Khoá luận tốt nghiệp hoàn thiện quy trình nhân dòng vô tính cây cỏ thi hắt hơi (achillea ptarmica) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

PHAN THỊ TRANG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CỎ THI HẮT
HƠI (ACHILLEA PTARMICA) BẰNG
KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

ThS. PHẠM PHƢƠNG THU

Hà Nội, 2018


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
ThS. Phạm Phƣơng Thu, Khoa Sinh - KTNN, trƣờng Ďại học Sƣ phạm
Hà Nội 2 là ngƣời Ďã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo Ďiều kiện thuận
lợi trong suốt quá trình tôi thực hiện Ďề tài và hoàn thành khóa luận này.
Ban giám hiệu trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa
Sinh - KTNN Ďã tạo mọi Ďiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học
tập cũng nhƣ thực hiện Ďề tài.
Ngoài ra, Ďể hoàn thành Ďề tài này tôi cũng Ďã nhận Ďƣợc những sự chỉ
bảo cả về kiến thức chuyên ngành cũng nhƣ phƣơng pháp tiến hành thí
nghiệm từ tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật, khoa Sinh KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. Tôi xin Ďƣợc cảm ơn những sự
giúp Ďỡ quý báu Ďó.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia Ďình, bạn bè Ďã Ďộng viên tôi giúp tôi có
thể vƣợt qua những khó khăn Ďể hoàn thành Ďƣợc Ďề tài này.
Hà Nội, ngày…..tháng….năm 2018
Sinh viên thực hiện

PHAN THỊ TRANG


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam Ďoan Ďây là công trình nghiên cứu của riêng tôi do ThS.
Phạm Phƣơng Thu hƣớng dẫn và không trùng lặp với kết quả của các tác giả
khác.
Hà Nội, ngày…..tháng….năm 2018
Sinh viên thực hiện

PHAN THỊ TRANG


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MS

: Murashige và Skoog

BAP

: 6 - Benzul amino purin

NAA

:  - Napthlacetic acid

Nxb

: Nhà xuất bản

TPHCM

: Thành Phố Hồ Chí Minh

KH&CN

: Khoa Học và Công Nghệ

NPK

: Nitơ, Photpho, Kali

ĐHST

: Điều hòa sinh trƣởng

CT

: Công thức

ĐC

: Đối Chứng

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn Ďề tài......................................................................................... 1
2. Mục Ďích nghiên cứu.................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về chi Achillea ............................................................ 3
1.2. Giới thiệu về Cỏ thi hắt hơi..................................................................... 3
1.2.1. Mô tả ................................................................................................. 3
1.2.2. Phân loại............................................................................................ 4
1.2.3. Phân bố.............................................................................................. 4
1.1.4. Đặc Ďiểm hình thái ............................................................................ 4
1.1.5. Điều kiện sinh thái ............................................................................ 5
1.3. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật trên thế giới và
ở Việt Nam ..................................................................................................... 5
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 9
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................. 9
2.2. Địa Ďiểm tiến hành nghiên cứu ............................................................... 9
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm................................................................ 9
2.3.1. Thiết bị .............................................................................................. 9
2.3.2. Dụng cụ ............................................................................................. 9
2.4. Môi trƣờng nghiên cứu và các chất Ďiều hòa sinh trƣởng thực vật ........ 9
2.5. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................ 10
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 10


2.6.1. Tạo vật liệu in vitro từ hạt cây hoa Cỏ thi hắt hơi .......................... 10

2.6.2. Nhân nhanh chồi in vitro ................................................................ 11
2.6.3. Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh.................................................. 12
2.6.4. Rèn luyện cây Cỏ thi hắt hơi in vitro thích nghi với môi trƣờng tự
nhiên .......................................................................................................... 13
2.7. Phƣơng pháp phân tích thống kê số liệu thực nghiệm .......................... 13
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 15
3.1. Tạo vật liệu khởi Ďầu ............................................................................ 15
3.2. Nhân nhanh chồi in vitro....................................................................... 17
3.2.1. Ảnh hƣởng của BAP lên khả năng nhân nhanh chồi cây Cỏ thi hắt
hơi ............................................................................................................. 17
3.2.2. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên khả năng nhân nhanh chồi cây Cỏ thi
hắt hơi........................................................................................................ 20
3.3. Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh ........................................................ 22
3.4. Rèn luyện cây Cỏ thi hắt hơi in vitro thích nghi với môi trƣờng tự
nhiên ............................................................................................................. 24
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 29
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Các công thức thí nghiệm xác Ďịnh hiệu quả của chất khử trùng .. 11
Bảng 2.2: Công thức ảnh hƣởng của BAP lên quá trình nhân nhanh ............. 12
Bảng 2.3: Công thức ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên quá trình nhân nhanh chồi
in vitro................................................................................................. 12
Bảng 2.4: Công thức ảnh hƣởng của NAA Ďến sự tạo rễ cây Cỏ thi hắt hơi in
vitro. .................................................................................................... 13
Bảng 2.5: Công thức ảnh hƣởng của giá thể Ďến tỷ lệ sống của cây Cỏ thi hắt
hơi ....................................................................................................... 13

Bảng 3.1: Tỷ lệ nảy mầm hạt Cỏ thi hắt hơi ở môi trƣờng MSo sau 2 tuần ... 15
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của BAP lên khả năng nhân nhanh chồi in vitro sau 4
tuần ..................................................................................................... 18
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên khả năng nhân nhanh chồi in vitro sau
4 tuần .................................................................................................. 20
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của α-NAA Ďến khả năng ra rễ của chồi và tạo cây in
vitro hoàn chỉnh sau 4 tuần................................................................. 22
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của giá thể Ďến tỷ lệ sống của cây Cỏ thi hắt hơi sau 2
tuần ..................................................................................................... 25


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cỏ thi hắt hơi – Achillea ptarmica (nguồn internet) ...................... 3
Hình 3.1: Vật liệu khởi Ďầu .......................................................................... 17
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của BAP Ďến khả năng nhân nhanh chồi in vitro ..... 19
Hình 3.3: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa Ďến khả năng nhân nhanh chồi in vitro
......................................................................................................... 21
Hình 3.4: Ảnh hƣởng của NAA Ďến khả năng tạo rễ của chồi in vitro ....... 23
Hình 3.5: Một số hình ảnh khi rèn luyện cây............................................... 27


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Ngày nay, khi Ďời sống của con ngƣời Ďƣợc nâng lên thì nhu cầu chơi
hoa, cây cảnh cũng sẽ ngày càng lớn. Hoa tƣơi Ďã trở thành một loại sản phẩm
mang giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí Ďặc biệt trong thị trƣờng sản phẩm
hàng hóa nông nghiệp thế giới. Hiện nay ở Việt Nam, cơ cấu cây trồng nông
nghiệp chuyển Ďổi nhanh chóng sang cơ cấu thị trƣờng theo hƣớng phát triển
trồng và xuất khẩu hoa cây cảnh, Ďây là một hƣớng Ďi mới mang lại lợi ích
kinh tế cao.

Trong các loại hoa cắt cành hiện nay thì hoa cúc là một loài hoa Ďƣợc ƣa
chuộng và trồng phổ biến ở nƣớc ta chỉ Ďứng sau hoa hồng [20]. Hoa cúc
không chỉ Ďem lại giá trị trong Ďời sống tinh thần mà còn Ďem lại hiệu quả
kinh tế cao cho ngƣời trồng. Hoa cúc có nhiều loại với nhiều màu sắc khác
nhau, cúc trắng, cúc Ďỏ, cúc tím, cúc vàng,… Là loại cây trồng Ďa dạng về
loài, màu sắc, dễ trồng, dễ sản xuất, dễ vận chuyển và tiêu thụ nên nó Ďƣợc
nhiều nhà vƣờn lựa chọn Ďƣa vào sản xuất.
Cây Cỏ thi hắt hơi có tên khoa học là Achillea ptarmica thuộc chi
Achillea, họ Cúc [27]. Cây có các chùm hoa màu trắng rực rỡ với vẻ Ďẹp
mong manh, quyến rũ, Ďƣợc trồng trong chậu, trong vƣờn làm cảnh, làm hoa
cắt cành Ďể bàn, trang trí cô dâu và làm hoa cƣới. Ngoài tác dụng làm cảnh,
trang trí, nó còn có các tác dụng khác: “lá có thể ăn sống hoặc nấu chín và
dùng làm thuốc chống côn trùng, ngoài ra Achillea ptarmica mang lại một
loại tinh dầu Ďƣợc sử dụng trong dƣợc liệu thảo dƣợc” [30]. Cỏ thi hắt hơi có
thể Ďƣợc nhân giống bằng hạt, tuy nhiên phƣơng pháp truyền thống này
thƣờng tốn nhiều thời gian và hiệu quả không cao. Trong khi Ďó nhân giống
bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào (in vitro) cho hiệu quả cao hơn hẳn.
Đây là phƣơng pháp kỹ thuật khoa học nhằm tạo ra các giống cây con sạch

1


bệnh với số lƣợng lớn trong một thời gian ngắn ở Ďiều kiện vô trùng và cũng
là tiền Ďề quan trọng Ďể góp phần bảo tồn nguồn gen. Từ những lí do trên
chúng tôi quyết Ďịnh tiến hành Ďề tài “Hoàn thiện quy trình nhân dòng vô
tính cây Cỏ thi hắt hơi (Achillea ptarmica) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế
bào thực vật”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Thăm dò các môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho nhân giống Cỏ thi hắt
hơi.

- Đƣa ra cơ sở cho việc xác Ďịnh quy trình nhân giống in vitro Cỏ thi hắt
hơi nhằm tạo cơ sở cung cấp giống cho quá trình sản xuất.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo vật liệu in vitro từ hạt cây Cỏ thi hắt hơi
- Ảnh hƣởng của BAP Ďến khả năng nhân nhanh chồi cây Cỏ thi hắt hơi
trong nhân giống invitro.
- Ảnh hƣởng của nƣớc dừa Ďến khả năng tạo chồi của cây Cỏ thi hắt
hơi trong nhân giống invitro.
- Ảnh hƣởng của NAA Ďến khả năng tạo rễ invitro cây Cỏ thi hắt hơi.
- Công thức giá thể tối ƣu nhất phù hợp với cây Triệu chuông in vitro
ở giai Ďoạn vƣờn ƣơm.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học: Cung cấp dẫn liệu khoa học về nuôi cấy in vitro cây
Cỏ thi hắt hơi (A.Ptarmica) phục vụ cho các nghiên cứu sau này.
Ý nghĩa thực tiễn: Hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây Cỏ thi
hắt hơi (A.Ptarmica), góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất
lƣợng tốt.

2


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về chi Achillea
Chi Cỏ thi (Achillea) là một chi có khoảng 85 loài thực vật có hoa thuộc
họ Cúc (Asteraceae), nói chung Ďƣợc gọi là Cỏ thi. Chúng có mặt ở châu Âu
và các khu vực ôn Ďới của châu Á và một số ít loài ở Bắc Mỹ. Các loài thực
vật này nói chung có các lá dạng diềm xếp nếp có lông và hƣơng thơm [29].
Các loài cây này có các cụm hoa lớn và phẳng bao gồm nhiều hoa nhỏ

mọc ở phía trên của thân cây. Các hoa có thể có màu trắng, vàng, da cam, Ďỏ
hay hồng, tùy theo loài, mọc phổ biến trong vƣờn [29].
Tên gọi khoa học của chi này Ďƣợc Ďặt theo tên của một nhân vật trong
thần thoại Hy Lạp là Achilles. Theo câu chuyện trong llliad, các binh lính của
Achilles Ďã sử dụng Cỏ thi Ďể Ďiều trị các vết thƣơng, lá cây Cỏ thi có tác
dụng sát trùng và cầm máu [29]. Các loài trong chi Achillea Ďều bị ấu trùng
của một số loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy (lepidoptera) phá hại [29].
1.2. Giới thiệu về Cỏ thi hắt hơi
1.2.1. Mô tả

Hình 1.1: Cỏ thi hắt hơi – Achillea ptarmica (nguồn internet)
Cỏ thi hắt hơi có tên khoa học là Achillea ptarmica, thuộc chi Achillea,

3


họ Cúc nên mang hầu nhƣ tất cả các Ďặc Ďiểm của chi. Cỏ thi hắt hơi là một
cây trồng lâu năm có thân thảo, mọc um tùm thành từng khóm, có thể cao Ďến
0,6m với tốc Ďộ nhanh. Thân thƣờng phân nhánh từ phần dƣới, có lông mƣợt.
Lá nhỏ, mọc cách, có màu xanh Ďậm, có răng lề lõm. Nó Ďƣợc phổ biến rộng
rãi trên khắp châu Âu và rải rác ở Bắc Mỹ, Nga [27],[30].
Cỏ thi hắt hơi có các chùm hoa màu trắng rực rỡ, hoa lƣỡng tính, Ďƣờng
kính hoa 8-16mm, có vẻ Ďẹp tinh tế nhẹ nhàng, những bông hoa có sức quyến
rũ, Ďó là Ďặc trƣng của giống hoa này, hoa nở rộ từ tháng 6 Ďến tháng 8. Loài
này thƣờng tìm thấy ở Ďồng cỏ, rãnh, bờ Ďất hoang. Chúng rất dễ trồng, chịu
khô hạn, không yêu cầu Ďối với Ďất, chịu lạnh [27],[30].
1.2.2. Phân loại
Giới (regnum) : Plantea
Bộ (ordo)

: Asterales

Họ (familia)

: Asteraceae

Chi (genus)

: Achillea

Loài (species) : A. ptarmica
Danh pháp

: Achillea ptarmica

1.2.3. Phân bố
Achillea ptarmica Ďƣợc phổ biến rộng rãi trên khắp châu Âu và rải rác ở
Bắc Mỹ, Nga [29].
1.1.4. Đặc điểm hình thái
Rễ: Rễ chùm, phát triển theo chiều ngang, lan rộng chứ không ăn sâu
vào Ďất, rễ có màu trắng Ďục mọc từ các phần mấu của thân gần sát mặt Ďất.
Thân: Thuộc cây thân thảo nhỏ, có nhiều Ďốt, có thể mọc Ďứng hoặc bò
trên mặt Ďất, cao khoảng 0,4 – 0,6 m.
Lá: Lá Ďơn, không có lá kèm. Lá nhỏ, mọc cách, có màu xanh Ďậm, có
răng lề lõm [27].

4


Hoa: Cụm hoa Ďầu trạng, lớn và phẳng bao gồm nhiều hoa nhỏ mọc ở

phía trên của thân cây, phát sinh từ các nách lá. Hoa lƣỡng tính, có màu trắng,
Ďƣờng kính hoa 8-16 mm, nở từ tháng 6 Ďến tháng 8.
1.1.5. Điều kiện sinh thái
Cây Cỏ thi hắt hơi là cây ƣa sáng, chịu khô hạn, không có yêu cầu Ďối
với Ďất, chịu lạnh. Nó Ďƣợc phổ biến rộng rãi trên khắp Châu Âu và rải rác ở
Bắc Mỹ, Nga [27],[30]. Vì thế khi trồng ở Việt Nam cần chú ý Ďiều kiện về
ánh sáng, nhiệt Ďộ và chế Ďộ tƣới nƣớc. Nên trồng cây vào mùa Ďông vì
Achiilea ptarmica là cây chịu lạnh và hạn chế tƣới nƣớc. Còn nếu trồng vào
mùa hè thì cần phải có lƣới che cho Ďến khi cây bén rễ Ďể tránh cho cây
không bị héo và chết do nhiệt Ďộ quá cao. Trong mùa nóng, tƣới ngày một lần
vào sáng sớm hoặc chiều mát, giữ cho Ďất không bị Ďọng nƣớc và luôn khô
thoáng. Khi cây trƣởng thành nên bổ sung chất dinh dƣỡng cho cây bằng cách
tƣới phân vi sinh hoặc phân lân NPK Ďể thúc Ďẩy sự ra hoa.
1.3. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật trên thế giới và ở
Việt Nam
Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh
học thực vật, Ďặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Đây là công
cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học.Trong vòng 30 năm trở lại Ďây, kỹ
thuật này Ďã làm nên một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và
hiện nay ngƣời ta Ďang hƣớng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này Ďể sản xuất
cây giống thƣơng mại. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Ďã trở thành một
phƣơng pháp nhân giống chuẩn và phổ biến Ďối với nhiều loại cây trồng nhƣ:
cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dƣợc liệu, cây ăn trái và rau
xanh. Những kiến thức về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ngày càng
Ďƣợc củng cố và có nhiều bƣớc tiến rõ rệt. Với phƣơng pháp này ngƣời ta có

5


thể nhân giống rất nhiều loài cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới

mà các phƣơng pháp nhân giống truyền thống không thể thực hiện Ďƣợc [31].
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro Ďều là thuật
ngữ mô tả các phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào Ďơn, mô, cơ
quan) trong ống nghiệm có chứa môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối
khoáng, vitamin, Ďƣờng và các chất Ďiều hòa sinh trƣởng thực vật trong Ďiều
kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi
hoặc cơ quan từ các mô nhƣ lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc Ďỉnh sinh trƣởng. Trƣớc
kia ngƣời ta dùng phƣơng pháp này Ďể nghiên cứu các Ďặc tính cơ bản của tế
bào nhƣ sự phân chia, Ďặc tính di truyền và ảnh hƣởng của các hóa chất Ďối
với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử
dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật Ďể nghiên cứu tất cả các vấn Ďề có liên
quan Ďến thực vật nhƣ sinh lý học, sinh hoá học, di truyền học và cấu trúc
thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống
vô tính Ďối với các loài cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và
thƣơng mại trong Ďời sống hàng ngày của con ngƣời [31].
Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt là ngƣời Ďầu tiên Ďƣa ra ý tƣởng
cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể nhƣng ông Ďã dùng tế bào quá chuyên biệt
nên không thành công [19]. Năm 1934, White Ďã thành công trong việc phát
hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua [26]. Năm 1964,
Ball là ngƣời Ďầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn [16]. Ông Ďã
thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trƣờng nuôi cấy
tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chƣa hoàn chỉnh. Sau Ďó nhiều
nhà nghiên cứu Ďã khám phá ra những thành phần dinh dƣỡng quan trọng cần
thiết cho sự phát triển của các tế bào Ďƣợc nuôi cấy. Năm 1951, Skoog và
Miller Ďã phát hiện ra các hợp chất có thể Ďiều khiển sự nhân chồi [31]. Năm
1962, Murashige và Skoog Ďã cải tiến môi trƣờng nuôi cấy Ďánh dấu một

6

bƣớc tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trƣờng của họ Ďã Ďƣợc dùng làm
cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn Ďƣợc sử dụng rộng rãi cho
Ďến nay [25]. Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan
bằng nuôi cấy Ďỉnh sinh trƣởng. Từ kết quả Ďó, lan Ďƣợc xem là cây nuôi cấy
mô Ďầu tiên Ďƣợc thƣơng mại hóa. Từ Ďó Ďến nay, công nghệ nuôi cấy mô và
tế bào thực vật Ďã Ďƣợc phát triển với tốc Ďộ nhanh trên nhiều cây khác và
Ďƣợc ứng dụng thƣơng mại hóa [22] [23] [24].
Trong thực tiễn sản xuất Ďể bảo quản và nhân nhanh các giống cây quý,
có giá trị kinh tế cao ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô. Hiện nay,
phƣơng pháp này Ďƣợc coi là tối ƣu nhất trong công tác giống cây trồng. Bằng
phƣơng pháp nuôi cấy mô, có thể tạo Ďƣợc một lƣợng sinh khối lớn trong một
thời gian ngắn. Sinh khối Ďƣợc tạo ra vẫn giữ nguyên Ďƣợc thuộc tính, nghĩa
là vẫn giữ Ďƣợc khả năng tổ hợp các chất thứ cấp nhƣ alkaloid, glycosid, các
steroid dùng trong y học, chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những
chất kìm hãm sinh trƣởng của vi khuẩn trong nông nghiệp [31].
Trên thế giới hiện có trên 700 công ty giống cây trồng áp dụng công
nghệ nuôi cấy mô, cơ quan và tế bào thực vật Ďể sản xuất hàng trăm triệu cây
giống sạch bệnh mỗi năm, bao gồm cây dƣợc liệu, cây ăn quả, cây lƣơng
thực, cây hoa, cây cảnh, cây lâm nghiệp. Công nghệ nuôi cấy mô mang lại
hiệu quả kinh tế cao so với các phƣơng pháp truyền thống, góp phần bảo vệ
an ninh lƣơng thực và chống biến Ďổi khí hậu toàn cầu.
Việt Nam có trên 100 phòng thí nghiệm nuôi cấy mô [28]. Riêng tỉnh
Lâm Đồng Ďã có trên 50 xƣởng sản xuất cây giống bằng nuôi cấy mô do các
doanh nghiệp tự Ďầu tƣ. Nhà nƣớc cũng Ďầu tƣ hai phòng thí nghiệm trọng
Ďiểm về công nghệ tế bào thực vật tại Viện Di truyền nông nghiệp và Viện
Sinh học nhiệt Ďới TPHCM. Để phục vụ các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô
Ďã Ďƣợc xây dựng, Bộ KH&CN triển khai nhiều dự án chuyển giao công nghệ

7

về nhân giống in vitro (vi nhân giống thực vật trong Ďiều kiện vô trùng) cho
các Ďịa phƣơng. Nhiều công nghệ Ďã Ďƣợc chuyển giao thành công sau khi các
viện, trƣờng Ďại học nghiên cứu, hoàn thiện. Thông qua các chƣơng trình
nghiên cứu ở các viện, các trƣờng, Ďã có nhiều cán bộ Ďƣợc Ďào tạo nâng cao
tay nghề về công nghệ tế bào thực vật ở trong và ngoài nƣớc. Đến nay, Việt
Nam Ďã có một Ďội ngũ thành thạo về nhân giống in vitro. Quy trình nhân
giống cho nhiều loại cây cảnh quan trọng Ďã Ďƣợc xây dựng và ứng dụng trực
tiếp trong sản xuất ở quy mô lớn nhƣ hoa cúc, hoa hồng, hoa Ďồng tiền,…
Các quy trình này Ďã Ďƣợc Bộ KH & CN công nhận là tiến bộ kỹ thuật
và cho áp dụng sản xuất rộng rãi. Ví dụ, quy trình công nghệ vi nhân giống
cây hoa hồng và hoa cúc ở Đà Lạt.
Achillea ptarmica là loài hoa Ďƣợc ƣa chuộng với vẻ Ďẹp trong sáng,
thuần khiết, nó không chỉ Ďem lại giá trị về mặt kinh tế mà còn Ďem lại giá trị
về mặt tinh thần. Trên thế giới chi Achillea nói chung và loài Achillea
ptarmica nói riêng Ďƣợc Linnaeus công bố 1753 [21]. Tuy nhiên, thông tin Ďã
Ďƣợc công bố rất hạn chế và hiện nay chƣa có nhiều nghiên cứu trên thế giới
về quy trình nhân nhanh loài A. ptarmica [17] cũng nhƣ các loài Achillea spp.
[14]. Hầu hết nghiên cứu tập trung vào phân tích thành phần và xác Ďịnh tính
chất của các hoạt chất trong cây [15].
Ở Việt Nam chi Achillea còn chƣa Ďƣợc nghiên cứu nhiều. Mới chỉ có
loài Achillea millefolium có thể tìm thấy thông tin trong Thực vật chí Việt
Nam và Từ Ďiển thực vật thông dụng

8


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu: Hạt cây Cỏ thi hắt hơi ( Achillea ptarmica) Ďƣợc

nhập nội từ viện nghiên cứu cây công nghiệp Vavilop – Nga (Vavilop
Research Institute of plant Industry).
2.2. Địa điểm tiến hành nghiên cứu
- Thí nghiệm Ďƣợc tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Khoa
Sinh-KTNN, Trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội 2.
- Vƣờn thực nghiệm Trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội 2.
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.3.1. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: Cân kĩ thuật (Sartorius,
Đức), tủ lạnh sâu (FRIGO), máy Ďo pH (HM30G/TOA, ĐỨC), nồi hấp khử
trùng (HV – 110/HIRAYAMA, Nhật), tủ lạnh, máy nƣớc cất 2 lần, buồng cấy
vô trùng (AV – 110/TELSTAR), máy khuấy từ ra nhiệt, cân phân tích, tủ ấm,
Micropipet Jinson.
2.3.2. Dụng cụ
Cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50ml), dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon,
bình tam giác, Ďèn cồn, bình xịt cồn, vỉ nhựa nuôi cấy,…
2.4. Môi trƣờng nghiên cứu và các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật
- pH môi trƣờng 5,8.
- Môi trƣờng Ďƣợc khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt Ďộ 117C trong
15 phút.
- Môi trƣờng sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog,
1962) [25] gồm các khoáng Ďa lƣợng, vi lƣợng, vitamin…thƣờng Ďƣợc sử
dụng trong nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào thực vật.

9


- Các chất Ďiều hòa sinh trƣởng Ďƣợc sử dụng: BAP (6 – Benzyl amino
purin); NAA ( - Napthlacetic acid).
- Nƣớc dừa.

- Các thành phần khác: Đƣờng saccarose 30g/l, agar 7g/l.
2.5. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm Ďều Ďƣợc thực hiện trong Ďiều kiện nhân tạo.
- Ánh sáng: các mẫu Ďều Ďƣợc nuôi cấy với cƣờng Ďộ chiếu sáng
2000lux.
- Quang kì: 10 giờ/ngày.
- Nhiệt Ďộ phòng: 25C - 27C.
- Độ ẩm trung bình: 70% - 74%.
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.6.1. Tạo vật liệu in vitro từ hạt cây hoa Cỏ thi hắt hơi
- Xử lí sơ bộ hạt cây Cỏ thi hắt hơi bằng cách lắc mẫu trong cồn 70%
(v/v)/10 giây + nƣớc cất khử trùng 2-3 lần, tiếp Ďến khử trùng bằng dung dịch
Javen 5% trong 5-20 phút theo bảng 2.1.
- Cuối cùng hạt Ďƣợc rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng (Mỗi lần
khoảng 1phút) trƣớc khi Ďƣa vào môi trƣờng cơ bản MS có 30g/l saccarose,
7g/l agar.
- Đánh giá thí nghiệm sau 2 tuần theo dõi dựa trên tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ
mẫu sống và tỉ lệ mẫu chết ở từng công thức.
Lưu ý: Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong buồng vô trùng
- Chỉ têu theo dõi:
+ Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (tổng số mẫu nhiễm / tổng số mẫu cấy vào) x 100
+ Tỷ lệ mẫu sống (%) = (tổng số mẫu sống / tổng số mẫu cấy vào) x 100
+ Tỷ lệ mẫu chết (%) = (tổng số mẫu chết / tổng số mẫu cấy vào) x 100

10


Bảng 2.1: Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử
trùng
Công thức

CT1 (ĐC)

Chất xử lí/ thời gian
Xử lí sơ bộ

CT2

Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/ 5 phút

CT3

Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/ 10 phút

CT4

Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/ 15 phút

CT5

Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/ 20 phút

2.6.2. Nhân nhanh chồi in vitro
Các thí nghiệm nhân nhanh chồi in vitro Ďều sử dụng môi trƣờng dinh
dƣỡng cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [25]: MS + 30g/l Ďƣờng Saccarose
+ 7g/l agar bổ sung các chất Ďiều hòa sinh trƣởng BAP, nƣớc dừa với các
nồng Ďộ khác nhau gồm 2 thí nghiệm sau:
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi
in vitro của cây Cỏ thi hắt hơi ở các nồng độ 0,1mg/l; 0,3mg/l; 0,5mg/l;
0,7mg/l; 0,9mg/l.

11


Bảng 2.2: Công thức ảnh hƣởng của BAP lên quá trình nhân nhanh
chồi in vitro
Công thức

Thành phần môi trƣờng

CT1

MS (Ďối chứng)

CT2

MS + 0,1 mg/1l BAP

CT3

MS + 0,3 mg/1l BAP

CT4

MS + 0,5 mg/1l BAP

CT5

MS + 0,7 mg/1l BAP

CT6

MS + 0,9 mg/1l BAP

Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến khả năng nhân nhanh
chồi in vitro của cây cỏ thi hắt hơi ở các nồng độ 5%/l, 10%/l, 15%/l.
Bảng 2.3: Công thức ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên quá trình nhân nhanh
chồi in vitro
Công thức

Thành phần môi trƣờng

CT1

MS( Ďối chứng)

CT2

MS + 5% nƣớc dừa

CT3

MS + 10% nƣớc dừa

CT4

MS + 15% nƣớc dừa

Các thí nghiệm Ďƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại.
Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần nuôi cấy dựa trên các chỉ tiêu: số chồi/mẫu,
chiều cao của chồi, số lá/chồi và chất lƣợng của chồi.

2.6.3. Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Các chồi Ďơn hữu hiệu có chiều cao ≥ 2 cm Ďƣợc tách ra khỏi cụm chồi
và cấy chuyển vào môi trƣờng kích thích ra rễ. Khả năng tạo rễ Ďƣợc Ďánh giá
trên công thức môi trƣờng MS bổ sung 0,1

12

0,7 mg/l 1-Naphthaleneacetic


acid (NAA).pH 5,7 ± 0,1. Thí nghiệm Ďƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3
lần nhắc lại. Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần theo dõi dựa trên các chỉ tiêu: số
rễ/mẫu, chiều dài trung bình của rễ (bảng 2.4).
Bảng 2.4: Công thức ảnh hƣởng của NAA đến sự tạo rễ cây Cỏ
thi hắt hơi in vitro.
Công thức

Thành phần môi trƣờng

CT1

MS (Ďối chứng)

CT2

MS + 0,1 mg/ 1l NAA

CT3

MS + 0,3 mg/1l NAA

CT4

MS + 0,5 mg/1l NAA

CT5

MS + 0,7 mg/1l NAA

2.6.4. Rèn luyện cây Cỏ thi hắt hơi in vitro thích nghi với môi trường tự
nhiên
hương pháp đưa c y ra vư n ươm: Cây in vitro 4 tuần tuổi hoàn chỉnh
Ďƣợc Ďƣa vào nhà lƣới theo dõi từ 5 - 7 ngày. Cây Ďƣợc rửa sạch Ďể loại bỏ
thạch dƣới vòi nƣớc chảy và Ďƣợc cấy vào khay Ďã chuẩn bị giá thể. Khả năng
sống của cây con Ďƣợc Ďánh giá trên các công thức giá thể khác nhau (bảng 2.5).
Bảng 2.5: Công thức ảnh hƣởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây
Cỏ thi hắt hơi
Công thức

Loại giá thể

CT1

50% Ďất + 50% sơ dừa

CT2

30% Ďất + 70% sơ dừa

CT3

100% cát ẩm

CT4

50% Ďất + 50% cát

CT5

30% Ďất + 70% cát

2.7. Phƣơng pháp phân tích thống kê số liệu thực nghiệm

13


Số liệu Ďƣợc thu thập và phân tích theo các tham số thống kê gồm giá trị
trung bình, Ďộ lệch chuẩn... bằng chƣơng trình Excel 2010 theo mô tả của
Nguyễn Văn Mã và cộng sự, 2013 [12].

14


CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Là giai Ďoạn Ďƣa cây ngoài tự nhiên vào môi trƣờng nuôi cấy invitro.
Đối với mỗi loại hạt, mỗi loại cây, mỗi loại mô khác nhau phải xác Ďịnh các
phƣơng thức khử trùng khác nhau sao cho thích hợp nhất. Thành công của
giai Ďoạn này phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: Ďối tƣợng nghiên cứu, cách lấy
mẫu, thời Ďiểm lấy mẫu, ngoài ra còn phụ thuộc vào chất khử trùng và thời

gian khử trùng. Giai Ďoạn này phải tạo ra Ďƣợc mẫu sạch khuẩn Ďể phục vụ
cho việc nghiên cứu ở các giai Ďoạn sau. Do Ďó, việc xác Ďịnh phƣơng thức
khử trùng có ý nghĩa quan trọng Ďối với sự thành công của Ďề tài nghiên cứu.
Đề tài này Ďã sử dụng hạt của cây Cỏ thi hắt hơi (Achillea ptarmica)
Ďƣợc nhập khẩu từ Nga Ďể tạo vật liệu vô trùng. Để tạo ra mẫu sạch in vitro
chúng tôi tiến hành nhƣ sau: Hạt Ďƣợc lắc với cồn 70% trong vòng 10 giây,
sau Ďó xử lí trong dung dịch NaClO 5% trong các khoảng thời gian khác nhau
(5-10-15-20 phút). Cuối cùng rửa sạch hạt bằng nƣớc cất khử trùng 3 lần (mỗi
lần khoảng 1 phút). Hạt Ďƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS (20ml MSI +
10ml MSII + 10ml MSIII + 10ml MSIV + 10ml MSV + 30g Ďƣờng + 7g aga)
sau 2 tuần nuôi cấy thu Ďƣợc kết quả nhƣ bảng 3.1.
Bảng 3.1: Tỷ lệ nảy mầm hạt Cỏ thi hắt hơi ở môi trƣờng MSo sau 2 tuần
Công thức

Tỷ lệ nảy mầm trên môi trƣờng MSo (%)

CT1 (ĐC)

0,0000 b

CT2

0,0000 b

CT3

6,6667 b

CT4

53,3333 a

CT5

0,0000 b

LSD 0.05

15.37

Ghi chú: Trong phạm vi cùng một cột, các giá trị mang chữ cái khác
nhau chỉ sự sai khác mang ý nghĩa thống kê ở mức  = 0.05

15


Kết quả bảng 3.1 cho thấy mẫu khử trùng ở các CT1 (xử lí sơ bộ), CT2
(Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/ 10 phút ), CT5 ( Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/
20 phút) không cho hiệu quả khử trùng. Do Ďó tỷ lệ mẫu sạch và tái sinh chồi
phụ thuộc vào nồng Ďộ và thời gian khử trùng. Ở cùng một nồng Ďộ chất khử
trùng NaClO 5% nhƣng với thời gian khử trùng 15 phút thì cho tỷ lệ mẫu
sống cao nhất (53,3333%) nên chúng tôi chọn thời gian khử trùng này cho các
thí nghiệm tiếp theo.
Nhƣ vậy, Ďiều kiện khử trùng tối ƣu trong nghiên cứu này là công thức
xử lý với NaClO 5 % trong 15 phút. Điều này có thể Ďƣợc giải thích do kích
thƣớc hạt A. ptarmica rất nhỏ, lớp vỏ mỏng nên NaClO 5% khi xử lí trong
thời gian quá lâu (20 phút) dễ dàng gây Ďộc cho tế bào và ảnh hƣởng Ďến tỷ lệ
nảy mầm của nội nhũ hạt. Năm 2015, Alvarenga và cộng sự Ďã nghiên cứu
một loài họ hàng của A. ptarmica là A. millefolium. Kết quả cho thấy, quá
trình vào mẫu bằng cách xử lý với NaClO và lắc với cồn 70% cho hiệu quả

tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu này [14].

A

B

16


C
Hình 3.1: Vật liệu khởi đầu
A. Hạt A. ptarmica vô trùng,
B. Hạt A. ptarmica nảy mầm sau 2 tuần
C. Hạt A. ptarmica sau 6 tuần
3.2. Nhân nhanh chồi in vitro
Giai Ďoạn nhân nhanh chồi in vitro có vai trò quan trọng trong việc tạo ra
lƣợng lớn cây con in vitro, quyết Ďịnh hiệu quả của quy trình nhân giống.
Chất ĐHST thực vật có vai trò quan trọng trong quá trình nuôi cấy mô tế bào
thực vật, thúc Ďẩy sự phát sinh hình thái của tế bào, kích thích hình thành chồi
và rễ. Trong nghiên cứu, các chất ĐHST nhƣ BAP và nƣớc dừa Ďã Ďƣợc sử
dụng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy Ďể Ďánh giá khả năng tái sinh chồi từ
hạt cây Cỏ thi hắt hơi nuôi cấy in vitro.
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân nhanh chồi cây Cỏ thi hắt
hơi

17