NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT – THỬ NGHIỆM VẮC XIN ĐẬU GÀ TRÊN TẾ BÀO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT – THỬ NGHIỆM
VẮC XIN ĐẬU GÀ TRÊN TẾ BÀO

Sinh viên thưc hiện

: PHẠM THỊ ANH ĐÀO

Lớp

: TC03TYTP

Mã số sinh viên

: 03212029

Niên khóa

: 2003-2009

Tp. Hồ Chí Minh , năm 2009


NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT – THỬ NGHIỆM VẮC XIN ĐẬU GÀ
TRÊN TẾ BÀO

Tác giả

PHẠM THỊ ANH ĐÀO

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ ngành Thú y

Giáo viên hướng dẫn:
Th.S TRẦN THỊ BÍCH LIÊN
Th.S KIM VĂN PHÚC

Tháng 04 năm 2009
i


LỜI CẢM ƠN
Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến công ơn sinh thành và dưỡng dục của Ba Mẹ
đã luôn yêu thương và nuôi dạy con thành người.
Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:
 Th.s Trần Thị Bích Liên
 Th.s Kim Văn Phúc
 BSTY Nguyễn Thị Lam Hương
 Chị Bùi Anh Thy
 Tập thể các Cô Chú, Anh Chị đang làm việc tại Trung Tâm Nghiên Cứu và
phân xưởng Siêu Vi Trùng thuộc Công Ty Thuốc Thú Y Trung Ương.
Đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn động viên và truyền đạt
những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn
tất khóa luận tốt nghiệp.
 Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
 Ban Chủ Nhiệm cùng toàn thể quý Thầy Cô khoa Chăn Nuôi – Thú Y trường
Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm
cho em trong quá trình học tập tại trường.

 Cảm ơn bạn bè và toàn thể lớp TCTYTP-03 đã cùng chung sức và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập.

ii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Đề tài “Nghiên cứu sản xuất – thử nghiệm vắc xin Đậu gà trên tế bào” đã được
thực hiện tại bộ môn Hóa Sinh thuộc Trung Tâm Nghiên Cứu và trại chăn nuôi của
Công Ty Thuốc Thú y Trung Ương. Thời gian thực hiện từ ngày 15/04/2008 đến ngày
15/04/2009.
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành các chỉ tiêu theo dõi như sau:
-

Thu nhận và nuôi cấy tế bào xơ phôi gà sử dụng để tiếp đời và chuẩn độ virus.

-

Khảo sát tính ổn định của chủng virus đậu gà đã được thích ứng trên tế bào xơ
phôi gà để sản xuất vắc xin.

-

Kiểm tra vô trùng, an toàn, hiệu lực và thời gian bảo quản của vắc xin sản xuất
thử nghiệm.

Kết quả nghiên cứu:
-

Virus đậu gà nhược độc chủng Weybridge thích ứng trên tế bào tiếp tục được

truyền đời trên tế bào xơ phôi gà cho thấy có sự phát triển tốt và ổn định qua
thời gian xuất hiện biểu hiện bệnh tích tế bào đến 48 – 96 giờ sau khi gây nhiễm
virus đậu gà, đủ điều kiện thu hoạch và hiệu giá virus từ 106,7 TCID50/ml - 107,3
TCID50/ml đủ điều kiện để sản xuất vắc xin.

-

Vắc xin sản xuất thử nghiệm trên tế bào được chế từ huyễn dịch virus thu được
ở lần tiếp đời thứ 14 chứa lượng virus tối thiểu cho 1 liều là 103,0 TCID50 đạt
tiêu chuẩn kiểm nghiệm vô trùng, an toàn, hiệu lực theo tiêu chuẩn Việt Nam
(10 TCN 196 – 94), có tính an toàn cao và có khả năng tạo miễn dịch tốt cho gà
để phòng bệnh đậu cho gà.

-

Vắc xin đông khô có thời gian bảo quản tối thiểu là 12 tháng ở 4 – 80C.

-

Vắc xin thử nghiệm ở thực địa cho 4290 con gà ri và gà tre sau khi chủng
không thấy những biểu hiện bất thường và có phản ứng tốt với vắc xin, đạt tiêu
chuẩn an toàn và phòng được bệnh đậu cho gà trong điều kiện chăn nuôi thông
thường ngoài thực địa.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa………………………………………………………………………………..i

Lời cảm ơn……………………………………………………………………………. ii
Tóm tắt luận văn………………………………………………………………………iii
Mục lục………………………………………………………………………………. iv
Danh mục các từ viết tắt……………………………………………………………... vii
Danh sách các bảng…………………………………………………………………..viii
Danh sách các hình…………………………………………………………………... ix
Danh sách các sơ đồ - biểu đồ………………………………………………...............x
Chương 1. MỞ ĐẦU………………………………………………………………... 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………... 1
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU…………………………………………………….. 1
1.2.1. Mục đích………………………………………………………………………. 1
1.2.2. Yêu cầu………………………………………………………………………... 2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………… 3
2.1. VIRUS ĐẬU – BỆNH ĐẬU TRÊN GÀ………………………………………... 3
2.1.1. Virus đậu………………………………………………………………………. 3
2.1.2. Virus đậu gà…………………………………………………………………… 4
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc virus đậu gà.................................................... 4
2.1.2.2. Sự nhân lên của virus đậu gà........................................................................... 5
2.1.2.3. Sức đề kháng của virus đậu gà.........................................................................5
2.1.2.4. Miễn dịch..........................................................................................................5
2.1.3. Bệnh đậu gà.........................................................................................................5
2.1.3.1.. Cơ chế sinh bệnh đậu gà................................................................................. 6
2.1.3.2. Triệu chứng của bệnh đậu gà............................................................................6
2.1.3.3. Bệnh tích của bệnh đậu gà............................................................................... 7
2.1.3.4. Tính chất dịch tể học........................................................................................9
2.1.3.5. Chẩn đoán bệnh đậu gà.................................................................................... 9
2.1.3.6. Phòng bệnh đậu gà...........................................................................................11
2.2. KHÁI QUÁT VỀ CÁC LOẠI VẮC XIN ĐẬU GÀ............................................. 12
iv

2.2.1. Vắc xin vô hoạt................................................................................................... 12
2.2.2. Vắc xin nhược độc..............................................................................................12
2.2.3. Vắc xin tái tổ hợp.............................................................................................. 12
2.3. SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ.................................................................13
2.3.1. Nguồn gốc nguyên bào sợi..................................................................................13
2.3.2. Đặc điểm nguyên bào sợi....................................................................................13
2.3.3. Vai trò nguyên bào sợi........................................................................................ 14
2.3.4. Thu nhận và nuôi cấy tế bào xơ phôi gà............................................................. 14
Chương 3. NỘI DUNG – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM.........16
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM................................................................................. 16
3.1.1. Thời gian............................................................................................................. 16
3.1.2. Địa điểm............................................................................................................. 16
3.2. NỘI DUNG THÍ NGHIỆM................................................................................... 16
3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM.................................................................................... 16
3.3.1. Vật liệu thí nghiệm............................................................................................. 16
3.3.2. Dụng cụ và thiết bị.............................................................................................. 17
3.3.3. Môi trường - hóa chất......................................................................................... 17
3.4. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM...........................................................................19
3.4.1. Thu nhận và nuôi cấy tế bào xơ phôi gà............................................................. 20
3.4.2. Khảo sát tính ổn định của chủng virus đậu gà đã được thích ứng trên tế bào
xơ phôi gà để sản xuất vắc xin.....................................................................................21
3.4.2.1. Gây nhiễm virus lên tế bào...............................................................................21
3.4.2.2. Tiếp đời virus trên tế bào.................................................................................22
3.4.2.3. Chuẩn độ xác định hiệu giá virus.....................................................................22
3.4.2.4. Sản xuất thử nghiệm vắc xin đậu gà trên tế bào...............................................23
3.4.3. Kiểm tra vô trùng, an toàn, hiệu lực của vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm
..........................................................................................................................24
3.4.3.1. Lấy mẫu........................................................................................................... 24
3.4.3.2. Kiểm tra vô trùng............................................................................................. 25

3.4.3.3. Kiểm tra an toàn và hiệu lực của vắc xin đậu gà thử nghiệm trên tế bào
cho gà ............................................................................................................................25
v


3.4.4. Xác định thời gian bảo quản của vắc xin đậu gà tế bào thử nghiệm...................28
3.4.5. Thử nghiệm miễn dịch của vắc xin đậu gà tế bào trên hộ chăn nuôi gia đình
ở thực địa...................................................................................................................... 28
3.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU................................................................................................... 28
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................29
4.1. KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ...................... 29
4.2. KẾT QUẢ KIỂM TRA TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA CHỦNG VIRUS ĐẬU GÀ
ĐÃ ĐƯỢC THÍCH ỨNG TRÊN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ...........................................30
4.2.1. Kết quả gây nhiễm và truyền đời virus đậu gà trên tế bào xơ phôi gà................30
4.2.2. Kết quả chuẩn độ xác định hiệu giá virus trên tế bào......................................... 32
4.2.3. Kết quả sản xuất thử nghiệm vắc xin đậu gà trên tế bào.................................... 33
4.3. KẾT QUẢ KIỂM TRA VÔ TRÙNG, AN TOÀN, HIỆU LỰC CỦA
VẮC XIN ĐẬU GÀ THỬ NGHIỆM............................................................................33
4.3.1. Kết quả kiểm tra vô trùng................................................................................... 33
4.3.2. Kết quả chuẩn độ virus chứa trong vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm............34
4.3.3 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của vắc xin mới sản xuất cho gà............... 35
4.4. KẾT QUẢ KIỂM TRA THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA VẮC XIN ĐẬU GÀ
TẾ BÀO THỬ NGHIỆM..............................................................................................40
4.5. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN ĐẬU GÀ TẾ
BÀO TRÊN HỘ CHĂN NUÔI GIA ĐÌNH Ở THỰC ĐỊA.........................................42
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................44
5.1. KẾT LUẬN........................................................................................................... 44
5.2. ĐỀ NGHỊ............................................................................................................... 44
PHỤ LỤC.....................................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................47

vi


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ADN (Acid Deoxyribonucleic): bộ gen AND
AGID (Agar Gel Immunodiffusion): Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch trên thạch
CAM (Chorioallantoic Membrane): Màng nhung niệu
CEF (Chicken Embryo Fibroblast): Tế bào xơ phôi gà
CPE (Cytopathic Effect): Bệnh tích tế bào
EID50 (Embryo Infective Dose): Liều gây nhiễm 50% trên phôi trứng
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay): Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym
MEM (Minimum Essential Medium): Môi trường tăng trưởng
NCS (Newborn Calf Serum): huyết thanh bê
PBSA (Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)): Muối đệm phosphate
TCID50 (Tissue Culture Infective Dose): liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi
VN (Virus Neutralisation) : Kỹ thuật trung hòa virus

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Phân loại các giống thuộc dưới họ Chordopoxvirinae……………………3
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm xác định hiệu lực của vắc xin đậu gà thử nghiệm.......... 26
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả miễn dịch cho gà đã chủng vắc xin ..27
Bảng 4.1: Tỷ lệ và thời gian xuất hiện bệnh tích tế bào ở 3 lần tiếp đời.................... 30
Bảng 4.2: Kết quả chuẩn độ xác định hiệu giá virus trên tế bào của các mẫu ký hiệu
từ P13 đến P15…………………………………………………………. 32
Bảng 4.3: Kết quả chuẩn độ virus của vắc xin đậu gà sản xuất thử nghiệm sau

đông khô………......................................................................................................... 34
Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm xác định hiệu lực vắc xin đậu gà thử nghiệm ……… 35
Bảng 4.5: Kết quả xác định hiệu quả miễn dịch cho gà đã chủng vắc xin…………. 38
Bảng 4.6: Kết quả theo dõi thời gian bảo quản của vắc xin đậu gà tế bào ở 4 – 80C..42
Bảng 4.7: Kết quả thử vắc xin đậu gà trên tế bào ở thực địa………………………...43

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Hình thái virus đậu gà……………………………………………………...5
Hình 2.2: Gà mắc bệnh đậu thể da…………………………………………………....8
Hình 2.3: Gà mắc bệnh đậu thể yết hầu (thể màng giả)……………………………. 8
Hình 2.4: Hình nguyên bào sợi………………………………………………………. 16
Hình 4.1: Tế bào xơ phôi gà sau 24 giờ nuôi cấy……………………………………. 29
Hình 4.2: Tế bào xơ phôi gà sau 48 giờ nuôi cấy……………………………………. 30
Hình 4.3: Bệnh tích trên tế bào xơ phôi gà sau gây nhiễm virus đậu gà……………...31
Hình 4.4: Tế bào xơ phôi gà đối chứng……………………………………………….31
Hình 4.5: Gà được chủng vắc xin đậu gà của NAVETCO (Gà đối chứng dương)…...36
Hình 4.6: Gà được chủng vắc xin đậu gà thử nghiệm………………………………...37
Hình 4.7: Gà được chủng dung dịch sinh lý ………………………………………….37
Hình 4.8: Gà đối chứng nổi nốt đậu khi công thử thách……………………………... 39
Hình 4.9: Gà đã chủng vắc xin đậu gà NAVETCO khi công thử thách……………... 40
Hình 4.10: Gà đã chủng vắc xin đậu gà thử nghiệm khi công thử thách…………….. 40

ix

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ
Trang
Sơ đồ 3.1: Tiếp đời virus trên tế bào xơ phôi gà…………………………………….. 22
Biểu đồ 4.1: Biểu đồ xác định hiệu kực của vắc xin sau khi chủng…………………. 35
Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ bảo hộ của vắc xin sau khi công thử thách………………………..38

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở nước ta ngành chăn nuôi gia cầm đặc biệt là chăn nuôi gà rất phổ biến với
nhiều mô hình chăn nuôi khác nhau, từ chăn nuôi hộ gia đình đến chăn nuôi tập trung
công nghiệp. Một trong những mối quan tâm của người chăn nuôi không chỉ là bệnh
dịch mà còn khống chế được sự lan truyền của các bệnh truyền nhiễm ở gia cầm.
Trong các loại bệnh truyền nhiễm gây thiệt hại lớn như Newcastle, Gumboro,
Tụ huyết trùng,…thường xảy ra ở gà thì bệnh đậu gà (Fowl pox) là bệnh khá phổ biến
đối với mọi lứa tuổi của gà. Bệnh tuy không gây chết gà hàng loạt nhưng cũng gây
nhiều thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi như làm gà chậm lớn, còi cọc, kém phát
triển, giảm khả năng thụ tinh, sản lượng trứng giảm…Do đó việc phòng bệnh bằng vắc
xin đậu là cần thiết trong chăn nuôi gà để phòng bệnh đậu cho gà.
Ở Việt Nam, vắc xin phòng bệnh đậu gà do Công Ty Thuốc Thú Y Trung Ương
(NAVETCO) sản xuất trên phôi trứng cho đến nay vẫn được đánh giá là ổn định, có
hiệu lực cao. Tuy nhiên vắc xin hiện nay sản xuất từ màng nhung niệu phôi trứng gà
có một số nhược điểm như tốn kém, không chủ động được nguồn nguyên liệu (trứng
gà), dễ tạp nhiễm,… Nhằm khắc phục những nhược điểm trên, việc nghiên cứu thêm
một loại vắc xin phòng bệnh đậu cho gà là điều rất cần thiết.
Được sự đồng ý của Bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm thuộc Khoa Chăn Nuôi

Thú Y Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu
Thú Y – Công Ty Thuốc Thú Y Trung Ương dưới sự hướng dẫn của Th.S Trần Thị
Bích Liên, Th.S Kim Văn Phúc chúng tôi tiếp tục tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu sản xuất – thử nghiệm vắc xin đậu gà trên tế bào”.
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
1.2.1. Mục đích
Xác định khả năng tạo một vắc xin mới có hiệu quả cao, ổn định và giá thành
thấp từ virus được thích ứng trên tế bào xơ phôi gà để phòng bệnh đậu gà .
1


1.2.2. Yêu cầu
- Thu nhận và nuôi cấy tế bào xơ phôi gà sử dụng để tiếp đời và chuẩn độ virus.
- Khảo sát tính ổn định của chủng virus đậu gà đã được thích ứng trên tế bào xơ
phôi gà để sản xuất vắc xin..
- Kiểm tra an toàn, vô trùng, hiệu lực và thời gian bảo quản của vắc xin sản xuất
thử nghiệm.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. VIRUS ĐẬU – BỆNH ĐẬU TRÊN GÀ
2.1.1. Virus đậu
Virus đậu gồm những virus gây bệnh truyền nhiễm chung cho người và nhiều
loài động vật như gia súc, gia cầm, chim hoang dại…đã được xếp trong bảng phân loại
virus thuộc họ Poxviridae.
Họ Poxviridae được chia thành hai họ phụ là Entomopoxvirinae (virus gây bệnh
đậu ở côn trùng) và Chordopoxvirinae (virus gây bệnh đậu cho loài động vật có xương

sống). Họ phụ Chordopoxvirinae bao gồm các giống sau
Bảng 2.1: Phân loại các giống thuộc dưới họ Chordopoxvirinae
(Trần Thị Bích Liên, Lê Anh Phụng, 2001)
Giống

Loài

Orthopoxvirus

Virus đậu mùa ở người, virus đậu khỉ, virus đậu bò, virus
đậu chuột, virus đậu gấu trúc, virus đậu lạc đà.



Parapoxvirus

Pseudocowpox,…

Avipoxvirus

Virus đậu gà, virus đậu bồ câu, virus đậu khỉ,…

Capripoxvirus

Virus đậu cừu, virus đậu dê

Leporipoxvirus

Virus đậu thỏ

Suipoxvirus

Virus đậu heo

Molluscipoxvirus

Virus đậu gây bệnh ở trẻ em

Các đặc điểm chung của họ Poxviridae
Virus có kích thước lớn nhất trong nhóm ADN virus (220 – 450 x 140 – 260 nm),

có vỏ (envelope) (một vài virion có lớp vỏ kép), ADN mạch đôi, thẳng và virus có tính
hướng bì.
Hình dạng tùy thuộc vào từng loại giống, các virus nhóm Orthopoxvirus thường
có dạng hình viên gạch trong khi Parapoxvirus có dạng hình oval. Virion có thể dài
3


đến 450 nm và có cấu trúc phức tạp. Phần lõi chứa hai chuỗi ADN được bao quanh bởi
một vỏ hình tạ, một hoặc hai thể bên nằm ở mặt lõm của quả tạ.
Bên ngoài virion là vỏ chứa lipid có nguồn gốc từ màng tế bào, nhưng nổi bật
nhất là các chuỗi protein hình cầu, tạo cấu trúc như dệt vải của virion, có đến 30 loại
protein cấu trúc được xác định và 4 enzyme bao gồm ADN và RNA polymerase.
Trong nhân của tế bào chủ, sợi ADN mạch đôi, thẳng của virus được dùng làm
khuôn mẫu cho quá trình phiên mã RNA thông tin và sao chép thông tin di truyền, với
sự tham gia của các loại enzyme. Tuy nhiên cơ chế lắp ráp của virion hiện nay chưa
được biết. Các virion thoát ra khỏi tế bào bằng cách nẩy chồi.
Virus đậu gây nên những mụn có mủ dạng như hạt gạo ở trên da, trên niêm mạc.
Virus đậu nói chung có thể phát triển tốt trên màng nhung niệu của phôi trứng gà đã
được ấp từ 11 đến 13 ngày và quan sát trên màng nhung niệu thì thấy có nhiều nốt đậu

màu trắng, giống gelatin và màng nhung niệu dày ra. Ở mỗi động vật ký chủ, tiểu thể
có tên gọi khác nhau như ở người là tiểu thể Paschen trong bệnh đậu mùa; ở gà, cừu là
tiểu thể Borrel, ở heo là tiểu thể Môrôsốp. Tập hợp những tiểu thể gọi là thể bao hàm,
chúng thường dựa vào nhân tế bào làm lõm một phần bề mặt của nhân. Trong bệnh
đậu gà, thể này gọi là thể Bollinger.
2.1.2. Virus đậu gà
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc virus đậu gà
Virus đậu gà là một loại ADN virus, thuộc giống Avipoxvirus, họ Poxviridae.
Virus có dạng hình viên gạch, kích thước khá lớn (260 nm x 350 nm).
Virus đậu gà bao gồm lớp bao ngoài, lớp mịn trong (đôi khi chỉ có lớp bao
ngoài), nhân, và các thể bên. Nhân lõm hai mặt với hai thể bên. Thể bên có hình dạng
thấu kính, nằm giữa màng nhân hoặc giữa lớp bao ngoài. Nhân chứa một sợi
nucleoprotein cuộn gập.
Bộ gen của virus đậu là ADN mạch đôi thẳng, đã được Afonso và các cộng sự
giải mã vào năm 2000.

4


Xúc tu bề mặt
Vỏ

Nhân lõm hai mặt

Thể bên
Hình 2.1: Hình thái virus đậu gà (Nguồn www.ivis.org)
2.1.2.2. Sự nhân lên của virus đậu gà
Virus chỉ nhân lên trong tế bào chất của tế bào thượng bì và hình thành thể vùi
trong tế bào chất (thể Bollinger). Những thể này khi lớn dễ quan sát dưới kính hiển vi.
2.1.2.3. Sức đề kháng của virus đậu gà

Virus đề kháng yếu với nhiệt độ, ở 60oC virus bị diệt trong vài phút, tuy nhiên
virus đậu gà có thể tồn tại lâu trong nhiệt độ lạnh.
Virus đậu gà bị vô hoạt bởi những chất sát trùng trong vòng 10 phút, tuy nhiên ở
nồng độ thấp như phenol 1 % hay formol 0,1% virus vẫn có thể sống trong 9 ngày.
Vẩy trên bề mặt của mụn đậu chứa lượng lớn virion, chúng có vai trò giúp virus
đề kháng với sự khô hạn.
2.1.2.4. Miễn dịch
Khi qua được bệnh, gà tạo miễn dịch suốt đời. Hiện đã có vắc xin phòng bệnh
đậu cho gà bằng cách chủng vào da cánh, thông thường chủng cho gà 10 – 14 ngày
tuổi.
Bệnh lây lan trong một đàn tương đối chậm và âm ỉ. Truyền lây cơ học qua muỗi
(có thể ve, rận) cũng như lây trực tiếp từ gà bệnh sang gà khỏe qua vết thương ở da và
bệnh xảy ra ở bất cứ đâu có gà nhốt.
2.1.3. Bệnh đậu gà
Bệnh đậu gà là một bệnh truyền nhiễm phổ biến xảy ra trên gà ở mọi lứa tuổi, còn
được gọi là bệnh trái gà hay bệnh bạch hầu, do virus đậu gà (Fowlpox virus) gây ra.
Bệnh thường lây lan và phát triển chậm, tạo những nốt mụn đậu ở phần da không có
5


lông hay tăng sinh ở màng niêm đường hô hấp trên, miệng, thực quản làm gà khó thở,
ăn kém, chậm phát triển, giảm tỷ lệ trứng, gà có thể chết khi bệnh nặng.
2.1.3.1. Cơ chế sinh bệnh đậu gà
Sau khi virus xâm nhập vào da và niêm mạc, virus gây nhiễm tế bào và gây bệnh
cục bộ. Với các chủng có độc lực cao thì sau khi sinh sản tại chỗ, virus xâm nhập sang
phủ tạng, nhưng trong các cơ quan thực thể virus không sinh sản mạnh mẽ nên không
gây các biến đổi bệnh lý.
Trong trường hợp bệnh xảy ra ở thể điển hình thì sau khi sinh sản tại nơi xâm nhập,
virus sẽ vào máu gây nhiễm trùng huyết sơ phát rồi vào các cơ quan, thực thể tăng
cường sinh sản và gây hủy hoại tế bào hay gây bệnh tích tế bào, nếu quá trình bệnh lý

nặng thì gia cầm có thể chết ở giai đọan này. Nếu cơ thể chịu đựng được thì từ phủ
tạng virus trở lại máu gây nhiễm trùng huyết thứ phát, sau đó theo máu đến toàn thân
rồi xuất hiện bệnh tích điển hình của bệnh đậu ở da và niêm mạc, tại các cơ quan khác
virus không nhân lên mạnh nhưng khả năng tồn tại của virus lâu.
2.1.3.2. Triệu chứng của bệnh đậu gà
Bệnh phát triển dưới hai thể: thể da và thể yết hầu. Hai thể này có thể biểu hiện
riêng lẻ hoặc chung ở trên gà.
 Thể da (đậu gà dạng khô)
Mụn đậu xuất hiện ở những vùng không có lông như ở đầu (mào, tích, xung
quanh mắt, mỏ, mũi,…), ở chân. Mụn lúc đầu sưng tấy màu hồng nhạt hoặc trắng, sau
chuyển tím sẫm dần, mụn khô đóng thành vẩy dễ bong. Vẩy bong để lại nốt sẹo màu
vàng xám. Mụn đậu ở khoé mắt có thể làm viêm kết mạc mắt làm gà khó nhìn, nếu ở
mắt gà con thì mắt sẽ sưng, chảy nước nhờn, ở thể nặng mắt chứa đầy mủ sau dẫn đến
bị mù, nếu ở khoé mỏ thì khó lấy thức ăn. Sự chuyển biến của mụn đậu từ 10 đến 12
ngày, mụn mọc rải rác hoặc chụm lại.
 Thể yết hầu (đậu gà dạng ướt hay còn gọi là thể màng giả)
Gà nhiễm bệnh xuất hiện màng giả (ở yết hầu, ở phần trên đường tiêu hóa và
đường hô hấp), làm niêm mạc đường tiêu hóa và hô hấp bị viêm, xuất huyết dẫn đến
loang lỗ trên bề mặt và sau cùng thành niêm mạc tăng sinh, các lớp màng giả dính chặt
vào niêm mạc làm gà bệnh ăn uống và thở khó khăn. Gà bị sưng mặt, sưng tích, phù
thũng, mắt gà viêm có ghèn, nhớt, dần dần mắt bị lồi do tích tụ các chất có trong hốc
6


mắt. Mũi viêm, chảy nước mũi rồi đặc quánh lại, mặt gà sưng to. tử vong đôi khi cao,
có thể trên 50%.
Nói chung, hai thể này đều làm gà suy nhược, ăn kém, giảm trọng lượng, chậm
phát triển, giảm sản lượng trứng, giảm tỷ lệ thụ tinh và thông thường bệnh kéo dài từ 3
đến 4 tuần.
2.1.3.3. Bệnh tích của bệnh đậu gà

 Bệnh tích đại thể
- Thể da: Khác nhau tùy theo từng giai đoạn của mụn nước. Đầu tiên xuất hiện
các điểm trắng nhỏ sau gia tăng kích thước thành mụn mủ (pox) rồi thành bọng nước
màu vàng. Các nốt sần được hình thành vào ngày thứ 5 – 6, sau đó mụn nước với tổn
thương dày đặc rồi trở nên xù xì màu xám rồi đỏ, cứng, sau mềm chứa nước nhờn
chuyển thành mủ vỡ ra. Cuối cùng mụn biến thành dạng mào vẩy có màu vàng đậm
hoặc xám. Sau 2 đến 3 tuần, mào vẩy trở nên cứng và khô, bị tróc đi để lại những vết
thẹo.
- Thể yết hầu: Ở gà lớn thường mắc thể yết hầu. Bắt đầu xuất hiện những nốt đục
trên màng niêm mạc phần trên đường tiêu hoá và hô hấp. Những nốt này gia tăng kích
thước và chuyển sang màu vàng. Chỗ có màng giả lúc đầu sưng đỏ, có nhiều nước
nhờn; bệnh nặng, màng giả dày đặc làm gà khó thở và chết. Khi gỡ màng này ra thấy
những vết lở và niêm mạc bị xuất huyết. Bệnh tích tăng sinh và viêm ở xoang dưới
mắt, thanh quản, bạch hầu.
 Bệnh tích vi thể
-

Ở niêm mạc và biểu bì, những tế bào thượng bì tăng sinh và bội triển.

-

Xuất hiện thể vùi ưa eosine trong tế bào chất của tế bào biểu mô trong những

giai đoạn phát triển khác nhau của bệnh.
-

Sự thâm nhập các tế bào viêm ở nơi bị nhiễm.

7

Hình 2.2: Gà mắc bệnh đậu thể da

Hình 2.3: Gà mắc bệnh đậu thể yết hầu (thể màng giả)

8


2.1.3.4. Tính chất dịch tễ học
 Loài vật mắc bệnh
Bệnh xảy ra trên gà ở mọi lứa tuổi nhưng cũng có thể xảy ra ở các loài chim.
Virus đậu gà có thể gây bệnh trên gà mọi lứa tuổi. Đối với gà nuôi công nghiệp,
bệnh có thể xảy ra trên gà vào khoảng 40 tuần tuổi. Đối với gà nuôi thả vườn, bệnh có
thể xảy ra trên gà con và có kèm theo sự phát triển của các loài ngoại kí sinh.
 Đường xâm nhập
-

Qua da tại nơi có vết thương, cắn mổ hay chích đốt.

-

Qua niêm mạc.

 Cách lây lan
-

Trực tiếp: Từ gà bệnh qua gà lành do vết thương ở da.

-

Gián tiếp:
+ Qua những chất thải từ gà bệnh (như nước mũi, nước dãi nhiễm, vẩy mụn đậu).
+ Qua thức ăn, nước uống bị nhiễm.
+ Qua dụng cụ chăm sóc nuôi dưỡng bị nhiễm.
+ Các côn trùng hút máu truyền bệnh như ruồi, muỗi, rệp, ve.

2.1.3.5. Chẩn đoán bệnh đậu gà
 Kỹ thuật tạo tiêu bản mẫu bệnh đậu gà
Khi virus đậu gà gây bệnh, chúng phát triển và nhân lên trong tế bào chất của tế
bào biểu mô với sự tăng sinh của những thể vùi Bollinger, là tập hợp nhiều tiểu thể
Borrel. Những thể vùi này có thể quan sát thấy trong các mụn đậu ở da, ở bạch hầu khi
nhuộm với haematoxylin và eosin (H & E), acridine orange hay nhuộm Giemsa.
Những tiểu thể có thể quan sát trên tiêu bản từ mẫu vết thương, dưới kính hiển vi điện
tử có thể quan sát thấy hình thái của những thể vùi nội bào Bollinger điển hình trên lát
cắt mỏng của mô nhiễm bệnh.
 Phân lập virus đậu gà
- Trên động vật cảm thụ
Phương pháp này dùng huyền dịch bệnh phẩm nghi ngờ có virus tiêm cho gà, sau
một thời gian gà xuất hiện các nốt đậu. Căn cứ vào biểu hiện đó và mổ khám các bệnh
tích đặc trưng, có thể kết luận sự có mặt của virus đậu gà. Tuy nhiên nhược điểm của

9


phương pháp này là mất thời gian, không kinh tế và dễ gây ô nhiễm môi trường và làm
lây lan nguồn bệnh.
- Trên phôi gà đang phát triển
Đa số virus gây bệnh có thể phát triển trên phôi gà, do đó phương pháp này được
sử dụng để phân lập, kiểm nghiệm, định loại, chế tạo kháng nguyên và các loại vắc
xin. Đây là phương pháp thuận lợi, tiết kiệm, cho kết quả nhanh.

Pha loãng huyễn dịch mô bệnh phẩm virus đậu gà với nồng độ kháng sinh thích
hợp. Tiêm dịch mẫu trên màng nhung niệu của phôi gà 10 - 12 ngày tuổi. Ấp ở 370C
trong 5 ngày, quan sát các biến đổi trên màng nhung niệu nếu xuất hiện nhiều nốt đậu
màu trắng đục, dày, thủy thũng chứng tỏ có sự phát triển của virus đậu gà. Sau đó tiến
hành nhuộm mẫu bệnh phẩm và quan sát dưới kính hiển vi điện tử để thấy tiểu thể
Borrel. Hiện nay các sản phẩm vắc xin sản xuất tại Việt Nam đều được sản xuất theo
phương pháp này.
- Trên môi trường tế bào
Virus đậu gà có khả năng thích ứng và phát triển tốt trên nhiều loại tế bào nuôi
cấy như tế bào xơ phôi gà, tế bào xơ phôi vịt, tế bào da của phôi gà. Dựa trên đặc tính
đó của virus nên các nhà khoa học đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào để phân lập
virus đậu gà trên tế bào.
Đây là phương pháp tiên tiến được sử dụng để phân lập, giám định, chuẩn độ, xác
định tính chất huyết thanh học, đặc biệt là dùng để chế tạo vắc xin. (Nguyễn Như
Thanh, Phùng Quốc Chương, 2006)


Các kỹ thuật huyết thanh học
 Kỹ thuật trung hòa virus (VN – virus neutralisation)
Phản ứng trung hòa là phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên tương ứng với

kháng thể có trong huyết thanh.
Nguyên tắc của phản ứng trung hòa là kháng nguyên kết hợp với huyết thanh
miễn dịch (kháng thể tương ứng) và sau một thời gian nhất định giữ hỗn hợp trong tủ
ấm thì virus sẽ bị trung hòa.
Sau phản ứng giữa virus và huyết thanh, lượng virus còn lại có thể được định
lượng trên phôi gà hoặc trên tế bào nuôi. Kháng thể trung hòa xuất hiện sau 1-2 tuần
nhiễm virus.
10

 Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch trên thạch (AGID – agar gel immunodiffusion)
Phương pháp này cho phép định tính các kháng thể bằng phản ứng giữa kháng
thể trong huyết thanh và kháng nguyên virus. Kháng nguyên được thu nhận bằng cách
lấy nốt đậu trên da hoặc trên màng nhung niệu, dùng siêu âm phá vỡ tế bào, đồng nhất
chúng lại với nhau. Đem hỗn dịch đó ly tâm và thu dịch nổi trên bề mặt làm kháng
nguyên.
 Phản ứng ngưng kết thụ động ( passive haemagglutination)
Hồng cầu đã được tanin hóa của cừu hoặc ngựa rất nhạy với kháng nguyên virus
đậu gà. Kháng nguyên được chuẩn bị tương tự như kỹ thuật AGID đã trình bày. Kỹ
thuật này tạo các phản ứng chéo giữa các virus đậu gia cầm. Phương pháp này có
nhược điểm là tốn thời gian, đặc biệt khi tiến hành thực hiện phản ứng với số lượng
mẫu huyết thanh lớn. Vì vậy kỹ thuật ELISA ngày càng được các nhà khoa học sử
dụng rộng rãi trong việc phát hiện kháng thể kháng kháng nguyên đậu gà.
 Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzyme ( ELISA)
Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzyme được sử dụng trong việc phát hiện kháng thể
dịch thể đối với virus đậu gà. Kỹ thuật này có thể phát hiện kháng thể sau 7– 10 ngày
khi gà nhiễm virus, tuy nhiên kỹ thuật này chưa có bộ kit thương mại trên thị trường.
2.1.3.6. Phòng bệnh đậu gà
 Vệ sinh chăm sóc
Thực hiện các biện pháp vệ sinh phòng bệnh như vệ sinh chuồng trại, tẩy uế bằng
nước vôi 10 – 20 % hoặc xút 1 – 2 %; khu chăn nuôi phải sạch, khô ráo, thoáng mát;
có chế độ nuôi dưỡng tốt; diệt ruồi muỗi định kỳ. Mua gà từ nơi không có bệnh và
cách ly ít nhất 2 tuần trước khi nhập đàn. Giết, loại bỏ những gà bị bệnh nặng, cách ly
ngừa phụ nhiễm những gà mắc bệnh nhẹ.


Vắc xin
Biện pháp hữu hiệu nhất phòng bệnh đậu cho gà là tiêm chủng vắc xin cho gà con,

gà lớn. Việc phòng ngừa dựa trên sự đáp ứng miễn dịch của gà đối với virus đậu gà
sau khi được chủng vắc xin và hình thành kháng thể dịch thể ngắn, gà khỏi bệnh chỉ
miễn dịch với những chủng virus mà nó từng mắc phải. Kháng thể từ gà mẹ có thể
truyền sang con nhưng lượng này không cao.

11


Đối với gà đẻ chỉ cần tiêm chủng một lần trước khi đẻ (giữa tuần thứ 9 và tuần
thứ 14). Không tiến hành tiêm chủng đối với gà đang đẻ. Đối với gà thịt có thể chủng
ngừa lúc 10 ngày tuổi và chủng một lần cho cả quá trình nuôi.
2.2.

KHÁI QUÁT VỀ CÁC LOẠI VẮC XIN ĐẬU GÀ
Để chủng bệnh đậu cho gà có các loại vắc xin sau: vắc xin vô hoạt, vắc xin nhược

độc và vắc xin tái tổ hợp.
2.2.1. Vắc xin vô hoạt
Nguyên tắc cơ bản trong phương pháp vô hoạt virus là phá hủy khả năng sinh sản
của virus có độc tính, nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên để kích thích sự sản sinh
kháng thể bảo hộ.
Có hai phương pháp làm vô hoạt virus, đó là:
 Phương pháp vật lý: Dùng nhiệt độ, tia tử ngoại, tia X, tia gamma và sóng siêu âm.
 Phương pháp hóa học: Dùng các chất hóa học như formalin, axit phenic…
2.2.2. Vắc xin nhược độc
Người ta sử dụng các virus có độc lực thấp đến vừa phải để sản xuất vắc xin
nhược độc với các phương pháp kỹ thuật khác nhau. Phương pháp thông dụng là gây
miễn dịch bằng một chủng virus có độc lực yếu (yếu tự nhiên hoặc được làm giảm độc
lực) đối với ký chủ. Hoặc người ta dùng một chủng virus có quan hệ gần, nhưng yếu
đối với loài khác để phòng bệnh như virus đậu bồ câu phòng bệnh đậu gà.

Nhiều loại vắc xin nhược độc được chế từ những chủng đã được làm giảm độc
lực bằng cách truyền đời nhiều lần trên một vài ký chủ, nhưng khác với ký chủ tiêm
phòng. Sự truyền đời liên tiếp sẽ giúp chủng virus có độc lực với ký chủ mới nhưng lại
giảm độc lực với ký chủ nguyên thủy.
Hiện nay ở nước ta vắc xin đậu gà được sử dụng rộng rãi là vắc xin nhược độc
đông khô do thời gian bảo quản lâu, đây là ưu điểm của vắc xin đông khô so với vắc
xin tươi.
2.2.3. Vắc xin tái tổ hợp
Đây là loại vắc xin điều chế từ chủng vi sinh vật được tạo ra bởi công nghệ gen
và công nghệ protein. Để có được các chủng vi sinh vật tái tổ hợp chứa kháng nguyên
đặc hiệu của nhiều giống, nhiều loài, chúng ta cần xác định các gen chịu trách nhiệm
phiên mã, dịch mã tổng hợp protein chủ yếu của kháng nguyên nhằm kích thích đáp
12


ứng miễn dịch bảo hộ đặc hiệu của mầm bệnh. Trước tiên, chuyển các gen đã chọn vào
vector plasmid, rồi gắn chèn vào bộ gen của vi sinh vật chủ. Nuôi cấy tạo sinh khối vi
sinh vật mang vector, sau đó tách, và tinh chế kháng nguyên đặc hiệu, dùng kháng
nguyên để chế tạo protein.
Tuy có giá thành cao, nhưng vắc xin tái tổ hợp chứa kháng nguyên đặc hiệu có
độ tinh khiết cao, tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mạnh cho cơ thể nên hiệu lực phòng
bệnh cao, thời gian miễn dịch kéo dài, liều tiêm vắc xin ít, không gây những đáp ứng
miễn dịch phụ.
Hiện nay, trên thế giới, một số nhà khoa học đã nghiên cứu, và chế tạo thành
công vắc xin đậu gà tái tổ hợp bằng cách tạo các vector tái tổ hợp.
2.3. SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ (CEF – CHICKEN EMBRYOS
FIBROBLAST)
2.3.1. Nguồn gốc nguyên bào sợi
Nguyên bào sợi (fibroblast) là loại tế bào thường gặp nhất trong các mô liên kết,
có nguồn gốc từ những tế bào trung mô trong phôi thai và những tế bào nguyên bào

sợi phân chia trong cơ thể trưởng thành. Ngoài ra, nguyên bào sợi cũng có thể xuất
phát từ những tế bào trung mô tiền nhân được duy trì trong các mô liên kết của cơ thể
trưởng thành.
2.3.2. Đặc điểm nguyên bào sợi
Dưới kính hiển vi điện tử, nguyên bào sợi là những tế bào non, ít biệt hóa.
Nguyên bào sợi thường có dạng hình thoi, hình sao, ít nhánh và ngắn, kích thước
không quá 20-25µm. Nhân bầu dục hoặc hình cầu, có một hoặc vài hạt nhân. Nhân của
nguyên bào sợi cô đặc được kéo dài theo trục dọc tế bào. Dưới kính hiển vi soi ngược,
ta có thể thấy được nhân nguyên bào sợi và ranh giới của từng tế bào. Bào tương ưa
base nhạt, lưới nội bào, ty thể phát triển và có ranh giới với chất nền ngoại bào không
rõ rệt. Nguyên bào sợi có khả năng phân chia mạnh, tế bào có thể di động yếu. Tế bào
có những nhánh là chân giả dạng sợi.
Hình dạng của tế bào có thể bị thay đổi do các yếu tố vật lý bề mặt nơi mà chúng
gắn bám.

13


Hình 2.4: Hình nguyên bào sợi (nguồn: connective tissue lab, 2002)
2.3.3. Vai trò nguyên bào sợi
Nguyên bào sợi là kiểu tế bào đặc biệt nhất của mô liên kết, chúng phân tán khắp
nơi trong mô liên kết của cơ thể. Nguyên bào sợi có khả năng tạo sẹo khi mô tổn
thương, chúng có khả năng phát triển nhanh trên bề mặt của mô bị thương giúp lành
vết thương.
Chính khả năng bám dính và phát triển trên nhiều loại bề mặt có tính chất vật lý
khác nhau giúp giải thích tại sao nguyên bào sợi là loại tế bào được nuôi cấy phổ biến
trong phòng thí nghiệm.
Nguyên bào sợi có khả năng di chuyển nhưng không có khả năng thực bào như
đại thực bào.
2.3.4. Thu nhận và nuôi cấy tế bào xơ phôi gà

Chọn trứng gà có phôi 9 – 10 ngày tuổi phát triển khỏe mạnh, bằng enzym
trypsin và các tác đông cơ học sẽ thu nhận được tế bào xơ phôi từ phôi trứng gà.
Tế bào xơ phôi được nuôi cấy trong những chai tế bào với môi trường MEM có
5% huyết thanh bê và được nuôi cấy trong tủ ấm CO2. Quan sát quá trình nhân lên của
tế bào sau mỗi 24 giờ dưới kính hiển vi quang học soi ngược, nhận thấy nguyên bào
sợi sẽ mọc lan ra trên bề mặt chai tế bào, bám vào đáy chai nuôi cấy và nhân lên. Các
tế bào nằm rải rác, cách rời nhau. Sau 45 – 48 giờ, tế bào nhân lên nhiều , mọc thành
một lớp tế bào kín chiếm trên 90% diện tích đáy chai nuôi cấy đồng thời không có tế
14