Khoá luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành Chế Biến và Bảo Quản Nông Sản Thực Phẩm

KIỂM NGHIỆM Enterobacter sakazakii TRONG SỮA BỘT TRẺ EM
THEO PHƯƠNG PHÁP ISO/TS 22964

Tác giả

TRẦN THỊ MỘNG DUNG

Khoá luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng Kỹ sư ngành
Chế Biến và Bảo Quản Nông Sản Thực Phẩm

Giáo viên hướng dẫn
TS. VŨ THỊ LÂM AN
ThS. VÕ MINH CHÂU

Tháng 8 năm 2009
i


LỜI CẢM ƠN
Con thành kính biết ơn công lao to lớn của cha mẹ đã sinh thành và nuôi dưỡng
để con có được như ngày hôm nay.
Chân thành khắc ghi công ơn dạy dỗ của các thầy cô trường Đại học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm đã
tận tình truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại
trường.
Xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến cô Vũ Thị Lâm An, giảng viên khoa Công Nghệ
Thực Phẩm, người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn anh Võ Minh Châu và tất cả các anh chị trong Cơ
Quan Thú Y vùng VI - 124 Phạm Thế Hiển, phường 2, quận 8, thành phố Hồ Chí

Minh đã giúp đỡ tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài.
Sau cùng, tôi xin cảm ơn tất cả các bạn bè đã gắn bó, động viên và chia sẻ
những khó khăn trong suốt thời gian qua.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 8 năm 2009
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Mộng Dung

ii


TÓM TẮT
Enterobacter sakazakii (E. sakazakii) là loại vi khuẩn hiếm gặp, nhưng một khi
đã nhiễm vào cơ thể thì tỷ lệ tử vong rất cao từ 40 ÷ 80 % thông qua nguồn thực phẩm,
đặc biệt là sữa bột dành cho trẻ em. Mức độ nguy hiểm của E. sakazakii trong sữa bột
là rất nghiêm trọng, có thể gây bệnh viêm màng não, viêm ruột non và nhiễm trùng
máu. Do đó, để xác định mức độ nhiễm của vi khuẩn này trong sữa bột, chúng tôi tiến
hành đề tài: “Kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột trẻ em theo phương
pháp ISO/TS 22964”.
Đề tài được thực hiện tại phòng vi sinh của Cơ Quan Thú Y vùng VI - 124
Phạm Thế Hiển, phường 2, quận 8, thành phố Hồ Chí Minh, thời gian từ 09/03/2009
đến 31/05/2009. Chúng tôi tiến hành kiểm nghiệm E. sakazakii trong 40 mẫu sữa bột
dành cho trẻ em theo phương pháp ISO/TS 22964. Các mẫu sữa được thu thập từ chợ,
siêu thị và phố sữa Nguyễn Thông… Hầu hết các mẫu sữa đều có nhãn hiệu và trong
đó có 4 mẫu sữa bột cân ký không rõ nguồn gốc. E. sakazakii phát hiện từ các mẫu sữa
bột được đối chiếu với chủng gốc ATCC 4869. Đồng thời so sánh kết quả kiểm
nghiệm E. sakazakii trong sữa bột trẻ em của chúng tôi với kết quả kiểm nghiệm của
các tác giả trong nước và ngoài nước.
Sau khi tiến hành thí nghiệm, chúng tôi đã phát hiện được 7 mẫu có sự hiện
diện của E. sakazakii trong tổng số 40 mẫu sữa bột kiểm nghiệm, với tỷ lệ nhiễm là
17,5%. Kết quả kiểm nghiệm này tái khẳng định sữa bột là một trong những nguồn lây

nhiễm bệnh do E. sakazakii. Đồng thời cũng là lời cảnh báo đối với cơ quan chức năng
về việc kiểm nghiệm vi khuẩn này trong sữa bột.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa

i

Lời cảm ơn

ii

Tóm tắt

iii

Mục lục

iv

Danh sách các chữ viết tắt

vii

Danh sách các bảng

viii

Danh sách các hình

ix

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

1

1.1. Đặt vấn đề

1

1.2. Mục đích

1

1.3. Ý nghĩa đề tài

2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1. Thực trạng nhiễm bệnh do E. sakazakii

3

2.2. Nguồn xâm nhiễm E. sakazakii

5

2.2.1. Từ thực phẩm

5

2.2.2. Từ môi trường

8

2.3. Các đặc tính của E. sakazakii

8

2.3.1. Phân loại khoa học của E. sakazakii

8

2.3.2. Đặc điểm hình thái

8

2.3.3. Đặc điểm sinh lý

9

2.3.4. Đặc điểm sinh hoá

11

2.4. Triệu chứng, cách phòng ngừa và cách điều trị bệnh do nhiễm E. sakazakii

13

2.4.1. Triệu chứng bệnh

13

2.4.2. Cách phòng ngừa

13

2.4.3. Cách điều trị

14

2.5. Phương pháp phát hiện E. sakazakii

14

2.5.1. Phương pháp truyền thống

14
iv


2.5.2. Phương pháp phân lập trên môi trường có chất phát quang

16

2.5.3. Phương pháp sinh học phân tử

17

2.5.3.1. Polymerase Chain Reaction

18

2.5.3.2. Random amplified of polymorphic DNA

18

2.5.3.3. Pulsed - field gel electrophoresis

18

2.5.3.4. Flourescence in situ hybridization

19

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20

3.1. Địa điểm nghiên cứu và bố trí thời gian

20

3.1.1. Địa điểm nghiên cứu

20

3.1.2. Bố trí thời gian

20

3.2. Vật liệu nghiên cứu

20

3.2.1. Mẫu kiểm nghiệm và chủng gốc E. sakazakii

20

3.2.2. Môi trường và hoá chất

20

3.3. Dụng cụ và thiết bị

21

3.3.1. Dụng cụ

21

3.3.2. Thiết bị

21

3.4. Phương pháp nghiên cứu

22

3.4.1. Quy trình phân lập

22

3.4.1.1. Tiền tăng sinh

24

3.4.1.2. Tăng sinh chọn lọc

24

3.4.1.3. Phân lập

24

3.4.1.4. Nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hoá

24

3.4.1.4.1. Khả năng lên men các loại đường

24

3.4.1.4.2. Kit sinh hoá IDS 14GNR

24

3.4.1.5 Theo dõi và đánh giá kết quả

24

3.4.2. Đối chiếu E. sakazakii phân lập được từ các mẫu sữa với chủng gốc
E. sakazakii

26

3.4.3. Các chỉ tiêu quan sát

26

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

27

4.1 Kết quả kiểm nghiệm E. sakazakii trong sữa bột theo phương pháp

v


ISO/TS 22964, so sánh E. sakazakii phân lập được với chủng gốc

27

4.2. So sánh kết quả kiểm nghiệm E. sakazakii trong 40 mẫu sữa bột theo
phương pháp ISO/TS 22964 với kết quả kiểm nghiệm của các tác giả
trong nước và ngoài nước

35

4.2.1. So sánh với kết quả kiểm ngiệm của các tác giả trong nước

35

4.2.2. So sánh với kết quả kiểm nghiệm của các tác giả nước ngoài

36

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

38

5.1. Kết luận

38

5.2. Đề nghị

38

5.2.1. Về phương pháp kiểm nghiệm

38

5.2.2. Về phía người sản xuất

38

5.2.3. Về phía cơ quan chức năng

39

5.3.4. Về phía người tiêu dùng

39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

40

PHỤ LỤC

46

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
α-MUG

4-methylumbelliferyl-alpha-D-glucoside

API

Analytical Profile Index

BPW

Buffered Peptone Water

CDC

Centers for Disease Control and Prevention

CLF

Central Laboratories Friedrichdorf

ctv

cộng tác viên

cfu

colony forming unit

DFI

Druggan Forsythe Iversen Agar

DNA

Deoxyribonucleic acid

E. sakazakii

Enterobacter sakazakii

EE

Enterobacteriaceae Enrichment Broth

ESPM

Enterobacter sakazakii Plating Medium

FAO

Food and Agriculture Organization

FDA

Food and Drug Adminstration

FSAI

Food Safety Authority of Ireland

ICMSF

International Commission for Microbiological Specification
for Foods

ISO

International Standard Organization

mLST

modified Lauryl Sulfate Tryptone

NA

Nutrient Agar

PE

Polyethylene

VIT

vermicon identification technology

rARN

ribosom ribonucleic acid

TS

Technical standard

TSA

Tryptic Soy Agar

UV

Ultraviolet

VRBGA

Violet Red Bile Glucose Agar

WHO

World Health Organization
vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Một vài trường hợp bùng phát bệnh do nhiễm E. sakazakii

4

Bảng 2.2 Giá trị D và giá trị z của E. sakazakii trong sữa bột dành cho trẻ em

11

Bảng 2.3 Một số khác biệt sinh hoá của E. sakazakii với các loài khác

12

Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hoá của E. sakazakii

13

Bảng 3.1 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu

21

Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng trong kiểm nghiệm

22

Bảng 3.3 Khả năng sử dụng các loại đường của vi khuẩn E. sakazakii

25

Bảng 3.4 Kết quả các phản ứng sinh hoá trong kit IDS 14GNR của E. sakazakii

25

Bảng 4.1 Kết quả khả năng lên men các loại đường của 12 mẫu sữa bột

31

Bảng 4.2 Kết quả thử các phản ứng sinh hoá trong kit IDS 14GNR của 5
mẫu sữa bột cho kết quả sorbitol dương tính

33

Bảng 4.3: Kết quả thử các phản ứng sinh hoá trong kit IDS 14GNR của 7
mẫu sữa bột cho kết quả sorbitol âm tính

34

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Sơ đồ các nguyên nhân nhiễm E. sakazakii vào trẻ em và gây bệnh
thông qua quá trình chuẩn bị sữa bột

7

Hình 2.2 Vi khuẩn E. sakazakii

8

Hình 2.3 Giới hạn nhiệt độ phát triển của E. sakazakii

9

Hình 2.4 Quy trình phân lập E. sakazakii theo ba phương pháp CLF, FDA, ISO

15

Hình 2.5 Khuẩn lạc của E. sakazakii trên ESPM, DFI và OK

17

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình phân lập E. sakazakii trong sữa bột bằng phương pháp

ISO/TS 22964

23

Hình 4.1 Độ đục của môi trường tăng sinh chọn lọc mLST/vancomycin sau 24
giờ ủ ở 44oC

27

Hình 4.2 Khuẩn lạc của chủng gốc E. sakazakii và khuẩn lạc của E. sakazakii
phân lập được từ mẫu sữa bột trên môi trường TSA sau 24 giờ ủ, ở 37oC

29

Hình 4.3 Chủng gốc E. sakazakii và vi khuẩn E. sakazakii phân lập được khi
ủ trên TSA ở 37oC

30

Hình 4.4 Các môi trường đường glucose, lactose, saccharose trước khi lên men
và sau khi lên men

31

Hình 4.5 Môi trường đường sorbitol trước khi lên men và sau khi lên men

32

ix

Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Tổ chức y tế thế giới khuyến cáo nên nuôi con bằng sữa mẹ hoàn toàn trong sáu
tháng đầu đời vì sữa mẹ là nguồn dinh dưỡng tốt nhất cho sự phát triển của trẻ sơ sinh.
Có thể do một số nguyên nhân nào đó, người mẹ không thể tiếp tục nuôi con bằng
chính nguồn sữa của mình thì sữa bột là nguồn dinh dưỡng và khoáng chất chủ yếu
cung cấp cho bé. Nhưng khi nguồn sữa bột bị lây nhiễm vi khuẩn do điều kiện vệ sinh
sản xuất hay bảo quản sữa không tốt, chúng sẽ trở thành môi trường trung gian truyền
các mầm bệnh cho trẻ em. Trong đó, E. sakazakii là một mầm bệnh xuất hiện trong vài
thập niên gần đây, đã gây ra những căn bệnh nghiêm trọng như bệnh viêm màng não,
nhiễm trùng máu và viêm ruột non... thậm chí có thể dẫn đến tử vong ở trẻ sơ sinh.
Tổng cục kiểm dịch, giám sát và kiểm tra chất lượng Trung Quốc vừa qua đã
phát hiện vi khuẩn đường ruột gây chết người E. sakazakii trong hơn 9,6 tấn sữa bột
dành cho trẻ em của Công ty thực phẩm Vị Toàn (Đài Loan) được xuất khẩu qua Hồng
Kông vào cuối năm 2008. Khối lượng lớn sữa này bị buộc phải tiêu huỷ. Phát hiện hết
sức kịp thời của cơ quan chức năng đã giúp ngăn chặn một hậu quả không thể lường
trước được (Báo O2TV).
Các nghiên cứu về vi khuẩn này chưa được thực hiện ở nước ta nhưng đã khá
phổ biến đối với các nước khác trên thế giới. Liệu ở Việt Nam sữa bột có phải là một
trong những nguồn lây nhiễm bệnh do E. sakazakii cho trẻ hay không? Để xác định
mức độ nhiễm E. sakazakii trong sữa bột, chúng tôi tiến hành đề tài “Kiểm nghiệm
Enterobacter sakazakii trong sữa bột trẻ em theo phương pháp ISO/TS 22964” do Tiến
sĩ Vũ Thị Lâm An và Thạc sĩ Võ Minh Châu đồng hướng dẫn.
1.2. Mục đích
Kiểm nghiệm vi khuẩn E. sakazakii từ nguồn sữa bột trẻ em được thu thập ở
các cửa hàng bán lẻ tại thành phố Hồ Chí Minh.
1

1.3. Ý nghĩa đề tài
Xác định mức độ nhiễm của vi khuẩn E. sakazakii trong sữa bột kiểm nghiệm.
Cảnh báo cho nhà sản xuất, người tiêu dùng về sự hiện diện của E. sakazakii
trong sữa bột dành cho trẻ em.
Cảnh báo cơ quan chức năng nên bổ sung E. sakazakii vào danh mục các vi
khuẩn cần kiểm nghiệm đối với sữa bột và các sản phẩm từ sữa bột dành cho trẻ em.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Thực trạng nhiễm bệnh do Enterobacter sakazakii
E. sakazakii được xem là nguyên nhân gây bệnh ở nhiều độ tuổi khác nhau, từ
trẻ em đến người trưởng thành và kể cả người già (Drudy và ctv, 2006). Đặc biệt là
những trẻ có hệ miễn dịch chưa hoàn thiện, trẻ sinh thiếu tháng hay trẻ có trọng lượng
thấp sau khi sinh, có nguy cơ nhiễm E. sakazakii cao hơn so với những trẻ khác
(Himelright và ctv, 2002).
Tỷ lệ nhiễm E. sakazakii là 1/100.000 đối với trẻ em dưới 12 tháng tuổi
(FAO/WHO, 2004). Trong khi đó, tỷ lệ này đối với trẻ có cân nặng dưới 2500 g là
8,7/100.000 (Braden, 2006) và trẻ có cân nặng dưới 1500 g là 9,4/100.000 (Stoll và
ctv, 2004). Trẻ em trên 12 tháng tuổi và người trưởng thành có nguy cơ mắc bệnh thấp
hơn khi nhiễm E. sakazakii (FAO/WHO, 2006).
E. sakazakii là một mầm bệnh cơ hội, thường gây ra hậu quả và triệu chứng
nghiêm trọng như viêm màng não, chết hoại ruột non (Van Acker và ctv, 2001) và
nhiễm trùng máu (Bar - Oz và ctv, 2001)… đặc biệt là ở trẻ sơ sinh với tỉ lệ tử vong rất
cao từ 40 ÷ 80% (Muytjens và ctv, 1988). Những trường hợp mắc phải bệnh xâm
nhiễm do E. sakazakii thường có khả năng sống sót thấp và để lại di chứng rất nghiêm
trọng như tai biến mạch máu não, tràn dịch não, u nang não, tứ chi bất toại… (Drudy

và ctv, 2006). Đối với người trưởng thành, sự nhiễm E. sakazakii được xem là ít nguy
hiểm hơn, triệu chứng thường gặp như viêm phổi, nhiễm khuẩn máu… với tỉ lệ tử
vong là 50% (Lai, 2001).
Cơn bùng phát bệnh đầu tiên xảy ra ở Anh, vào năm 1958, do E. sakazakii xâm
nhiễm gây ra viêm màng não, làm 2 trẻ tử vong (Urmenyi và Franklin, 1961). Kể từ
thời gian đó cho đến năm 2004, có hơn 70 trường hợp nhiễm E. sakazakii xảy ra ở
nhiều nước trên thế giới (Bảng 2.1).

3


Bảng 2.1: Một vài trường hợp bùng phát bệnh do nhiễm E. sakazakii
Năm

Địa điểm

1958

Anh

Số
lượng
bệnh
nhân
2

Số
lượng
tử
vong

2

1985

Đan Mạch

1

1

Joker và ctv (1965)

1958

Georgia

1

0

Monroe và ctv (1979)

1958

Oklahoma

1

1

Adamson và ctv (1981)

1981

Ấn Độ

1

0

Kleiman và ctv (1981)

1983

Đan Mạch

8

6

Muytjens và ctv (1983)

1977 – 1981

Hy Lạp

1

1

Aldova và ctv (1984)

1984

Hy Lạp

11

4

Arseni và ctv (1987)

1984

Missouri

1

0

Naqvi và ctv (1985)

1984

Massachusetts

2

1

Willis và ctv (1988)

1986 – 1987

Iceland

3

1

Biering và ctv (1989)

1988

Tennessee

4

0

Simmons và ctv (1989)

1990

Maryland

1

0

Noriega và ctv (1990)

1990

Ohio

1

0

Gallagher và ctv (1991)

1998

Belgium

12

2

Van Acker và ctv (2001)

1999 – 2000

Israel

2

0

Bar - Oz và Block (2001)

2001

Tennessee

10

1

Himelright và ctv (2002)

2002

Belgium

1

1

FDA (2005)

2004

New Zealand

5

1

FDA (2005)

2004

Pháp

4

2

FSAI (2006)

Nguồn tài liệu
Urmenyi và Franklin (1961)

(Tổng hợp bởi Drudy và ctv, 2006)
Vì vậy, năm 2002, ICMSF gọi E. sakazakii là “Mối nguy nghiêm trọng nhưng
khá hiếm, có thể làm chết người hay để lại những di chứng xấu, có thời gian tồn tại lâu
dài”.
Trước các trường hợp bùng phát bệnh do nhiễm E. sakazakii, năm 2005, các
quốc gia thuộc khối liên minh châu Âu quy định trong thực phẩm sấy khô dạng bột
dành cho trẻ sơ sinh và trẻ em không được phép có sự hiện diện của E. sakazakii
4


(Sanjaq, 2007). Trong khi đó, ở nước ta từ năm 2002 cho đến nay, tiêu chuẩn Việt
Nam TCVN 5538 : 2002 và tiêu chuẩn của Bộ y tế của sữa bột vẫn chưa đề cập đến E.
sakazakii (Phụ lục 2, trang 49).
2.2. Nguồn xâm nhiễm E. sakazakii
E. sakazakii được xem là vi sinh vật gây bệnh cho người thông qua nguồn thực

phẩm và môi trường.
2.2.1. Từ thực phẩm
E. sakazakii đã được phân lập từ những nguồn thực phẩm khác nhau như gạo,
pho mát, thịt, gia vị, bánh mì lên men và thực phẩm khô dạng bột dành cho trẻ em
(Kanivets và ctv, 2001; Iversen và ctv, 2004; Kandhai và ctv, 2004; Gurtler và ctv,
2005). Kim và ctv (2005) đã phát hiện ra rằng E. sakazakii có thể phát triển trên rau
quả cắt tươi và trong sản phẩm nước ép.
Nổi bật nhất là sản phẩm sữa bột. Nó được xem như là một nguyên nhân chính
bùng phát các trường hợp xâm nhiễm bệnh do E. sakazakii (Muytjens và ctv, 1988;
Biering và ctv, 1989; Simmons và ctv, 1989; Nazarowec - White và Farber, 1997;
Himelright và ctv, 2001; Van Acker và ctv, 2001). Muytjens và ctv (1988) đã kiểm
nghiệm 141 mẫu sữa bột từ 35 quốc gia khác nhau, phát hiện 14,2 % mẫu có sự hiện
diện của E. sakazakii. Hầu hết các nghiên cứu gần đây xác định số lượng E. sakazakii
trong sữa bột từ 0,22 ÷ 1,61 cfu/100 g (Santos, 2006).
Đối tượng nhiễm bệnh nhiều nhất là trẻ em và trẻ sơ sinh thông qua việc sử
dụng nguồn sữa bột nhiễm E. sakazakii (Van Acker và ctv, 2001; Himelright và ctv,
2002). Sản phẩm sữa bột nhiễm E. sakazakii có thể là do nguồn nguyên vật liệu, do
các máy móc, thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong suốt quá trình sản xuất. Mullane
và ctv (2007) đã phân lập được E. sakazakii tại các khu vực trong quá trình sản xuất
như khu vực sấy, khu vực đóng gói và khu vực phối trộn nguyên liệu…
Ngoài ra, E. sakazakii cũng có thể xâm nhiễm thông qua quá trình pha chế sữa.
Forsythe (2005) đã liệt kê các yếu tố tạo nên mối nguy nhiễm E. sakazakii trong sữa
bột dành cho trẻ em:
- Sữa bột bị xâm nhiễm từ quá trình sản xuất.
- Sữa bột bị xâm nhiễm từ dụng cụ sử dụng trong quá trình pha chế sữa.

5


- Sữa bột bị xâm nhiễm từ con người pha chế sữa.

- Sữa bột bị xâm nhiễm từ dụng cụ chứa sữa làm vệ sinh chưa sạch, có thể hình
thành màng sinh học (biofilm) bám vào bề mặt dụng cụ.
- Sữa bột bị xâm nhiễm từ nguồn nước sử dụng để pha chế sữa.
- Sự phát triển của E. sakazakii trong suốt quá trình tồn trữ sữa đã pha chế.
- Sự sống sót của E. sakazakii trong dạ dày trẻ em trước khi vận chuyển đến
ruột non.
Kim và ctv (2007) đã tóm tắt các nguyên nhân nhiễm E. sakazakii vào sữa bột
và gây bệnh cho trẻ em thông qua quá trình chuẩn bị sữa (Hình 2.1).

6


Bản thân sữa bột
(0,36 ÷ 66 cfu/100g)

Nguồn nước, môi trường
bệnh viện hay nhà ở

Con người, dụng
cụ pha sữa

Tồn trữ sữa đã pha ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài (> 4 giờ)

E. sakazakii phát triển lên đến 10 ÷ 100 cfu/ 100ml
(Thời gian trung bình cho một thế hệ E. sakazakii là 0,4 giờ ở 37oC)
E. sakazakii gây
bệnh viêm màng não,
tràn dịch não và
những di chứng thần
kinh khác

Dạ dày với pH > 4,
điều kiện thuận lợi
cho sự sống sót của
E. sakazakii

Uống vào
Gây bệnh
viêm ruột
non và
tiêu chảy

E. sakazakii gây
bệnh nhiễm trùng
máu

Thường xảy ra ở trẻ sơ sinh, trẻ sinh thiếu tháng hay trẻ có cân nặng
thấp sau khi sinh
Hình 2.1: Sơ đồ các nguyên nhân nhiễm E. sakazakii vào sữa bột
và gây bệnh cho trẻ em thông qua quá trình chuẩn bị sữa

7


2.2.2. Từ môi trường
E. sakazakii được tìm thấy trong nhiều môi trường khác nhau như đất, nước,
không khí, môi trường sản xuất (Muytjens và ctv, 1988), môi trường bệnh viện
(Nazarowec - White và Farber, 1999), môi trường nhà ở (Kandhai và ctv, 2004).
Ngoài ra, E. sakazakii còn được phân lập từ lưu chất và mô của những người
nhiễm bệnh như máu, dịch não tuỷ, tuỷ sống, nước bọt, nước tiểu, ruột, phân, vết

thương…(Farmer và ctv, 1980).
2.3. Các đặc tính của Enterobacter sakazakii
2.3.1. Phân loại khoa học của Enterobacter sakazakii
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Enterobacter
(Farmer và ctv, 1980)
2.3.2. Đặc điểm hình thái
E. sakazakii là trực khuẩn Gram âm hình que, có chiều dài khoảng 3µ và chiều
rộng khoảng 1µ, thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tuỳ ý, không có bào tử và có khả năng di
động nhờ lông mao (Farmer và ctv, 1980).

Hình 2.2: Vi khuẩn E. sakazakii (Sanjaq, 2007)
E. sakazakii đã từng được biết đến với tên gọi là vi khuẩn “Enterobacter
cloacea sinh sắc tố vàng”. Năm 1980, Farmer và ctv dựa trên sự khác nhau về quá

8


trình lai phân tử ADN - ADN, phản ứng sinh hoá, tính nhạy cảm với kháng sinh và sự
hình thành sắc tố màu vàng trên khuẩn lạc… để phân biệt loài vi khuẩn này với
Enterobacter cloacae. Vi khuẩn này được lấy theo tên của nhà vi khuẩn học người
Nhật - Riichi Sakazaki. Từ đó, Enterobacter sakazakii chính thức được thừa nhận như
một loài riêng biệt.
Hình thái đặc trưng của vi khuẩn E. sakazakii là sự hình thành các khuẩn lạc
mang sắc tố màu vàng trên môi trường TSA trong khoảng nhiệt độ từ 20oC ÷ 40oC
(Iversen và ctv, 2004). Cũng trên môi trường TSA, ở nhiệt độ 25oC, khuẩn lạc mang

sắc tố màu vàng rõ hơn ở nhiệt độ 37oC (Nazarowec - White và Farber, 1997).
E. sakazakii có hai dạng khuẩn lạc đặc trưng, dạng thứ nhất là khuẩn lạc hình
tròn, bề mặt lồi, khô hay nhày nhớt, mép răng cưa hình chữ V hay vỏ sò. Thường gặp
hơn là dạng khuẩn lạc thứ hai có hình tròn, bề mặt phẳng, bóng láng (Farmer và ctv,
1980).
Kích thước của khuẩn lạc phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ
và thời gian (Iversen và Forsythe, 2003). Trên môi trường TSA, ở 37oC, sau 24h nuôi
cấy, kích thước khuẩn lạc từ 2 ÷ 3 mm; còn ở 25oC, sau 24h và 48h nuôi cấy, kích
thước của nó là 1 ÷ 1,5 mm và 2 ÷ 3 mm (Nazarowec - White và Farber, 1997).
2.3.3. Đặc điểm sinh lý
E. sakazakii là vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt nhất so với các vi khuẩn khác
trong họ Enterobacteriaceae (Nazarowec - White và ctv, 1997). Theo nghiên cứu của
Iversen và ctv (2004), hầu hết các chủng E. sakazakii đều có khả năng phát triển ở một
khoảng rộng của nhiệt độ từ 6oC đến 45oC và nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là từ
37oC đến 43oC.

Hình 2.3: Giới hạn nhiệt độ phát triển của E. sakazakii (Forsythe, 2005)
9


Ngoài ra, một số chủng E. sakazakii có thể phát triển ở nhiệt độ thấp 5,5oC
(Nazarowec - White và Farber, 1997). Theo nghiên cứu của Iversen và ctv (2004),
cũng tồn tại một số chủng E. sakazakii phát triển ở nhiệt độ cao hơn (47oC) trong sản
phẩm sữa bột dành cho trẻ em.
Khả năng đề kháng nhiệt của E. sakazakii phụ thuộc vào tình trạng sinh lý,
khoảng nhiệt độ phát triển và thành phần của môi trường sống (như hàm lượng chất
béo, hàm lượng chất khô, hàm lượng đường…) (Iversen và ctv, 2004).
E. sakazakii không có khả năng sống sót qua quá trình thanh trùng Pasteur ở
72oC trong 15 phút (Iversen và ctv, 2004). Nhưng cũng có một vài nghiên cứu cho
rằng E. sakazakii có thể tồn tại trong điều kiện sống khắc nghiệt như môi trường khô

hạn có hoạt độ nước aw = 0,2 (Breeuwer và ctv, 2003) và sống sót qua quá trình sấy
phun (Arku và ctv, 2008). Khả năng này có được là do E. sakazakii có thể tích luỹ các
ion, chủ yếu là ion K+ và các chất hoà tan như proline, glycine, betaine, trehalose…
bên trong tế bào giúp ổn định màng phospholipit-protein (Kempf và Bremer, 1998).
E. sakazakii có khả năng chống lại các chất tẩy rửa được sử dụng trong quá
trình vệ sinh dụng cụ và thiết bị. Điều này có được là do E. sakazakii có khả năng sinh
exopolysaccharide bên ngoài tế bào, giúp cho quá trình tạo màng sinh học (biofilm)
trên silic, nhựa, polycarbonat, thuỷ tinh… làm tăng khả năng kết dính của vi khuẩn
này với bề mặt dụng cụ và thiết bị (Leberkuhner và Wagner, 1986). Từ đó làm tăng
nguy cơ nhiễm E. sakazakii vào thực phẩm, đặc biệt là sữa bột dành cho trẻ em.
E. sakazakii đề kháng với macrolide, lincomycin, clindomycin, streptogramin,
rifampicin, acid fusidic và fosfomycin. Nhưng nó nhạy cảm với loại kháng sinh như
tetracyline, aminoglycoside, β-lactam, chloramphenicol, antifolate và quinolone (Stock
và ctv, 2002).
E. sakazakii có thể phát triển được trên môi trường có khoảng pH khá rộng từ
4,5 - 10 (Breeuwer và ctv, 2003).
Giá trị D và z của E. sakazakii được thể hiện trong bảng 2.2.

10


Bảng 2.2: Giá trị D và giá trị z của E. sakazakii trong sữa bột dành cho trẻ em
Giá trị Da (phút)
52°C

53°C

Giá
trị

54°C

56°C

58°C

60°C

54,8

23,7

10,3

4,2

2,5

± 4,7

± 2,5

± 0,7

± 0,6

± 0,2

8,3

6,4

1,1

0,27

3,1

20,2

7,1

2,4

0,34

3,6

Nguồn tài liệu

zb(oC)
5,8

Nazarowec - White và
Farber, 1997c

0,4

Breeuwer và ctv, 2003d

0,48
0,5

Breeuwer và ctv, 2003

21,1

9,9

4,4

± 2,7

± 0,8

± 0,4

5,6

Edelson - Mammel và
Buchanan, 2004e

(Tổng hợp bởi Edelson - Mammel và Buchanan, 2004)
Ghi chú:
a
Giá trị D là thời gian cần thiết để số lượng vi sinh vật giảm đi 10 lần
b
Giá trị z là nhiệt độ để giá trị D giảm đi 10 lần
c
Giá trị D của 10 chủng E. sakazakii (5 chủng được phân lập từ bệnh phẩm và 5

chủng được phân lập từ thực phẩm)
d
Giá trị D của 4 chủng khác nhau
e
Giá trị D của chủng E. sakazakii chịu nhiệt nhất
2.3.4. Đặc điểm sinh hoá
Farmer và ctv (1980) đã nhận ra một vài điểm khác biệt của vi khuẩn E.
sakazakii so với các loài khác trong họ Enterobacteriaceae là khả năng sản sinh enzym
α-glucosidase, Tween 80-esterase trên môi trường nuôi cấy và không có khả năng lên
men đường D-sorbitol (Bảng 2.3). Tuy nhiên theo nghiên cứu gần đây của Sanjaq
(2007), có 5% chủng E. sakazakii có khả năng lên men đường D-sorbitol.

11


Bảng 2.3: Một số khác biệt sinh hoá của E. sakazakii với các loài khác
Phản ứng

E. sakazakii

E. cloacea

E. agglomerans

E. aerogenes

D-sorbitol

-

+

(++)

+

Glucose

+

+

(++)

+

Saccharose

+

+

(+)

+

H2 S

-

-

-

-

Indol

-

-

(++)

-

Citrat

+

+

(++)

+

α-Glucosidase

+

-

-

-

Tween-80 esterase

+

-

-

-

Phosphoamidase

-

+

+

+
(Farmer và ctv, 1980)

Ghi chú: + dương tính sau 24 giờ; (++) xấp xỉ 89 % dương tính; (+) 73 % dương tính; - âm
tính sau 24 giờ

Một số đặc điểm sinh hoá đặc trưng quan trọng của E. sakazakii được thể hiện
qua Bảng 2.4.

12


Bảng 2.4: Đặc điểm sinh hoá của E. sakazakii
Phản ứng

%

Phản ứng

%

sinh hóa

dương tính

sinh hóa

dương tính

100

Sorbitol

0

Arginin dehydroxlase

100

Rhamnose

100

Lysin decarbonxylase

0

Saccharose

100

Ornithine decarbonxylase

85

Lactose

100

Citrate

85

Melibiose

100

H2 S

0

Amydalin

100

Urease

0

Arabitol

100

100

Oxydase

0

O-nitrophenyl-β-Dgalactopyranoside

Mannitol
Indol

0

NO2

100

Voges-Proskauer

85

N2

0

Gelatin

0

Di động

94

Glucose

100

Inositol

72
(Garrity, 2005)

2.4. Triệu chứng, cách phòng ngừa và điều trị bệnh do nhiễm E. sakazakii

2.4.1. Triệu chứng bệnh
Những dấu hiệu và triệu chứng ban đầu của bệnh do nhiễm E. sakazakii là
biếng ăn, vàng da, xanh xao, hô hấp yếu, co giật và nhiệt độ cơ thể không ổn định (Bar
- Oz và ctv, 2001).
2.4.2. Cách phòng ngừa
Đối với nhà sản xuất, các quá trình sản xuất cần được kiểm soát vệ sinh chặt
chẽ bằng các hệ thống đảm bảo chất lượng như GMP (Good Manufacturing Practice),
HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point)… để phòng tránh sự lây nhiễm
13


vi khuẩn E. sakazakii vào các sản phẩm sữa bột.
CDC (2002) khuyến cáo cho người tiêu dùng cách phòng ngừa bệnh do nhiễm
E. sakazakii:
-

Sữa được lựa chọn dựa trên thành phần dinh dưỡng cần thiết.

-

Người pha sữa nên rửa tay trước khi pha.

-

Xử lý nhiệt các dụng cụ trước khi pha sữa.

-

Nước dùng để pha sữa phải trên 60oC.

-

Không uống sữa đã pha được giữ ở nhiệt độ phòng sau 4 giờ.

-

Sữa đã pha phải được bảo quản lạnh nếu không uống ngay.

-

Sữa còn dư nên bỏ đi.

-

Việc pha chế sữa nên làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.4.3.Cách điều trị
Trước năm 1985, bệnh nhân được điều trị bằng ampicilin, gentamicin hoặc
chloramphenicol. Sau năm 1985, thường dùng cephalosporin kết hợp với ampicilin và
gentamicin (Lai, 2001).
2.5. Phương pháp phát hiện Enterobacter sakazakii
2.5.1. Phương pháp truyền thống
Ba phương pháp truyền thống phân lập E. sakazakii thường được sử dụng như
phương pháp CLF, phương pháp FDA và phương pháp ISO/TS 22964. Quy trình tóm
tắt ba phương pháp này được thể hiện đầy đủ trong hình 2.4.

14


Phương pháp

CLF

FDA

ISO

Tiền
tăng sinh

mẫu : BPW
tỷ lệ 1 : 9
22 ÷ 24 giờ
ở 37oC

mẫu : BPW
tỷ lệ 1 : 9
22 ÷ 24 giờ
ở 37oC

Tăng sinh
chọn lọc

1 ml trong
9 ml EE
22 ÷ 24 giờ
ở 37oC

1 ml trong
9 ml EE

22 ÷ 24 giờ
ở 37oC

0,1 ml trong
10 ml mLST
22 ÷ 24 giờ
ở 44oC

Phân lập

MacConkey
22 ÷ 24 giờ
37oC

VRBGA
22 ÷ 24 giờ
37oC

TSA
22 ÷ 24 giờ
37oC

Simmon’s citrat (+)
Sorbitol (-)

mẫu : BPW
tỷ lệ 1 : 9
22 ÷ 24 giờ
ở 37oC

TSA
48 ÷ 72 giờ ở 25oC

TSA
22 ÷ 24 giờ
37oC

Chọn khuẩn điển hình

Thử
sinh hóa

Kết quả

Kiểm tra bằng hệ thống sinh hóa API 20E

Xác định sự hiện hiện E. sakazakii trong mẫu

Hình 2.4: Quy trình phân lập E. sakazakii theo ba phương pháp CLF, FDA, ISO
(Sanjaq, 2007)

15


Phương pháp CLF: mẫu sau khi được tiền tăng sinh trong dung dịch pepton
đệm và tăng sinh chọn lọc trong môi trường EE, sẽ được phân lập trên môi trường
MacConkey. Sau đó, chọn các khuẩn lạc điển hình để thử sinh hoá với Simmon’s
citrat, sorbitol. Khuẩn lạc nghi ngờ hình thành trên môi trường MacConkey sẽ được
trải lại trên môi trường TSA để tìm ra khuẩn lạc mang sắc tố vàng và dùng hệ thống
API 20E (API 32E…) để khẳng định kết quả (Sanjaq, 2007).

Phương pháp FDA: mẫu sau khi trải qua bước tiền tăng sinh trong dung dịch
pepton đệm và tăng sinh chọn lọc trong môi trường EE, sẽ được phân lập trên môi
trường VRBGA. Sau khi phân lập, ta chọn năm khuẩn lạc màu đỏ hồng và chuyển qua
phân lập trên môi trường TSA để phát hiện ra khuẩn lạc đặc trưng mang sắc tố vàng.
Cuối cùng, sử dụng hệ thống sinh hoá API 20E (API 32E…) để khẳng định kết quả
(FDA, 2002a).
Phương pháp ISO/TS 22964: mẫu cũng trải qua các bước tiền tăng sinh trong
dung dịch pepton đệm, tăng sinh chọn lọc trong môi trường mLST (môi trường LST
có bổ sung 0,5M NaCl và 10 mg/l vancomycin) và phân lập trên môi trường TSA để
tìm ra khuẩn lạc đặc trưng mang sắc tố vàng của E. sakazakii. Sau đó, sử dụng hệ
thống sinh hoá API 20E (API 32E…) để khẳng định kết quả (Iversen và ctv, 2007).
2.5.2. Phương pháp phân lập trên môi trường có chất phát quang
Phương pháp này chủ yếu dựa trên khả năng hoạt động của enzym αglucosidase do E. sakazakii sinh ra trên môi trường phân lập.
Môi trường phân lập DFI có bổ sung chất chỉ thị 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-αD-glucopyranoside (X-α-Glc). Trên môi trường này, enzym α-glucosidase sẽ kết hợp
với X-α-Glc ở vị trí 5-bromo-4-chloro-3-indolol trong điều kiện có oxy không khí, tạo
nên bromo chloroindigo sẽ nhuộm xanh các khuẩn lạc của E. sakazakii (Iversen và ctv,
2004).
Môi trường phân lập OK có bổ sung chất 4-methyl-umbelliferyl-α-D-glucoside.
Trên môi trường này, khuẩn lạc của E. sakazakii sẽ phát quang dưới tia UV có bước
sóng 365 nm (Oh và Kang, 2004).

16