Xác định salbutamol, clenbuterol và ractopamine trong thức ăn chăn nuôi, nước tiểu lợn và sản phẩm từ thịt

ĐẠIHỌCQUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNGĐẠIHỌCKHOAHỌCTỰNHIÊN
---------------------

VũQuốc Hƣng

XÁCĐỊNHSALBUTAMOL, CLENBUTEROL VÀ RACTOPAMINE
TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI, NƢỚC TIỂU LỢN
VÀ SẢN PHẨM THỊT

LUẬNVĂNTHẠCSĨKHOAHỌC

HàNội– 2017


ĐẠIHỌCQUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNGĐẠIHỌCKHOAHỌCTỰNHIÊN
---------------------

VũQuốc Hƣng

XÁCĐỊNHSALBUTAMOL, CLENBUTEROL VÀ RACTOPAMINE
TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI, NƢỚC TIỂU LỢN
VÀ SẢN PHẨM THỊT

Chuyênngành:HóaphântíchMã số: 60440118

LUẬNVĂNTHẠCSĨKHOAHỌC
CHỦ TỊCH HỘI ĐỘNG

NGƢỜIHƢỚNGDẪNKHOAHỌC

PGS.TS. TẠ THỊ THẢO

PGS.TSNGUYỄNVĂN RI

Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Luận án này đƣợc hoàn thành với sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của các
Thầy Cô, gia đình và bạn bè, đồng nghiệp.
Với tình cảm chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PSG.TS.
Nguyễn Văn Ri đã nhiệt tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa
Hóa học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tâm
huyết truyền dạy kiến thức và động viên tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu tại
đây.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, lãnh đạo cùng
các cán bộ của Phòng giám định Hóa pháp lý - Viện Khoa học hình sự - Bộ Công
an, các học viên và sinh viên trong bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, trƣờng
Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã ủng hộ, giúp đỡ, động viên tôi trong cả quá
trình học tập và hoàn thành luận án.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2017

Học viên

Vũ Quốc Hƣng

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
MỤC LỤC ....................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... vii
DANH

MỤC

TỪ

VIẾT

TẮT

............................................................................................................................................ vii
i

MỞ ĐẦU.......................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 4
1.1.Giới thiệu về hoocmon tăng trƣởng β2-agonist ............................................... 4
1.1.1. β2-agonist là gì? .................................................................................... 4
1.1.2. Tác dụng của β2-agonist........................................................................ 4
1.1.3. Phân loại β2-agonist .............................................................................. 4
1.2. Giới thiệu về Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine .............................. 5

1.2.1. Thông tin chung..................................................................................... 5
1.2.1.1. Salbutamol ........................................................................................................ 5
1.2.1.2.Clenbuterol ........................................................................................................ 5
1.2.1.3. Ractopamine..................................................................................................... 6
1.2.2. Tính chất và tác dụng của Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine . 6
1.2.2.1. Tác dụng làm giãn phế quản........................................................................ 6
1.2.2.2. Tác dụng làm tăng tỷ lệ nạc/mỡ. ................................................................. 8
1.2.3.Tác hại của Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine đối với sức khỏe
con người ......................................................................................................... 8
1.2.4. Tình hình sử dụng Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine .............. 9
1.2.5. Các phương pháp xác định Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine 12
1.2.5.1. Trong nước ....................................................................................................... 12

ii


1.2.5.2. Thế giới .............................................................................................................. 13
1.3. Phƣơng pháp nghiên cứu sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)......... 18
1.3.1. Giới thiệu phương pháp phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ (LCMS/MS) ............................................................................................................ 18
1.3.1.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................................ 18
1.3.1.2. Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................. 19
1.3.1.3. Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) .......................................................... 20
1.3.1.4. Bộ phân tích khối ............................................................................................ 22
1.3.2.Quy trình định tính và định lượng β2-agonists (Salbutamol, Clenbuterol
và Ractopamine).............................................................................................. 24
1.3.2.1. Chiết chất phân tích ra khỏi mẫu................................................................ 24
1.3.2.2. Làm sạch dịch chiết và làm giàu chất phân tích..................................... 24
1.3.3. Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid Phase Extraction: SPE) ......................... 25
1.3.3.1. Hoạt hóa cột ..................................................................................................... 25
1.3.3.2. Nạp mẫu vào cột.............................................................................................. 26

1.3.3.3. Rửa cột ............................................................................................................... 26
1.3.3.4. Rửa giải ............................................................................................................. 26
1.3.3.5. Làm giàu chất phân tích ................................................................................ 26
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 27
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................... 27
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 27
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 27
2.2. Hóa chất và dụng cụ dung trong nghiên cứu .................................................. 27
2.2.1. Hóa chất và dung dịch thử .................................................................... 27
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................ 28
2.2.3. Chất chuẩn và nội chuẩn....................................................................... 29
2.3. Xây dựng phƣơng pháp xác định Clenbuterol, Salbutamol và

iii


Ractopamine bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ, tối ƣu hóa các thông số kỹ
thuật của hệ thống LC-MS/MS. ................................................................................. 30
2.3.1.Khảo sát quá trình quét phổ các ion chất chuẩn và nội chuẩn (Sử dụng
chế độ Full scan) ............................................................................................. 30
2.3.2. Khảo sát năng lượng phân mảnh của các tiền ion (chọn chế độ SRM:
Selected Reaction Monitoring)........................................................................ 31
2.3.3. Khảo sát nhiệt độ ống mao quản .......................................................... 31
2.3.4. Khảo sát chương trình dung môi .......................................................... 32
2.3.5. Khảo sát khoảng tuyến tính của clen, sal, rac trong xây dựng đường
chuẩn ............................................................................................................... 32
2.1.Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu. ............................................................. 32
2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ lại Sal, Clen, Rac
và nội chuẩn đồng vị trên cột SCX. ................................................................. 32
2.4.2. Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn Sal, Clen và Rac. ......... 33

2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích ............... 34
2.4.4. Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu. .................................................. 35
2.4.5. Xác định hiệu suất thu hồi..................................................................... 35
2.5. Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp (LOD,
LOQ) ................................................................................................................................. 36
2.6. Phƣơng pháp lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu nƣớc tiểu, mẫu thịt lợn và mẫu
TACN ................................................................................................................................ 36
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 38
3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện xác định Salbutamol, Clenbuterol và
Ractopamine bằng LC-MS/MS .................................................................................. 38
3.1.1. Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS) ................................. 38
3.1.1.1. Tối ưu hóa các điều kiện của nguồn và khí (Source and gas
Optimization) ................................................................................................... 39

iv


3.1.2. Lựa chọn cột tách .................................................................................. 40
3.1.3. Khảo sát chương trình gradient ............................................................ 41
3.1.4. Khảo sát tốc độ pha động ..................................................................... 44
3.1.5. Khảo sát thành phần acid formic trong pha động ................................ 46
3.2. Tối ƣu quá trình xử lý mẫu phân tích các β2-agonist .................................... 47
3.2.1. Quy trình xử lý nên mẫu thịt và thức ăn chăn nuôi .............................. 47
3.2.1.1. Chọn cột chiết SPE............................................................................. 47
3.2.1.2. Khảo sát pH chiết ............................................................................... 48
3.2.1.3. Khảo sát điều kiện rửa giải ............................................................... 49
3.2.2. Quy trình xử lý mẫu trên nền mẫu nước tiểu ........................................ 53
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ....................................................................... 55
3.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn.................................. 55
3.3.1.1. Khảo sát khoảng tuyến tính ................................................................ 55

3.3.1.2. Đường chuẩn các β2-agonist có nội chuẩn (sử dụng để phân tích mẫu
thực)................................................................................................................. 56
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương
pháp. ................................................................................................................ 58
3.3.3. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi) ....................... 61
3.3.3.1. Tiến hành thực nghiệm trên mẫu thịt ................................................. 61
3.3.3.2. Tiến hành thực nghiệm trên mẫu TACN ................................................... 63
3.3.3.3. Tiến hành thực nghiệm trên mẫu nước tiểu ....................................... 65
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN............................................................................... 72
KẾT LUẬN ..................................................................................................................... 72
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................... 73
TÀILIỆUTHAMKHẢO .................................................................................... 74
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 80
Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic trong pha động .................... 80

v


Phụ lục 2: Kết quả khảo sát qui trình chiết mẫu ............................................. 83
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Quy định mẫu đƣợc coi dƣơng tính với nhóm β2–agonist............. 10
Bảng 3.1: Các thông số tối ƣu hóa điều kiện phân mảnh ............................... 39
Bảng 3.2: Các thông số tối ƣu cho nguồn và khí ............................................ 40
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ acid formic tới diện tích peak β2-agonist ...... 46
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của pH tới quá trình chiết. ........................................... 48
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của tỉ lệ MeOH: NH4OH 25% tới quá trình chiết. ..... 50
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của thể tích rửa giải ..................................................... 51
Bảng 3.7: Cách pha các dung dịch chuẩn để lập đƣờng chuẩn có chứa IS .... 56
Bảng 3.8: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các β2-agonist trong

nền mẫu thịt ..................................................................................................... 59
Bảng 3.9: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các β 2-agonist trong
nền mẫu TACN ............................................................................................... 59
Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các β2-agonist trong
nền mẫu nƣớc tiểu lợn ..................................................................................... 60
Bảng 3.11: Độ lặp lại và độ thu hồi của Salbutamol trên nền mẫu thịt .......... 61
Bảng 3.12: Độ lặp lại và độ thu hồi của Clenbuterol trên nền mẫu thịt ......... 62
Bảng 3.13: Độ lặp lại và độ thu hồi của Ractopamine trên nền mẫu thịt ....... 63
Bảng 3.14: Độ lặp lại và độ thu hồi của Salbutamol trên nền TACN ............ 64
Bảng 3.15: Độ lặp lại và độ thu hồi của Clenbuterol trên nền TACN ............ 64
Bảng 3.16: Độ lặp lại và độ thu hồi của Ractopamin trên nền TACN ........... 65
Bảng 3.17: Độ lặp lại và độ thu hồi của Salbutamol trên nền nƣớc tiểu lợn .. 66
Bảng 3.18: Độ lặp lại và độ thu hồi của Clenbuterol trên nền nƣớc tiểu lợn . 66
Bảng 3.19: Độ lặp lại và độ thu hồi của Ractopamin trên nền nƣớc tiểu lợn . 67
Bảng 3.20: Kết quả mẫu sản phẩm thịt ........................................................... 68

vi


Bảng 3.21: Kết quả thực tế mẫu nƣớc tiểu lợn ............................................... 69
Bảng 3.22: Kết quả mẫu thức ăn chăn nuôi .................................................... 70
DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Mô tả tổng quát các bộ phận của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao .. 20
Hình 1.2: Bộ phân tích khối một tứ cực .......................................................... 22
Hình 1.3: Sơ đồ bộ phân tích khối ba tứ cực .................................................. 23
Hình 1.4: Nguyên tắc hoạt động của cột SPE (SCX) ..................................... 26
Hình 3.1: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chƣơng trình gradient 1 .................. 41
Hình 3.2: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chƣơng trình gradient 2 .................. 42
Hình 3.3: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chƣơng trình gradient 3 .................. 42

Hình 3.4: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chƣơng trình gradient 4 .................. 43
Hình 3.5: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chƣơng trình gradient 5 .................. 43
Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải các β2-agonist tại tốc độ dòng 0,2 ml/phút ............ 44
Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải các β2-agonist tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút ............ 45
Hình 3.8: Sắc đồ rửa giải các β2-agonist tại tốc độ dòng 0,4 ml/phút ............ 45
Hình 3.9: Sắc đồ rửa giải các β2-agonist tại tốc độ dòng 0,5 ml/phút ............ 45
Hình 3.10: Sắc đồ các β2-agonist tại nồng độ acid formic 0,1% .................... 47
Hình 3.11: Mối tƣơng quan giữa diện tích peak và nồng độ Sal .................... 55
trong khoảng 0,05-500 ng/ml .......................................................................... 55
Hình 3.12: Mối tƣơng quan giữa diện tích peak và nồng độ Clen .................. 55
trong khoảng 0,05- 500ng/ml .......................................................................... 55
Hình 3.13: Mối tƣơng quan giữa diện tích peak và nồng độ Rac ................... 56
trong khoảng 0,05- 500ng/ml .......................................................................... 56
Hình 3.14: Đƣờng chuẩn Sal (R2 = 0,9997) .................................................... 57
Hình 3.15: Đƣờng chuẩn Clen (R2 = 1,0000) .................................................. 58
Hình 3.16: Đƣờng chuẩn Rac (R2 = 1,0000) ................................................... 58
Hình 3.17: Sắc đồ LOD của Sal, Clen, Rac trong nền mẫu thịt ..................... 59

vii


Hình 3.18: Sắc đồ LOD của Sal, Clen, Rac trong nền mẫu TACN ................ 60
Hình 3.19: Sắc đồ LOD của Sal, Clen, Rac trong nền mẫu nƣớc tiểu lợn ..... 60
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết
tắt

Viết đầy đủ

Nghĩa tiếng việt

ACN

Acetonitrile

CE

Collision energy

Năng lƣợng va chạm

EI

Electron Ionization

Ion hóa bằng dòng electron

ESI

Eelectrospray ionization

Chế độ ion hóa phun điện tử

EU

European Union

Châu Âu

HPLC

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IUPAC

International Union of Pure and
Applied Chemistry

Liên minh quốc tế về hóa học cơ bản
và ứng dụng

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantity

Giới hạn định lƣợng

MeOH

Methanol

Metanol

MRL

Maximum Residue Limit

Giới hạn dƣ lƣợng tối đa

PSA

Primary and secondary amine

Các amin bậc 1, bậc 2

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

U.S. NRP United States National Residue
Program

Chƣơng trình quốc gia về tồn dƣ

chất độc của Mỹ

UPLC-

Ultral performance liquid

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối

MS/MS

chromatography tandem mass
spectrometry

khối phổ

UV

Ultraviolet

Tử ngoại

TACN

Thức ăn chăn nuôi

NT

Nƣớc tiểu

Sal

Salbutamol

Clen

Clenbuterol

Rac

Ractopamine

Kháng sinh nhóm β2-agonist

viii


ix


MỞ ĐẦU
Xã hội ngày càng phát triển, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm càng ngày
càng đƣợc chú trọng nhiều hơn so với trƣớc kia. An toàn thực phẩm ngày nay
không chỉ đơn thuần là các vấn đề về thực phẩm nhiễm bẩn, ôi thiu, thiếu vệ sinh
mà còn ở chỗ thực phẩm có chứa những độc chất gây hại cho con ngƣời. Chất cấm
trong chăn nuôi không phải là vấn đề mới, từ năm 2006, cơ quan chức năng đã phát
hiện tồn dƣ chất cấm trong thịt gia súc, gia cầm và trong chăn nuôi, nhất là trong
thịt lợn. Tuy nhiên, việc sử dụng chất cấm trong sản xuất, kinh doanh thức ăn chăn
nuôi và chăn nuôi thời gian qua có diễn biến phức tạp cả về tính chất, mức độ và
trên quy mô diện rộng. Các loại chất cấm thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất, kinh
doanh thức ăn chăn nuôi, trong chăn nuôi chủ yếu là các chất thuộc nhóm beta –

agonist (Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamin). Các chất này khi cho ăn sẽ làm cho
lợn tăng trọng nhanh, nở mông, nở đùi, tăng tỉ lệ thịt nạc, tăng lợi nhuận cho ngƣời
chăn nuôi và chất tạo màu (VAT Yellow), tạo màu sắc đẹp cho thực phẩm nên đƣợc
các đối tƣợng thƣờng xuyên sử dụng. Thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn
nuôi cũng đang là vấn đề đƣợc ngƣời tiêu dùng quan tâm bởi qua điều tra, khảo sát
của các cơ quan chức năng, hầu hết các trại nuôi gà có sử dụng kháng sinh đều cao
hơn quy chuẩn; ngoài ra, một số loại kháng sinh ngoài quy chuẩn cũng đƣợc sử
dụng và có hàm lƣợng cao hơn quy định. Riêng trong 10 tháng đầu năm 2015, tại
các khu vực tỉnh, thành phố phía Nam, cơ quan chức năng đã lấy mẫu kiểm tra và
phát hiện nhiều mẫu nƣớc tiểu lợn dƣơng tính với Salbutamol, tập trung ở các tỉnh,
thành phố nhƣ: Đồng Nai phát hiện 109/654 mẫu (chiếm 16,7%); TP. Hồ Chí Minh
phát hiện 95/516 mẫu (chiếm 18,4%); Tiền Giang phát hiện 35/525 mẫu (chiếm
6,7%)… Nồng độ chất Salbutamol trong các mẫu nƣớc tiểu vật nuôi rất cao, đa số
trên 200ppb, có mẫu lên tới 665ppb.
Trƣớc tình hình trên, với vai trò nòng cốt của ngành Công an trong phòng
chống tội phạm, vi phạm pháp luật về môi trƣờng, lực lƣợng Cảnh sát PCTP vể môi
trƣờng đã tập trung tham mƣu chỉ đạo và triển khai đồng bộ các biện pháp công tác
phòng chống; trong đó đã tích cực phối hợp với các ban, ngành của Bộ Nông nghiệp

1


và Phát triển nông thôn để thanh, kiểm tra nhằm phát hiện các cơ sở sản xuất thức
ăn chăn nuôi, các cơ sở chăn nuôi sử dụng chất cấm; phối hợp với Bộ Y tế, Bộ Tài
chính, Tổng cục hải quan đẩy mạnh công tác kiểm tra, kiểm soát các hóa chất nhập
khẩu đƣợc sử dụng trong ngành y tế nhƣng là chất cấm trong chăn nuôi. Trong
tháng 11/2015, lực lƣợng Cảnh sát PCTP về môi trƣờng Công an các đơn vị, địa
phƣơng đã tiến hành kiểm tra 40 cơ sở chăn nuôi; 14 cơ sở thức ăn chăn nuôi, thuốc
thú y; 06 cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi; 04 cửa hàng thịt; 03 cơ sở giết mổ. Qua
kiểm tra, phát hiện 04 cơ sở chăn nuối có hành vi sử dụng chất cấm trong chăn nuôi

(Salbutamol); 01 cửa hàng thuốc thú y có dấu hiệu buôn bán chất cấm trong chăn
nuôi. Phối hợp với các cơ quan chức năng tiến hành xử phạt 40 triệu đồng với 03 cơ
sở sản xuất thức ăn chăn có hành vi sử dụng chất cấm trong chăn nuôi. Riêng Cục
Cảnh sát PCTP về môi trƣờng đã phối hợp với các ngành chức năng (Thanh tra Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, cục quản lý dƣợc – Bộ y tế) kiểm tra 15 công
ty, cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi; làm việc với 10 doanh nghiệp nhập khẩu hóa
chất y tế có vi phạm bán hóa chất (Salbutamol) không đúng đối tƣợng. Quá trình
thanh tra, kiểm tra, ngoài việc phát hiện sai phạm của các cchemơ sở sản xuất thức
ăn chăn nuôi, cơ sở chăn nuôi trong việc sử dụng chất cấm, các sai phạm của các
công ty nhập khẩu, kinh doanh hóa chất y tế lén lút bán chất tạo nạc cho các đối
tƣợng sử dụng trong chăn nuôi, còn phát hiện đƣợc nhiều phƣơng thức, thủ đoạn đối
phó rất tinh vi, xảo quyệt nhằm trốn tránh sự phát hiện của cơ quan chức năng nhƣ
để riêng chất cấm với thức ăn không phối trộn tại xƣởng mà sử dụng trực tiếp tại cơ
sở chăn nuôi… Từ tình hình thực tế trên, Cục Cảnh sát PCTP về môi trƣờng đã
tham mƣu, kiến nghị với Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn bổ sung 05 loại
chất Vàng Ô vào danh mục cấm nhập khẩu, kinh doanh và sử dụng trong chăn nuôi
gia súc, gia cầm tại Việt Nam.
Với mức độ gây hại nhƣ vậy, việc xác định dƣ lƣợng Salbutamol,
Clenbuterol, Ractopamine trong thức ăn chăn nuôi và trong thịt, nƣớc tiểu của gia
súc, gia cầm là rất cần thiết. Trong bản luận văn này, chúng tôi đã triển khai nghiên
cứu phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamine trong

2


mẫu thức ăn chăn nuôi và trong mẫu nƣớc tiểu, mẫu thịt của lợn bằng phƣơng pháp
sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Phƣơng pháp này có độ nhạy và độ
chính xác cao, dễ áp dụng và có thể trở thành công cụ rất tốt phục vụ cho công tác
thanh tra, kiểm tra an toàn thực phẩm.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về hoocmon tăng trƣởng β2-agonist

1.1.1. β2-agonist là gì?
Các hợp chất β2-agonist là các dẫn xuất tổng hợp của phenethanolamin.
Trong dƣợc lý, b2-agonist là hợp chất liên kết với một protein đặc biệt trên màng tế
bào (Receptor) và nó gây ra sự kích thích trong tế bào. Nó giống hệt tác dụng của
các chất nội sinh (ligand) gắn cùng với một loại protêin. Các chất này có khả năng
liên kết tạo phức với một phân tử sinh học (protêin) để đáp ứng mục đích sinh học.
1.1.2. Tác dụng của β2-agonist
Beta-agonist đƣợc phân làm hai nhóm theo đặc tính chữa bệnh nhƣ sau:
Nhóm β1-agonist: gồm các chất nhƣ dobutamine, isoproterenol, samoterol và
epinephrine có tác dụng kích thích tim, đƣợc dùng để điều trị sốc tim, suy tim cấp
tính.
Nhóm β2-agonist: gồm các chất nhƣ salbutanol, clenbuterol, cinaterol,
fenoterol, formoterol, terbutaline, denopamine, isoxsuprine, ractopamine,… có tác
dụng làm giãn cơ, đƣợc dùng để điều trị hen phế quản, bệnh phổi tắc nghẽn mãn
tính.
1.1.3. Phân loại β2-agonist
Đối với động vật khi sử dụng β2-agonist dẫn tới sự chuyển hƣớng số lƣợng
lớn các chất dinh dƣỡng từ mô mỡ về cơ, làm tăng sự tổng hợp protein thay vì mỡ,
do để nó có tác dụng làm tăng lƣợng thịt nạc và làm giảm lƣợng mỡ của cơ thể động
vật.
Tác dụng phụ khi sử dụng β2-agonist: gây cảm giác lo lắng, hồi hộp, tim đập
nhanh, giảm hàm lƣợng kali trong máu, tăng huyết áp, run cơ, đau đầu, buồn nôn...

Các β2-agonist chia làm 2 loại:
- Các β2-agonist tác dụng ngắn: Salbutamol, Terbutalin, Fenoterol.
- Các β2-agonist tác dụng dài: Clenbuterol, Formoterol, Salmeterol.

4


Sự phân chia này dựa trên thời gian tác dụng của mỗi loại. Đối với
Salbutamol, Terbutaline và Fenoterosau khi đƣa vào cơ thể tác dụng rất nhanh, chỉ
trong vài phút và kéo dài khoảng 4 đến 6 giờ. Đối với Clenbuterol, Formoterol và
Salmeterol thời gian tác dụng kéo dài đến xấp xỉ 12 giờ [1]. Thời gian hoạt động lâu
dài của loại thứ hai là do các phân tử này ban đầu khuếch tán vào màng plasma của
tế bào phổi, và sau đã đƣợc giải phóng chậm trở lại bên ngoài tế bào nơi mà chúng
cã thể kết hợp với β2-adrenoceptors.
Tháng 11/1995 FDA (Mỹ) đƣa ra một tƣ vấn sức khoẻ, báo động cho công
chúng: sử dụng các β2-agonist tác dụng dài có thể dẫn tới các triệu chứng xấu và
trong vài trƣờng hợp gây tử vong.
1.2.

Giới thiệu về Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine

1.2.1. Thông tin chung
1.2.1.1. Salbutamol
-

Danh pháp thƣờng: Sabutamol

-

Danh pháp quốc tế (IUPAC): 4-[2-(tert-butylamino)-1-hydroxyethyl]-2(hydroxymethyl) phenol

-

Công thức phân tử: C13H21NO3

-

Công thức cấu tạo hai đồng phân quang học của salbutamol

-

Khối lƣợng phân tử: 239,311 g/mol

-

Thời gian bán huỷ: 3,8 - 6 giờ

1.2.1.2.Clenbuterol
-

Danh pháp thƣờng: Clenbterol

-

Danh pháp quốc tế (IUPAC): (RS)-1-(4-Amino-3,5-dichlorophenyl)-2-(tertbutylamino)ethan-1-ol

-

Công thức phân tử: C12H18Cl2N2O

5


-

Công thức cấu tạo hai đồng phân quang học của Clenbuterol

-


Khối lƣợng phân tử: 277,19 g/mol

-

Thời gian bán huỷ: 36 – 39 giờ

1.2.1.3.Ractopamine
-

Danh pháp thƣờng: Ractopamin

-

Danh

pháp

quốc

tế

(IUPAC):

4-[3-[[2-Hydroxy-2-(4-

hydroxyphenyl)ethyl]amino]butyl]phenol
-

Công thức phân tử:C18H23NO3

-

Khối lƣợng phân tử: 301,39 g/mol

-

Công thức cấu tạo của Ractopamine

1.2.2. Tính chất và tác dụng của Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine
1.2.2.1. Tác dụng làm giãn phế quản.
• Salbutamol
Salbutamol [1-(4-(RS)-hydroxy- 3- hydroxymethylphenyl)- 2-(t-butylamino)
ethanol] là chất chủ vận thụ thể adrenergic β2 (β2-adrenoceptor agonist) có tác dụng
trên cơ trơn và cơ xƣơng, gồm có: giãn phế quản, giãn cơ tử cung và run. Tác dụng
giãn cơ trơn tùy thuộc vào liều dùng và đƣợc cho rằng xảy ra thông qua hệ thống
adenyl cyclase - AMP vòng, với việc thuốc gắn vào thụ thể β2-adrenergic tại màng
tế bào gây ra sự biến đổi ATP thành AMP vòng làm hoạt hóa protein kinase. Điều
này dẫn đến sự phosphoryl hóa các protein và cuối cùng làm gia tăng canxi nội bào

6

loại liên kết; calci nội bào ion hóa bị giảm bớt gây ức chế liên kết actin-myosin, do
đó làm giãn cơ trơn.
Thuốc chủ vận β2 nhƣ salbutamol cũng có tác dụng chống dị ứng bằng cách
tác dụng lên dƣỡng bào làm ức chế sự phóng thích các hóa chất trung gian gây co
thắt phế quản nhƣ histamin, yếu tố hóa ứng động bạch cầu đa nhân trung tính (NCF)
và prostaglandin D2.
Salbutamol làm giãn phế quản ở cả ngƣời bình thƣờng lẫn bệnh nhân suyễn
hay bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD) sau khi uống. Salbutamol còn làm gia
tăng sự thanh thải tiêm mao nhầy (đã đƣợc chứng minh ở bệnh nhân COPD lẫn ở
ngƣời bình thƣờng).
Salbutamol kích thích các thụ thể β2 gây ra các tác dụng chuyển hóa lan
rộng: tăng lƣợng acid béo tự do, insulin, lactat và đƣờng; giảm nồng độ kali trong
huyết thanh.
Salbutamol có lẽ là chất có hiệu lực và an toàn nhất trong số các thuốc giãn
phế quản loại giống giao cảm.
• Clenbuterol
Clenbuterol[(RS)-1-(4-Amino-3,5-dichlorophenyl)-2-(tert-butylamino)
ethan-1-ol] là một chất thuộc nhóm β2–agonist, có tác dụng làm giảm cơ trơn phế
quản, ổn định màng tế bào mast nên giảm tiết chất trung gian và kích thích cơ vân
(gây run), tăng sự vận chuyển dịch nhày nhờ các lông trên đƣờng hô hấp. Thƣờng
dùng trong các cơn hen suyễn cấp. Đối với hầu hết các trƣờng hợp, nhóm β2–
agonist là thuốc làm giãn phế quản hiệu quả nhất hiện nay.
• Ractopamine
Ractopamine [4-((S)-1-hydroxy-2-((R)-4-(4-hydroxyphenyl)butan-2ylamino)
ethyl) phenol] là một chất thuộc nhóm β2–agonist, đƣợc dùng nhƣ là thức ăn bổ
sung kích thích tăng trƣởng và tăng tỷ lệ thịt nạc ở lợn vỗ béo. Cơ chế tác động của
ractopamine vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ nhƣng chúng hoạt động thông qua sự chuyển
hóa AMP và kết quả là phá vỡ các mô mỡ và tích lũy protein cho các mô cơ.

7


Ractopamine thƣờng đƣợc sử dụng dƣới dạng ractopamine hydrochloride và đƣợc
xem nhƣ là nhân tố phân phối lại vật chất trong cơ thể.
1.2.2.2. Tác dụng làm tăng tỷ lệ nạc/mỡ.
Trên cơ thể động vật, β2–agonist điều tiết sự sinh trƣởng: thúc đẩy phát triển
cơ bắp và tác dụng phân giải lipid, điều khiển các chất dinh dƣỡng hƣớng tới mô cơ,
tăng sinh quá trình tổng hợp protein để tích luỹ nạc và giảm sinh tổng hợp mỡ, giảm
tích luỹ mỡ trong cơ thể; nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn. Nhờ tính chất này các
chất nhóm β2–agonist bị sử dụng trái phép trong chăn nuôi, chỉ cần một lƣợng nhỏ
β2–agonist trộn vào thức ăn hàng ngày làm cho lợn lớn rất nhanh, mỗi ngày có thể
tăng từ 1,5 tới 2 kg, xƣơng vai xƣơng đùi nhỏ lại, các bắp thịt to lên và trở thành lợn
siêu nạc nhanh chóng.
Về dƣợc động học, salbutamol đƣợc hấp thụ đến 80% qua đƣờng tiêu hóa và
chuyển hóa đáng kể trƣớc khi vào máu. Sản phẩm chuyển hóa chủ yếu là dƣới dạng
muối sulphat, đƣợc hình thành trong niêm mạc ruột và tồn tại dạng không hoạt
động. Khoảng 10% thuốc tồn tại trong máu ở dƣới dạng gắn với protein. Nghiên
cứu đã chỉ ra rằng 58-78% lƣợng thuốc có gắn phóng xạ đƣợc đào thải qua nƣớc
tiểu trong vòng 24 giờ và 65-84% trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc, trong đó
34-47% thuốc tồn tại ở dạng liên hợp và khoảng 50% tồn tại dạng tự do. Lƣợng
salbutamol tích luỹ trong gan ít hơn trong cơ, nó có thể thải dần qua nƣớc tiểu và
một ít qua đƣờng phân. Tuy nhiên, đây là một chất bền nhiệt, hầu nhƣ không thay
đổi, không mất đi trong quá trình nấu ở nhiệt độ trên 100oC.
1.2.3. Tác hại của Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine đối với sức khỏe con
người
Salbutamol, clenbuterol, ractopamine đều là những chất tăng trọng. Các chất
này đƣợc sử dụng trong chăn nuôi với mục đích làm tăng năng suất sản xuất thịt;
trong thể thao, chúng đƣợc sử dụng bất hợp pháp để làm tăng quá trình đồng hóa và

đƣợc sử dụng nhƣ các loại doping. Nhƣng hậu quả ảnh hƣởng đến sức khoẻ ngƣời
dùng là rất nghiêm trọng. Các nhà khoa học cảnh báo, sử dụng thƣờng xuyên thực
phẩm chứa hocmon nói chung, đặc biệt là hocmon hoá học tổng hợp sự gây những

8


tác hại rất lớn cho con ngƣời. Bình thƣờng cơ thể con ngƣời tự tổng hợp đƣợc
những hocmon cần thiết cho quá trình sinh trƣởng và phát triển. Khi những loại
hocmon này đƣợc đƣa vào cơ thể quá thƣờng xuyên qua đƣờng ăn uống thì khả
năng vốn có trên dần bị ức chế, đến lúc bị phá hỏng [2]. Salbutamol, clenbuterol,
ractopamine là chất rất dễ tồn dƣ trong thịt và thƣờng tạo thành hiện tƣợng trúng
độc mãn tính và trúng độc cấp tính: rối loạn nhịp tim, run cơ, co thắt phế quản, phù
nề, liệt cơ, tăng huyết áp....khi ngƣời tiêu dùng sử dụng thực phẩm còn tồn dƣ
salbutamol, clenbuterol, ractopamine.
1.2.4. Tình hình sử dụng Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine
Từ những năm 80, các chất salbutamol, clenbuterol và ractopamine đã đƣợc
bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn, bò thịt, gà thịt nhằm kích thích sinh trƣởng, tăng
tỉ lệ thịt nạc, giảm chi phí thức ăn.
Ở Việt Nam, vấn đề “báo động tồn dƣ hoá chất cấm trong thịt gia súc, gia
cầm” đã đƣợc báo chí nói đến nhiều năm 1999. Các hoá chất cấm trong thịt gia súc,
gia cầm chủ yếu là các loại chất kích thích tăng trƣởng họ β2–agonist. Các dẫn xuất
thuộc nhóm β2–agonist thƣờng dùng có salbutamol, mabuterol, clenbuterol.
Ractopamin, cimaterol, phenoterol ... và nhiều chất tƣơng tự khác. Năm 2002 nƣớc
ta đã cấm sử dụng những loại chất kích thích này vì nó có khả năng gây ảnh hƣởng
nghiêm trọng đến sức khoẻ ngƣời tiêu dùng. Tuy nhiên, do lợi nhuận to lớn mà nó
mang lại, ngƣời chăn nuôi đã lạm dụng những loại chất này trộn vào thức ăn cho vật
nuôi. Gần đây, việc sử dụng thức ăn có nhiễm chất kích thích đƣợc phát hiện tại thành
phố Hồ Chí Minh (2006-2007). Trong 86 mẫu lợn đƣợc giết mổ tại đây có gần 20%
mẫu có chứa các hợp chất β2–agonist. Ngoài ra ngƣời ta cũng phát hiện tại đây có

thận bò, ngựa có hàm lƣợng salbutamol cao gấp 3 lần so với tiêu chuẩn quốc tế.
Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cho biết, kết quả phân tích
cho thấy tình trạng sử dụng hoocmon kích thích tăng trƣởng họ β2–agonist
(Clebuterol, Salbutamol, Ractopamin...) trên thức ăn chăn nuôi ở phía Nam đáng
báo động. Đây là những chất gây nguy hại cho sức khoẻ con ngƣời nằm trong danh
mục cấm của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn nhƣng vì lợi nhuận có doanh

9


nghiệp đã bất chấp, sử dụng hoocmon để phối trộn vào thức ăn chăn nuôi. Viện
cũng khẳng định, từ tháng 6-11/2006, Viện nhận 428 mẫu thức ăn chăn nuôi do Cục
Chăn nuôi và 12 tỉnh, thành gửi về, chủ yếu là thức ăn hỗn hợp, thức ăn đậm đặc,
nguyên liệu chế biến. Số mẫu trên chia làm 2 giai đoạn phân tích bằng phƣơng pháp
định tính và định lƣợng. Kết quả phân tích β2–agonist trong thức ăn chăn nuôi nhƣ
sau: Có 47/428 mẫu dƣơng tính (chiếm 10,98%). Hầu hết các mẫu dƣơng tính với
β2–agonist là thức ăn cho lợn - chiếm 96,5%, chỉ có 3,5% là thức ăn dùng cho gà.
Theo kết quả phân tích mẫu của Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, 2
loại hoocmon cấm nhƣ Clenbuterol, Salbutamol thƣờng đƣợc sử dụng phổ biến. Hàm
lƣợng Clenbuterol trung bình trong thức ăn chăn nuôi là khá cao 124,82 ppb. Mẫu
thấp nhất chứa 1,54 ppb còn mẫu cao nhất chứa tới 319,49ppb. Có tới 34,5% số mẫu
dƣơng tính có hàm lƣợng trên 235 ppb. Đối với Salbutamol dù thấp hơn Clenbuterol
nhƣng trung bình cũng ở mức 57,71 ppb và dao động từ 21,90 - 87,51 ppb.
Theo Thông tƣ 01/2016/TT-BNNPTNT ngày 15 tháng 02 năm 2016 của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn quy định mẫu đƣợc coi là dƣơng tính khi có
kết quả phân tích định lƣợng cao hơn hoặc bằng một trong các giá trị (tính bằng
ppb) nêu tại bảng dƣới đây:
Bảng 1.1: Quy định mẫu đƣợc coi dƣơng tính với nhóm β2–agonist
TT
1

2
3
4
5
6
7
8

Loại mẫu
Thức ăn chăn nuôi
Thuốc thú y
Nƣớc uống
Nƣớc tiểu
Thịt
Thận
Gan
Máu

Clenbuterol
10,0
10,0
5,0
3,0
0,2
0,2
0,2
0,2

Salbutamol
10,0

10,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0

Ractopamine
10,0
10,0
5,0
2,0
1,0
1,0
1,0
1,0

Năm 2015, một lần nữa vấn đề sử dụng chất cấm trong chăn nuôi lại bùng
phát trở lại với quy mô và tính chất rất phức tạp, các cơ quan quản lý không chỉ
đƣợc phát hiện sử dụng chất cấm ở nhiều địa phƣơng mà còn xuất hiện ở nhiều đối
tƣợng sử dụng. Nếu nhƣ thời điểm năm 2012 đa số chỉ phát hiện việc sử dụng chất

10


cấm trong các cơ sở chăn nuôi nông hộ, thì năm 2015 đã phát hiện trong cả các cơ
sở sản xuất kinh doanh thức ăn chăn nuôi, thuốc thú y và trong các cơ sở chăn nuôi
trang trại lớn,…điển hình là khu vực các tỉnh phía Nam trong 10 tháng đầu năm
2015: Đồng Nai đã phát hiện 109/654 mẫu nƣớc tiểu lợn dƣơng tính với chất

salbutamol (chiếm 16,7%), TP. HCM 95/516 mẫu (chiếm 18,4 %),Đăk Nông 3/54
mẫu (chiếm 5,6 %), Tây Ninh 5/9 mẫu (chiếm 55,5 %), Tiền Giang 35/525 mẫu
(chiếm 6,7 %) và Vĩnh Long 6/68 mẫu (chiếm 8,8 %)…Nồng độ salbutamol trong
các mẫu nƣớc tiểu vật nuôi rất cao, đa số là trên 200 ppb, có mẫu lên tới 665 ppb.
Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thông báo kết quả triển khai các
tháng cao điểm về kiểm soát tại tổng số cơ sở kiểm tra là 1733 cơ sở, trong đó có 51
cơ sở có vi phạm về chất cấm (chiếm 2,9%), trong đó:
 Tổng số mẫu thức ăn chăn nuôi đã lấy: 1008 mẫu, 13 mẫu vi phạm chất
cấm (chiếm 1,3%).
 Tổng số mẫu nƣớc tiểu lợn đã lấy: 3503 mẫu, 212 mẫu vi phạm chất cấm
(chiếm6,05%).
 Tổng số mẫu thịt, phủ tạng đã lấy: 398 mẫu, 12 mẫu vi phạm chất cấm
(chiếm 3,0%).
Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, thời gian qua, việc sử dụng
chất cấm trong chăn nuôi và chế biến thức ăn gia súc có biểu hiện giảm, nhƣng vẫn
diễn ra khá phức tạp. Đầu năm 2016, cơ quan chức năng đã kiểm tra 40 công ty sản
xuất thức ăn chăn nuôi ở khu vực phía Bắc thì có đến 18 công ty vi phạm. Cục Thú
y lấy 1.457 mẫu kiểm tra thì có tới 10% mẫu có chứa chất cấm, trong khi lấy 1.026
mẫu nƣớc tiểu thì có đến 67 mẫu có phát hiện chất salbutamol.
Theo Cục Cảnh sát phòng chống tội phạm về môi trƣờng (C49), Bộ Công an,
trong năm 2015, các doanh nghiệp đƣợc Bộ Y tế cấp phép nhập khẩu hơn 9 tấn chất
salbutamol nhƣng có đến hơn 6 tấn không đƣợc sử dụng vào sản xuất Dƣợc mà
đƣợc tuồn ra ngoài thị trƣờng, số này cũng không loại trừ việc sử dụng vào chăn
nuôi lợn (heo).

11


Bộ luật hình sự sửa đổi năm 2015, tại Điều 317 quy định “các cá nhân, tổ
chức sử dụng các hóa chất, phụ gia bị cấm trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

sẽ bị phạt hành chính từ 50 - 200 triệu, phạt tù từ 1 - 5 năm, trường hợp nặng có thể
bị phạt tù 20 năm”, nhƣ vậy, các hành vi sử dụng chất tạo nạc cấm trong chăn nuôi
có thể bị xử lý hình sự thay vì chỉ xử lý hành chính nhƣ trƣớc. Với việc nâng cao
khung hình phạt, cùng với các biện pháp quản lý chặt chẽ quy trình nhập khẩu và sử
dụng các chất thuộc nhóm β2–agonist, dự báo tình trạng sử dụng chất tạo nạc cấm
trong thời gian tới sẽ đƣợc kiểm soát.
Nhƣ vậy, để đáp ứng yêu cầu đấu tranh phòng chống tội phạm trong lĩnh vực
an toàn thực phẩm đã đặt ra yêu cầu cần giám định đối với lực lƣợng Kỹ thuật hình
sự CAND, cụ thể là Phòng giám định Hoá pháp lý, Viện Khoa học hình sự, 02 Đội
giám định Hóa pháp lý thuộc Phân Viện Khoa học hình sự tại Tp Hồ Chí Minh và
Tp Đà Nẵng và các Phòng Kỹ thuật hình sự Công an cấp tỉnh. Các lực lƣợng này
cần phải chuẩn bị các điều kiện cần thiết để có thể triển khai giám định định lƣợng
các chất cấm này khi có yêu cầu từ các cơ quan tiến hành tố tụng.
Trong điều kiện hiện nay và với các trang thiết bị, hóa chất, chất chuẩn hiện
có Viện Khoa học hình sự có thể đáp ứng đƣợc điều kiện cần để giám định một số
chất cấm này trong một số đối tƣợng mẫu cụ thể. Tuy nhiên, để có thể đảm bảo kết
quả đƣợc chính xác, khách quan, phù hợp với các phƣơng pháp phân tích hiện đang
sử dụng trên thế giới, cũng nhƣ các phƣơng pháp mà các phòng thí nghiệm đạt
chuẩn hiện tại ở Việt Nam thì cần thiết phải có một nghiên cứu khoa học để xây
dựng phƣơng pháp phân tích phù hợp, đảm bảo kết quả có độ chính xác, độ chụm
tốt, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng đáp ứng yêu cầu đặt ra theo quy định
hiện hành.
1.2.5. Các phương pháp xác định Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine
1.2.5.1. Trong nước
Tổng Cục Tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng đã ban hành TCVN 112942016 [15] xác định dƣ lƣợng B2-Agonist (clenbuterol, salbutamol và ractopamin)
trong thịt gia súc bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng phổ khối lƣợng hai lần. Các chất

12

nhóm B2-Agonist có trong mẫu sản phẩm thịt đƣợc chiết tách bằng hỗn hợp
axetonitrile và isopropanol. Sử dụng các muối natri clorua, natri sulfat và magie
sulfat để tủa protein và loại nƣớc có trong dịch chiết. Dịch chiết đƣợc bay hơi dung
môi đến khô, phần cặn đƣợc hòa tan bằng dung dịch nƣớc chứa 10% axetonitril, sau
đó làm sạch bằng n-hexan. Phần dịch chiết sau khi làm sạch đƣợc phân tích bằng kỹ
thuật sắc ký lỏng phổ khối lƣợng hai lần để xác định clenbuterol, salbutamol và
ractopamin. Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp là clenbuterol 0,1mg/kg,
salbutamol 2,5mg/kg và ractopamin là 5mg/kg.
1.2.5.2. Thế giới
 Phƣơng pháp sắc ký lỏng bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Các

tác

giả

P.V.Colthup,

F.A.A.Dallas,

D.A.Saynor,

P.F.Carey,

L.F.Skidmore, L.E.Martin và K.Wilson [RE1] đã xác định đƣợc Salbutamol trong
huyết tƣơng ngƣời bằng cách chiết Salbutamol ra khỏi mẫu bằng phƣơng pháp SPE
sau đó chuyến Salbutamol về dạng có màu xanh bằng phản ứng với dimethyl-pphenylanediamine. Chất nhuộm màu đƣợc tách bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng
và đƣợc định lƣợng bởi độ hấp thụ ở bƣớc sóng 650 nm. Phƣơng pháp này cho độ
nhạy cao, giới hạn phát hiện tƣơng đối thấp: 20ng/ml trong nƣớc tiểu và 1ng/ml
trong huyết tƣơng.

 Phƣơng pháp ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Phƣơng pháp hấp thụ miễn dịch có gắn enzyme (ELISA –Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) đã đƣợc ứng dụng để xác định beta-agonistdựa trên nguyên
lý kháng nguyên –kháng thể. Phƣơng pháp ELISA có độ nhạy cao, thao tác tƣơng
đối đơn giản, thời gian phân tích nhanh nhƣng có nhƣợc điểm là kém chính xác
trong cácnền phức tạp, kém linh hoạt vì phải phụ thuộc vào hóa chất của nhà sản
xuất. Phƣơng pháp ELISA xác định clenbuterol và salbutamol có rất nhiều dạng,
dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể
đƣợc gắn với một enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol
phosphat) vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự
xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng

13


nguyên và thông qua cƣờng độ màu sẽ biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng
thể cần phát hiện. Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng
nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml).
Meyer và các cộng sự đã xác định đƣợc salbutamol và clenbuterol có trong
mẫu nƣớc tiểu bằng cách sử dụng enzym immunoassay (EIA) và HPLC [RE2].
Mẫu nƣớc tiểu đƣợc làm sạch qua cột chiết SPE C18 silicagel (100 mg), dùng
HPLC tách lấy phân đoạn salbutamol và clenbuterol rồi dùng EIA để phân tích.
Phƣơng pháp EIA này sử dụng hoóc môn đánh dấu, đƣợc điều chế bằng cách đun
Sal và monocloractic trong môi trƣờng kiềm để hình thành salbutamol–4–
carbonxylmethyl ether (CME), đƣợc nối với coenzim biocytin qua liên kết peptit.
Thêm vào mẫu glubomin miễn dịch G của cừu (hoặc thỏ) và ủ cho đến khi phản
ứng đạt trạng thái cân bằng. Thêm vào đó dung dịch streptavidin –perosidase và ủ
cho tới khi có màu, dựa vào màu sắc có thể tính đƣợc nồng độ salbutamol trong
mẫu. Nhóm tác giả khẳng định, HPLC là phƣơng pháp hữu hiệu để phân tích các
beta-agonist nhƣng để sàng lọc thì sử dụng EIA sẽ nhanh, rẻ hơn và có thể phân

tích hàng loạt mẫu.
 Phương pháp điện di mao quản
Việc xác định các beta-agonistbằng phƣơng phápđiện di mao quản chủ yếu
sử dụng các detector điện hóa nhƣ đo dòng, đo điện thế hay đo độ dẫn. Việc sử
dụngcác detector điện hóa hay UV –Vis cho giá trị LODcủa phƣơng pháp đạt đƣợc
cỡ ppm, với độ nhạy này có thể xác định hàm lƣợng các beta-agonisttrong mẫu
dƣợc phẩm hay một số mẫu thức ăn chăn nuôi, nƣớc tiểu, huyết thanh của ngƣời sử
dụng dƣợc phẩm. Tuy nhiên với các mẫu nƣớc tiểu, huyết thanh, thịt hay nội tạng
động vật có dƣ lƣợng B2-agonistnhỏ cỡ ppb, việc phát hiện và định lƣợng đƣợc
bằng các detector này sẽ khó. Theo nghiên cứu của tác giả Anurukvorakun và cộng
sự [RE3] với phƣơng pháp CE sử dụng detector MS cho giá trị LOD tốt nhất bằng
0,3 ppb nhƣng hệ CE –MS có cấu tạo phức tạp, chi phí đầu tƣ cao nên không đƣợc
dùng phổ biến. Phƣơng pháp điện di mao quản sửdụng detector độ dẫn C4D gần
đây đƣợc sử dụng nhiều, tuy nhiên độ nhạy kém cũnglà một hạn chế chính của

14