XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN DIVISION CHÂU MỸ CỦA VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM TRÊN CÁC LÔ HẠT GIỐNG CÂY HỌ CÀ NHẬP KHẨU VÀO VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN DIVISION CHÂU MỸ CỦA
VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM TRÊN
CÁC LÔ HẠT GIỐNG CÂY HỌ CÀ NHẬP
KHẨU VÀO VIỆT NAM BẰNG
KỸ THUẬT PCR

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

NGUYỄN THỊ NGỌC THẢO

Niên khóa :

2005 – 2009

Tháng 2 năm 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI TÓM TẮT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN DIVISION CHÂU MỸ CỦA
VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM TRÊN
CÁC LÔ HẠT GIỐNG CÂY HỌ CÀ NHẬP
KHẨU VÀO VIỆT NAM BẰNG
KỸ THUẬT PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN THỊ HOA

NGUYỄN THỊ NGỌC THẢO

KS. PHAN THỊ THU HIỀN
KS. NGUYỄN VĂN LẪM

Tháng 2 năm 2010


LỜI CẢM ƠN
Đề tài “Xác định sự hiện diện Division Châu Mỹ của vi khuẩn Ralstonia
solanacearum trên các lô hạt giống cây họ cà nhập khẩu vào Việt Nam bằng kỹ thuật
PCR” được thực hiện từ tháng 2/2009 đến tháng 7/2009, tại Trung tâm kiểm dịch thực
vật sau nhập khẩu II.
Hôm nay đề tài đã hoàn thành, đánh dấu cho khả năng của tôi có thể đóng góp
và trở thành một người có ích cho xã hội. Đó như là một thành công của bản thân tôi.

Nhưng để có được thành công này, tôi vô cùng biết ơn gia đình. Gia đình đã tạo điều
kiện cho tôi ăn học. Tôi chân thành cảm ơn các thầy cô tại trường Đại học Nông Lâm
đã tận tình chỉ dạy và trang bị cho tôi những kiến thức sẽ thật hữu ích trong suốt quá
trình làm việc của tôi hiện tại và sau này. Tôi vô cùng cảm ơn sự hướng dẫn tận tình
của các anh chị tại Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu II, trong đó tôi xin
cảm ơn chị Nguyễn Thị Hoa, chị Phan Thị Thu Hiền, chị Nguyễn Thị Huyền và anh
Nguyễn Văn Lẫm, những người thầy, người cô đồng thời là anh, chị đã tận tâm giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận này tôi đã có nhiều sai sót mong
các thầy cô, anh chị bỏ qua. Tôi sẽ cố gắng phấn đấu hơn trong suốt quá trình làm việc
sau này để không phụ lòng gia đình, thầy cô, các anh chị hướng dẫn và bạn bè đã giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Xin chân thành cảm ơn
Nguyễn Thị Ngọc Thảo

i


TÓM TẮT
NGUYỄN THỊ NGỌC THẢO, Đại Học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, tháng 2/2010
Đề tài “XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN DIVISION CHÂU MỸ CỦA VI KHUẨN
RALSTONIA SOLANACEARUM TRÊN CÁC LÔ HẠT GIỐNG CÂY HỌ CÀ NHẬP
KHẨU VÀO VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR”
Hội đồng hướng dẫn:
ThS. NGUYỄN THỊ HOA
KS. PHAN THỊ THU HIỀN
KS. NGUYỄN VĂN LẪM
Việc xác định Division Châu Mỹ của vi khuẩn Ralstonia solanacearum (đặc
biệt là dòng biovar 2, race 3 – đối tượng kiểm dịch thực vật của nước Mỹ) trên các lô

hạt giống cây họ cà nhập khẩu là cần thiết cho công tác kiểm dịch thực vật xuất nhập
khẩu của nước ta, do một phần hạt giống nhập khẩu này sẽ được sử dụng để sản xuất
ra hạt giống lai xuất khẩu sang Mỹ.
Vì vậy, trong đề tài này, chúng tôi đã thực hiện phân lập vi khuẩn Ralstonia
solanacearum từ 26 lô hạt giống cây họ cà nhập khẩu từ nhiều nước được thu nhận
trong bốn tháng đầu năm 2009 trên các môi trường chọn lọc đặc trưng. Kết quả, chúng
tôi đã phân lập được 25 dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum (thuộc 6/ 26 lô hạt
giống cây họ cà nhập khẩu đã được kiểm tra). Kết hợp với 13 dòng vi khuẩn Ralstonia
solanacearum của Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu II phân lập vào tháng
12 năm 2008, chúng tôi tiến hành giám định Division Châu Mỹ bằng kỹ thuật PCR với
cặp primer DIV2F/ DIV2R. Để tăng độ chính xác chúng tôi kiểm chứng kết quả bằng
cặp primer DIV1F/ DIV1R.
Kết quả nhận thấy không có sự hiện diện của Division Châu Mỹ trong các dòng
vi khuẩn kiểm tra. Tỷ lệ tiềm ẩn của Ralstonia solanacearum trong các lô hạt giống
cây họ cà nhập khẩu là khá cao (38,46%). Các dòng vi khuẩn thu nhận được đa phần
thuộc biovar 3 - dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh chủ yếu ở miền Bắc Việt Nam theo
các nghiên cứu gần đây.

ii


SUMMARY
NGUYEN THI NGOC THAO, Nong Lam University, HCMC, Augurst 2009.
The

title

of

research:

“AMERICANUM”

“DETERMINATION

DIVISION

OF

FOR

RALSTONIA

THE

PRESENT

OF

SOLANANCEARUM

ON

SOLANACEAE SEEDS IMPORTED TO VIETNAM BY PCR TEST”.
The determination for the presence of “Americanum” Division (Division II) of
the bacterium Ralstonia solanacearum (special race 3 biovar 2 – the plant quarantine
pest of the USA) on the imported Solanaceae seeds is necessary for the plant
quarantine services. Because a part of these seeds would be cultivated on the areas
where produce Solanaceae seeds export to the USA.
In this report, we isolated Ralstonia solanacearum by using selective media

from 26 Solanaceae seeds lots imported from differente countries in the 4 early
months of 2009. Result of this, we isolated 25 strains of Ralstonia solanacearum
isolated (from 6/ 26 Solanaceae seeds lots imported were isolated). Combination with
13 strains of Ralstonia solanacearum, which were isolated by PEQC2 in December
2008, we checked for the presence of Division II by PCR test using primer pair
DIV2F/ DIV2R and confirmed the result by PCR test with primer pair DIV1F/ DIV1R.
We did not find out the presence Division II of Ralstonia solanacearum in 26 lots of
the imported Solanaceae seeds. The proportion of Ralstonia solanacearum isolated in
Solanaceae seeds is 38, 46%. Almost of Ralstonia solanacearum strains were biovar 3
– bacterial wilt in the North of Vietnam. This result is suitable with some recent
researches about bacterial wilt in the North of Vietnam.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn...................................................................................................................i
Tóm tắt........................................................................................................................ii
Summary....................................................................................................................iii
Mục lục ......................................................................................................................iv
Danh sách các chữ viết tắt .........................................................................................vi
Danh sách các bảng ..................................................................................................vii
Danh sách các hình ..................................................................................................viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
I. Đặt vấn đề................................................................................................................ 1
II. Yêu cầu của đề tài .................................................................................................. 2
III. Nội dung thực hiện ............................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................... 4
I. Tóm tắt lịch sử nghiên cứu bệnh............................................................................. 4

II. Giới thiệu vi khuẩn Ralstonia solanacearum ........................................................ 5
A. Phân loại và danh pháp.......................................................................................... 6
1. Phân loại ................................................................................................................. 6
2. Danh pháp............................................................................................................... 7
B. Sự phân chia vi khuẩn R. solanacearum................................................................ 7
1. Race ........................................................................................................................ 7
2. Biovar .................................................................................................................... 7
3. Division .................................................................................................................. 8
C. Triệu chứng bệnh điển hình ................................................................................... 8
1. Triệu chứng bệnh điển hình trên cà chua ............................................................... 8
2. Triệu chứng trên khoai tây...................................................................................... 9
D. Mức độ phổ biến của vi khuẩn Ralstonia solanacearum .................................... 11
III. Các kỹ thuật dùng chẩn đoán bệnh héo xanh ..................................................... 13
A. Phương pháp truyền thống................................................................................... 13
B. Phương pháp huyết thanh (ELISA) ..................................................................... 13
C. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................................... 14

iv


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................. 17
I. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.........................................................................17
II. Vật liệu.................................................................................................................17
A. Mẫu nghiên cứu ..................................................................................................17
B. Hóa chất dùng trong nghiên cứu..........................................................................17
1. Môi trường phân lập .............................................................................................17
2. Hóa chất ly trích DNA.......................................................................................... 17
C. Dụng cụ và thiết bị...............................................................................................18
1. Dụng cụ.................................................................................................................18
2. Thiết bị..................................................................................................................18

III. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................19
A. Phương pháp phân lập, nuôi cấy và tồn trữ mẫu ................................................. 19
B. Xác định vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng thử sinh hóa .......................... 20
C. Phương pháp xác định biovar .............................................................................. 20
D. Phương pháp xác định Division ......................................................................... 21
1. Ly trích và tinh sạch DNA tổng số .....................................................................21
2. Phương pháp PCR ................................................................................................ 23
3. Kỹ thuật điện di ................................................................................................... 24
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................. 25
I. Kết quả ..................................................................................................................25
A. Thu thập, phân lập, tồn trữ mẫu vi khuẩn............................................................ 25
B. Xác định vi khuẩn Ralstonia solanacearum........................................................27
C. Xác định biovar bằng phản ứng sinh hóa ............................................................ 29
D. Xác định Division vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng PCR ....................... 31
II. Thảo luận .............................................................................................................34
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................37
I. Kết luận .................................................................................................................37
II. Đề nghị.................................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................39
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BDB

Blood disease bacterium

DIV1

DIV1F/ DIV1R

DIV2

DIV2F/ DIV2R

ELISA

Enzyme linked immonosorbent assay

LB

Luria – Bertani

PCR

Polymerase Chain Reaction

PGA

Thạch đường khoai tây (Potato glucose agar)

TZC

Tripheny tetrazolium chloride

WA

Thạch nước cất (Water agar)

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Trình tự oligonucleotide của primer...........................................................15
Bảng 2.2 Kết quả khuếch đại PCR sử dụng các tổ hợp primer khác nhau ................16
Bảng 3.1 Trình tự các primer được sử dụng trong thí nghiệm ..................................18
Bảng 3.2 Bảng phân loại Ralstonia solanacearum theo biovar................................21
Bảng 4.1 Bảng thông tin chi tiết mẫu các lô hạt giống họ cà nhập khẩu...................25
Bảng 4.2 Tỷ lệ hạt giống nhiễm vi khuẩn trên môi trường TWA.............................27
Bảng 4.3 Kết quả thử Gram của các dòng vi khuẩn trên môi trường PGA ...............28
Bảng 4.4 Kết quả xác định dòng vi khuẩn R.solanacearum trên môi trường TZC ...29
Bảng 4.5 Kết quả xác định biovar bằng phản ứng sinh hóa ......................................31
Bảng 4.6 Bảng gradient nhiệt của hai lần thử nghiệm .............................................. 33

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Triệu chứng bệnh điển hình của bệnh héo xanh ..........................................9
Hình 2.2 Mô thân cây cà chua đổi sang màu nâu ở bệnh héo xanh.............................9
Hình 2.3 Triệu chứng bệnh “brown rot” trên cây khoai tây ......................................10
Hình 2.4 Dịch nhầy vi khuẩn có dạng kéo sợi...........................................................10
Hình 2.5 Dịch vi khuẩn tiết ra từ mắt của củ khoai tây .............................................11
Hình 2.6 Triệu chứng bệnh “brown rot” trên củ khoai tây ........................................11
Hình 2.7 Khuẩn lạc của vi khuẩn R. solanacearum trên môi trường thạch TZC ......13
Hình 3.1 Sơ đồ vị trí các hạt giống trên môi trường TWA........................................19
Hình 3.2 Dòng vi khuẩn trên hạt giống sau 5 ngày quan sát; mẫu O3M09 4.3 ........19
Hình 4.1 Hạt nảy mầm trên môi trường WA. ............................................................26

Hình 4.2 Khuẩn lạc vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên môi trường TZC .........28
Hình 4.3 Kết quả xác định biovar ở mẫu 56DT.........................................................29
Hình 4.4 Kết quả xác định biovar bằng phản ứng sinh hóa ở mẫu C1M09 3.7 ........30
Hình 4.5 Kết quả xác định biovar của dòng O2M08 4.3...........................................30
Hình 4.6 Kết quả khuếch đại PCR với tổ hợp primer DIV1F/DIV1R ......................32
Hình 4.7 Kết quả khuếch đại PCR với cặp primer DIV1F/ DIV1R ..........................34

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
I. Đặt vấn đề
Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây hại nặng trên cây họ
cà ở nhiều khu vực trên thế giới. Vi khuẩn Ralstonia solanacearum được Ervin Smith
nghiên cứu, mô tả, và định danh là Pseudomonas solanacearum vào năm 1896, đến
năm 1995, được Yabuchi và ctv đổi tên thành Ralstonia solanacearum. Đây là loài vi
khuẩn quan trọng có thể tồn tại và gây bệnh ở nhiều vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới
trên thế giới (CABI, 2007).
Theo tổ chức Bảo vệ Thực Vật Châu Âu và Địa Trung Hải (EPPO), tổ chức
Bảo vệ Thực vật Bắc Mỹ (USDA), Ralstonia solanacearum race 3 biovar 2 là dòng vi
khuẩn gây bệnh quan trọng. Đây là đối tượng kiểm dịch thực vật thuộc diện điều chỉnh
của các nước thuộc khu vực Châu Âu và Địa Trung Hải và là đối tượng kiểm dịch thực
vật của các nước thuộc khu vực Bắc Mỹ (gồm Canada, Mỹ, Mexico).
Từ những yêu cầu thực tế phải giám định vi khuẩn Ralstonia solanacearum đối
với hạt giống họ cà xuất khẩu qua thị trường Mỹ, Cục bảo vệ thực vật, Trung tâm kiểm
dịch thực vật sau nhập khẩu II đã thực hiện đề tài “Cấu trúc quần thể vi khuẩn
Ralstonia solanacearum, đối tượng kiểm dịch thực vật xuất khẩu trên hạt giống hại
cây họ cà ở vùng nguyên liệu giống xuất khẩu sang Mỹ”.
Kết quả bước đầu từ đề tài trên cho thấy có khả năng có Division Châu Mỹ của
vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên hạt giống họ cà nhập khẩu vào Việt Nam, điều

này gây trở ngại trong việc xuất khẩu sản phẩm cây họ cà qua thị trường Âu Mỹ. Do
đó việc phát hiện Division Châu Mỹ của vi khuẩn Ralstonia solanacearum chính xác
là điều cần thiết trong thực hiện công tác xuất nhập khẩu. Bên cạnh đó, những kỹ thuật
sinh học phân tử hiện nay giúp cho việc xác định nhanh và chính xác nhiều đối tượng
vi sinh vật mà điển hình là kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng
phổ biến và mang tính đặc hiệu cao. Vì thế đề tài “Xác định sự hiện diện Division
Châu Mỹ của vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên các lô hạt giống cây họ cà nhập
khẩu vào Việt Nam bằng kỹ thuật PCR” là cấp thiết và mang tính ứng dụng cao trong
công tác kiểm dịch thực vật.

1


II. Yêu cầu của đề tài
-

Thu thập, phân lập và tồn trữ mẫu vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên hạt
giống thuộc các lô hạt giống cây họ cà nhập khẩu vào Việt Nam trong 4 tháng
đầu năm 2009.

-

Xác định biovar vi khuẩn Ralstonia solanacearum.

-

Ly trích DNA vi khuẩn Ralstonia solanacearum.

-

Xác định Division Châu Mỹ của vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng kỹ
thuật PCR với cặp primer DIV2F/ DIV2R.

III. Nội dung thực hiện
-

Phân lập các dòng vi khuẩn thu thập được trên môi trường TZC (Tripheny
tetrazolium chloride) (TTC hay TZC) (Kelman, 1954).

-

Xác định biovar vi khuẩn dựa vào phản ứng sinh hóa theo phương pháp của
French (1995).

-

Ly trích và tinh sạch DNA tổng số của vi khuẩn sử dụng CTAB/ NaCl.
•

Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường LB (Luria - Bertani). Sau 48 giờ,
thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 12.000 vòng/5 phút/4oC.

•

Rửa sinh khối thu được với 1 ml nước cất vô trùng và đánh tan bằng
vortex.

•

Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 560 µl dung dịch TE 1X và

đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng
vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 - 2 giờ.

•

Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, hoà tan thật kỹ bằng vortex.

•

Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (khoảng 1/10 thể tích). Trộn
đều, ủ ở 65oC trong 10 phút.

•

Thêm 780 µl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol.
Trộn đều, ly tâm 12.000 vòng/10 phút, ở 4oC.

•

Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới (nếu
không thể phân biệt bề mặt chung giữa các dung dịch, có thể ly tâm lần
nữa ở tốc độ lớn hơn).

•

Thêm 500 µl choroform/isoamyl/alcohol, trộn đều, ly tâm 12.000
vòng/10 phút/4oC.

2

•

Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới. Kết tủa
DNA với 0,6 thể tích isopropanol, đem ủ - 20oC trong 30 phút. Thu kết
tủa bằng cách ly tâm 12.000 vòng/10 phút/4oC, loại bỏ phần dịch bên
trên thu lấy phần kết tủa ở đáy ống.

•

Rửa kết tủa bằng ethanol 70% đã được làm lạnh, invert ống qua lại, ly
tâm 12.000 vòng/10 phút/4oC. Thu kết tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng.

•

Hòa tan hoàn toàn DNA trong 200 µl dung dịch TE. Cho thêm vào 1 µl
dung dịch men RNAse, ủ ở 37oC trong 1 giờ.

•

Chiết xuất dung dịch DNA với 100 µl dung dịch hỗn hợp
phenol/chloroform/isoamyl alcohol ( 25 : 24 :1), trộn đều, ly tâm 12.000
vòng/ 10 phút/ 4oC.

•

Thu dịch bên trên và chiết xuất với 50 µl choroform/isoamyl alcohol
(24 :1), trộn đều, ly tâm 12000 vòng/ 10 phút/ 4oC.

•

Thu dịch bên trên, cho vào 3M sodium acetate, pH= 5,0 và isopropanol,
dùng khoảng 0,6 thể tích dung dịch, ủ 30 phút ở -20oC.

•

Rửa kết tủa bằng ethanol 70% đã được làm lạnh, invert ống qua lại, ly
tâm 12.000 vòng/10 phút/4oC. Thu kết tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng.

•
-

Hòa tan kết tủa trong 30 µl dung dịch TE.

Xác định Division Châu Mỹ của vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng kỹ
thuật PCR với cặp primer DIV2F/ DIV2R, kiểm tra kết quả với cặp primer
DIV1F/ DIV1R, sử dụng iQTM suppermix taq (Bio rad).

3


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. Tóm tắt lịch sử nghiên cứu bệnh
-

Năm 1896 E. F. Smith nghiên cứu mô tả và định tên Pseudomonas

solanacearum (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1999). Pseudomonas solanacearum đã
được định tên trong danh sách Approved bởi Skerman và ctv vào năm 1980. Nghiên
cứu tiếp theo của Yabuuchi và ctv (1995) đã đổi tên vi khuẩn Pseudomonas

solanacearum thành Ralstonia solanacearum, và xác định loài vi khuẩn này có quan
hệ với loài R. syzygii, nguyên nhân gây bệnh Sumatra của cây đinh hương và BDB
(blood disease bacterium) gây bệnh trên chuối ở Indonesia (CABI, 2007).
-

Những năm sau, bệnh héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra được

nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu như Kelman (1954), HayWard (1994),
Yabuuchi (1995), Seal và ctv (1993, 1999) cho đến nay vẫn còn nhiều nhà khoa học
tiếp tục nghiên cứu về sự đa dạng của vi khuẩn Ralstonia solanacearum cũng như các
biện pháp phòng chóng bệnh do vi khuẩn gây ra trên nhiều vùng lãnh thổ khác nhau.
-

Đối với sự lây nhiễm và chuyển giao mầm bệnh trên hạt giống đã được nghiên

cứu trên đậu phộng ở Indonesia bởi Machmud và Middleton, 1990; Machmud, 1993; ở
Trung Quốc được nhiên cứu bởi Zang và ctv, 1993; Dongfang và ctv, 1994. Nghiên
cứu xác định R. solanacearum race 1 trên hạt của cây cà chua và cà tím trong tự nhiên
bởi Shakya, 1993; Chatterijee và ctv, 1994; Singh, 1994. Sự lây nhiễm vi khuẩn R.
solanacearum trên hạt giống ớt và cà chua trong sản xuất được nghiên cứu bởi Devi và
Menson, 1980; Moffett và ctv, 1981 (CABI, 2007).
-

Tại Việt Nam, Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề đã mô tả đặc điểm và cách phòng

trừ bệnh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra trên cà chua, khoai tây (Vũ Triệu
Mân và Lê Lương Tề, 1999). Năm 2001, Lê Lương Tề đã nhận dạng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum bằng PCR và đánh giá tính kháng bệnh héo xanh của một số
giống cà chua đối với các dòng vi khuẩn tại Hà Nội. Năm 2002, Nguyễn Thị Yến đã
nghiên cứu thành phần race, biovar vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây trồng cạn tại

15 tỉnh phía Bắc và Nam Trung Bộ. Hoàng Hoa Long, 2002, đã thực hiện giám định vi
khuẩn Ralstonia solanacearum bằng kỹ thuật PCR trên các mẫu vi khuẩn được phân
lập từ mẫu cà chua bị bệnh héo rũ. Năm 2003, Phạm Đăng Minh nghiên cứu cấu trúc
4


quần thể vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh hại cây trồng ở một số tỉnh phía
Nam bằng kỹ thuật PCR. Năm 2008, Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu II
đã nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên hạt giống cây
họ cà ở vùng nguyên liệu giống xuất khẩu sang Mỹ
-

Bệnh héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum có nhiều tên gọi khác nhau

như trên cà chua có tên Southern wilt (theo cách gọi người Mỹ), Bacteria wilt (theo
cách gọi của người Anh). Trên khoai tây ở Mỹ gọi là “brown rot”, Ấn Độ gọi là
“Bacteria ring disease”. Ở Việt Nam thường gọi là bệnh héo xanh, héo rũ vi khuẩn.
-

Ngoài ra, vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh trên chuối gọi là “bệnh

Moko”, trên thuốc lá gọi là “Granville wilt”.
II. Giới thiệu vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum có hình gậy, hai đầu hơi tròn, có một lông roi
ở một đầu, kích thước 0,9 - 2 x 0,5 - 0,8 μm, gram âm, là vi khuẩn đất ký sinh trên
thực vật. Chúng thường gây ra bệnh chết héo trên cây họ cà, ảnh hưởng trên diện rộng
và gây tác hại lớn trong sản xuất (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1999), chúng được
xếp vào nhóm vi khuẩn đa thực (nhóm gây bệnh trên nhiều loại cây trồng hoặc nhiều
họ khác nhau) (Đỗ Tấn Dũng, 1998).
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum có thể lan truyền theo nước tưới, xâm nhập

vào rễ, thân, cuống lá của cây qua các vết thương cơ giới do nhổ cây giống đem trồng,
do côn trùng, tuyến trùng… hoặc có thể xâm nhập vào cây qua các lỗ hở tự nhiên (khí
khổng, thủy khổng, mắt củ...). Sau khi xâm nhập vào rễ vi khuẩn sẽ lan tới các bó
mạch dẫn xylem, sinh sản và phát triển trong đó. Chúng sản sinh ra các men pectinaza
và cellulaza phân hủy các mô. Ngoài ra, vi khuẩn còn sản sinh ra các độc tố
expolysaccarit (EPS) và lipopolysaccarit (LPS) gây tắc mạch dẫn cản trở sự vận
chuyển nước và nhựa trong cây dẫn đến bệnh héo xanh. Bệnh thường xảy ra vào lúc
cây đang tăng trưởng gây hại nặng trên đất cát pha, tuy nhiên trên đất thịt và ở những
vùng luân canh với cây lúa thì bệnh nhẹ hơn (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1999).
Vi khuẩn phát triển thích hợp ở nhiệt độ 26oC – 30oC, nhiệt độ tối thiểu là 10oC,
tối đa 40oC, nhiệt độ gây chết là 55oC, mẫn cảm với môi trường khô, phát triển trong
phạm vi pH rộng (6 – 8), pH tối ưu 6,8 – 7,2 (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1999).
Trên môi trường Kelman (1954) khuẩn lạc màu trắng kem, nhẵn bóng, nhờn
(đối với vi khuẩn có tính độc gây bệnh). Nếu khuẩn lạc chuyển sang kiểu khuẩn lạc
5


răn reo là dòng vi khuẩn mất tính độc (nhược độc). Để phát hiện dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum hiện nay thường sử dùng môi trường chọn lọc TZC (Tripheny
tetrazolium chloride), trên môi trường này dòng vi khuẩn có tính độc sẽ có khuẩn lạc ở
giữa màu hồng, rìa trắng vả dòng vi khuẩn không độc thì có màu đỏ tối (Vũ Triệu Mân
và Lê Lương Tề, 1999).
Dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum có khả năng phân giải làm lỏng gelatin,
khử nitrat, tạo ra acid khi phân giải một số loại đường, hợp chất cacbon không có khả
năng thủy phân tinh bột…(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1999).
Nguồn bệnh vi khuẩn có thể tồn tại lâu trong đất từ 5 -6 năm, ở trong cơ thể ký
chủ hoặc bên trong hạt giống có thể tồn tại trong 7 tháng, nếu bám dính trên bề mặt hạt
chỉ tồn tại trong 2 ngày (Đỗ Tấn Dũng, 1998). Theo nghiên cứu của Zhang và ctv
(1993) thì nước là nhân tố quan trọng trong sự lây lan mầm bệnh vi khuẩn trên hạt đậu
phộng. Sự cất trữ hạt giống trong điều kiện bảo quản khô có thể tạo ra hạt giống đậu

phộng sạch bệnh. Tuy nhiên trong nghiên cứu trên không đề cập đến những hạt giống
khác (CABI, 2007).
Ngoài ra nghiên cứu về mặt sinh học phân tử cho thấy tính gây bệnh của các
dòng vi khuẩn có độc Ralstonia solanacearum được quyết định bởi gen hrp. Độc tố
exopolysaccharide (EPS) do vi khuẩn tiết ra được tổng hợp dựa vào các gen epsA,
epsB và OPS (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1999).
A. Phân loại và danh pháp
1. Phân loại
Theo CABI (2007) phân loại vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc:
-

Giới: Bacteria

-

Ngành: Proteobacteria

-

Lớp: Beta Proteobacteria

-

Bộ: Burkholderiales

-

Họ: Ralstoniaceae

-

Giống: Ralstonia

6


2. Danh pháp
-

Pseudomonas solanacearum (E.F. Smith, 1914)

-

Bacillus solanacearum (E.F. Smith, 1986)

-

Burkhoderia solanacearum (Yabuuchi, 1992)

-

Ralstonia solanacearum (Yabuuchi, 1995)

B. Sự phân chia vi khuẩn R. solanacearum
1. Race: theo Buddenhagen và ctv (1962) dựa trên phạm vi ký chủ vi khuẩn
Ralstonia solanacearum được chia làm 3 race (CABI 2007).
-

Race 1: vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc nhóm này tấn công trên nhiều

loại cây trồng và hạt giống khác nhau, đặc biệt tấn công trên các cây như khoai tây, cà
chua, cà tím, ớt, thuốc lá và đậu phụng, nhiệt độ phát triển thích hợp ở nhiệt độ 35oC –
37ºC.
-

Race 2: gây hại trên các cây họ chuối như chuối tam bội (nguyên nhân gây bệnh

Moko), và Heliconia spp, thích hợp với nhiệt độ cao 35oC – 37ºC.
-

Race 3: chủ yếu tấn công trên khoai tây, cà chua, không có tính độc hại cao với

nhóm cây họ cà khác. Khác với race 1, race 3 thường tấn công vào những vùng có
nhiệt độ thấp, vĩ độ cao, nhiệt độ thích hợp là 27oC. Kí chủ có thể là hạt giống cây họ
cà như Solanum dulcamar, S. nigrum, S. cineraum ( Australia)...
Năm 1986, thêm 2 race gây bệnh trên gừng (Zingiber officinable) và cây dâu tằm
(Morus spp) đã được biết đến nhưng tính trạng của chúng vẫn chưa được rõ ràng.
-

Race 4: gây hại trên gừng Philippin.

-

Race 5: được ghi nhận trên cây dâu tằm Mulberry (Trung Quốc).

Sự phân chia các race thường rất phức tạp do phụ thuộc vào thành phần cây kí chủ và
phạm vi phân bố của chúng. Theo Martin và French (1997), race 1 lưu tồn nhiều năm
trong đất, ngược lại race 3 thường có xu hướng giảm sau vài năm không có khoai tây
dại làm ký chủ (CABI, 2007).
2. Biovar

Theo Hayward (1964) vi khuẩn R. solanacearum có 4 biotype (biovar) dựa vào
khả năng sản xuất acid từ việc sử dụng và oxi hóa 3 loại disaccharide (cellobiose,
lactose, maltose) và 3 loại hexan alcohol (dulcitol, mannitol, sorbitol). Theo
Bundenhagen (1986) dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây dâu tằm có thể thuộc biovar 5.
theo Hayward (1993) các biovar này hầu hết không tương quan với race được nghiên
7


cứu bởi Buddenhagen và ctv (1992), ngoại trừ race 3 tương đương với biovar 2
(CABI, 2007).
3. Division
Race và biovar được phân loại vào trong 2 Division chính dựa vào phép phân
tích đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP) (Cook và Sequeira, 1988, 1994).
Dòng châu Á của race 1 (biovar 3, 4, 5) tập hợp thành một nhóm là Division I,
Division “Asiaticum”. Dòng châu Mỹ của race 1 (biovar 1), race 2 (biovar 1) và race 3
(biovar 2) tập hợp thành 1 nhóm khác là Division II, Divison “Americanum”. Sự phân
tích 2 Division sau này được xác định bằng cách sử dụng marker phân tử. Các primer
đặc hiệu trong phân tích Division cụ thể đã được mở rộng vào năm 1999 bởi Seal và
ctv (CABI, 2007).
Theo Possier và ctv (1999) dòng vi khuẩn Châu Phi phân lập từ các nước
Reunion, Madagaskar, Zimbabwe và Angola dựa vào kỹ thuật PCR-RFLP của vùng
gene hrp thì nhận thấy ràng nó có họ gần hơn với Division Châu Á (CABI, 2007).
C. Triệu chứng bệnh điển hình
Triệu chứng bệnh thường biểu hiện ngay sau khi bệnh xâm nhập vào cây. Cây
bị bệnh ban ngày lá mất màu nhẵn bóng, tái xanh, héo cụp xuống. Giai đoạn cây con
thường biểu hiện bệnh trên toàn cây, còn ở giai đoạn trưởng thành bệnh thường biểu
hiện trên lá ngọn trước. Ở 1- 2 ngày đầu cây có thể phục hồi lại được vào lúc trời mát
hoặc về đêm, nhưng sau 2-3 ngày lá héo không thể phục hồi lại được và toàn cây héo
rũ rồi chết. Cắt ngang đoạn thân gần mặt đất ta thấy bó mạch bị hóa nâu, trong điều
kiện ẩm độ cao, thân cây bị bệnh dần dần thối mềm, ấn mạnh gần miệng cắt có thể

thấy dịch nhờn vi khuẩn tiết ra màu trắng sữa. Rễ có màu nâu đen và thối, củ thường bị
thối, cắt ngang củ có một vòng màu nâu gần phần vỏ bên ngoài (Vũ Triệu Mân – Lê
Lương Tề, 1999).
1. Triệu chứng bệnh điển hình trên cà chua
Trên cây cà chua, triệu chứng đầu tiên có thể thấy được là sự mềm rũ của lá
non. Dưới điều kiện thuận lợi của môi trường cho mầm bệnh phát triển (nhiệt độ đất
vào khoảng 250C, độ ẩm cao) sau 1 vài ngày toàn bộ cây sẽ héo rũ. Dưới điều kiện ít
thuận lợi hơn (nhiệt độ đất dưới 210C) hiện tượng héo ít xảy ra. Khi ta cắt ngang thân,
nhận thấy mô mạch bị hóa nâu, có hiện tượng ứa dịch vi khuẩn trắng hoặc vàng vàng
(CABI, 2007).
8


Hình 2.1 Triệu chứng bệnh điển hình của bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia
solanacearum gây ra trên cây cà chua. (photo courtesy of Central Science Laboratory,
Harpenden Archive, British Crown, Bugwood.org).

Hình 2.2 Mô thân cây cà chua đổi sang màu
nâu ở bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralsonia
solanacearum. (photo courtesy of Central
Science Laboratory, Harpenden Archive, British
Crown, Bugwood.org).

2. Triệu chứng trên khoai tây
Giai đoạn đầu của bệnh là sự héo rũ của lá theo hướng đỉnh của cây ở nhiệt độ
cao trong suốt ban ngày và hồi phục về đêm. Trong giai đoạn đầu, lá vẫn xanh nhưng
sau đó sẽ vàng và hoại tử. Sự héo rũ của cành non hoặc cả cây nhanh chóng xảy ra và
không thể thay đổi được, kết quả cây sẽ đỗ sập xuống và chết (CABI, 2007).

9

Hình 2.3 Triệu chứng bệnh “brown rot” trên cây khoai tây do vi khuẩn
Ralstonia solanacearum gây ra. (photo courtesy of Central Science Laboratory,
Harpenden Archive, British Crown, Bugwood.org).

Khi cắt ngang thân cây bị héo rũ thì bó mạch thường có màu nâu và có dịch vi
khuẩn dạng sữa tiết ra từ bề mặt vết cắt. Khi đặt thẳng đứng thân cây bị cắt trong nước,
dịch vi khuẩn kéo dạng sợi chỉ sẽ chảy từ bó mạch ra ngoài (CABI, 2007).

Hình 2.4 Dịch nhầy vi khuẩn có dạng kéo sợi khi
đặt thân cây bị cắt ngang thẳng đứng trong nước.
Ở khoai tây triệu chứng bệnh có thể quan sát được ở củ, củ được xem như là
nơi bệnh phát triển. Khi cắt ngang củ có triệu chứng bệnh sẽ quan sát được biểu lộ của
bệnh là sự đổi màu của mô thường gọi là “vascular ring”. Ở mức độ cao hơn, sự
chuyển màu có thể kéo dài làm cho lõi và vỏ của củ khoai tây có dạng xốp. Trên bề
mặt cắt của củ bị nhiễm bệnh có dịch nhầy dạng trắng đục được tiết ra, dịch nhầy này
bao gồm tế bào vi khuẩn và ngoại bào polysaccharide của chúng (CABI, 2007).

10


Hình 2.5 Dịch vi khuẩn tiết ra từ mắt của củ
khoai tây bệnh “brown rot”. (photo courtesy
of Central Science Laboratory, Harpenden
Archive, British Crown, Bugwood.org).

Hình 2.6 Triệu chứng bệnh “brown rot” trên
mặt cắt củ khoai tây. (photo courtesy of
Central Science Laboratory, Harpenden

Archive, British Crown, Bugwood.org).

D. Mức độ phổ biến của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Ngày nay, vi khuẩn Ralstonia solanacearum được ghi nhận gây hại ở hầu hết
các châu lục (Theo CABI, 2007).
-

Châu Âu, tại các nước như Hungary, Đức, Pháp, Slovakia, Nga, Moldova…
dòng vi khuẩn được ghi nhận đa phần thuộc race 3.

-

Ở Châu Á: Bangladesh, Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Indonesia, Nhật,
Malaysia, Philippin, Việt Nam… các dòng vi khuẩn được ghi nhận đa phần
thuộc race 1, 2, 3.

-

Châu Phi: Angola, Lybia… các dòng vi khuẩn thu nhận được thuộc race 1, 2.

11


-

Châu Mỹ các nước như Costa Rica, Panama, Canada, Mexico, Mỹ, Braxin,
Uruguay... các dòng vi khuẩn đa phần thuộc race 1, 2, 3.

-

Châu Úc: Australia, Newzealand…
Ở Indonesia bệnh được phát hiện đầu tiên trên đậu phộng vào năm 1905 ở vùng

Cirebon. Về sau bệnh được ghi nhận trên nhiều loại cây trồng khác như cà chua, thuốc
lá, chuối. Kết quả nghiên cứu bệnh héo xanh trên đậu phộng giữa AARD và ACIAR
vào năm 1985 cho rằng đây là bệnh chính trên đậu phộng ở Indonesia, thiệt hại do
bệnh từ 15 - 90% năng suất (Wright, 1991).
Ở Đài Loan, bệnh được ghi nhận gây hại trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, cà
tím, đậu phộng, dâu tây, tía tô, thầu dầu, mè, củ cải, rau dền và một số cây trồng khác.
Trên nhiều loại cây trồng sự thiệt hại do bệnh gây ra có thể từ 5-100% năng suất. Các
dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum chủ yếu thuộc race 1 (Yung An Lee, 2001).
Ở Mỹ, bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum được Ervin Smith
phát hiện đầu tiên trên cây họ cà vào năm 1986. Vi khuẩn Ralstonia solanacearum
race 3 biovar 2 được phát hiện trên cây phong lữ nhập khẩu trong nhà kính ở 4 vùng
của nước Mỹ vào tháng 2 năm 2003. Cùng năm 2003, vi khuẩn Ralstonia
solanacearum cũng được phát hiện trên cây phong lữ nhập khẩu ở các nhà kính tại
New York (CABI, 2007).
Ở Việt Nam, dựa trên phạm vi kí chủ và phản ứng sinh hóa của các dòng vi
khuẩn Ralstonia solanacearum được phân lập trên cà chua, khoai tây, đậu phộng từ 15
vùng sản xuất ở miền Bắc và Nam Trung Bộ, bệnh được ghi nhận trên cà chua, khoai
tây, cà tím, thuốc lá, đậu phộng, gừng, ớt. Qua một số kết quả nghiên cứu công bố gần
đây cho thấy ở nước ta vi khuẩn gây bệnh héo xanh thuộc Division châu Á (Lê Lương
Tề, 2002), race1, biovar 3 và 4 (Nguyễn Thị Yến, 2002). Ở miền Nam, dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum Division châu Á, race 1 và biovar 3 gây hại trên cà chua, cà
tím, cà pháo, ớt, thuốc lá, gừng, đậu phộng, khoai tây ở tỉnh Bình Dương, Tây Ninh,
Tiền Giang, Tp. Hồ Chí Minh (Phạm Đăng Minh, 2003).

12

III. Các kỹ thuật dùng chẩn đoán bệnh héo xanh
A. Phương pháp truyền thống
Phương pháp nuôi cấy trên môi trường nhân tạo: môi trường thạch nước, thạch
khoai tây, khuẩn lạc mọc lên có dạnh hình tròn, ướt, màu trắng kem.
Trên môi trường TZC (Kelman, 1954) khuẩn lạc phát triển có màu hồng và nâu
đỏ, các khuẩn lạc Ralstonia solanacearum thường phát triển sau 4 - 5 ngày nuôi cấy,
trong khi đó vi khuẩn khác thường bị ức chế, hoặc có thể phát triển nhưng không màu
(Shurfleff, 1997). Ngoài ra, môi trường TZC cho phép phân biệt 2 loại khuẩn lạc thuộc
chủng độc hay chủng không độc của vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Trên môi
trường này khuẩn lạc của chủng độc có màu trắng hồng ở giữa và chủng không độc thì
đỏ tối.

Hình 2.7 Khuẩn lạc vi khuẩn Ralstonia solanacearum. A) Khuẩn lạc độc của vi khuẩn R.
solanacearum trên môi trường thạch TZC; B) Khuẩn lạc có độc (phía dưới) và khuẩn lạc
không độc(phía trên) của R. solanacearum trên môi trường phát triển thạch CPG. (photo
courtesy of P. Champoiseau, University of Florida).

B. Phương pháp huyết thanh (ELISA)
Phương pháp ELISA thì cho kết quả nhanh, nhạy, đặc hiệu, phù hợp với các kết
quả nghiên cứu bằng những phương pháp khác. Phương pháp ELISA trước đây chỉ xác
định được vi khuẩn có hiện diện trong mẫu hay không, không phân biệt được dòng độc
và không độc, hay những thông tin đặc biệt của loài như race. Hiện nay, sử dụng
phương pháp ELISA cho phép ta nhận diện được dòng vi khuẩn có độc hay không có
13


độc của vi khuẩn Ralstonia solanacearum nhưng vẫn không cung cấp được các thông
tin về race. Các kháng thể phân lập từ dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà
chua thì chỉ đặc hiệu với dòng vi khuẩn gây bệnh trên cà chua nhưng không đặc hiệu
với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh trên kí chủ khác (Rajeshwari

và ctv, 1998).
C. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR cho kết quả nhanh, nhạy trong việc xác định vi khuẩn
Ralstonia solanacearum cũng như 2 phân nhóm chính của loài vi khuẩn này (S. E.
Seal và ctv 1999).
Robert và ctv (1990); Stackerbrandt & Goebel (1994) trên cơ sở nghiên cứu
tính tương đồng DNA – DNA của các isolate Ralstonia solanacearum đã đưa ra kết
luận sự liên hệ giữa các loài thường lớn hơn 70% và mối tương đồng này không vượt
ra giới hạn của loài (trích dẫn bởi Seal và ctv, 1999).
Cook và ctv (1989, 1991) đã nghiên cứu sự biến thiên trong loài của vi khuẩn
Ralstonia solanacearum. Ông đã phân chia Ralstonia solanacearum thành hơn 40
nhóm RFLP và so sánh hệ số tương đồng từ những nhóm này đồng thời khám phá ra 2
phân nhóm chiếm tỷ lệ lớn của vi khuẩn là Division I (gồm các thành viên thuộc
biovar 3, 4 và 5), Division II (gồm các thành viên thuộc biovar 1, 2 và N2) (trích dẫn
bởi Seal và ctv, 1999).
Seal và ctv (1992b) tìm thấy rằng các dòng Ralstonia solanacearum có 3 nhóm
dấu hiệu đặc trưng sau khi thực hiện phản ứng khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với các
primer tRNA tương ứng. Sự phân ly của Ralstonia solanacearum thành 3 nhóm dấu
hiệu PCR thì tương ứng với các Division tự nhiên được chứng tỏ trên sự phân tích cơ
bản RFLP của Cook và ctv (1989, 1991) . Tương tự, Gillings và ctv (1993) đạt được
sự phân ly di truyền tương tự nhờ vào sử dụng enzym cắt giới hạn HeaIII khuyếch đại
gen polygalacturonase của Ralstonia solanacearum (trích dẫn bởi Seal và ctv, 1999).
Như vậy, từ những nghiên cứu nêu trên đưa ra kết luận là vùng gen 16S rRNA
trong Ralstonia solanacearum có ảnh hưởng vào sự tồn tại của hai nhóm Division
chính của vi khuẩn này (Seal và ctv, 1993; Taghavi và ctv, 1996).
Do đó trình tự oligonucleotide của primer dùng trong khuyếch đại có chọn lọc
Division I (biovar 3, 4, 5) hoặc Division II (biovar 1, 2) của vi khuẩn Ralstonia

14

solanacearum đã được Ly và ctv (1993) thiết kế dựa vào sự so sánh trình tự 16S rDNA
của vi khuẩn (trích dẫn bởi Seal và ctv, 1999) (bảng 2.1).
Bảng 2.1 Trình tự oligonucleotide của primer để khuyếch đại có chọn lọc Division I,
Division II
Primer

Trình tự (5’- 3’)

Vị trí khuếch đại *

OLI1

GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC

75 – 95

Y2

CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT

361 – 338

BV345 CGT CAT CCA CAC CAG GTA TTA ACC AGT

484 – 458

DIV1F

CGC ACT GGT TAA TAC CTG GTG

455 – 475

DIV2F

CGC TTC GGT TAA TAC CTG GAG

455 – 475

DIV1R CTA CCG TGG TAA TCG CCC TCC

1454 – 1474

DIV2R CTG CCG TGG TAA TCG CCC CCC

1454 – 1474

ITSR

N/A

GCA GAG ACT TCC ACC TCC A

(*) Hệ thống đánh số trên E.coli (Woese và ctv, 1983). Primer Y2 được thiết kế bởi Young và
ctv (1991). N/A: không xác định.(Seal và ctv, 1999)

Theo kết quả nghiên cứu của Seal và ctv (1999) thì tổ hợp primer
DIV1F/DIV1R cho kết quả khuyếch đại PCR dương tính với Division I và âm tính với
Division II tuy nhiên cho kết quả dương tính với dòng vi khuẩn không xác định được
loài nào nhưng có kết quả thử phản ứng sinh hóa tương tự biovar 2. Tổ hợp primer

DIV2F/ DIV2R âm tính với Division I và dương tính với Division II. Tuy nhiên tổ hợp
primer DIV2F/DIV2R lại cho kết quả dương tính với nhóm vi khuẩn BDB (blood
disease bacterium) và Pseudomonas syzygii. Đối với 2 tổ hợp primer OLI1/ BV345 và
DIV2F/ ITSR thì cho kết quả chỉ dương tính đối với Division I hay Division II (bảng
2.2).

15