Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu nhân giống vôtínhcây hoa triệu chuông (calibrachoa praviflora) bằng kĩ thuậtnuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
---------------------

HÀ THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY HOA
TRIỆU CHUÔNG ( Calibrachoa praviflora ) BẰNG
KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học

HÀ NỘI- 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
---------------------

HÀ THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY HOA
TRIỆU CHUÔNG ( Calibrachoa praviflora ) BẰNG
KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
Th.S PHẠM PHƢƠNG THU

HÀ NỘI- 2018


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Phƣơng Thu giảng
viên Khoa Sinh - KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình
hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban
Chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện
để tôi hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận
tình của thầy La Việt Hồng và cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý
thực vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận,
nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ
Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm sinh lí
thực vật- trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị,
phƣơng tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2018
Sinh viên

HÀ THỊ LAN ANH


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố.

Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2018
Sinh viên
HÀ THỊ LAN ANH


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

Napthlacetic acid

BAP:

6- Benzyl amino purin

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

CT:

Công thức

ĐC:

Đối chứng

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất ................... 20
khử trùng ......................................................................................................... 20
Bảng 2.2. Ảnh hƣởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây hoa
Triệu chuông ................................................................................................... 21
Bảng 2.3. Ảnh hƣởng của NAA đến sự tạo rễ cây hoa Triệu chuông in vitro 22
Bảng 2.4. Ảnh hƣởng của giá thể tới tỉ lệ sống của cây hoa Triệu chuông .... 23
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian và nồng độ chất khử trùng NaClO đến khả
năng tạo mẫu sạch và tái sinh chồi .................................................................. 25
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi của
cây Triệu chuông ............................................................................................. 27
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây mô Triệu chuông sau
2 và 4 tuần ra ngôi ........................................................................................... 33


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.Hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora) ........................... 3
Hình 1.2. Một số màu hoa hiện có của hoa Triệu chuông ....................... 5
Hình 3.1. Chồi cây hoa Triệu chuông.................................................... 25
Hình 3.2. Cụm chồi Triệu chuông sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng
có bổ sung BAP ..................................................................................... 29
Hình 3.3. Chồi in vitro của hoa Triệu chuông có bổ sung 0,3 mg/l
Kinetin sau 6 tuần nuôi cấy ................................................................... 30
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của α-NAA đến khả năng hình thành rễ ở cây hoa
Triệu chuông .......................................................................................... 31
Hình 3.4. Tạo rễ cây Triệu chuông in vitro ........................................... 32
Hình 3.5. Cây hoa Triệu chuông trong giai đoạn rèn luyện ................. 35

Hình 3.6. Triệu chuông in vitro đã ra hoa ngoài tự nhiên ..................... 35
Hình 3.7. Nhân nhanh cây hoa Triệu chuông in vitro ........................... 36


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1.Lí do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Giới thiệu về cây hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora).................. 3
1.1.1. Vị trí, phân loại: ...................................................................................... 3
1.1.2. Nguồn gốc ............................................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lí ...................................................................... 3
1.1.4. Kĩ thuật chăm sóc cây hoa Triệu chuông ................................................ 5
1.2. Kĩ thuật nhân giống cây hoa Triệu chuông ................................................ 7
1.2.1. Nhân giống hữu tính................................................................................ 7
1.2.2. Nhân giống vô tính .................................................................................. 7
1.2.3. Nhân giống vô tính in vitro cây hoa Triệu chuông ................................. 8
1.2.3.1. Cơ sở khoa học về nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................. 8
1.2.3.2. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro ............................... 9
1.2.3.3. Đặc điểm của cây giống in vitro ........................................................ 11
1.2.3.4. Những yếu tố ảnh hƣởng đến kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro ... 11
1.3. Tình hình sản xuất và các nghiên cứu về nhân giống hoa Triệu chuông . 16
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 17
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................ 17
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ................................................................. 17

2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 17
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 17
2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy ............................................................................. 18
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................ 19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 19
2.3.1. Bố trí thí nghiệm. .................................................................................. 19
2.3.2. Phƣơng pháp phân tích số liệu .............................................................. 23
CHƢƠNG 3: K T QUẢ VÀ THẢO UẬN .................................................. 24
3.1.Tạo vật liệu in vitro từ chồi cây hoa Triệu chuông ................................... 24
3.2. Nhân nhanh chồi cây hoa Triệu chuông in vitro ...................................... 26
3.3. Kích thích chồi ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh ..................................... 30
3. 4. Ảnh hƣởng của các loại giá thể lên tỷ lệ sống của cây in vitro khi đƣa ra
vƣờn ƣơm ........................................................................................................ 32
CHƢƠNG 4: K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ .................................................. 37
4.1. Kết luận .................................................................................................... 37
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 38


MỞ ĐẦU
1.Lí do chọn đề tài
Triệu chuông (Calibrachoa parviflora

là loài hoa thuộc họ Cà

(Solanaceae), phân bố chủ yếu ở vùng Nam Mỹ, Mexico, và tây nam Hoa Kỳ
[7], [16]. Đây là loài hoa cảnh đƣợc ƣa chuộng trên thế giới bởi màu sắc vô
cùng đa dạng và phong phú. Về hình thái, hoa Triệu chuông có đặc điểm gần
giống với hoa Dạ yên thảo, cả hai loài này cùng thuộc họ Cà nhƣng ở hai chi

khác nhau. Theo nghiên cứu củaStehmann và cộng sự (1997), hoa Triệu
chuông có bộ NST 2n = 18, Dạ yên thảo có bộ NST 2n = 16 và chúng khác xa
nhauvề cấu trúc nhiễm sắc thể [20]. Đặc tính nổi bật của hoa Triệu chuông so
với Dạ yên thảo là hoa nhỏ và sai hoa hơn, cây có thể ra hoa quanh năm, thời
gian chơi hoa dài hơn, khả năng chịu nắng nóng và mƣa tốt hơn. Vì thế, đây
đƣợc xem là đối tƣợng hoa cảnh rất phù hợp để phát triển với điều kiện ở Việt
Nam hiện nay.
Theo thông tin từ các cơ sở cung ứng giống, hiện nay phần lớn cây
giống Triệu chuông đƣợc gieo từ hạt F1 nhập khẩu, tuy nhiên giá bán hạt
giống Triệu chuông khá cao, tỷ lệ nảy mầm của hạt tƣơng đối thấp (khoảng
50% - 60%), cây con có tỷ lệ chết cao, do đó ảnh hƣởng đến giá thành cây
giống. Ngoài phƣơng pháp gieo hạt, Triệu chuông còn có thể nhân giống bằng
phƣơng pháp giâm cành, tuy nhiên phƣơng pháp nhân giống này có hệ số
nhân thấp, cây giâm cành có sức sống yếu hơn cây gieo bằng hạt và nhanh tàn
hơn. Do vậy, việc cung ứng nguồn cây in vitro sạch bệnh, hoàn thiện quy
trình nhân giống hoa Triệu chuông là rất cần thiết. Đây cũng là tiền đề quan
trọng để góp phần bảo tồn nguồn gen và phục vụ công tác chọn tạo giống.
Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện nay mới chỉ tập trung vào phân loại [20] và
xây dựng cây phát sinh loài [7].

1


Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu xác định
đƣợc qui trình nhân giống cây Triệu chuông (Calibrachoa parviflora) bằng kĩ
thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm cung ứng cây giống sạch bệnh và
giảm giá thành cho thị trƣờng hoa cảnh Việt Nam.
2. Mục đích nghiên cứu
Xác định đƣợc quy trình nhân dòng vô tính cây hoa Triệu chuông
(Calibrachoa parviflora) in vitro.

3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo vật liệu in vitro từ chồi đỉnh cây Triệu chuông (Calibrachoa
parviflora).
- Ảnh hƣởng của BAP, Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi của cây
Triệu chuông (Calibrachoa parviflora) in vitro.
- Ảnh hƣởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của cây Triệu chuông
(Calibrachoa parviflora) in vitro.
- Công thức giá thể tối ƣu nhất phù hợp với cây Triệu chuông in vitro
ở giai đoạn vƣờn ƣơm.
4. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học: Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu
về nhân giống in vitro cây hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora)
- Ý nghĩa thực tiễn: Góp phần sản xuất giống Triệu chuông có hiệu
quả cao, chất lƣợng tốt.

2


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora)
1.1.1. Vị trí, phân loại:
Giới:

Plantae (Thực vật)

Phân giới:

Tracheobionta

Ngành:

Spermatophyta

Phân ngành:

Magnoliophyta

Lớp:

Magnoliopsida

Phân lớp:

Asteridae

Bộ:

Solanales

Họ:

Solanaceae

Chi:

Calibrachoa

Tên khoa học:

Calibrachoa parviflora [25].

Hình 1.1.Hoa Triệu
chuông (Calibrachoa
parviflora)

1.1.2. Nguồn gốc
Cây hoa Triệu chuông có xuất xứ từ Châu Âu,đƣợc biết đến vào đầu
những năm 1990, là loài hoa mới đƣợc nhập nội vào nƣớc ta trong những
năm gần đây. Tất cả các giống Triệu chuông là giống lai với các giống có
nguồn gốc từ Nam Mỹ [24].
Các giống hoa Triệu chuông hoang dại đầu tiên đƣợc phát hiện ở
Brazil có sự đa dạng về màu sắc, kích thƣớc và hình dáng hoa. Thông qua
quá trình lai tạo và chọn lọc, các giống hoa Triệu chuông trồng hiện nay có
nhiều ƣu điểm để phù hợp với thị hiếu của ngƣời chơi hoa.
1.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lí
- Rễ: Rễ cây hoa Triệu chuông thuộc loại rễ chùm, phần lớn phát triển
theo chiều ngang, ở tầng đất mặt từ 10 - 20 cm. Kích thƣớc các rễ trong bộ
rễ chệnh lệch nhau không nhiều, số rễ tƣơng đối nhiều nên khả năng hút

3


nƣớc và dinh dƣỡng của cây rất mạnh. Vì vậy, Triệu chuông rất thích hợp
trồng trên các loại giá thể tơi xốp, chủ động điều chỉnh thành phần dinh
dƣỡng phù hợp để kích thích bộ rễ phát triển.
- Thân: Cây hoa Triệu chuông thuộc loại cây hoa thân thảo rủ có chiều
cao từ 10 - 50 cm. Thân khá cứng, phủ ít lông dính, nhánh cây đƣợc phân ra
từ các nách lá. Trên thân có các mắt ngủ tiềm sinh ở giữa cuống lá và thân.
Thân có khả năng tái sinh nên đƣợc sử dụng để nhân giống vô tính.

- Lá:

á đơn mọc cách trên thân không có lá kèm. Phiến lá mềm

mỏng, mép nguyên không có răng cƣa, có thể to hay nhỏ hình thuôn hoặc
oval, có màu sắc khác nhau (xanh đậm, xanh nhạt...) tùy thuộc vào
giống.Mặt trên và mặt dƣới của lá có lớp lông phủ mịn, gân lá hình chân
chim.
-Hoa: Triệu chuông là loại hoa quanh năm nếu đƣợc chăm sóc tốt.Hoa
hình chuông, cánh mƣớt nhƣ nhung và viền cánh hoa có gợn sóng. Cụm hoa
chủ yếu có một hoa hoặc tập hợp một vài hoa trên đỉnh cành dài, cứng. Màu
sắc hoa rất đa dạng, hầu nhƣ có tất cả các màu trong tự nhiên (trắng, tím, đỏ
hồng,...) và độ đậm nhạt thay đổi từ khi hoa bắt đầu nở đến khi hoa tàn. Một
bông có thể có một màu hoặc nhiều màu pha trộn. Đƣờng kính bông hoa chỉ
khoảng 1 - 2cm tuy nhiên cây vô cùng sai hoa. Hoa lƣỡng tính gồm 5 tiểu
nhụy gắn ở phần dƣới của ống vành. Cánh đài hợp ở gốc, còn lại ở quả, cánh
tràng hợp thành ống loe rộng ở đỉnh, nổi rõ các gân thùy.
- Quả: nang hai mảnh, nhiều hạt.

4


Hình 1.2. Một số màu hoa hiện có của hoa Triệu chuông
1.1.4. Kĩ thuật chăm sóc cây hoa Triệu chuông
Nếu ai đã từng chăm Dạ yến thảo thì chăm sóc hoa Triệu chuông rất dễ
dàng. Không “đỏng đảnh” nhƣ Dạ yến thảo, Triệu chuông không dễ dàng bị
héo khi nhiệt độ tăng, khả năng chịu mƣa và nắng nóng cũng tốt hơn.
- Ánh sáng: Triệu chuông ƣa sáng hoàn toàn, càng nhiều nắng cây
càng sai hoa.
- Nhiệt độ: Mặc dù ƣa nắng, tuy nhiên là cây thân thảo bộ rễ ăn nông

nên Triệu chuông dễ bị đốt nóng nếu trƣng dƣới ánh nắng mặt trời gay gắt.

5


Nhiệt độ phù hợp với Triệu chuông từ 15 - 280C, mùa hè cần che nắng hoặc
trƣng cây dƣới giàn lƣới. Nhiệt độ cao quá khiến cây xấu yếu, phát triển kém.
- Độ ẩm: Cây hoa Triệu chuông sinh trƣởng, phát triển thuận lợi nhất
trong điều kiện ẩm độ đất từ 65 - 80%, độ ẩm không khí từ 60 - 75%. Trong
thời kỳ nở hoa nếu độ ẩm quá cao gây thối hoa và sâu bệnh phát triển mạnh
làm giảm chất lƣợng hoa và độ bền của hoa. Khi trồng nên sử dụng chậu
thoáng và thoát nƣớc tốt.
- Tưới nước: Triệu chuông ƣa nƣớc nhƣng không chịu đƣợc úng. Cây
nhiều lá hoa nên cần bổ sung nƣớc đầy đủ, mùa hè nhiệt độ cao nƣớc thoát
nhanh nên tƣới 2 - 3 lần vào sáng sớm hoặc chiều mát mỗi lần tùy kích thƣớc
chậu khoảng 300 - 500ml. Mùa đông khi nhiệt độ ngoài trời 15 - 220C, lƣợng
mƣa ít thì có thể trƣng ra ngoài mà không sợ cây bị mƣa táp. Tƣới nƣớc khi
thấy đất trên mặt chậu se khô [23].
Tốc độ sinh trƣởng của Triệu chuôngkhá nhanh, cây liên tục ra hoa
hết đợt này đến đợt khác, thời gian chơi hoa rất dài và có khi đƣợc dùng làm
hoa tết để bàn tạo không gian đẹp cho các gia đình. Bên cạnh đó, chúng
không cần cầu kì trong chăm sóc, rễ cây khỏe, nhu cầu nƣớc không khắt khe,
ít sâu bệnh và cóthể chịu đƣợc nắng mƣa thất thƣờng [22]. Với những ƣu thế
này, hoa Triệu chuông xứng đáng là cây hoa ban công hoàn hảo phù
hợpnhiều vùng sinh thái của nƣớc ta, đặc biệt là khu vực miền Bắc. Vì vậy, để
đảm bảo cho sự sinh trƣởng, phát triển của cây hoa Triệu chuông đƣợc thuận
lợi, nâng cao năng suất và chất lƣợng hoa, cần tiến hành nghiên cứu trên các
giống cụ thể và áp dụng các biện pháp kỹ thuật trồng nhƣ: thời vụ, giá thể,
phân bón… phù hợp với từng giai đoạn sinh trƣởng.

6


1.2. Kĩ thuật nhân giống cây hoa Triệu chuông
1.2.1. Nhân giống hữu tính
Nhân giống hữu tính là hình thức dùng hạt để làm giống, cây con
đƣợc hình thành từ hạt. Đây là phƣơng pháp nhân giống cây đơn giản, dễ
làm, ít tốn kém và không cần nhiều trang thiết bị. Hạt giống đƣợc hình thành
do kết quả thụ tinh giữa giao tử đực (hạt phấn với giao tử cái (noãn . Từ hạt
sẽ hình thành một cây mới mang đặc tính của cả cây bố và cây mẹ (trong
trƣờng hợp thụ phấn chéo hoặc nghiêng hẳn về cây bố hoặc cây mẹ (trong
trƣờng hợp vô phối . Cây con mọc lên từ hạt, thƣờng tạo thành cây giống
khỏe, có khả năng sinh trƣởng phát triển tốt, khả năng chống chịu cao (sâu
bệnh và điều kiện ngoại cảnh , năng suất cao.
Tuy nhiên, phƣơng pháp nhân giống hữu tính cũng nhƣợc điểm là: Hạt
giống tạo ra có bản chất lai, có ƣu thế lai, cây có tính dị hợp, cây thƣờng bị
phân ly với tỷ lệ cao, tỷ lệ cây mọc thƣờng biến động, cây có thời gian sinh
trƣởng rất dài 5 - 6 tháng. Mặt khác, phƣơng pháp nhân giống bằng hạt
thƣờng gặp nhiều khó khăn: khả năng thụ phấn thụ tinh thấp ở những vùng
sinh thái có nhiệt độ, ẩm độ… không phù hợp. Do đó, chất lƣợng hoa không
cao, giá trị thƣơng phẩm thấp. Nên phƣơng pháp nhân giống này ít đƣợc sử
dụng trong sản suất.
1.2.2. Nhân giống vô tính
Cây hoa Triệu chuông cũng có thể đƣợc nhân giống từ các cơ quan, bộ
phận sinh dƣỡng của cây nhƣ thân, lá... Ðây là hình thức nhân giống vô tính
phổ biến ở nhiều loại cây trồng. Quá trình nhân giống vô tính có thể diễn ra
trong tự nhiên và nhân tạo. Phƣơng pháp nhân giống vô tính có nhiều ƣu
điểm:
- Giữ đƣợc những đặc tính di truyền của cây mẹ.
- Cây giống sau trồng sớm ra hoa.

7


- Thời gian nhân giống nhanh.
- Các đột biến có lợi khó bị mất đi do không phải trải qua quá trình
phân bào giảm nhiễm.
Bên cạnh những ƣu điểm nổi bật, phƣơng pháp nhân giống này vẫn
còn có một số nhƣợc điểm sau:
- Cây mẹ truyền bệnh virus sang cho cây con.
- Cây giống nhanh bị thoái hóa (sinh trƣởng phát triển không đều, cây
nhanh tàn, giảm giá trị thƣơng phẩm .
- Hệ số nhân thấp, cần số lƣợng lớn cây bố mẹ, tốn thời gian, phụ
thuộc vào điều kiện thời tiết và cây giống dễ bị thoái hóa qua quá trình canh
tác lâu dài.
1.2.3. Nhân giống vô tính in vitro cây hoa Triệu chuông
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống, thƣờng đƣợc sử
dụng cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật,
bằng việc sử dụng các bộ phận khác nhau của cây với kích thƣớc nhỏ.
1.2.3.1. Cơ sở khoa học về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát
sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hƣớng, dựa vào sự phân
hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực
vật.
Tính toàn năng của tế bào
Haberlandt G.(1902 là ngƣời đầu tiên đƣa ra quan điểm rằng mỗi tế
bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát
triển thành một cá thể hoàn chỉnh [9]. Theo quan điểm sinh học hiện đại thì
mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền
cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế

8


bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng
của tế bào [3].
Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào
Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm
nhiều cơ quan chức năng khác nhau, đƣợc hình thành từ nhiều loại tế bào
khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào
đầu tiên (tế bào hợp tử . Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia
thành nhiều tế bào phôi sinh chƣa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa .
Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục đƣợc biến đổi thành các tế
bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau.
Quá trình phân hóa tế bào có thể hiện thị:
Tế bào phôi sinh  Tế bào dãn  Tế bào phân hóa có chức năng
riêng biệt.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng
chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi mình. Trong trƣờng
hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi
sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào.
Tế bào chuyên hoá (mô  Tế bào phôi sinh [14], [15].
Ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro đã mở ra một hƣớng phát triển
mới trong ngành nông nghiệp, giúp tăng sản lƣợng và chất lƣợng cây giống,
đảm bảo nguồn cung cấp cây giống có chất lƣợng tốt cho thực tiễn sản xuất.
1.2.3.2. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro
Cho tới nay việc sử dụng phƣơng pháp nhân giống in vitro đã đƣợc áp
dụng cho nhiều loại cây trồng (trên 400 loài).Giáo sƣ Murashige của trƣờng

Ðại học California đã chia quy trình nhân giống in vitro làm ba giai đoạn và

9


một giai đoạn tiếp sau in vitro [12]:
1 T o vật liệu nu i c

h i đ u in vitro

Giai đoạn này là bƣớc thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Các mẫu đã đƣợc khử
trùng và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng thích hợp để tạo ra các chồi mới.
Giảm tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh, tăng khả năng tái sinh có vai trò quan trọng ở
giai đoạn này và thƣờng kéo dài từ 4 - 6 tuần.
2 Nhân nhanh ch i c m ch i in vit o
à giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao
nhất. Ở giai đoạn này các chồi đƣợc kích thích phát sinh thành nhiều chồi,
mầm nhằm cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo. Hệ số nhân phụ thuộc
nhiều vào vai trò của các loại phytohoocmon (thƣờng là cytokynin .
3 T o câ hoàn ch nh hu n u ện cây con
Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn đƣợc chuyển sang
môi trƣờng tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá,
rễ. Trong giai đoạn này, nồng độ cytokynin đƣợc giảm xuống và tăng nồng
độauxin nhằm kích thích sự hình thành rễ.
Huấn luyện cây con: à giai đoạn chuấn bị cho cây con chuyển ra ngoài
hệ thống vô trùng khi đã đạt kích thƣớc nhất định.
4

hu n câ

a t ng ngoài đi u iện tự nhi n

Đây là giai đoạn chuyển cây in vitro từ trạng thái sống dị dƣỡng sang
sống hoàn toàn tự dƣỡng và thích nghi với điều kiện tự nhiên. Sự biến động
của các yếu tố nhƣ: thời tiết, đất đai, sâu bệnh,… gây nhiều khó khăn trong
việc đƣa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên.
Nhƣ vậy, cả bốn giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro đều có vai
trò quyết định đến khả năng ứng dụng thành công các quy trình nhân giống in
vitro vào thực tiễn.

10


1.2.3.3. Đặc điểm của cây giống in vitro
Cây giống in vitro khi đƣa ra môi trƣờng tự nhiên, gặp một số vấn đề
nhƣ sau:
- Cây dễ bị mất nƣớc do cấu trúc lá có lớp cutin trên bề mặt ít.
- Bộ máy quang hợp và lục lạp kém phát triển.
- Rễ của các chồi không có khả năng đồng hóa cabon và thƣờng bị
chết do rễ đƣợc hình thành từ callus thân, cho nên mối liên kết rễ - không
bào và thân không tốt.
Vì vậy, trƣớc khi đƣa cây ra ngoài cần phải có các biện pháp xử lý để
tăng khả năng sống sót của cây. Các biện pháp đó gọi là huấn luyện cây
trƣớc khi đƣa cây ra ngoài.
Việc huấn luyện cây bao gồm:
- Giảm thể nƣớc của môi trƣờng.
- Giảm ẩm độ trong bình nuôi cây.

Cả 2 dạng xử lý nhằm phát triển chức năng của khí khổng và lớp cutin.
Các biện pháp có thể áp dụng nhƣ: đậy nút bình bằng các vật liệu có thể thoát

hơi nƣớc, mở nắp bình trƣớc khi trồng vài ngày, khi cho cây ra rễ in vitro
điều chỉnh ánh sáng, nhiệt độ cao hơn các giai đoạn trƣớc… [14], [15].
1.2.3.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro
a. Mẫu cấy
Về nguyên tắc, trừ những mô đã hóa gỗ còn tất cả các mô khác trong
cơ thể thực vật đều có thể dùng làm vật liệu cấy. Tuy vậy, các mô đang phát
triển mạnh nhƣ mô phân sinh ngọn, thƣợng tầng, đầu rễ, phôi đang phát
sinh, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh đốt... khi đặt vào
môi trƣờng chứa chất sinh trƣởng thích hợp có khả năng nuôi cấy để tạo mô
sẹo hoặc tạo thành cây hoàn chỉnh [3].
b. Phƣơng pháp vô trùng

11


Mẫu có chứa ít hay nhiều vi khuẩn, nấm tùy theo sự tiếp xúc của
chúng với môi trƣờng. Để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi mô nuôi cấy thì
phƣơng pháp thông dụng hiện nay là dùng các hóa chất có hoạt tính diệt
khuẩn và nấm vi khuẩn.
Khả năng tiêu diệt nấm, vi khuẩn của hóa chất vô trùng phụ thuộc vào
nồng độ, thời gian xử lí và mức độ xâm nhập của chúng trên bề mặt nuôi
cấy. Để tăng hiệu quả thì ngƣời ta có thể ngâm mẫu vào etanol 70 - 80%
trong 30 giây, sau đó mới xử lí với dung dịch diệt khuẩn. Với các mẫu quá
bẩn thì phải rửa kĩ bằng nƣớc xà phòng và phải để dƣới vòi nƣớc chảy từ 20
- 30 phút, sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy.
Tác nhân vô trùng ngoài diệt nấm, vi khuẩn còn ảnh hƣởng tới mô
cấy. Vì vậy, chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và sự
mẫn cảm của mẫu [1].
c. Môi trƣờng nuôi cấy
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài,

bộ phận và mục đích nuôi cấy, vì vậy thành phần của môi trƣờng là khác
nhau. Thành phần môi trƣờng còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển,
phân hóa khác nhau của mẫu cây và mục đích nuôi cấy nhƣ: duy trì mô ở
trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [1].
Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất, nhƣng tất cả
các loại môi trƣờng nuôi cấy đều gồmcó các thành phần sau: Các loại muối
khoáng. nguồn cacbon, vitamin, các chất điều tiết sinh trƣởng, các nhóm
chất bổ sung, chất độn [5].
* Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy
mô - tế bào thực vật đƣợc chia thành hai nhóm theo hàm lƣợng sử dụng:
nhóm đa lƣợng và nhóm vi lƣợng.

12


- ác ngu n tố hoáng đa ượng:
Nitơ (N : thƣờng đƣợc sử dụng ở hai dạng nitrat (NO 3- hoặc muối
amoni (NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau.
ƣu huỳnh (S : Chủ yếu và tốt nhất là muối SO 42-.
Photpho (P : Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về photpho
rất cao. Chính vì vậy photpho là một nguyên tố cần thiết của môi trƣờng và
thƣờng đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở dạng ortophotphat hoặc đƣờng photphat.
Ngoài ra khi photpho ở dạng H 2PO4 và HPO4- còn có tác dụng nhƣ một hệ
thống đệm làm ổn định pH của môi trƣờng trong quá trình nuôi cấy.
-

ác ngu n tố hoáng vi ượng: Ngoài các nguyên tố khoáng đa

lƣợng, trong môi trƣờng còn cần các nguyên tố vi lƣợng là Fe, B, Mn, I, Mo,

Cu, Zn, Ni, Co.
* Nguồn cacbon
Hầu hết các mô nuôi cấy là dị dƣỡng, không có khả năng tổng hợp
cacbon. Vì vậy việc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là
điều kiện bắt buộc. Trong phần lớn các môi trƣờng, nguồn cacbon và năng
lƣợng chủ yếu là saccarosevà glucoselà nguồn cacbon tốt nhất. Ở một số mô
thì có thể dùng mantose, fructosevà galactose.
* Vitamin
Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả
năng tự tổng hợp đƣợc hầu hết các loại vitamin, nhƣng thƣờng không đủ về
lƣợng do đó phải bổ sung thêm vào môi trƣờng một số vitamin, đặc biệt là
các vitamin thuộc nhóm B nhƣ vitamin B1, B3, B5, B6, axit nicotinic, mesoinosit. Năm 1972, theo kết quả nghiên cứu của Riley, vitamin B1 đƣợc coi là
vitamin thiết yếu đối với sự sinh trƣởng của tế bào thực vật [18].
* Các chất điều hòa sinh trƣởng

13


Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (phytohoocmon là thành phần
quan trọng bậc nhất của môi trƣờng nuôi cấy. Nhờ những chất này, các nhà
nghiên cứu có thể chủ động điều khiển quá trình phát sinh hình thái của thực
vật in vitro. Có hai nhóm chất đƣợc sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin.
Hàm lƣợng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, ngƣợc lại ở hàm
lƣợng cao sẽ tạo mô sẹo. Các chất thuộc nhóm auxin thƣờng dùng là IBA,
IAA, NAA và 2,4D.
Các cytokinin thƣờng dùng trong môi trƣờng nuôi cấy là Kinetin,
BAP. Các mức thấp hơn của cytokinin biểu hiện hiệu quả kích thích kém,
dẫn đến sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi giảm. Hàm lƣợng cytokinin cao
sẽ hoạt hóa thành chồi bất định, chồi nhiều nhƣng kích thƣớc nhỏ. Ngoài ra,
theo kết quả nghiên cứu của Narayanaswami năm 1996 cho thấy nồng độ

cao của cytokinin còn kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ [13].
* Các nhóm chất chất bổ sung
Bên cạnh các chất điều hòa sinh trƣởng, ngƣời ta còn sử dụng nhiều
dung dịch hữu cơ phức tạp có thành phần không xác định nhƣ: nƣớc dừa,
dịch chiết nấm men nhằm tăng cƣờng sự sinh trƣởng và phát triển của mô
nuôi cấy.
Trong nuôi cấy có trƣờng hợp ngƣời ta sử dụng cả than hoạt tính nhƣ
một chất phụ gia, kết quả nghiên cứu của Fridborg và cộng sự (1978 cho
thấy than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất tiết ra từ mô cấy, vỏ bao
phấn và làm tăng hiệu suất sinh phôi [8].
* Chất độn (thạch - agar)
Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trƣờng. Theo
nghiên cứu của Bhojwani và Razdan (1983), khi nồng độ của agar cao, môi
trƣờng trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất dinh dƣỡng nhƣ hấp thụ của

14


mô gặp khó khăn [6]. Đa số nuôi cấy phôi đƣợc thực hiện trên môi trƣờng có
agar nhƣng phụ thuộc vào loài cây mà sử dụng cho phù hợp.
d. Điều kiện nuôi cấy
* Nhiệt độ
Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trƣởng và phát triển ở các loài là không
nhƣ nhau. Thực tế nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì nhiệt độ đƣợc duy
trì, ít biến đổi, thƣờng là 25 ± 10C.
Theo tác giả Shigenobu và Sakamoto (1981 thì nhiệt độ cũng nhƣ
thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không đổi trong suốt thời gian nuôi cấy
[19].
* Ánh sáng
Ánh sáng có ảnh hƣởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thành của

mô nuôi cấy, bao gồm cƣờng độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng
Cƣờng độ ánh sáng từ 1000 - 2500 lux đƣợc dùng phổ biến cho nhiều loại
mô.
* Giá trị pH của môi trƣờng
Độ pH của môi trƣờng dinh dƣỡng ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình
thu nhận các dinh dƣỡng từ môi trƣờng vào tế bào. Vì vậy, đối với mỗi loại
môi trƣờng nhất định và đối với từng trƣờng hợp cụ thể của các loài cây phải
chỉnh độ pH của môi trƣờng với mức ổn định ban đầu. Giá trị pH của môi
trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng và phát triển ở nhiều loài thực vật biến đổi
từ 5,0 - 6,0. Khi pH thấp sẽ hoạt hóa các enzyme hydrolose dẫn tới kìm hãm
sinh trƣởng đồng thời kích thích sự già hóa của các tế bào trong mô nuôi
cấy.

15


1.3. Tình hình sản xuất và các nghiên cứu về nhân giống hoa Triệu
chuông
Ở Việt Nam, công việc nuôi cấy mô tế bào bắt đầu thực hiện trong
khoảng năm 1977 ở Phân Viện Khoa học Thành phố Hồ Chí Minh. Hiện nay
có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy ở cácTrƣờngĐại học, các Viện
nghiên cứu, các Sở khoa học và Công nghệ ở các Tỉnh, Thành phố.Đà ạt là
nơi có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của tƣ nhân phục vụ cho công
tác nhân giống hoa và rau củ [4].
Hiện nay nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào đã đƣợc áp dụng ở một
số loài hoa: đồng tiền, cẩm chƣớng, dạ yến thảo… và đã đem lại hiệu quả
kinh tế cao cho ngƣời sản xuất. Cây hoa đƣợc nhân giống từ nuôi cấy mô tế
bào có năng suất rất cao (gấp 3 - 4 lần so với các cách nhân giống khác), chất
lƣợng giống hoa tốt. Vùng hoa Mê inh (Vĩnh Phúc , Tây Tựu (Hà Nội) hiện
nay hầu hết các giống hoa mới đều đƣợc trồng bằng cây nhân giống từ

phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào [21]. Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới và
trong nƣớc chƣa có một công trình nghiên cứu nào về nhân giống in vitro cây
hoa Triệu chuông. Chính vì vậy, tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nhân dòng
vô tính cây hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora) bằng kĩ thuật nuôi
cấy mô tế bào thực vật” để góp phần sản xuất giống Triệu chuông năng suất
cao, chất lƣợng tốt phục vụ nhu cầu thị hiếu của con ngƣời.

16