Nghiên cứu một số đặc điểm thực vật, thu nhận và đánh giá hoạt tính sinh học của cây lá cẩm (Peristrophe bivalvis)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGÔ NGỌC SƠN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
THỰC VẬT, THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY LÁ CẨM
(Peristrophe bivalvis)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật

Hà Nội, 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGÔ NGỌC SƠN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
THỰC VẬT, THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY LÁ CẨM
(Peristrophe bivalvis)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH,

Hà Nội, 2018


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn và tri ân sâu sắc đến PGS.TS
NGUYỄN VĂN ĐÍNH, khoa SINH - KTNN trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà
Nội 2, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện đề tài này.
Tôi xin gửi lời tri ân đến Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà
Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh-KTNN, Cán bộ phòng Thí nghiệm Sinh lý
học Thực vật khoa Sinh - KTNN trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2, cùng các
bạn trong nhóm đề tài Sinh lý học Thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình , bạn bè đã luôn động viên, hỗ trợ và
đóng góp ý kiến trong quá trình tôi học tập và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin trân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Ngƣời thực hiện

Ngô Ngọc Sơn


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc
điểm thực vật, thu nhận và đánh giá hoạt tính sinh học của cây lá cẩm
(Peristrophe bivalvis)”. là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do PGS. TS.
Nguyễn Văn Đính hƣớng dẫn. Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là
trung thực và không trùng lặp với kết quả và nghiên cứu của ngƣời khác.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Ngƣời thực hiện

Ngô Ngọc Sơn


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Điểm mới, sáng tạo của đề tài ....................................................................... 2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 2
5. Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 2
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3
1. Giới thiệu về cây cẩm tím ............................................................................. 3
1.1. Đặc điểm, phân loại cây cẩm tím ............................................................... 3
1.2. Đặc điểm thực vật học................................................................................ 3
1.3. Một số kỹ thuật tách chiết màu từ lá cẩm .................................................. 4
1.4. Một số ứng dụng và đặc tính của dịch chiết lá cẩm ................................... 5
1.5. Hoạt tính chống oxi hóa và khả năng ức chế và tiêu diệt tế bào ung thƣ
của cây cẩm ....................................................................................................... 6
Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu .............................................. 8
2.1. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................ 8
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu................................................... 8
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................ 9
2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu về hình thái, giải phẫu thực vật ...................... 9
2.3.2. Phƣơng pháp thực nghiệm thu nhận sắc tố từ thân và lá cây cẩm tím ... 9
2.3.3. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm .......................................... 9
2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính qu t gốc tự do DPPH ......................... 11

2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào.................................... 12
CHƢƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 14


3.1. Đặc điểm hình thái và giải phẫu của cây cẩm tím ................................... 14
3.2. Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa, gây độc dòng tế bào ung thƣ ....... 19
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 22


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu hình thái, giải phẫu thân, cuống lá và phiến lá
cây cẩm tím ............................................................................................ 14
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính quét gốc tự do DPPH của mẫu ... 19
Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ gan ngƣời
Hep 3B và ung thƣ phổi ngƣời A549 của mẫu ...................................... 20


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của cây cẩm tím......................................... 15
Hình 3.2. Đặc điểm giải phẫu của thân, cuống lá và phiến lá của cây ..... 16
cẩm tím...................................................................................................... 16
Hình 3.3. Tách chiết, thu nhận và chứng minh đặc tính của cặn sắc tố từ
cây cẩm tím ............................................................................................... 17
Hình 3.4. Sơ đồ quy trình thu nhận chất nhuộm màu từ thân và lá cây cẩm
tím ............................................................................................................. 18


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Trong tình hình hiện nay số ngƣời bị ngộ độc thực phẩm do lạm dụng
chất màu tổng hợp ngày càng gia tăng, làm ảnh hƣởng xấu tới sức khoẻ của
con ngƣời. Vì vậy mà xu hƣớng chung của thế giới là tìm kiếm và chiết tách
các chất màu tự nhiên có thể sử dụng trong công nghiệp thực phẩm từ nguyên
liệu thực vật hoặc bán tổng hợp.
Việt Nam là nƣớc có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiều loại địa hình nên
có nguồn thực vật đa dạng, trong đó có nhiều loại cây dùng cho chất màu để
nhuộm thực phẩm: bánh, xôi, nƣớc giải khát, rƣợu...
Cây cẩm thuộc chi Peristrophe đã đƣợc ngƣời dân sử dụng để nhuộm
màu thực phẩm từ lâu, gần đây có một số nghiên cứu trên cây này đã đƣợc
tiến hành nhƣng kết quả mới chỉ dừng lại bƣớc đầu.Trong nghiên cứu này,
cây cẩm tím đƣợc thu phƣờng Xuân Hòa, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc có
các đặc điểm về hình thái và giải phẫu tƣơng tự nhƣ mô tả của tác giả Đỗ Thị
Xuyến và Nguyễn Thị Phƣơng Thảo (2007) [7].
Ngày nay xã hội càng phát triển thì nhu cầu về thực phẩm càng gia
tăng, sự gia tăng thể hiện ở cả chất và lƣợng của thức ăn. Sự ra đời của các
chất nhuộm màu nhân tạo đã tạo ra những thay đổi cho ngành công nghệ thực
phẩm. Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứu, các chất nhuộm màu tổng hợp có
gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sức khỏe của con ngƣời. Các chất nhuộm
màu có nguồn gốc tự nhiên đã đƣợc con ngƣời tìm kiếm và khai thác để thay
thế chất nhuộm màu tổng hợp.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu
một số đặc điểm thực vật, thu nhận và đánh giá hoạt tính sinh học của cây lá
cẩm (Peristrophe bivalvis)”.

1


2. Mục đích nghiên cứu

Xây dựng và hoàn chỉnh một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và thu
nhận cặn sắc tố tự nhiên từ cây cẩm tím
3. Điểm mới, sáng tạo của đề tài
Nghiên cứu này nhằm mục đích xây dựng quy trình thu nhận sản phẩm
là chất nhuộm màu (sắc tố) từ thân và lá cây cẩm tím đƣợc thu tại phƣờng
Xuân Hòa, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Mô tả một số đặc điểm sinh học của cây cẩm tím
- Thu nhận sắc tố từ thân và lá cây cẩm tím
- Đánh giá hoạt tính sinh học của cặn sắc tố từ cây cẩm tím
5. Phạm vi nghiên cứu
Các thí nghiệm về đặc điểm hình thái, giải phẫu và thu nhận cặn sắc tố tự
nhiên từ cây cẩm tím đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh lý học Thực
vật, Khoa Sinh-KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 và tại Viện Hóa
Sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học: Hoàn thiện một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và thu
nhận cặn sắc tố tự nhiên từ cây cẩm tím
Ý nghĩa thực tiễn: Tạo chất nhuộm màu có nguồn gốc tự nhiên không ảnh
hƣởng đến sức khỏe con ngƣời thay thế chất nhuộm màu tổng hợp.

2


NỘI DUNG
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Giới thiệu về cây cẩm tím
1.1. Đặc điểm, phân loại cây cẩm tím
Cây cẩm tím là một trong những loài cây thân thảo hàng năm có rất

nhiều ứng dụng nhƣ dƣợc liệu, chất nhuộm màu thực vật [6]. Các loài cây này
phân bố rất phổ biến ở nhiều quốc gia nhƣ Campuchia, Trung Quốc, Ấn Độ,
Indonesia, Lào, Malaysia, Thái Lan và Việt Nam. Chúng cũng đƣợc tìm thấy
ở dƣới những tán rừng có độ cao từ 500-1000 m so với mực nƣớc biển [11].
Thuật ngữ thực vật học của các cây này đã có nhiều thay đổi trong thời gian
qua nhƣ Justicia bivalvis (1759), Dicliptera bivalvis (L) Juss. (1807),
Justicia tinctoria Roxb (1820), Peristrophe tinctoria (Roxb) Ness (1832),
Peristrophe roxbughiana

(Schult.) Bremek (1955),

Peristrophe baphica

(Spreng) Bremek. (1957) [6], [17].
Theo điều tra, loài này gồm 4 dạng (Cẩm đỏ; 02 dạng Cẩm tím; 1 dạng
cẩm vàng), sự phân chia này dựa trên kết quả điều tra kinh nghiệm của ngƣời
dân bản địa. Theo “Danh lục các loài thực vật Việt Nam” [1], thì chi
Peristrophe Nees có 4 loài, trong đó chỉ có loài Cẩm (P. bivalvis (L.) Merr.) ở
Bắc Bộ và loài Kim loung nhuộm (P. montana (Wall.) Nees) ở Nam Bộ đƣợc
coi là cây nhuộm màu.
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy dịch chiết từ cây lá cẩm có lợi cho sức
khỏe con ngƣời [19], [20], [21]. Trong suốt thời gian dài, dịch chiết lá cẩm
chƣớng xem nhƣ là nguồn chất nhuộm màu tốt đối với thực phẩm ở Việt Nam
và nhiều nƣớc ở Châu Á [14].
1.2. Đặc điểm thực vật học

3


Cây cẩm thuộc chi Peristrophe, họ Acanthaceae. Là loài cây thân thảo

mọc phổ biến ở những vùng ẩm ƣớt. Ở nƣớc ta, cây cẩm có nhiều ở Mƣờng
Khƣơng (Lào Cai), Mộc Châu (Sơn La) và Thái Nguyên [6].
Loài Peristrophe roxburghiana là cây thân thảo dạng bụi. Nó sinh
trƣởng nhanh ở những vùng đất trũng ẩm cao. Chiều cao của cây có thể đạt từ
30-50 cm. Lá cây mọc đối, có hình dạng từ mũi mác (vuốt nhọn ở đầu tận
cùng) đến dạng ovan, dài từ 4-9 cm, rộng từ 2-4 cm. Lá của nó cũng có vị
ngọt. Hoa của chi Peristrophe đƣợc miêu tả màu tím hồng, lá bắc dạng lá,
hình trứng, bó chùm nhỏ, dài 2 cm, rộng 10-12 cm, gân lá hình tim, đỉnh lá
nhọn, có lông, cuống lá dài 3-4 cm, có 2 lá bắc, hình mũi mác dài 6 mm, rộng
1,5 mm, đài hoa xẻ 5 phần, đài hoa hình mũi mác, dài 4-6 mm, có nhiều lông,
tràng hoa hai môi, dạng ống mảnh dài 1,8 cm, có 2 môi [2], [6].
1.3. Một số kỹ thuật tách chiết màu từ lá cẩm
Sắc tố từ lá cẩm đƣợc tách chiết bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau,
phổ biến nhất là ba phƣơng pháp chính:
- Tách chiết có sử dụng sóng siêu âm
- Tách chiết có sử dụng vi sóng
- Tách chiết bằng dung môi
Tác giả Jiang HZ và cộng sự (2011a) là ngƣời sử dụng sóng siêu âm để
tách chiết chất màu từ cây cẩm và nhận thấy rằng cồn 70%, công suất siêu âm
300 W, nhiệt độ chiết 70oC trong thời gian chiết là 45 phút là tốt nhất, tỷ lệ
giữa chất rắn và lỏng thu đƣợc là 1:35 [12]. Trong khi đó, tác giả Jiang HZ
(2011b) sử dụng kỹ thuật sóng siêu ẩm để thu các sắc tố đỏ từ những loài cây
cẩm với dung môi là nƣớc và đã tìm thấy điều kiện tách chiết tối ƣu là công
suất siêu âm 400 W, tỷ lệ giữa pha rắn:lỏng là 1:35, nhiệt độ chiết là 65oC
trong thời gian chiết là 35 phút [13]. Trong một nghiên cứu khác, tác giả
Nguyễn Thị Thanh Hƣơng và Trịnh Thị Thủy (2010) đã dùng nƣớc chiết nóng

4

ở 85-90oC để chiết trong 60 phút với hai giai đoạn, giai đoạn 1 là 40 phút và
giai đoạn 2 là 20 phút để chiết sắc tố từ lá cẩm [5].
Ngoài các sắc tố kể trên, sắc tố haematochrome (sắc tố tảo, hỗn hợp của
carotenoid và các dẫn xuất của chúng) là một trong những loại sắc tố có màu
đỏ máu có mặt trong nhiều loại vi sinh vật và thực vật chẳng hạn nhƣ
Haematococcus pluvialis, Trentepohlia và Euglena cũng nhƣ có trong các
loại hồ tiêu đỏ và cây cẩm. Các nhóm nghiên cứu của tác giả Niu G và cộng
sự (2006) [15], tác giả Jiang HZ (2011) [12], [13] cũng đã thành công khi
tiến hành tách chiết từ cây cẩm bằng cách sử dụng kỹ thuật chiết kết hợp vi
sóng. Điều kiện tách chiết tốt nhất của phƣơng pháp này là công suất vi sóng
là 320 W, thời gian chiết là 75 giây, tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi là
1:20 (w/v). Đến nay, kỹ thuật này đƣợc xem nhƣ phù hợp nhất để tách chiết
sắc tố haematochromen nhanh và hiệu quả cao [12], [13].
Trong dân gian, thân và lá cây cẩm tím đƣợc ngƣời dân thu hái và nấu
lấy nƣớc, các sắc tố hòa tan trong nƣớc nấu này đƣợc sử dụng để nhuộm gạo
nếp cho ra màu tím (theo thông tin phỏng vấn ngƣời dân của nhóm nghiên
cứu).
1.4. Một số ứng dụng và đặc tính của dịch chiết lá cẩm
Ở nƣớc ta, cây cẩm đã đƣợc sử dụng nhƣ nguồn chất màu để nhuộm
thực phẩm từ rất lâu. Các chất màu này qua thời gian đƣợc sử dụng rộng rãi
trong dân gian đã khẳng định tính an toàn của chúng. Tuy nhiên, các sắc tố từ
cây cẩm gần đây mới đƣợc xem là có tiềm năng thay thế các chất nhuộm màu
tổng hợp. Trong những năm qua, các nhà khoa học thực phẩm ở Việt Nam và
Trung Quốc quan tâm tới việc nghiên cứu thu nhận các sắc tố từ cây cẩm,
trong đó nƣớc đƣợc sử dụng làm dung môi để chiết sắc tố từ cây cẩm [2].
Nhóm nghiên cứu của tác giả Jiang và cộng sự (2011b) đã thu các sắc
tố đỏ từ cây cẩm bằng kỹ thuật chiết kết hợp sóng siêu âm với dung môi là

5

cồn. Tác giả nhận thấy rằng các sắc tố từ cây cẩm có thể dễ dàng phân tán
trong nƣớc và cồn [13].
Các sắc tố chiết ra từ lá cẩm khá bền vững và cho màu đỏ cảm ở pH 11,
tuy nhiên khi pH tăng lên 12 hoặc hơn thì màu này sẽ trở thành vàng-xanh lá
cây và mất sự ổn định.
Các chất oxi hóa và vitamin C làm cho màu nhuộm từ dịch chiết từ cây
cẩm bị mờ đi. Sắc tố từ lá cẩm khá bền với nhiệt độ và ánh sáng. Một số loại
thức ăn đƣợc bổ sung axit citric và kali sorbat (dùng trong bảo quản thực
phẩm) có ảnh hƣởng rất nhỏ đến sự ổn định của sắc tố lá cẩm. Các ion kim
loại có nhiều trong thức ăn nhƣ K+, Na+, Cu2+, Mg2+, Zn2+ và Ca2+ không ảnh
hƣởng đến sự bền màu của các sắc tố này. Ngƣợc lại, các ion nhƣ Fe3+, Al3+
có thể làm mờ màu đỏ của sắc tố từ lá cẩm.
Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dịch chiết từ lá cẩm có khả năng
kháng mạnh hoạt động của vi sinh vật nhƣ Bacillus subtilis, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli [16], [20].
1.5. Hoạt tính chống oxi hóa và khả năng ức chế và tiêu diệt tế bào ung
thƣ của cây cẩm
Các chất chống oxi hoá có vai trò rất quan trọng trong việc vô hiệu hóa
các gốc tự do gây suy thoái DNA, tổn thƣơng tế bào và rối loạn thể chất và
tinh thần. Vì vậy, các chất chống oxi hóa giúp bảo vệ con ngƣời chống lại
bệnh nhiễm trùng và các bệnh thoái hoá do các gốc oxi tự do gây ra [18].
Thực vật có chứa các chất chống oxi hoá tự nhiên. Đã có nhiều công bố trƣớc
đây cho thấy flavonoid (flavones, flavanones, isoflavones, flavonols,
flavanonols, flavan-3-ols, anthocyanins và anthocyanidins) và các hợp chất
phenolic (dẫn xuất của axit benzoic nhƣ axit gallic, và dẫn xuất của axit
cinnamic nhƣ coumaric, caffeic và acid ferulic) là những nhóm chính của các

6

chất chống oxi hoá tự nhiên có thể giúp cây trồng chống lại các điều kiện bất
lợi (stress) và bệnh tật [8], [10].

7


Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu:
Cây cẩm tím (Peristrophe bivalvis) thu tại phƣờng Xuân Hòa, thị xã
Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc và sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm
trong nghiên cứu.

Hình 2.1. Cây cẩm tím trồng tại vƣờn thực nghiệm
Thời gian và địa điểm nghiên cứu:
Nghiên cứu đƣợc tiến hành chính tại Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực
vật (Khoa Sinh-KTNN, trƣờng ĐHSP Hà Nội 2), Phòng thí nghiệm Hóa lý
(Khoa Hóa học, trƣờng ĐHSP Hà Nội 2) từ tháng 9-10/2017 và tại Viện Hóa
Sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

8


Hóa chất: nghiên cứu sử dụng thuốc nhuộm carmin, dung dịch javen
(NaClO) (Trung Quốc), xanh mêtylen (Trung Quốc), nƣớc cất.
Dụng cụ: lam kính, dao cạo, lamen, ống hút, giấy lọc, đĩa petri, đĩa
đồng hồ
Thiết bị: kính lúp soi nổi (Optika), kính hiển vi (Carl Zeiss), tủ sấy

(Memmert), cân kỹ thuật (Satorious), lò vi sóng (LG), tủ lạnh (Toshiba), Thiết
bị cô quay chân không Strike 300 (Steroglass).
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu về hình thái, giải phẫu thực vật
- Quan sát và mô tả hình thái thực vật thân, lá, hoa,...
- Phƣơng pháp làm tiêu bản tạm thời để nghiên cứu cấu tạo giải phẫu [2]:
+ Chọn mẫu (thân, cuống lá, phiến lá) tƣơi đƣợc cắt ngang thành bản
mỏng bằng dao cạo.
+ Ngâm nƣớc javen 5 phút để tẩy các chất chứa trong tế bào.
+ Rửa bằng axit acetic, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất.
+ Nhuộm mẫu bằng axeto carmin trong 30 phút rồi đem rửa lại bằng
nƣớc.
+ Nhuộm mẫu bằng xanh metylen khoảng 10 giây rồi rửa bằng nƣớc
cất.
+ Đặt mẫu vào 1 giọt nƣớc trên lam kính, đậy lá kính, soi trên kính
hiển vi (Optika).
+ Chụp ảnh và đo kích thƣớc
2.3.2. Phƣơng pháp thực nghiệm thu nhận sắc tố từ thân và lá cây cẩm
tím
Chiết tách chất màu từ cây Cẩm theo “Phƣơng pháp nghiên cứu hoá
học cây thuốc” [4].
2.3.3. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

9


Gốc tự do nitric oxide (•NO) đƣợc sản sinh ở nhiều loại tế bào khác
nhau. Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào nhƣ đại thực bào, nguyên bào
sợi hay tế bào gan thƣờng đƣợc sản sinh với lƣợng lớn khi xuất hiện các đáp
ứng viêm [22].

Một phƣơng pháp đƣợc sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu
các thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite). Phản ứng này đòi hỏi rằng
nitrate (NO3) đầu tiên đƣợc giảm thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate
reductase.
Nitrite đƣợc phát hiện và phân tích bằng cách hình thành một màu hồng
đỏ khi mẫu thử có chứa NO2- với thuốc thử Griess.
Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các
thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) đƣợc thêm vào để tạo
thành màu hồng.
Phƣơng

pháp

MTT

(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

tetrazolium bromide) là một phƣơng pháp so màu, đo độ suy giảm màu để
đánh giá khả năng sống sót của tế bào [23]. Ở các tế bào sống, hệ enzym
oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải
MTT thành dạng formazan không hoà tan, màu tím đậm. Do vậy, tỉ lệ tế bào
sống sót đƣợc suy ra từ lƣợng formazan tạo thành từ MTT. Lƣợng formazan
tạo thành đƣợc hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp
thụ ở bƣớc sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm
đƣợc suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào.
Các bƣớc tiến hành:
Tế bào RAW264.7 đƣợc nuôi cấy 48 giờ trong môi trƣờng DMEM ở
37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate
(10000µg/mL). Sau đó chúng đƣợc nuôi cấy trong giếng phiến 96 với mật độ
2,5 x 105 tế bào/giếng. Tế bào đƣợc kích thích với LPS trong 24 giờ với sự có

10


mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, đƣợc pha sẵn trong
DMSO. Dịch nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử Griess. NaNO2 ở các
nồng độ khác nhau đƣợc sử dụng để xây dựng đƣờng chuẩn. Độ hấp thụ đƣợc
đo ở 570 nm. Cardamonin đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng dƣơng [24].
Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính invitro
đƣợc bổ sung dung dịch MTT (0.5mg/ml), ủ 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó
hút bỏ hết môi trƣờng trên bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan trong
isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm.
2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính qu t gốc tự do DPPH
Nguyên lý
1,1- Diphenyl 1-2 picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu
tím và có độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 517nm. Khi có mặt chất chống oxi
hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2- Diphenyl-1-1picryhydrazine (DPPH-H) có màu
vàng. Đo độ giảm hấp thụ ở bƣớc sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc
DPPH của chất chống oxi hóa.
DPPH màu tím + R꞉H  DPPH-H + R•
Các bƣớc tiến hành
Mẫu thử đƣợc pha trong DMSO. DPPH pha loãng trong MeOH với nồng
độ thích hợp. 10 μL mẫu thử đƣợc ủ với 190 μL dung dịch DPPH, ủ ở nhiệt độ
37oC trong 20 phút và đo trên máy ELISA ở bƣớc sóng 517 nm. Chất đối chứng
Ascorbic đƣợc dùng để kiểm soát độ ổn định và đánh giá hoạt tính ức chế tƣơng
đƣơng [25, 26]. Các ph p thử đƣợc lặp lại 3 lần.
Kết quả đƣợc tính theo công thức sau:
% ức chế = 100 – [(ODs) / (ODc) x 100]
- ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử
- ODc : Mật độ quang trung bình của mẫu control (không có mẫu thử, chỉ

có DPPH, coi nhƣ giá trị ức chế 0%)

11


2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
Dòng tế bào ung thƣ phổi ngƣời A549 và ung thƣ gan ngƣời Hep3B
đƣợc cung cấp bởi GS. Jeong-Hyung Lee, trƣờng ĐHQG Kangwon, Hàn
Quốc. Tế bào ung thƣ đƣợc nuôi cấy in vitro theo phƣơng pháp Mosmann và
cs [1]. Tế bào nuôi cấy ở 37oC trong môi trƣờng DMEM hoặc RPMI 1640có
bổ sung huyết thanh nhau phôi bò 10% (FBS), 100U/ml penicillin và
100mcg/ml streptomycin trong tủ nuôi cấy CO2 5% trong 48 giờ.
Các bƣớc tiến hành
Tế bào đƣợc nuôi cấy 48 giờ trong môi trƣờng DMEM hoặc RPMI 1640
ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 units/mL) và streptomycin
sulphate (100µg/mL). Sau đó chúng đƣợc nuôi cấy trong giếng phiến 96 với
thể tích là 200 µl, mật độ 2-5 x 105 tế bào/giếng (tuỳ từng loại tế bào). Sau 24
giờ, chúng đƣợc thử với hợp chất pha sẵn ở các nồng độ khác nhau trong
DMSO. Sau 72h, cho phản ứng với 0.5 mg/mL µl MTT, ủ 4h ở 37oC và 5%
CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trƣờng trên bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan
trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm. Camptothecin đƣợc sử
dụng làm đối chứng dƣơng.
Tính kết quả
Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử,
mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì đƣợc đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) đƣợc tính theo công thức:

[

Trong đó:

]

OD: mật độ quang

σ: độ lệch tiêu chuẩn

12


σ đƣợc tính theo công thức:
√

∑
̅

Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i
x ꞉: giá trị OD trung bình
n: số giếng thử lặp lại
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50% ± σ) sẽ đƣợc chọn ra cho thử
nghiệm bƣớc tiếp theo hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 5

13


CHƢƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm hình thái và giải phẫu của cây cẩm tím
Các đặc điểm hình thái, giải phẫu thân, lá cây cẩm tím thu tại phƣờng
Xuân Hòa, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc đƣợc thể hiện ở Bảng 3.1, Hình

3.1, Hình 3.2.
Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu hình thái, giải phẫu thân, cuống lá và phiến lá
cây cẩm tím
Chiều

Kích thƣớc các mô của thân (µm)

cao
thân
(cm)

Lông

Biểu

đa bào

bì

Vỏ

Libe

Gỗ

Hình Cuống
dạng

lá

lá

(cm)

Mũi
30-60 628,58 235,59 260,80 97,06 120,46 mác

14

Kích thƣớc phiến lá

Chiều Chiều Chiều
3-4

dài

rộng

dày

vuốt

(cm)

(cm)

(µm)

nhọn

7,6

3,4

112,03


Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của cây cẩm tím
a. Cành cây cẩm tím; b, c. Mặt trên và mặt dưới của lá; d. Đoạn thân mang
rễ; e, f. Hoa cây cẩm tím

15


Hình 3.2. Đặc điểm giải phẫu của thân, cuống lá và phiến lá của cây
cẩm tím
a. Lắt cắt ngang thân; b. Một góc lát cắt ngang thân (b1: lông đa bào, b2:
biểu bì; b3: vỏ; b4: libe; b5: gỗ); c. Lát cắt ngang cuống lá; d. lát cắt ngang
phiến lá
Kết quả cho thấy, cây cẩm tím có dạng thân thảo cao từ 30-60 cm, trên
thân có rễ phụ (Hình 3.1 a, d), lá rõ phiến và cuống lá, có chiều dài 3-4 cm,
phiến lá có hình mũi mác vuốt nhọn (Hình 3.1 b, c), có mạch gỗ và libe thứ
cấp, các cánh hoa dính liền thành dạng ống ở phần dƣới, phía trên chia thành
hai môi (Hình 3.1 e, f).

16


- Trong nghiên cứu này: Thân và lá cẩm tím → Đun trong nƣớc sôi →
Dịch chiết (sắc tố) → Cất quay chân không → Cặn sắc tố.

Kết quả tách chiết, thu nhận cặn sắc tố bằng phƣơng pháp cất quay
chân không và thực nghiệm chứng minh đặc tính của cặn sắc tố đƣợc thể hiện
ở Hình 3.3.

Hình 3.3. Tách chiết, thu nhận và chứng minh đặc tính của cặn sắc tố từ
cây cẩm tím
a. Thân và lá cẩm tươi; b. Đun sôi trong nước cất 2 lần trong 15 phút; c.
Nước sắc tố thu được (400 ml) có pH=6; d. Cất quay chân không nước sắc tố

17