Phương pháp thử nghiệm tế bào (Nuôi cấy tế bào động vật)

Nuôi cấy mô động vật


Nuôi cấy mô động vật là gì?
• Nuôi cấy in vitro (culture) (duy trì và/ hoặc
tăng sinh (proliferate)) tế bào, mô hoặc cơ
quan
• Các dạng nuôi cấy mô
• Nuôi cấy cơ quan
• Nuôi cấy mô
• Nuôi cấy tế bào


Nuôi cấy cơ quan
• Phôi hoặc cơ quan được tách từ cơ thể và được
nuôi cấy in vitro.
• Thuận lợi
• Chức năng sinh lý bình thường được duy trì.
• Tế bào vẫn duy trì sự biệt hóa.

• Bất lợi
• Không có khả năng làm tăng các phôi hoặc cơ quan.
• Tăng trưởng chậm.
• Môi trường nuôi cấy cần vô trùng trong mỗi lần thí
nghiệm.


Nuôi cấy mô
• Một phần mô sau khi được tách ra được nuôi trong
môi trường nuôi cấy
• Thuận lợi

• Chức năng bình thường có thể được duy trì.
• So với nuôi cấy cơ quan thì có thể gia tăng mô (nhưng
thường không dễ đạt).

• Bất lợi
• Tổ chức gốc của các mô bị mất.


Nuôi cấy tế bào
• Mô sau khi được tách ra thường được phân cắt
thành tế bào (thường sử dụng enzyme), các tế bào
sau đó được nuôi trong môi trường nuôi cấy.
• Thuận lợi
• Phát triển một dòng tế bào qua nhiều thế hệ
• Có thể làm gia tăng số lượng

• Bất lợi
• Tế bào có thể mất vài đặc tính của sự biệt hóa.


EMP04


Tại sao cần phải nuôi cấy tế bào?
• Nghiên cứu
• Tránh được các khó khăn trong nghiên cứu phản ứng tế
bào:
• Ảnh hưởng (phá hủy) các mô xung quanh
• Sự thay đổi của động vật thử nghiệm dưới những điều kiện
stress của thử nghiệm.

• Làm giảm số lượng động vật thử nghiệm

• Có khả năng thương mại hóa với tỷ lệ cao
• Tạo ra các tế bào (vật liệu): vaccine, antibody, hormone


Những thuận lợi của nuôi cấy tế bào
• Thuận lợi:
• Có thể kiểm soát môi trường
• Mẫu đồng nhất
• Cần ít hóa chất/ thành phần hơn mô hình động vật

• Bất lợi:
• Khó duy trì các dòng tế bào
• Giá thành cao (do chỉ một phần nhỏ của mô tăng
trưởng)
• Khó biệt hóa


Các dạng nuôi cấy tế bào
1. Nuôi cấy sơ cấp (Primary Cultures)
•

Lấy trực tiếp từ mô động vật, phôi hoặc người trưởng
thành
•
•

•

Thuận lợi:
•

•

Nuôi cấy các mô từ động vật
Nuôi cấy dòng tế bào đơn (bằng enzyme, hoặc cơ học)
Thường duy trì được đặc tính biệt hóa của tế bào in vivo

Bất lợi:
•
•
•

Giai đoạn đầu tế bào không đồng nhất, càng về sau nguyên
bào sợi (fibroblast) trở nên trội hơn.
Sự chuẩn bị các dòng tế bào sơ cấp thường rất thủ công
Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn.


Các dạng nuôi cấy tế bào
2. Nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture)
•
•
•
•
•
•
•

Nuôi cấy từ dòng tế bào sơ cấp
Đã được phân lập bằng cách chọn lọc hoặc tạo dòng
Các dòng tế bào đồng dạng
Chu kỳ sống giới hạn in vitro
Duy trì được các kiểu hình được biệt hóa
Phụ thuộc vào giá thể nuôi
Có sự nhiễm do tiếp xúc


Các dạng nuôi cấy tế bào
3. Nuôi cấy liên tục
Từ những dòng tế bào sơ cấp
Subculture = phân lập và nuôi cấy các dòng tế bào sau khi gia
tăng mật số trong môi trường và cơ chất thích hợp.

Thường là những dòng tế bào đơn
Có thể tăng sinh trong môi trường qua nhiều lần cấy
chuyển
Có hai loại tế bào
Dòng tế bào (Cell line)
Dòng tế bào liên tục (Continuous cell line)
11


Các dạng nuôi cấy tế bào
1) Dòng tế bào (Cell line)
•
•

Giới hạn chu kỳ sống, thường “già” khoảng 3 chu
kỳ phân chia
Thường ở dạng lưỡng bội và giữ được vài đặc
điểm của sự biệt hóa.


Nuôi cấy liên tục
2) Dòng tế bào liên tục (Continuous cell lines)
•
•

Có thể nhân lên không giới hạn
Có khả năng thay đổi hình dạng bởi:
•
•
•

•

Tế bào khối u
Gene ung thư
Xử lý hóa chất

Đặc điểm ban đầu của sinh vật bị thay đổi hoặc
mất


Quy trình nuôi cấy tế bào
Mô động vật
Tách tế bào

Dòng tế bào sơ cấp
Nuôi cấy
Lưu trữ

Dòng tế bào Dòng tế bào liên tục

Lưu trữ

Số lượng tăng giới hạn Số lượng tăng không giới hạn


Sự đa dạng của hình thái tế bào phụ thuộc vào loại tế bào

Fibroblastic

Epithelial

Endothelial

Neuronal


Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Để tế bào tăng trưởng cần những điều kiện gì?
• Cơ chất hoặc dung dịch (flask nuôi cấy tế bào)
Dĩa nhựa có thành phần hóa học phù hợp hoặc được
tráng với protein ECM.
Môi trường lỏng (suspension)
• Chất dinh dưỡng là môi trường nuôi chính

• Điều kiện môi trường (CO2, nhiệt độ 37oC, độ ẩm)
Oxy duy trì ổn định
• Vô trùng tuyệt đối


Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Môi trường cơ bản
• Duy trì pH và áp suất thẩm thấu (260-320 mOsm/L).
• Cung cấp chất dinh dưỡng và năng lượng
Thành phần của môi trường cơ bản
Muối vô cơ
• Duy trì áp suất thẩm thấu
• Kiểm soát tính thấm của màng (Na+, K+, Ca2+)
• Ion và các cofactor của enzyme
Chất chỉ thị pH – Phenol Red
• Thích hợp nhất cho tế bào tăng trưởng pH 7.4


Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Thành phần môi trường cơ bản
Dung dịch đệm (Bicarbonate và HEPES)
• Dung dịch đệm bicarbonate cung cấp CO2 khí quyển
• HEPES có pH 7.2 – 7.6 (không cần CO2)
Glucose
• Cung cấp năng lượng
Acid keto (oxaloacetate và pyruvate)
• Chất trung gian của chu trình đường phân và chu trình
Krebs

• Acid keto được thêm vào môi trường như nguồn năng
lượng
• Duy trì sự chuyển hóa tế bào ở mức cao nhất


Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Thành phần cơ bản của môi trường
Carbohydrate
• Nguồn năng lượng
• Glucose và galactose
• Nồng độ thấp (1 g/L) và cao(4.5 g/L) trong môi trường cơ
bản
Vitamin
• Tiền chất của nhiều cofactor
• Vitamin nhóm B cần cho sự tăng trưởng và tăng sinh của tế
bào
• Vitamin phổ biến thường tìm thấy trong môi trường cơ bản
là riboflavin, thiamine và biotin
Các yếu tố khác
• Kẽm, đồng, selenium và chất trung gian tricarboxylic acid


Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Các chất bổ sung
L-glutamine
• Acid amin thiết yếu (tế bào không tổng hợp được)
• Nguồn năng lượng (chu trình citric acid), sử dụng
trong sự tổng hợp protein

• Môi trường lỏng thường không ổn định- thêm vào
như chất bổ sung
Acid amin không thiết yếu
• Thường được thêm vào môi trường cơ bản
• Nguồn năng luợng, tổng hợp protein


Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Chất bổ sung
Yếu tố tăng trưởng và hormone (ví dụ: insulin)
• Kích thích sự vận chuyển glucose và sử dụng
glucose
• Hấp thu acid amin
• Duy trì sự biệt hóa
Chất kháng sinh, kháng nấm
• Penicillin, streptomycin, gentamicin, amphotericin B
• Giảm nguy cơ nhiễm vi khuẩn và nấm
• Tế bào có thể trở nên kháng kháng sinh– thay đổi
kiểu hình
• Tốt nhất là tránh nuôi trong thời gian dài


Môi trường nuôi cấy tế bào in vitro

Foetal Calf/Bovine Serum (FCS & FBS)
• Yếu tố tăng trưởng và hormone
• Nơi tế bào gắn lên

• Gắn và trung hòa độc tố

Đun 56oC, 30 phút khi sử dụng
• Phá hủy kháng thể và bổ thể

• Phá hủy virus
Lưu ý: không đun quá lâu, nhiệt độ quá cao gây phá hủy
yếu tố tăng trưởng, hormone và vitamin ảnh hưởng đến sự
tăng trưởng của tế bào.


Nuôi cấy tế bào trong phòng thí nghiệm như thế nào?

Phục hồi quần thể tế bào
phân lập từ mô đang trữ lạnh

Containment level 2
cell culture laboratory

Duy trì tế bào trong
môi trường nuôi cấy
Typical
cell culture flask

Cấy chuyền

Đếm tế bào
Bảo quản đông lạnh

‘Mr Frosty’
Used to freeze cells

Cách đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu

Diagram represent cell count using hemocytometer.


Đường cong tăng trưởng lý tưởng trong nuôi cấy tế bào