Khoá luận tốt nghiệp Nhân giống in vitro cây hoa Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

PHẠM THỊ LIÊN

NHÂN GIỐNG CÂY HOA OẢI HƢƠNG LÁ XẺ
(LAVANDULA DENTATA L.) BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI
KHOA SINH - KTNN

PHẠM THỊ LIÊN

NHÂN GIỐNG CÂY HOA OẢI HƢƠNG LÁ XẺ
(LAVANDULA DENTATA L.) BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

TS. LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. La Việt Hồng - Khoa Sinh
KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, động viên
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ
nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi để tôi hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật đã giúp đỡ,
đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi
lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh
lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật - trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều
kiện thuận lợi về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Phạm Thị Liên


LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi: - Phòng Đào tạo trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2.
- Khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực
hiện dưới sự hướng dẫn của TS. La Việt Hồng. Các số liệu, kết quả nghiên

cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

PHẠM THỊ LIÊN


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BAP: 6-Benzylaminopurine
MS: Murashige & Skoog
NAA: 1-naphthaleneacetic acid
IAA: Indolo-3-axit axetic
IBA: Indol butyric acid
Kinetin (KIN): 6-furfurylaminopurinne
Ads: Adenine hemisulfate
M : Margara N30K
TDZ: Thidiazuron
Mg/l: miligam/ lít


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................ 2
2.1. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................. 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 2
NỘI DUNG....................................................................................................... 3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. Giới thiệu về chung về chi Lavandula và loài L. dentata .......................... 3
1.2. Đặc điểm sinh học của Lavandula dentata L............................................. 4
1.3. Giá trị sử dụng ............................................................................................ 5
1.4. Tình hình nghiên cứu Lavandula dentata L. trên thế giới và ở Việt Nam 6
1.4.1. Tình hình nghiên cứu Lavandula dentata L. trên thế giới ...................... 6
1.4.2. Tình hình nghiên cứu Lavandula dentata L. ở Việt Nam....................... 8
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 9
2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 9
2.2. Thời gian và điạ điểm nghiên cứu.............................................................. 9
2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .................................................................. 9
2.3.1. Thiết bị .................................................................................................... 9
2.3.2. Dụng cụ ................................................................................................... 9
2.4. Môi trường nuôi cấy ................................................................................... 9
2.5. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................... 10
2.6. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 10
2.6.1. Tạo vật liệu khởi đầu............................................................................. 10


2.6.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro ..................................................... 10
2.6.3. Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh ........................................................ 11
2.6.4. Rèn luyện cây Oải hương in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên ... 11
2.7. Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm ................................................... 11
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 12
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu................................................................................ 12
3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro ........................................................ 14
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh và nhân nhanh chồi L. dentata in vitro
......................................................................................................................... 14
3.2.2. Ảnh hưởng của Kinetin (KIN) đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi
L. dentata in vitro ............................................................................................ 16

3.3. Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh ........................................................... 18
3.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên......................... 20
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 24
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 28


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cây Oải hương lá xẻ ...... 12
Bảng 3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi 14
Bảng 3.2.2. Ảnh hưởng của KIN đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi L.
dentata in vitro sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................ 16
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của NAA và IAA tới quá trình ra rễ in vitro ở cây L.
dentata sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................. 18
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống sót của cây L. dentata in vitro
giai đoạn rèn luyện .......................................................................................... 21


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2. Cây hoa Oải hương lá xẻ (Lavandula dentate L.)............................. 4
Hình 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân ........................................ 13
Hình 3.2.1. Chồi Lavandula dentata sau 8 tuần trên môi trường MS+ BAP 0,7
mg/l .................................................................................................................. 15
Hình 3.2.2. Chồi L. dentata trên môi trường MS + BAP 0,9 mg/l có hiện
tượng thủy tinh hóa ......................................................................................... 15
Hình 3.2.3. Chồi L. dentata trên môi trường MS+ KIN ................................. 17
Hình 3.3. Rễ cây L. dentata trên môi trường MS+ NAA 0,5 mg/l sau 3 tuần
nuôi cấy ........................................................................................................... 19

Hình 3.4. Quá trình rèn luyện cây in vitro Lavandula dentata ....................... 22


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cây hoa Oải hương lá xẻ có tên khoa học là Lavandula dentata L. có nguồn
gốc từ Địa Trung Hải. Là một loài hoa đẹp và phổ biến trong ngành công nghiệp
dược liệu, nó còn được xem như thứ thảo dược của tình yêu với hoa màu tím và
mùi thơm đặc trưng. Chúng có nhiều ở quần đảo Canary, Naderia, vùng Địa Trung
Hải, Bắc Phi, Tây Nam Á, bán đảo Ả Rập, Ấn Độ,... [30].
Lavandula là một chi nhỏ thuộc các loài cây nửa bụi hoặc cây bụi thuộc
họ Bạc hà (Lamiacae) [6]. Thời kỳ ra hoa thường từ tháng 6 đến tháng 8 [29].
Rất nhiều trong số đó có chất thơm và dược tính được sử dụng rộng rãi để chiết
xuất tinh dầu. Nhu cầu tinh dầu hoa oải hương ngày càng nhiều, tinh dầu hoa
Oải hương được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm, hương liệu, dược
liệu, gia vị cho món ăn, ngoài ra còn có tác dụng trong trang trí [28].
Ở các nước ôn đới, từ lâu Lavandula đã trở thành cây trồng lưu niên có
giá trị thương mại quan trọng và thường được trồng bằng hạt hay giâm cành
bằng thân cây. Tuy nhiên, các phương pháp này thường lâu, chất lượng không
cao và không đồng đều [7], [8]. Mặc dù, cây hoa Oải hương có thể nhân giống
vô tính bằng gốc nhưng vẫn thiếu các phương pháp nhân giống vô tính đảm bảo
và chất lượng để cung cấp số lượng lớn cây cho các ngành công nghiệp sản xuất
hương liệu. Vừa để đáp ứng nhu cầu trên và vừa để khắc phục một số hạn chế
của phương pháp nhân giống bằng hạt và giâm cành. Những yếu tố khác như khí
hậu, nguồn nước, hay việc nhạy cảm với bệnh cũng có thể ảnh hưởng tới thành
phần và tính chất của tinh dầu [9].
Vì thế, sử dụng phương pháp nhân giống in vitro trong ống nghiệm trong
điều kiện môi trường có kiểm soát, sẽ tạo điều kiện cho phép nhân giống nhanh
các dòng vô tính cao cấp và cho chất chuyển hoá có giá trị trong suốt cả năm mà
không hạn chế theo mùa [5] [31]. Hơn nữa, kỹ thuật di truyền chỉ có thể kết hợp

1


với kỹ thuật nuôi cấy vô tính trong ống nghiệm [22], mới có thể cho các nhà sản
xuất hoa Oải hương cơ hội cải thiện chất lượng và số lượng của các loại tinh
dầu. Để có được sự thành công của vi nhân giống phụ thuộc vào thành phần của
môi trường dinh dưỡng, nồng độ và sự kết hợp của điều hòa sinh trưởng thực vật
[28].
Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nhân giống in vitro cây
hoa Oải hƣơng lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô”.
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng và hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa Oải hương lá xẻ
bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.
2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo vật liệu khởi đầu
- Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro
- Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
- Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu nhân giống invitro
về hoa Oải hương (Lavandula dentata L.).
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài có thể được sử dụng nghiên cứu trong nuôi cấy mô tế bào
hoa Oải hương (Lavandula dentata L.). Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả
cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả nghiên
cứu khai thác, bảo tồn các nguồn gen quý về loài hoa Oải hương.

2


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chung chi Lavandula và loài L. dentata
Tên khoa học chi Lavendula (Lavandula) bắt nguồn từ tiếng Latinh
Lavare, chúng phân bố chủ yếu ở vùng Địa Trung Hải, bán đảo Ả Rập, quần đảo
Canary, Maderia, Bắc phi, Tây Nam Á và Ấn Độ.... Ở Việt Nam, có khoảng 4
loài và một số giống lai được trồng chủ yếu ở Đà Lạt nơi có khí hậu mát mẻ và
một số ít ở Hà Nội, vì chúng là loài hoa ưa lạnh và khô, không chịu được độ ẩm
cao, nắng nóng [2].
Hiện nay, hoa Oải hương mới được trồng nhiều ở các nước ôn đới như
Tasmania, Tây Ban Nha, Ý, Anh, Trung Quốc, Asutraylia, đặc biệt là vùng
Provence ở Pháp có những cánh đồng Oải hương bạt ngàn, tít tắp [26].
Cây hoa Oải hương lá xẻ có tên khoa học là Lavandula dentata L. là loài
cây thuộc chi Oải hương (Lavandula) họ Bạc Hà (Lamiaceae Lindl. 1836), bộ
Bạc Hà (hoa Môi, Lamiales). Chi Oải hương có 39 loài, nhiều giống lai và gần
400 giống cây trồng đã có đăng ký [26].
Cây Oải hương có hai loại: Lá lớn và lá nhỏ, Lavandula dentata L. thuộc
loại lá nhỏ, nói chung giống lá nhỏ được ưa chuộng hơn trong lĩnh vực trang trí
và được sự lựa chọn từ người tiêu dùng, nhóm này cũng là đối tượng phù hợp
của nuôi cấy mô tế bào thực vật.

3


1.2. Đặc điểm sinh học của Lavandula dentata L.

Hình 1.2. Cây hoa Oải hương lá xẻ (Lavandula dentate L.)

Thân: Cây hoa Oải hương có thân nhỏ, cao từ 0,2 - 1m, cây phân thành
nhiều nhánh và mọc thành bụi. Toàn thân có lớp lông mỏng phủ ngoài.
Lá: Cây có nhiều lá, lá nhỏ, hẹp, hình dải có mép hơi gập xuống, không
có cuống, màu xanh thẫm, mọc đối xứng. Bề mặt lá cũng có lông. Đặc biệt,
Lavandula dentata L. có mép lá xẻ nên được gọi là hoa Oải hương lá xẻ.
Rễ: Rễ cây dạng chùm, ưa sống ở những nơi hơi kiềm, đất tơi xốp, toát
nước tốt.
Hoa: Hoa mọc thành chùm ở đỉnh, đối xứng hai bên, lưỡng tính, mẫu 5, đài
và tràng hợp thành ống có hai môi rõ. Hoa Oải hương có màu tím hoa cà, ống hoa
được sắp xếp liên tục vòng quanh cuống hoa. Cuống hoa dài, màu xám, có góc
cạnh. Thời kì ra hoa của cây là vào khoảng tháng 6 đến tháng 8 [33].

4


1.3. Giá trị sử dụng
Cây hoa Oải hương được sử dụng rộng rãi làm cây cảnh và sinh mật cho
ong bướm đến hút [32] và cũng có thể trồng tái tạo cho các khu rừng bị tàn phá
do hỏa hoạn [27]. Tuy nhiên, giá trị kinh tế của hoa Oải hương chủ yếu có liên
quan đến tính chất của các loại tinh dầu của chúng, đã được quy định nghiêm
ngặt theo tiêu chuẩn quốc tế ISO và được sử dụng cả trong ngành thẩm mỹ và trị
liệu. Tinh dầu Oải hương được sử dụng rộng rãi trong sản xuất xà phòng, nước
hoa, phụ gia thực phẩm và các sản phẩm khác, như các chất làm dễ chịu hay là
tác nhân kháng khuẩn [20]. Tinh dầu hoa oải hương đã được người La Mã và Hy
Lạp cổ đại sử dụng, nhưng sự xuất hiện và trở nên phổ biến của các loại chất
thay thế đã làm người ta nghĩ tới tinh dầu hoa Oải hương như một chất tự nhiên
[32].
Tinh dầu Oải hương được sinh ra từ tuyến lông trên bề mặt của lá và có
thành phần chính là các nhóm hidrocacbon không no, 50-60 trong số đó đã được
phát hiện. Linalool và linalool acetate là các nhóm hidrocacbon không no phong

phú nhất trong các giống hoa Oải hương phổ biến [29]. Thành phần tinh dầu
được xác định chủ yếu bởi kiểu gen thực vật, mặc dù điều kiện môi trường và
nuôi cấy cũng có thể gây ảnh hưởng lớn và thành phần giữa các mô khác nhau
cũng có thể thay đổi được [25]. Tinh dầu từ Lavandula lá hẹp bị chi phối bởi các
chất hóa học và các chất axetat và tinh dầu từ Lavandula lá rộng chi phối bởi
linalol, 1,8-cineole ...[29]. Các thành phần tương đối của mỗi nhóm hidrocacbon
không no trong các loại dầu thiết yếu là khác nhau giữa các loài cây.
Các đặc tính dược liệu của tinh dầu hoa Oải hương đã được xem xét bởi
Woronuk gần đây (2011). Những loại dầu này có thể được cơ thể người hấp thụ
qua ba đường: hệ hô hấp, tiếp xúc trực tiếp qua da và đường tiêu hóa [29]. Dầu
sential Es được sử dụng rộng rãi trong hương liệu và xoa bóp, có nhiều lợi ích
đã được công bố [20]. Dầu hoa Oải hương được cho là có thể kích thích ngủ và

5


được sử dụng rộng trong công nghệ phân tử nhằm xác định mùi hương và tính
chất tinh dầu [29].
Chiết suất tinh dầu hoa Oải hương cũng được sử dụng trong ngành công
nghiệp thực phẩm do có tác dụng tăng cường sức khỏe và dinh dưỡng.
Kovatcheva-Apostolova và cộng sự (2008) còn nhận thấy rằng việc bổ sung
chiết suất Lavandula vera vào gà băm nhỏ giảm quá trình oxy hóa lipid và sự
phá hủy α-tocopherol trong thịt nấu chín, chứng minh tác dụng chống sự oxy
hóa thực phẩm [15]. Chiết suất hoa Oải hương và tinh dầu phytotoxic với thuộc
tính chống côn trùng cũng có giá trị trong ngành công nghiệp hoá chất dùng
trong nông nghiệp.
1.4. Tình hình nghiên cứu Lavandula dentata L. trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.1. Tình hình nghiên cứu Lavandula dentata L. trên thế giới
Trong những năm qua, kỹ thuật nuôi cấy in vitro phát triển rất mạnh mẽ,
nuôi cấy mô tế bào thực vật đã và đang trở thành một công cụ hiệu quả của công

nghệ sinh học [27]. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro được ứng dụng rộng rãi trong việc
nhân giống vô tính cây trồng, trong cải thiện giống, bảo vệ nguồn gen, thu sinh
khối, hoặc chất quý.... Với những thành công trong nhân giống các cây trồng
khác nhau mà những khó khăn trong việc nhân giống các loài Oải hương ngoài
tự nhiên cũng đã khắc phục được bằng phương pháp nhân giống in vitro và được
áp dụng từ sớm.
Vật liệu nuôi cấy khởi đầu thường được sử dụng là hạt, đỉnh chồi, đoạn
thân hay lá. Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu đối với
Lavandula nói chung và các loài Lavandula dentata nói riêng. Ngoài ra còn
nhiều nghiên cứu tập trung đi sâu vào một số lĩnh vực như chọn tạo giống, nhân
giống, các biện pháp kỹ thuật và các biện pháp phòng trừ sâu, bệnh hại, chiết
suất tinh dầu…
Ngay từ năm 1989, Calvo và Segura đã tiến hành nuôi cấy mô loài L.

6


latifolia trên môi trường MS + BAP 8,9 µM + IAA 0,6 µM. Kết quả đã xuất
hiện 15,4 chồi/mẫu có kích thước trung bình lớn hơn 10 mm. Không dừng lại ở
đó, vẫn là loài này đến năm 1996, Calvo cộng tác với Sánchez-Gras nghiên cứu
trên môi trường đó nhưng giảm nồng độ BAP 8,88 µM và IAA 0,57 µM thì thấy
chiều cao chồi tăng lên (16 mm) còn số chồi giảm chỉ còn 6,2 [11], [18], [29].
Cùng năm 1996, Nober đã công bố kết quả nghiên cứu trên loài L.
stoechas với 5-6 chồi/mẫu có kích thước 15-20 mm trong môi trường M + Ads
[24], [28].
Những thành công trước đó đã thôi thúc Jordan và cộng sự (1998) tiến
hành nuôi cấy L. dentate bằng mô phân sinh, sử dụng chồi nách và không bổ
sung auxin. Ông thấy rằng ở môi trường cơ bản 1/2 MS tỷ lệ chồi sống là 100%
[17], [18], [28]. Đến năm 2005, Echeverrigaray và cộng sự khi nghiên cứu nuôi
cấy Lavandula dentata L. trên các loại môi trường và đã xác định được tỷ lệ

chồi sống đạt 100% ở môi trường MS + NAA 2,5 μM; số chồi trung bình/mẫu
và chiều cao chồi (mm) có số lượng tốt nhất là 18,60; 35,3 tại môi trường MS +
BAP 2,2 μM + IBA [17], [28].
Năm 1999, Andrade và cộng sự có bước tiến hơn trong nghiên cứu ảnh
hưởng của MS + TDZ (2,25 µM) tới loài L. vera. Kết quả nhân nhanh đạt được
rất tốt với 10,78 chồi/mẫu, chồi cao 20,7 mm [28].
Tiến hành trên loài khác đến năm 2002, Dias và nhóm nghiên cứu đã xác
định được môi trường tối ưu cho nhân nhanh L. viridis là ½ MS + BAP 0,67 µM
cho số lượng 11,69 chồi/mẫu và có chiều cao chồi là 44,39 mm [15]. Ngoài ra
phải kể dến công trình của Zuzarte và cộng sự năm 2010, nghiên cứu quy trình
nhân nhanh của loài L. pedunculata đã đi đến kết luận môi trường MS + BAP
1,11 µM cho chồi tốt nhất là 4,07 chồi/mẫu, có kích thước 5 mm [31].
Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc giúp các nhà nghiên cứu
và sản xuất hoa Oải hương về sau có thể kế thừa kinh nghiệm, tiết kiệm được

7


thời gian và kinh phí để đem lại hiệu quả cao trong việc nhân giống và nuôi
trồng cây hoa Oải hương trong điều kiện Việt Nam. Ngày nay, hoa Oải hương
vẫn đang và sẽ được các nhà khoa học nghiên cứu trên nhiều khía cạnh khác
nhau để đóng góp nhiều hơn tư liệu về nuôi cấy mô của loài này cũng như để
phục vụ cho sản xuất…
1.4.2. Tình hình nghiên cứu Lavandula dentata L. ở Việt Nam
Lê Tiến Thành là người đầu tiên ở nước ta bằng việc đưa những chậu hoa
Oải hương vốn ưa khí hậu vùng ôn đới ra thị trường. Nhưng bằng cách gieo hạt
và giâm cành đã cho thấy không đạt hiệu quả cao, gieo bằng hạt thì chậm lớn, độ
trưởng thành và ra hoa chậm [34].
Hiện nay mới chỉ có nghiên cứu nhân giống in vitro một số loài
Lavandula angustifolia của nhóm Đỗ Tiến Vinh, Mai Thị Phương Hoa, Lê Bảo

Ngọc (2016) sử dụng môi trường MS có bổ sung BAP (0,1 mg/l) và IAA (0,5
mg/l),...[1]. Trong đó chưa thấy có các công trình nghiên cứu về Lavandula
dentata. Các kết quả nghiên cứu còn chưa nhiều, chưa hoàn thiện và chưa đáp
ứng được nhu cầu ngày càng phong phú của con người.
Ngoài ra, đối với việc sản xuất hoa Oải hương nước ta cũng còn nhiều hạn
chế, phần đa là trồng ở Đà Nẵng và một số vườn nhỏ rải rác ở các nơi. Nguyên
nhân một phần điều kiện khí hậu không hợp, và cũng không thể kể đến là nguồn
cung cấp giống chưa nhiều. Chủ yếu trồng bằng hạt hay giâm cành nhưng hiệu
quả đạt được không cao, ngoài ra còn nhập ngoại nhưng giá thành lại khá cao
[32], [33].
Vì vậy, việc triển khai xây dựng quy trình nghiên cứu Lavandula dentata
L. là rất cần thiết vừa để đáp ứng nhu cầu thị trường, vừa bổ sung thêm tài liệu
nuôi cấy mô hoa Oải hương ở Việt Nam.

8


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là hoa Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.)
Vật liệu nghiên cứu là đốt thân cây hoa Oải hương lá xẻ (Lavandula
dentata) trưởng thành được lấy từ vườn cây ươm giống ở Đà Lạt.
2.2. Thời gian và điạ điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu từ 1/2017 đến tháng 4/2018
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, Vườn thực nghiệm
sinh học Khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
2.3.1. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: Cân kĩ thuật (Sartorius,
Đức), máy đo pH (HM30G/TOA, Đức), Nồi hấp khử trùng (HV-110/

HIRAYAMA, Nhật), Tủ lạnh Hitachi (31AG5D, Thái lan), Máy cất nước hai lần
(Hamilton, Mỹ), Buồng cấy vô trùng (AV-110/TELSTAR), Máy khuấy từ gia
nhiệt (ARE/VELP, Italia), Cân phân tích (Sartorius, Đức).
2.3.2. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồn, vỉ
xốp nuôi cấy,…
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy
- Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng cơ
bản MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 30 g/l saccharose, 7 g/l agar và
các chất điều hòa sinh trưởng: Kinetin (KIN), 6-Benzyl amino purine (BAP), αNapththalen acetic acid (α-NAA), IAA (Indolo-3-axit axetic)…
- pH môi trường: 5,8.
- Môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 117 oC trong
15 phút.
9


2.5. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo.
- Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng 2000lux.
- Quang kì: 16 giờ/ngày.
- Nhiệt độ phòng: 25 oC-27 oC.
- Độ ẩm trung bình: 74%-80%.
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại.
Gồm các thí nghiệm:
2.6.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Sử dụng đốt thân của cây trưởng thành cắt dài khoảng 1,5 cm, loại bỏ hết
lá, tránh làm tổn thương đến chồi nách. Sau đó, chúng được làm sạch bề mặt sơ
bộ bằng nước xà phòng trong 30 phút rồi rửa sạch bằng nước.
Tiếp theo là bước khử trùng thì làm trong box, lắc ở cồn 70% trong 5

phút, lắc ở Javen ở các nồng độ là 1%, 3%, 5%, 7% và 10% đều trong 10 phút.
Sau đó rửa sạch bằng nước cất, cắt bỏ hai đầu sao cho chồi dài khoảng 1cm rồi
đặt lên giấy thấm đã khử trùng. Cuối cùng là cấy lên môi trường MS (Murasige
và Skoog, 1962) có bổ sung 7 g/l agar và 30 g/l saccharose, theo dõi trong 10
tuần.
2.6.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro
a. Ảnh hƣởng của BAP đến tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro
- Sử dụng chồi in vitro 10 tuần tuổi nuôi cấy trên môi trường MS + 7 g/l
agar + 30 g/l saccharose có bổ sung riêng rẽ các nồng độ chất điều hoà sinh
trưởng BAP khác nhau: 0,0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 (mg/l).
- Theo dõi: số chồi/mẫu, số lá/chồi và chiều cao chồi (cm) sau 8 tuần nuôi
cấy.

10


b. Ảnh hƣởng của Kinetin đến tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro
- Sử dụng đoạn chồi in vitro 10 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 7 g/l
agar + 30 g/l saccharose có bổ sung riêng rẽ các chất điều hoà sinh trưởng thuộc
nhóm Kinetin (KIN): 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 (mg/l).
- Theo dõi: số chồi/mẫu, số lá/chồi và chiều cao chồi (cm) sau 8 tuần nuôi
cấy.
2.6.3. Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh
- Ảnh hưởng của NAA và IAA đến quá trình ra rễ tạo cây in vitro hoàn
chỉnh. Chồi in vitro có chiều cao 2-2,5 cm được nuôi cấy trên môi trường MS+ 7
g/l agar + 30 g/l saccharose có bổ sung NAA (0,0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l)
hoặc IAA (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l).
- Theo dõi: số rễ/mẫu, chiều dài rễ sau 4 tuần nuôi cấy và thời gian xuất
hiện rễ.
2.6.4. Rèn luyện cây Oải hƣơng in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên

Cây Lavandula dentata L. nuôi cấy mô hoàn chỉnh được đưa vào rèn
luyện thích nghi với điều kiện tự nhiên trên các giá thể đất, đất: xơ dừa tỉ lệ 1:1,
đất: trấu tỉ lệ 1:1 đã được xử lý. Sau đó, cây sống sót được đem trồng ra vườn
ươm.
2.7. Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm
Số liệu thực nghiệm được phân tích theo các tham số thống kê gồm trung
bình mẫu, độ lệch chuẩn, phân tích thống kê số liệu ANOVA 1 yếu tố và kiểm
tra sự sai khác giữa giá trị trung bình bằng phương pháp LSD của Fisher trên
phần mềm Excel 2010 [4].

11


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Bảng 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cây Oải hương lá xẻ
Dung dịch Javen

Tỷ lệ mẫu

Tỷ lệ mẫu

nhiễm (%)

sạch chết (%)

Tỷ lệ mẫu

Nồng độ

Thời gian

(%)

(phút)

1

10

83,33

16,67

0

3

10

56,67

30,00

13,33

5

10

19,05

28,57

52,38

7

10

16,67

73,33

10,00

10

10

22,85

77,15

0

sạch sống
(%)

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05

Khi sử dụng Javen làm chất khử trùng, kết quả sau 8 tuần cho thấy Javen
có tác dụng đến việc làm sạch đốt thân và chồi của Lavandula dentata L. (bảng
1), các công thức cho thấy sự ảnh hưởng rõ rệt của Javen trong việc làm sạch
mẫu. Trong đó, chồi được khử trùng ở Javen 5% cho tỷ lệ mẫu sạch sống cao
nhất là 52,38%, khi khử trùng ở nồng độ Javen cao hơn mẫu hầu như không
sống được do độ tẩy rửa quá cao, Javen thấp lại làm mẫu nhiễm nhiều hơn.
Năm 2006, Đỗ Thế Vinh và cộng sự khi nghiên cứu khả năng nảy mầm
của hạt Lavandula angustifolia có kết luận rằng nồng độ Javen 75% trong 10
phút là thích hợp nhất cho việc khử trùng hạt (tỷ lệ vô trùng 75,45%, tỷ lệ nảy
mầm 30,71%). Như vậy, Javen có ảnh hưởng nhất định đến việc khử trùng mẫu
của Lavandula. Tuy nhiên hiệu quả có khác nhau ở các loài khác nhau và vật
liệu khác nhau [1].

12


Hình 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân
a. Cây dùng vào mẫu
b. Mẫu sạch lắc ở Javen 5% sau 1 tuần
c. Mẫu xuất hiện chồi sau 3 tuần
d. Mẫu sạch sau 6 tuần

13


3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro
3.2.1. Ảnh hƣởng của BAP đến tái sinh và nhân nhanh chồi L. dentata in vitro
Bảng 3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi
L. dentata in vitro sau 8 tuần nuôi cấy

MS+ BAP (mg/l)

Số chồi/mẫu

Số lá/chồi

Kích thước chồi (cm)

ĐC

1,73 ± 0,5a

10,30 ± 1,03c

1,61 ± 0,64a

0,1

2,73 ± 0,81ab

8,60 ± 1,4bc

2,83 ± 0,69ab

0,3

4,13 ± 1,22bc

10,47 ± 0,9c

1,66 ± 0,59a

0,5

5,87 ± 2,21c

6,93 ± 1,33ab

3,17 ± 0,73b

0,7

10,13 ± 1,02d

9,67 ± 1,21c

3,28 ± 0,76b

0,9

8,27 ± 0,76d

6,00 ± 0,53a

1,95 ± 0,83a

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro hoa
Oải hương cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa. BAP kích thích sự tạo chồi cụ thể ở

BAP 0,7 mg/l cho chất lượng tốt nhất cả về số lượng chồi (10,13 chồi/mẫu), và
kích thước chồi (3,28 cm). Tuy vậy, chiều cao chồi và số lá/chồi của mẫu ĐC
cao hơn môi trường có bổ sung chất điều hòa vì khi sinh chồi nách ít sẽ tạo động
lực để nó phát triển chồi đỉnh và bản thân trong cây cũng có khả năng sản sinh
ra chất kích thích sinh trưởng.
Trong khi đó, Jordan và đồng tác giả lại cho rằng MS + BAP 8,8 μM là
thích hợp nhất cho sự tạo chồi của cây Lavandula dentata với số chồi lên đến
22,1 [18].
Mặt khác, trên các công thức có bổ sung BAP từ 0,5 mg/l trở lên chồi có
hiện tượng thủy tinh hóa xảy ra sau khoảng 4 tuần nuôi cấy, số lượng chồi tạo ra
không đáng kể. Đây là hiện tượng thường xảy ra trong công tác vi nhân giống thực
vật không ngoại trừ Oải hương. Hiện tượng này được quan sát ở L.vera (Andrade
và cộng sự, 1999), L. dentata (Echeverrigaray và cộng sự, 2005) và L. pedunculata
(Zuzarte và cộng sự, 2010) khi có mặt nồng độ cao của BAP. Điều này được lí giải

14


do điều kiện nuôi cấy (nồng độ chất điều hòa quá cao, saccharose và agar ít, lượng
nước tích lũy trong tế bào quá nhiều…) [28].

Hình 3.2.1. Chồi Lavandula dentata sau 8 tuần trên môi trường MS + BAP 0,7 mg/l

Hình 3.2.2. Chồi L. dentata trên môi trường MS + BAP 0,9 mg/l có hiện tượng thủy tinh
hóa

15


3.2.2. Ảnh hƣởng của Kinetin (KIN) đến quá trình tái sinh và nhân nhanh

chồi L. dentata in vitro
Kinetin và BAP thuộc nhóm xytokinin, Kinetin cũng được biết đến với
vai trò là chất điều hòa sinh trưởng, kích thích sự tăng chồi. Hầu như các nhà
nghiên cứu trước đó không nghiên cứu nhân nhanh hoa Oải hương trên môi
trường có bổ sung chất điều hòa Kinetin [28]. Khi tiến hành bổ sung Kinetin và
môi trường MS ở các nồng độ khác nhau cho kết quả tại bảng 3.2.2 như sau:
Bảng 3.2.2. Ảnh hưởng của KIN đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi L.
dentata in vitro sau 8 tuần nuôi cấy
MS + KIN

Số lá/chồi

Số chồi/mẫu

(mg/l)

Kích thước chồi
(cm)

ĐC

1,73 ± 0,50a

10,27 ± 1,03ab

1,61 ± 0,64ab

0,1

1,60 ± 0,60

9,67 ± 1,21a

1,75 ± 0,93bc

0,2

2,33 ± 0,61a

10,40 ± 1,00b

2,61 ± 1,19c

0,3

2,27 ± 0,70a

7,97 ± 1,36a

1,06 ± 0,49a

0,4

0,4 ±0,4

2,07 ±1,92

0,31 ± 0,30a

a

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05

16