.2delT
(p.Met1Argfs)............................................................................................................48
Hình 3.6: Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.92G>A
(p.Arg31Lys) .............................................................................................................49
Hình 3.7: Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.426A>T
(p.Term142Tyr) .........................................................................................................50
Hình 3.8: Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.81G>T
(p.Glu27Asp) .............................................................................................................52
6


Hình 3.9: Hình ảnh điện di chẩn đoán trước sinh bệnh Hb Bart’s bằng kỹ thuật
Multiplex GAP PCR .................................................................................................54
Hình 3.10. Hình ảnh điện di chẩn đoán trước sinh bệnh Hb Bart’s bằng kỹ thuật CARMS PCR ...............................................................................................................55
Hình 3.11. Hình ảnh điện di Hemglobin máu cuống rốn thu thập từ thai bị phù mắc
Hb Bart’s ...................................................................................................................57

7


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần Hb ở các giai đoạn phát triển của người bình thường ..........15
Bảng 1.2: Các thể bệnh α thalassemia và các biểu hiện lâm sàng ............................18
Bảng 3.1: Bảng tổng kết về độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR ....................43
Bảng 3.2: Kết quả xác định 5 đột biến mất đoạn thường gặp bằng kỹ thuật Multiplex

Gap- PCR C-ARMS PCR .........................................................................................46
Bảng 3.4: Kiểu gen của 47 bệnh nhân HbH ..............................................................53
Bảng 3.5: Tổng hợp kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia ...................56

8


MỞ ĐẦU
Alpha thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng
bởi sự suy giảm hoặc thiếu hụt tổng hợp chuỗi α globin trong phân tử Hemoglobin.
Bệnh thuộc nhóm bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới, là nguyên nhân gây tan
máu hàng đầu ở trẻ em.
Bệnh α thalassemia xuất hiện ở tất cả các chủng tộc trên thế giới, đặc biệt ở
khu vực nhiệt đới, trong đó có khu vực Đông Nam Á. Hiện nay, có khoảng 5% dân
số thế giới là người mang gen bệnh α thalassemia, phân bố khác nhau ở từng quốc
gia, chủng tộc [37]. Trung Quốc, người mang gen α thalassmia chiếm 5-15% dân số
[2], Hong Kong 4% [3], Thailand 15-30% [13], Lào 43% [5], Việt Nam 5% [63].
Người bình thường có hai gen α globin nằm trên mỗi NST 16, và có tổng số
bốn gen α globin trên hai NST 16 tương đồng (αα/αα). Tùy theo số lượng gen α bị
đột biến, gây ra các biểu hiện lâm sàng ở nhiều mức độ khác nhau. Bệnh Hemoglobin
H (HbH) là một trong các thể bệnh của bệnh Alpha Thalassemia với ba trên bốn gen
α globin của cơ thể bị đột biến.
Trẻ mắc bệnh HbH thường có thiếu máu, tan máu, có thể phải phụ thuộc truyền
máu, gây hậu quả nghiêm trọng cho hàng loạt các cơ quan trong cơ thể. Nếu không
được điều trị, trẻ mắc HbH thể nặng thường tử vong sớm, hoặc muộn hơn vì các biến
chứng của bệnh.
Tại bệnh viện Nhi Trung Ương, mỗi năm tiếp nhận khoảng 50 trường hợp trẻ
bị HbH mắc mới. Các xét nghiệm công thức máu và phân tích thành phần Hemoglobin
góp phần đáng kể trong việc hỗ trợ chẩn đoán ban đầu. Tuy nhiên, các xét nghiệm
này không chỉ ra chính xác kiểu gen đột biến và không thể chẩn đoán trước sinh cho

thai nhi. Do đó, việc xác định loại đột biến gây bệnh HbH bằng các kỹ thuật phân tử
đóng vai trò quan trọng trong việc xác định thể bệnh, là cơ sở thiết yếu cho tư vấn di
truyền và chẩn đoán trước sinh bệnh α thalassemia.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh học
phân tử phát hiện đột biến trên gen α globin gây bệnh Hemoglobin H”
9


Mục tiêu của đề tài:
-

Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện các đột biến trên gen α

globin gây bệnh Hemoglobin H và chẩn đoán trước sinh bệnh α Thalassemia

10


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.Lịch sử nghiên cứu bệnh Alpha Thalassemia
1.1.1. Thế giới
Năm 1954 Minnich lần đầu tiên mô tả một bệnh nhân thiếu máu người Thái
Lan với một đặc điểm là có nhiều thể vùi trong hồng cầu. Lúc đó ông gọi loại thiếu
máu này là thiếu máu có thể vùi trong hồng cầu. Ngoài đặc điểm trên, Minnich còn
thấy ở bệnh nhân này có hồng cầu biến dạng kiểu thalassemia, nhiều hồng cầu hình
bia và một số hồng cầu mảnh [22].
Năm 1955 Rigarass [38], và năm 1956 Goutass [15] đều độc lập công bố tìm
được HbH trong thành phần Hb của một số bệnh nhi. Tuy nhiên, các tác giả khi đó
gọi bệnh HbH như một bệnh Hb riêng biệt, chưa tìm thấy mối liên hệ giữa bệnh HbH
và bệnh α thalassemia.

Năm 1959 Ramot [10] đã tách được thành phần Hb Bart’s trong máu của bệnh
nhân HbH. Những phát hiện này giúp các nhà nghiên cứu hướng tới mối liên hệ giữa
bệnh HbH và các thể của bệnh α thalassemia. Điều này được di truyền phân tử xác
minh vào những năm sau này.
Năm 1963 Dance đã phát hiện ra cơ chế tạo thành HbH nhờ phát hiện được
phần globin của HbH gồm 4 chuỗi β. Do khi chuỗi α bị giảm, các chuỗi β tăng tổng
hợp tạo các chuỗi β thừa dư. Các chuỗi này kết hợp với nhau tạo thành phân tử β4, là
phần globin của HbH [65]. Tương tự cơ chế như vậy, trong thời kỳ bào thai, các chuỗi
“không α” lúc đó chủ yếu là chuỗi γ. Khi chuỗi α giảm hoạt động, các chuỗi γ tăng
tổng hợp, tạo các chuỗi γ thừa dư. Các chuỗi này sẽ kết hợp tạo thành phân tử Hb
Bart’s γ4. Nhờ sự phát hiện này bản chất globin của HbH và Hb Bart’s đã được phát
hiện, và từ đó các nhà nghiên cứu đã đi sâu vào bản chất của bệnh.
Đầu những năm 60, ngoài việc nghiên cứu những biểu hiện đa dạng của bệnh
HbH, các tác giả bắt đầu đi vào nghiên cứu lĩnh vực gen di truyền của bệnh α
thalassemia nói chung và các thể bệnh α thalassemia nói riêng [18].

11


Năm 1964, Wealtherall lần đầu tiên đưa ra giả thuyết có 2 cặp gen α globin.
Mô hình này đã giải thích được các biểu hiện phong phú của các thể bệnh α
thalassemia, cũng như các biểu hiện lâm sàng đa dạng của bệnh HbH ở các dân tộc
khác nhau [19].
Trong cùng năm 1964, Wasi đã đưa ra bằng chứng chứng minh cho giả thuyết
có 2 gen α globin. Ông đã quan sát tỷ lệ mắc bệnh HbH trong gia đình mắc bệnh là
1/4. Từ đó tác giả cho rằng ngoài gen kinh điển ở 1 trong 2 người bố và mẹ gây bệnh
thì còn có 1 gen nhẹ hơn nằm ở người còn lại, có tác dụng tương hỗ với gen kinh điển
tạo nên bệnh HbH [32].
Cùng thời gian này, Wasi và cộng sự cũng tiến hành một nghiên cứu trên các
bệnh nhân mắc HbH tại Thái Lan, kết quả cho thấy: Điện di máu cuống rốn của 30

trẻ sơ sinh được sinh ra từ các cha mẹ mắc bệnh HbH, đã phát hiện 29/30 trường hợp
có Hb Bart’s. Điều đó chứng tỏ hầu như tất cả các trẻ sơ sinh sinh ra từ các cha mẹ
mắc bệnh HbH đều là người mang gen α thalassemia [32] . Những trẻ này được phân
làm 2 nhóm dựa vào những đặc điểm máu ngoại vi: Nhóm thứ nhất gồm 14 trẻ có
biến đổi hình thái hồng cầu ngoại vi theo kiểu thalassemia, hồng cầu nhỏ, nhược sắc,
to nhỏ không đều. Tăng sức bền thẩm thấu hồng cầu. Lượng Hb Bart’s trong máu
cuống rốn chiếm 5-6% trong thành phần Hb của cơ thể. Nhưng biểu hiện lâm sàng và
huyết học trên cho phép xếp nhóm trẻ này vào nhóm α1- thalassemia. Nhóm thứ hai:
gồm những trẻ còn lại không có biến đổi về hình dáng hồng cầu ngoại vi, hoặc có
biến đổi rất ít, không đáng kể. Sức bền thẩm thấu hồng cầu đạt mức bình thường.
Lượng Hb Bart’s trong máu cuống rốn chiêm 1-2% trong thành phần Hb. Những biểu
hiện trên cho phép xếp nhóm trẻ này vào nhóm α2-thalassemia.
Như vậy, quan sát trên cho phép tác giả nhận định rằng bệnh HbH bao gồm cả
2 gen α1 và α2 thalassemia. Về mặt di truyền có thể coi bệnh HbH là thể dị hợp tử
kép của α1/α2 thalassemia.
Năm 1965, Nannakorn đã có một nghiên cứu trên 138 bệnh nhân HbH ở
Thailand với những mô tả về đặc điểm huyết học khá đầy đủ. Ngoải ra, tác giả còn

12


đề cập đến vấn đề cắt lách đối với những bệnh nhân HbH có thể cái thiện tốt tình
trạng của bệnh [26].
Cho đến năm 1980, sinh học phân tử trong bệnh α thalassemia mới được hoàn
toàn hiểu rõ, được công bố rộng rãi với các nghiên cứu của Higgs [71]
1.1.2.Việt Nam
Tại Việt Nam, bệnh lý về huyết sắc tố được bắt đầu nghiên cứu từ những năm
1960, tuy nhiên hầu hết đều tập trung vào β Thalassemia và HbE [3]. Đối với bệnh α
Thalassemia, từ trước năm 1985, bệnh này chưa được phát hiện ở Việt Nam do chưa
áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán. Dựa vào điều kiện địa lý ở vùng Đông Nam Á, một

số nhà nghiên cứu về huyết học ở nước ta lúc đó dự đoán có thể có bệnh α thalassemia
tại Việt Nam. Đến năm 1985, dự đoán ấy mới được chứng minh nhờ sự phát hiện
bệnh HbH, là một thể bệnh của α thalassemia.
Năm 1996, Dương Bá Trực tiến hành nghiên cứu: “Đặc điểm lâm sàng và
huyết học bệnh HbH ở trẻ em Việt Nam. Bước đầu tìm hiểu tần suất bệnh Alpha
Thalassemia ở Hà Nội”. Đây là nghiên cứu đầu tiên trên đối tượng bệnh nhân HbH.
Tuy nhiên, tại thời điểm nghiên cứu, chưa có sự ứng dụng của sinh học phân tử để
xác định kiểu gen của bệnh [9].
Năm 2005, Trần Thuỳ Ngân đã ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định kiểu gen thalassemia trong vùng dịch tễ sốt rét của tỉnh Bình Phước [5].
Từ năm 2008 đến 2013, Nguyễn Khắc Hân Hoan đã tiến hành nghiên cứu: “Nghiên
cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh  và  thalassemia”. Nghiên cứu tiến hành
trên đối tượng là các phụ nữ mang thai. Khi người vợ và người chồng có kết quả tầm
soát huyết đồ nghi ngờ là người mang gen bệnh thalassemia, được thực hiện xét nghiệm
di truyền phân tử để khẳng định, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh [1].
Từ năm 2013 đến 2015, Ngô Diễm Ngọc và cộng sự đã nghiên cứu về mối liên
hệ giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Alpha Thalassemia trên các bệnh nhân đến
khám và điều trị tại bệnh viện Nhi Trung Ương và tiến tới sàng lọc người mang gen,
tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh[6], [7].

13


Năm 2015, Ngô Thị Tuyết Nhung và cộng sự đã ứng dụng các kỹ thuật phân tử
để chẩn đoán bệnh HbH trên đối trượng bệnh nhi tại bệnh viện Nhi Trung Ương [8].
1.2.Cấu trúc phân tử Hemoglobin ở người bình thường
1.2.1.Cấu trúc phân tử Hemoglobin
Phân tử Hemoglobin (Hb) ở người là một phân tử protein được cấu tạo từ hai
cặp chuỗi dimer polypeptide, α và β globin, tạo thành cấu trúc tetramere. Phân tử α2β2
là cấu trúc của phân tử Hb ở người trưởng thành. Chức năng chính của phân tử này
là vận chuyển oxygen (O2) từ phổi đến các tổ chức, và vận chuyển carbon dioxide

(CO2), carbon monoxide (CO), nirtric oxide (NO) theo chiều ngược lại [2333].
Chức năng của phân tử Hb được hình thành dựa trên đặc điểm cấu tạo các
chuỗi amino acid của chuỗi globin, bao gồm 7 vòng xoắn của chuỗi α và 8 vòng xoắn
của chuỗi β globin. Các vòng xoắn này lần lượt gấp lại tạo thành các phân tử dimer
và sau đó tạo thành cấu trúc tetramere. 4 chuỗi polypeptide của phân tử Hb khi kết
hợp với nhau thì mỗi chuỗi tạo ra ở phần trung tâm một vị trí để gắn phần nhân Hem,
là phân tử sắt-protoporphyrin IX, mang liên kết hóa trị mạnh, do đó phân tử này được
bảo vệ khỏi sự xâm nhập của môi trường xung quanh. Do đó, cấu trúc phân tử Hb
gồm hai phần: phần globin và phần HEM [33].

Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo phân tử Hemoglobin [33].
Phần HEM là phần tạo nên màu đỏ của chất Hb, có cấu trúc chung cho nhiều
loài. Phần này là một vòng protoporphyrin và một nguyên tử sắt hóa trị II (Hình1.1).
Nhân Protoporphyrin gồm 4 vòng pyrol, gắn với nhau qua các cầu nối methan (-CH=)
và một số mạch thẳng gồm methy (- CH3 =), vinyl (- CH = CH2) và propionate (- CH2
14


- CH2 - COOH). Nguyên tử sắt nằm ở trung tâm, có hai mối liên kết chặt chẽ với hai
nguyên tử nito và hai mối liên kết giả với hai nguyên tử nito khác, do quá tình chuyển
và nhận điện tích. Ở người những rối loạn bệnh lý trong phần HEM ít xảy ra hơn hẳn
so với những rối loạn bệnh lý trong phần globin [33].
Phần globin có bản chất là protein. Phần này đặc hiệu cho từng loài. Ở người,
phần globin được cấu tạo bởi 4 chuỗi polypeptide giống nhau từng đôi một, gắn với
nhau. Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM. Do đó, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi
polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển 4 phân tử oxy [33].

Hình 1.2: Chức năng vận chuyển oxy của phân tử Hemoglobin [33].
1.2.2.Các dạng Hemoglobin trong cơ thể
Trong quá trình phát triển cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có sự

chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống. Phân
tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả chia chuỗi polypeptide
thành các loại như sau: Chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (γ), chuỗi delta
(δ), chuỗi epsilon (ε), chuỗi zeta (ζ) [12].
Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin. Các
loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau. Trong hồng cầu
của người bình thường trưởng thành, hemoglobin A (α2β2) chiếm khoảng 97% trong
tổng số Hb của cơ thể, hemoglobin A2 (α2δ2) chiếm ~2% và hemoglobin F
(hemoglobin bào thai) (α2γ2) chiếm ~ 1% [12].
Bảng 1.1: Thành phần Hb ở các giai đoạn phát triển của người bình thường
15


Thai < 8 tuần

Hb Gower

HbF

HbA1

HbA2

(ζ2ε2; α2ε2)

( α 2 γ2 )

(α2β2)

(α2δ2)

Nhiều

Ít

Thai > 8 tuần

90-99%

1-10%

Sơ sinh

60-90%

10-40%

<1%

<2%

96%

~3%

Trẻ > 1 tuổi và
người trưởng thành

2 gen ζ và ε chỉ biểu hiện trong giai đoạn sớm của phôi, sau đó giảm dần và
thay bằng sự biểu hiện của 2 gen α và 2 gen γ, hình thành nên Hemoglobin Gower1

(ζ2ε2), Gower2 (α2ε2) và Porland (ζ2γ2). 2 gen α và γ dần dần biểu hiện tạo thành HbF
(α2γ2), là loại Hb chiếm ưu thế ở 3 tháng giữa của thai kỳ và có ái lực với oxy tăng
nhẹ so với Hb ở người trưởng thành (Hình 1.3). Tại thời điểm sinh, gen α globin đã
đạt đến mức độ hoạt động đầy đủ, gen γ giảm hoạt động, nhóm gen β (δ và β) dần
dần tăng hoạt động. Do đó ở người bình thường, khi được 1 tuổi, loại hemoglobin
chiếm ưu thế là Hb của người trưởng thành HbA và HbA2.Tuy nhiên trong một vài
trường hợp, gen γ globin vẫn tiếp tục được biểu hiện trong tế bào hồng cầu trưởng
thành, gây hội chứng tồn dư huyết sắc tố bào thai có tính chất di truyền (HPFH) [12].

Hình 1.3: Các chuỗi globin ở giai đoạn trước sinh, và sau sinh [12].

16


1.3.Bệnh Alpha Thalassemia
1.3.1. Khái niệm chung về bệnh Alpha Thalassemia.
Thalassemia là một nhóm bệnh di truyền lặn trên NST thường có biểu hiện
lâm sàng là tình trạng thiếu máu ở các mức độ khác nhau. Thuật ngữ “Thalassemia”
có nguồn gốc từ Hy Lạp, “thalassa” nghĩa là biển, “heama” nghĩa là máu, hay còn gọi
là “bệnh máu vùng biển”, được phát hiện đầu tiên và gặp phổ biến ở các nước thuộc
vùng biển Địa Trung Hải [34].
Bệnh thalassemia được phân loại dựa trên loại chuỗi globin nào trong phân tử
hemoglobin bị đột biến. Chuỗi β globin được mã hóa bởi gen β globin trên NST 11
và chuỗi α globin được mã hóa bởi gen α globin trên NST 16. Ở người bình thường,
có 4 locus gen mã hóa cho chuỗi α globin và 2 locus gen mã hóa cho chuỗi β globin.
Hai loại chuỗi này tạo nên phân tử α2β2 là hemoglobin A (HbA), chiếm 95% thành
phần Hb ở người trưởng thành [26].
Bệnh α thalassemia là bệnh thiếu máu tan máu di truyền gây ra do giảm hoặc
mất hẳn sự tổng hợp của chuỗi α globin trong phân tử Hb. Sự suy giảm tổng hợp này
dẫn đến sự dư thừa của chuỗi β globin tạo phân tử γ4, gọi là Hb Bart’s (thời kỳ bào

thai), và β4, và HbH (thời kỳ trưởng thành) [49].
1.3.2.Dịch tễ học bệnh α Thalassemia
Như hầu hết các bệnh về rối loạn gen globin nói chung, bệnh α thalassemia
xảy ra ở tất cả các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với tần số cao. Ở một số vùng, tần
số người mang gen α thalassemia có thể chiếm 80-90% dân số [28]. Các bằng chứng
về dịch tễ học đã chứng minh rằng các rối loạn về gen globin nói chung và bệnh α
thalassemia nói riêng có liên quan đến các khu vực lưu hành bệnh sốt rét, mặc dù cơ
chế về vấn đề này tuy đã được nghiên cứu rộng rãi nhưng vẫn chưa được sáng tỏ [71].
Trong tất cả các bệnh về rối loạn gen globin, bệnh α thalassemia là bệnh có sự
phân bố rộng rãi nhất. Do đó, với sự kết hợp giữa các dạng allen đột biến khác nhau
của bệnh α thalassemia, cũng như giữa bệnh α và β thalassemia, đã tạo ra nhiều kiểu
hình phong phú của bệnh. Và cũng vì thế, bệnh HbH, là α thalassemia thể trung gian
được tìm thấy chủ yếu ở Đông Nam Á, Trung Đông và Địa Trung Hải.
17


Bệnh α thalassemia xuất hiện ở tất cả các chủng tộc trên thế giới, rất phổ biến
ở Đông Nam Á. Hiện nay, có khoảng 5% dân số thế giới là người mang gen bệnh α
thalassemia, phân bố khác nhau ở từng quốc gia, chủng tộc [37]. Trung Quốc, người
mang gen α thalassmia chiếm 5-15% dân số [2], Hong Kong 4% [3], Thailand 1530% [13], Lào 43% [5], Việt Nam 5% [63].
Thalassemia là một vấn đề toàn cầu. Trong khoảng 20 năm tới, ước tính sẽ có
khoảng 900,000 trẻ sinh ra mắc bệnh Thalassemia, trong đó 95% số trẻ này thuộc về
các nước Châu Á, Ấn Độ, và Trung Đông. Sự gia tăng nhanh chóng của quần thể
người thalassemia ở các khu vực này đang thay đổi bộ mặt lâm sàng của bệnh
thalassemia trên thế giới. Ngày nay, dịch tễ học của bệnh thalassemia đã thay đổi một
cách đáng kể so với trước đây. Thalassemia hiện nay là nhóm bệnh không thuần nhất
với sự khác nhau về tính chủng tộc, kiểu hình, kiểu gen, và cách thức điều trị. Trước
đây, bệnh HbE-β thalassemia và HbH rất hiếm gặp ở Bắc Mỹ và Châu Âu, nhưng
ngày nay do sự di dân, các bệnh lý này đã trở nên thường gặp hơn so với bệnh
thalassemia thể nặng điển hình [48].

1.3.3. Đặc điểm lâm sàng bệnh α thalassemia.
Bệnh α thalassemia được chia thành 4 thể khác nhau tùy theo số lượng gen α
globin bị đột biến, với các biểu hiện lâm sàng rất phong phú và khác nhau ở mỗi thể
bệnh (Bảng 1.2)
Bảng 1.2: Các thể bệnh α thalassemia và các biểu hiện lâm sàng
Thể bệnh

Biểu hiện bệnh

Người mang gen

Lâm sàng và huyết học bình thường

α thalassemia thể nhẹ

Thiếu máu nhẹ, hồng cầu nhỏ nhược sắc

Bệnh HbH

Thiếu máu từ vừa đến nặng, hồng cầu nhỏ, nhược sắc,
tan máu, vàng da, gan lách to.

Bệnh Hb Bart’s

Thiếu máu nặng, phù toàn thân, tràn dịch màng bụng, gan
lách to, dị tật xương, tim mạch, lưu thai

18

1.3.3.1. Người mang gen α thalassemia.
Người mang gen α thalassemia có lâm sàng và huyết học bình thường, không
có biểu hiện thiếu máu hồng cầu nhỏ nhược sắc trên xét nghiệm công thức máu.
1.3.3.2. α thalassemia thể nhẹ.
Người α thalassemia thể nhẹ thường không có triệu chứng lâm sàng, chỉ được
phát hiện qua xét nghiệm công thức máu biểu hiện thiếu máu hồng cầu nhỏ nhược
sắc mức độ từ nhẹ đến trung bình. Các dấu hiệu khác liên quan đến tình trạng thiếu
máu như xanh xao, mệt mỏi, thở nhanh, ngắn thường rất hiếm gặp, hoặc nếu có thì
thường liên quan đến các bệnh tật khác kèm theo.
1.3.3.3. Bệnh Hemoglobin H (HbH).
Bệnh HbH thường gặp ở những bệnh nhân mang dị hợp tử kép của hai đột biến
trên gen α globin, trong đó có một đột biến mất đoạn hai gen và một đột biến mất
đoạn một gen. Ở những bệnh nhân này, chuỗi α globin chỉ được tổng hợp bằng khoảng
30% so với bình thường. Triệu chứng lâm sàng thường gặp nhất ở bệnh nhân HbH là
tình trạng thiếu máu (2.6-13.3g/dl) với lượng HbH thay đổi từ 0.8-40%, đôi khi còn
có kèm theo Hb Bart’s ở một vài trường hợp. Bệnh nhân thường có lách to. Vàng da
có thể xuất hiện ở nhiều mức độ khác nhau. Trẻ mắc HbH có thể có biểu hiện chậm
lớn. Ngoài ra còn có thể có các dấu hiệu do biến chứng khác của bệnh như: nhiễm
trùng, các vết loét ở chi dưới, sỏi mật, suy giảm acid folic và có thể có các cơn tan
máu cấp sau khi điều trị thuốc hoặc sau các đợt nhiễm trùng nặng. Bệnh nhân lớn tuổi
hơn có thể kèm theo biểu hiện thừa sắt ở nhiều mức độ khác nhau [41, 69].
1.3.3.4. Hội chứng phù thai Hemoglobin Bart’s (Hb Bart’s).
Hội chứng phù thai do Hb Bart’s là thể bệnh nặng nhất của α thalassemia, do
mất hoàn toàn 4 gen α globin, gây nên tình trạng suy giảm hoàn toàn khả năng sản
xuất chuỗi α globin.
Trẻ mắc Hb Bart’s có thành phần Hb trong hồng cầu chủ yếu là loại Hb không
có chức năng γ4 và β4. Tuy nhiên, vẫn còn một lượng Hb bào thai Porland (ζ2γ2) tồn
tại, là loại Hb duy nhất có chức năng vận chuyển oxy để duy trì sự sống cho bảo thai.
19

Biểu hiện lâm sàng của trẻ mắc Hb Bart’s có da xanh xám, phù nề, suy tim và thiếu
máu kéo dài từ giai đoạn thai trong tử cung (Hình 4). Ngoài ra còn biểu hiện gan lách
to, não chậm phát triển, hệ xương và hệ tim mạch phát triển bất thường, bánh rau dày.
Trẻ mắc Hb Bart’s hầu hết thường tử vong ngay trong giai đoạn thai (23-38 tuần)
hoặc ngay sau khi sinh. Chỉ có một vài trường hợp báo cáo là sống sót nhờ được điều
trị tích cực và truyền máu ngay trong giai đoạn sơ sinh [20].

(A)

(B)

Hình 1.4: Hội chứng phù thai do Hb Bart’s [20].
A: Máu ngoại vi có hồng cầu non, nhỏ, nhược sắc. B: Phù thai do Hb Bart’s
1.4.Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen α globin.
1.4.1. Cụm gen α globin.
Cụm gen α globin (α globin cluster) bao gồm các gen chức năng là hai gen α
(α2, α1), 1 gen phôi (ζ2), 3 giả gen (ψζ1, ψα2, ψα1), và 1 gen chưa xác định được
chức năng (θ1). Các gen này sắp xếp theo trình tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ như sau: 5’ζ2 - ψζ1 - ψα2 - ψα1 - α2 - α1 - θ1 - 3’ (Hình 5) [42].

Hình 1.5: Cấu trúc cụm gen α globin [21]
20


Cụm gen bình thường được ký hiệu là αα, có chiều dài khoảng 25-65 kb. Phía
đầu nguồn của cụm gen có 4 trình tự không mã hóa có tính bảo tồn cao, hay còn gọi
là trình tự bảo tồn đa loài (Multi- species conserved sequence - MCS), gọi là MCSR1 đến -R4, là những trình tự tham gia vào quá trình điều hòa gen α globin. Cho đến
nay, chỉ có MCR2, hay còn được biết đến với tên gọi HS-40 là được chứng minh rằng
có vai trò quan trọng cho sự biểu hiện của gen α globin [15].

Hình 1.6: Cấu trúc vùng MCS-R trong cụm gen α globin [15]
HS-40 là một đoạn trình tự ADN có chiều dài khoảng 40kb nằm ở đầu nguồn của
cụm gen α globin, là một vùng DNA có tính nhạy cảm cao và là vị trí gắn với các yếu
tố trong quá trình dịch mã. Sự toàn vẹn của vùng HS-40 là yếu tố cần thiết cho sự
biểu hiện của gen α globin, nhiều bằng chứng đầy đủ đã chỉ ra rằng mất đoạn vùng
HS-40 làm mất hoàn toàn khả năng biểu hiện của cụm gen α globin phía hạ nguồn,
và có biểu hiện như một người mang gen α-thalassemia [15].
1.4.2. Gen α globin.
Có 2 gen α globin, α1 và α2, với tổng chiều dài khoảng từ 1 đến 2kb. Mỗi gen
gồm 3 exon (vùng mã hóa protein), và 2 intron (vùng không mã hóa). Chiều dài và
trình tự của các vùng intron tương đối khác nhau và thay đổi giữa các cá thể (Hình 9)
[71].
Gen α1 và α2 có chiều dài 850bp, cùng mã hóa cho chuỗi α globin gồm 141
acid amin, là thành phần cấu tạo nên phân tử Hb của cơ thể. Trong đó, gen α2 có vai
trò gấp đôi gen α1 trong quá trình sản xuất chuỗi α globin. Điều này có thể do các tác
động khác nhau của các trình tự khởi đầu nằm gần các trình tự mã hóa, làm cho các
đột biến trên gen α2 thường dẫn đến các hậu quả nghiêm trọng hơn so với cùng đột
biến đó nếu nằm trên gen α1 globin [71]
21


Hình 1.7: Cấu trúc gen α globin [71]
Như vậy, mỗi người bình thường có 2 NST số 16 thì sẽ có tổng số 4 gen α
globin mang chức năng. Về tổng số, sản phẩm chuỗi α globin được sản xuất từ 4 gen
α globin tương đương với sản phẩm chuỗi β globin được sản xuất từ 2 gen β globin
nằm trên NST số 11, tạo ra phân tử Hb có 4 chuỗi globin
1.5. Chẩn đoán bệnh Alpha Thalassemia
1.5.1. Xét nghiệm huyết đồ cơ bản
1.5.1.1. Xét nghiệm công thức máu
Xét nghiệm huyết học được coi là xét nghiệm ban đầu để phát hiện người bệnh

và sàng lọc người mang gen bệnh α-thalassemia, cho phép đánh giá tình trạng thiếu
máu (Hb giảm), hồng cầu nhỏ (MCV giảm), nhược sắc (MCH giảm), mức độ giảm
tuỳ thuộc vào số lượng gen bị đột biến và loại đột biến ảnh hưởng đến quá trình tổng
hợp chuỗi α globin [31]. Tuy nhiên những xét nghiệm này không đặc hiệu và không
có giá trị chẩn đoán xác định.
1.5.1.2. Điện di Hemoglobin
Phương pháp điện di Hb được sử dụng để phân tích các thành phần Hb bất
thường. Đây là loại xét nghiệm quan trọng, đặc biệt đối với người mắc HbH và khi
sàng lọc Hb Bart’s trong thời kỳ sơ sinh để phát hiện người lành mang gen αthalassemia, hoặc được dùng để phát hiện bất kỳ loại Hb bất thường nào khác kết hợp
với α-thalassemia. Ở người α-thalassemia thể nhẹ, HbA2 trong điện di Hb có thể giảm

22