So sánh sự khác biệt về tốc độ tăng trưởng của các tế bào có và không có phương tiện truyền thông khác nhau trong plasmid

So sánh sự khác biệt về tốc độ tăng trưởng của các tế bào có và không có phương
tiện truyền thông khác nhau trong plasmid
Chúng tôi muốn so sánh tốc độ tăng trưởng của các tế bào được chuyển đổi với một
plasmid trong đó cho thấy một biểu hiện cấu thành của một loại protein nhất định với tốc
độ tăng trưởng của các tế bào không được chuyển đổi với bất kỳ plasmid. Nghiên cứu mô
hình này, chúng ta cần phải phát triển các chủng khác nhau của các tế bào trong phương
tiện truyền thông khác nhau như thể hiện trong hình 7.

Hình 7: Thí nghiệm này giúp so sánh tốc độ tăng trưởng của các chủng khác nhau trong
phương tiện truyền thông kháng sinh khác nhau.
Chúng tôi cấy một thuộc địa từ các tấm chứa sự căng thẳng cần thiết vào phương tiện
truyền thông tương ứng của nó (các phương tiện truyền thông với các yêu cầu kháng
sinh). Đó là, DH5a sẽ được cấy vào LB mà không cần bất kỳ kháng sinh, RFP (trong
pSB1C3) các tế bào có chứa sẽ được cấy vào LB chứa Chloramphenicol (CHL), CFP
(trong pSB1A2) các tế bào có chứa sẽ được cấy vào LB chứa Ampicillin (Amp) và RFP
-CFP tế bào đồng chuyển vào LB có chứa cả thuốc kháng sinh. Những sau đó được phát
triển trong khoảng 4 giờ hoặc cho đến khi họ đạt được một giá trị OD600 từ 0,1 đến 0,5.


Sau đó, văn hóa của mỗi dòng được lấy và cấy vào từng nước canh 5ml không chứa
kháng sinh, Amp, CHL và Amp-CHL để các giá trị OD trong tất cả các ống tiêm tươi là
0,01. Bây giờ chúng tôi có một mảng của 16 ống với sự kết hợp khác nhau có thể:

DH5a không có kháng sinh, DH5a trong Amp, DH5a trong CHL và Dh5a trong
Amp-CHL

RFP (pSB1C3) trong không có kháng sinh, RFP (pSB1C3) trong Amp, RFP
(pSB1C3) trong CHL và RFP (pSB1C3) trong Amp-CHL

CFP (pSB1A2) trong không có kháng sinh, CFP (pSB1A2) trong Amp, CFP
(pSB1A2) trong CHL và CFP (pSB1A2) trong Amp-CHL


RFP (1C3)-CFP (1A2) trong không có kháng sinh, RFP (1C3)-CFP (1A2) trong
Amp, RFP (1C3)-CFP (1A2) trong CHL và RFP (1C3)-CFP (1A2) trong Amp-CHL
Do đó, điểm khởi đầu cho tất cả các mẫu là như nhau - một OD600 0,01. Mỗi giờ bắt đầu
từ điểm tiêm, các OD của tất cả 16 mẫu được đo. Điều này sẽ cung cấp cho một ý tưởng
hợp lý của tốc độ tăng trưởng của các chủng khác nhau trong phương tiện truyền thông
kháng sinh khác nhau.
Giao thức thử nghiệm:
1. Một thuộc địa của DH5a được cấy vào 3ml LB mà không cần bất kỳ kháng sinh trong
một ống 50ml máy ly tâm.Tương tự như vậy, RFP (1C3) thuộc địa được cấy vào 3ml LB
với CHL, CFP (1A2) thuộc địa vào 3ml LB với Amp và RFP-CFP thuộc địa vào 3ml LB
với Amp-CHL.
2. Cấy này được phép phát triển trong khoảng 4 giờ hoặc cho đến khi OD600 của mỗi
mẫu qua 0.1.
3. Sau đó, chúng tôi sử dụng OD 1 x Vol 1 = OD 2 x Vol 2 để đo lường bao nhiêu để
inoculte từ văn hóa 4 giờ này cho mỗi 5ml tươi LB trung bình với sự kết hợp kháng sinh
khác nhau để các OD bắt đầu là 0,01. Trong trường hợp này, OD 1 là OD600 của văn hóa
4 giờ, Vol 1 là khối lượng này văn hóa 4 giờ cần phải được inoculted trong các nền văn
hóa 5ml tươi, OD 2 là 0,01 (bắt đầu OD cho tất cả các nền văn hóa 5 ml ) và Vol 2 là khối
lượng cuối cùng (5ml + vol 1).
4. Từ mẫu tươi tiêm này, 150ul của nền văn hóa được sử dụng để đo OD mỗi giờ bắt đầu
từ điểm nếu tiêm phòng. Các 150ul của mẫu được pha loãng 5 lần để 750ul và sau đó
OD600 được đo.
5. Toàn bộ thủ tục được lặp đi lặp lại để kiểm tra khả năng tái.
Lưu ý: Sau 4 giờ ủ bệnh ban đầu (các nền văn hóa 3ml), chúng tôi sử dụng này để cấy
một nền văn hóa 5ml với kháng sinh tương tự trong môi trường như trong văn hóa
3ml. Các OD600 ống 5ml này sau khi tiêm phòng là 0,01. Điều này sau đó đã được thực
hiện để phát triển trong 2,5 giờ. Đây là văn hóa từ đó chúng ta tiêm 16 ống cuối cùng mà
sau đó sẽ được sử dụng cho các phép đo.
Bấm vào đây để có kết quả

Mô hình


Phương trình cơ bản:

Ở đâu,
X + là các tế bào với các plasmid.
X - là tế bào không có plasmid.
u + là tỷ lệ tăng trưởng tế bào tế bào đặc biệt với các plasmid.
u - là mức tăng trưởng tế bào cụ thể của các tế bào mà không có plasmid.
p là xác suất của một tế bào để mất một plasmid.
Chúng tôi đang cố gắng để đưa ra một mô hình toán học cho các quần thể tương đối của
plasmid có chứa plasmid và tế bào miễn phí đối với thời gian sử dụng các đường cong
tăng trưởng đã được tạo ra và kết quả từ sự phát huỳnh quang với.
Huỳnh quang hình ảnh của các tế bào để kiểm tra hướng mất plasmid
Thí nghiệm này được thiết kế để nghiên cứu mất plasmid khi các tế bào (chuyển đổi với
một plasmid) được trồng trong phương tiện truyền thông mà không có áp lực chọn lọc
cần thiết. Ở đây, chúng tôi thực hiện 4 thí nghiệm khác nhau để nghiên cứu như thế nào
1. Các tế bào biến đổi với RFP (pSB1C3) mất plasmid trong sự vắng mặt của
Chloramphenicol trong môi trường
2. Các tế bào biến đổi với CFP (pSB1A2) mất plasmid trong sự vắng mặt của
Ampicillin trong môi trường.
3. Tế bào cotransformed với RFP (pSB1C3) và CFP (pSB1A2) mất RFP (pSB1C3)
plasmid khi phát triển trong sự vắng mặt của Chloramphenicol và trong sự hiện
diện của Ampicillin trong môi trường.
4. Tế bào cotransformed với RFP (pSB1C3) và CFP (pSB1A2) mất CFP (pSB1A2)
plasmid khi phát triển trong sự vắng mặt của Ampicillin và trong sự hiện diện của
Chloramphenicol trong môi trường.

Fig 6.3: thủ tục thử nghiệm để đo tốc độ mất plasmid bằng hình ảnh huỳnh quang
Chúng tôi nhận thuộc địa của mỗi căng thẳng và cấy nó lần đầu tiên trong một môi
trường với kháng sinh thích hợp.Sau đó sử dụng để cấy trong môi trường phát triển cụ thể
như trong hình 6.3.
1. RFP (pSB1C3) các tế bào có chứa sẽ được trồng trong môi trường không chứa
kháng sinh và trong môi trường có chứa Chloramphenicol
2. CFP (pSB1A2) các tế bào có chứa sẽ được trồng trong môi trường không chứa
kháng sinh và trong môi trường có chứa Ampicillin.
3. Di động đồng chuyển sẽ được trồng trong môi trường không chứa kháng sinh,
trung bình chỉ chứa Ampicillin, trung bình chỉ chứa Chloramphenicol, trung bình
có chứa cả Ampicillin và Chloramphenicol.
Hành vi dự kiến của hệ thống được (được liệt kê theo thứ tự như 3 điều kiện nêu trên):
1. RFP (pSB1C3) Các tế bào có chứa phát triển trong môi trường không có
Chloramphenicol cuối cùng sẽ mất plasmid và do đó cho thấy không có huỳnh
quang đỏ khi chụp ảnh dưới kính hiển vi và những người mà được trồng ở các
chloramphenicol có chứa trung bình tất cả sẽ được huỳnh quang màu đỏ.
2. CFP (pSB1A2) có chứa các tế bào phát triển trong môi trường không có
Ampicillin cuối cùng sẽ mất plasmid và do đó cho thấy không có Cyan huỳnh
quang và những người mà được trồng trong Ampicillin có chứa trung bình tất cả
sẽ được huỳnh quang Cyan.
3. Tế bào Cotransformed phát triển trong môi trường không có thuốc kháng sinh cuối
cùng sẽ mất cả plasmid và do đó cho thấy không có huỳnh quang màu đỏ hoặc
Cyan, những người mà được trồng trong Ampicillin có chứa trung bình tất cả sẽ
được huỳnh quang Cyan, những người mà được trồng trong Chloramphenicol có
chứa trung bình tất cả sẽ được huỳnh quang đỏ và những người được phát triển
trong môi trường có chứa cả thuốc kháng sinh tất cả sẽ được huỳnh quang cả
Cyan và đỏ.


Giao thức:

1. Cấy 3ml LB chứa Ampicillin với một thuộc địa của các tế bào biến đổi với CFP
(pSB1A2) - canh 1, cấy 3ml LB chứa Chloramphenicol với một thuộc địa của các tế bào
biến đổi với RFP (pSB1C3) - canh 2, cấy 3ml LB chứa Ampicillin và Chloramphenicol
với một thuộc địa của các tế bào đồng chuyển với CFP (pSB1A2) và RFP (pSB1C3) canh 3.
2. Văn hóa được phát triển trong 4 giờ hoặc cho đến khi OD600 qua 0.1.
3. Sau đó, chúng tôi sử dụng OD 1 x Vol 1 = OD 2 x Vol 2 để đo lường bao nhiêu để lây
từ văn hóa 4 giờ này cho mỗi 5ml tươi LB trung bình với sự kết hợp kháng sinh khác
nhau để các OD bắt đầu là 0,01. Trong trường hợp này, OD 1 là OD600 của văn hóa 4
giờ, Vol 1 là khối lượng này văn hóa 4 giờ cần phải được tiêm vào nền văn hóa 5ml tươi,
OD 2 là 0,01 (bắt đầu OD cho tất cả các nền văn hóa 5 ml .) và Vol 2 là khối lượng cuối
cùng (5ml + vol 1) tiêm chủng bắt buộc là: a. Nước dùng 1 vào ống không có kháng sinh
trong LB - ống 1 b. Nước dùng 1 vào ống với Ampicillin trong LB - ống 2 c. Nước dùng
2 vào ống không có antibioti trong LB - ống 3 d. Nước dùng 2 vào ống với
Chloramphenicol trong LB - ống 4 e. Nước dùng 3 vào ống không có kháng sinh trong
LB - ống 5 f. Nước dùng 3 vào ống với Ampicillin trong LB - ống 6 g. Nước dùng 3 vào
ống với Chloramphenicol trong LB - ống 7 h. Nước dùng 3 vào ống với cả hai kháng sinh
trong LB - ống 8 . 4 nền văn hóa này được phép phát triển cho 2,5 giờ. 5. Đo OD ở giai
đoạn này và cũng chuẩn bị cho một slide hình ảnh huỳnh quang từ mỗi ống 8. 6. Sau đó,
chúng tôi sử dụng OD 1 x Vol 1 = OD 2 x Vol 2 để đo lường bao nhiêu để lây từ văn hóa
2,5 giờ này cho mỗi 5ml tươi LB trung bình với sự kết hợp kháng sinh cùng để các OD
bắt đầu là 0,01. Trong trường hợp này, OD 1 là OD600 của văn hóa 2,5 giờ, Vol 1 là khối
lượng này văn hóa 2,5 giờ mà cần phải được tiêm vào nền văn hóa 5ml tươi, OD 2 là 0,01
(bắt đầu OD cho tất cả các nền văn hóa 5 ml ) và Vol 2 là khối lượng cuối cùng (5ml +
vol 1). Văn hóa tức là từ ống dành 1 được sử dụng để inoculte một ống tươi 1. Tương tự
như vậy theo như nhau cho tất cả 7 loại ống khác. 7. Hãy nền văn hóa mới này phát triển
trong 2,5 giờ và lặp lại từ bước 5 cho khoảng 5 lần.