Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu việt nam (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

BÙI VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU VIỆT NAM

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số: 9440117

Hà Nội – 2018


Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Bùi Minh Lý
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp tại Học viện Khoa học và
Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày …
tháng … năm 201….

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


1

MỞ ĐẦU
Việt Nam được quốc tế công nhận là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế
giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển,… Nằm ở trung tâm Đông Nam Á, Việt Nam có tổng
chiều dài bờ biển khoảng 3260 km làm ranh giới phía tây của biển Đông, với diện tích mặt nước rộng hơn
1.000.000 km2 là một trong những biển quan trọng nhất của thế giới, có nguồn rong biển đa dạng và phong
phú. Trên thế giới có khoảng 6.000 loài rong biển đã được xác định và chia làm 03 ngành rong chính dựa
trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophytes), rong nâu (Pheophytes) và rong đỏ (Rhodophytes). Rong
biển có vai trò quan trọng trong nguồn lợi sinh vật biển, càng ngày càng được con người khai thác, nuôi
trồng và sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm , công nghiệp... Theo các kết quả nghiên cứu thì hiện
nay Việt Nam đã phát hiện gần 1000 loài rong biển, trong đó có khoảng 143 loài rong nâu (Phaeophyta) là
nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn và dài cùng với sinh lượng lớn. Do vậy, rong nâu được coi là nguồn
nguyên liệu vô cùng quý giá của hiện tại và trong tương lai cho nông nghiệp, công nghiệp sản xuất dược liệu,
thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Trong các ngành công nghiệp sản xuất dược liệu, rong nâu được sử dụng
làm nguồn nguyên liệu chính để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide bao gồm
fucoidan, laminaran, alginate và hợp chất khác như phlorotannin, mannitol,… với khả năng ứng dụng hết
sức rộng lớn [1-6].
Trong số các polysaccharide từ rong nâu, fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do
có nhiều hoạt tính sinh học quý như chống đông tụ máu, kháng khuẩn, chống virus kể cả HIV, chống ung
thư, chống nghẽn tĩnh mạch, điều biến miễn dịch, giảm lipid máu, chống oxy hóa, hạ cholesteron, các đặc

tính chống bổ thể, chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu, tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị
trong phẫu thuật,… [6]. Fucoidan là sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu, có cấu trúc hóa học
phức tạp bởi tính đa dạng của các liên kết glycoside cũng như nhiều gốc đường đơn khác nhau liên kết với
nhau và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate cũng như các nhánh khác được sắp xếp không theo
quy luật trên mạch polymer. Thành phần cấu tạo nên fucoidan thường là bao gồm chủ yếu fucose và sulfate
cùng một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose..., đôi khi còn có axít uronic [6,7].
Nhờ vào sự đa dạng cấu trúc hóa học và sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị, sulfated
polysaccharide (fucoidan) đã được nghiên cứu mạnh và sâu. Việc giải thích làm sáng rõ chính xác cấu trúc
hóa học của fucoidan là hết sức phức tạp, fucoidan được tách ra từ rong nâu thường là hỗn hợp của nhiều cấu
trúc sulfated polysaccharides khác nhau. Fucoidan thông thường là có cấu trúc phân nhánh và chứa nhiều
monosaccharide khác nhau cũng như có nhóm sulfate và axtate [7,8]. Fucoidan từ rong nâu thuộc chi
Sargassum, Hormophysa và Turbinaria có cấu trúc hóa học phức tạp [9,10] nhưng lại rất hấp dẫn về hoạt
tính cũng như ứng dụng của chúng và sẵn có trong tự nhiên. Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm
xác định cấu trúc tinh vi của fucoidan đã được công bố, nhưng chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện
được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan [10,11,12] như liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh, vị
trí các gốc sulfate, các phân tử đường đơn khác… Cho tới nay, phần lớn các công trình nghiên cứu về hoạt
tính sinh học được tiến hành trên các sản phẩm fucoidan thô. Vì vậy, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính
sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ [12,13,14]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ
chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để bào chế dược liệu thì việc
xác định chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là điều quyết định đầu tiên và đang thu hút sự chú ý của


2

nhiều nhà khoa học trên thế giới. Chính vì vậy tôi chọn tên đề tài luận án là “Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc
và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam”.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án là:
Nghiên cứu phân lập, xác định các đặc điểm cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các
fucoidan từ một số loài rong nâu sinh trưởng ở vùng biển Việt Nam phục vụ cho việc điều tra tài nguyên hợp
chất thiên nhiên biển của Việt Nam và làm rõ bản chất hóa học của các đối tượng nghiên cứu.

Để đạt được mục tiêu trên của luận án, các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:
Nghiên cứu sàng lọc một số loài rong nâu để chọn ra các đối tượng nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như
hoạt tính sinh học của các fucoidan
Nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan chiết xuất từ một số loài rong
nâu chọn lọc.
Khảo sát mối quan hệ giữa các đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của một số fucoidan chọn lọc.
Bố cục của luận án: Luận án gồm 175 trang: Mở đầu 3 trang, Chương 1 Tổng quan 45 trang, Chương 2 Đối
tượng và phương pháp nhiên cứu 21 trang, Chương 3 Thực nghiệm 15 trang, Chương 4 Kết quả và thảo luận
79 trang, Kết luận và kiến nghị 4 trang, Danh mục các công trình đã công bố 2 trang, Tài liệu tham khảo 12
trang, có 31 bảng biểu và 64 hình ảnh.
Chương 1. TỔNG QUAN
Rong biển hay còn được gọi là tảo kích thước lớn, rong biển là thực vật bậc thấp sống tự dưỡng bằng
cách quang hợp, hình thái dạng tản. Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không
quá 1 năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn [1,4]. Tổng số loài rong biển trên thế giới được
báo cáo chủ yếu thuộc 3 ngành chính, có 900 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 1500 loài thuộc
ngành rong nâu (Phaeophyta) và 4000 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và hiện nay đã có nhiều công
trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới.
Fucoidan là một sulfated polysaccharide phân lập từ rong nâu lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913
[23]. Theo danh pháp carbohydrate, vì các polysaccharide được tạo nên bởi fucose và sulfate được đặt tên là
sulfate fucan. Sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu và động vật trên thực tế chỉ có mặt trong
ngành Da gai (echinoderms), cụ thể là cầu gai và hải sâm [10]. Nhưng ngược lại, cấu trúc của các sulfated
polysaccharide từ rong nâu phức tạp hơn nhiều trong thành phần. Ngoài fucose và sulfate, chúng còn có thể
chứa thêm các monosaccharide khác như: galactose, xylose, manose, axít glucuronic,… đồng thời có thể bị
acetyl hóa một phần. Cấu trúc hóa học chi tiết của các polymer sinh học phức tạp này trong nhiều trường hợp
còn chưa được biết đến. Sulfated polysaccharide (Fucoidan) là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu
nhờ các hoạt tính sinh học đa dạng và đặc thù của chúng như: kháng đông tụ, kháng huyết khối, kháng virut,
kháng dính, kháng tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều
biến hệ miễn dịch, ngừa thai [6]. Vì vậy, mà fucoidan trở thành một nguồn tiềm năng cho các ứng dụng làm
thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng, dược liệu,... và số các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng
vọt trong khoảng 10 năm trở lại đây [25].

3

Khi nghiên cứu tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước chúng tôi rút ra kết luận sau:
Các nghiên cứu về hàm lượng, thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của fucoidan tách chiết và phân lập
từ các loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum, Sargassum denticapum và Sargassum
binderi, chưa được nghiên cứu đầy đủ và hệ thống. Về nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính của fucoidan từ hai
loài rong nâu nghiên cứu trong luận án Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens chưa được nghiên
cứu ở trong và ngoài nước. Cấu tạo hóa học của fucoidan từ 6 loài rong nâu: Sargassum polycystum (Fsp),
Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii
(Fsw) và Tubinaria ornata (Fto), đã được nghiên cứu ở các công trình trước, tuy nhiên chưa có nghiên cứu
nào nói về mối quan hệ giữa cấu tạo mạch nhánh của fucoidan với hoạt tính gây độc tế bào. Vì vậy chúng tôi
sẽ nghiên cứu mối quan hệ giữa hình dạng, kích thước với hoạt tính sinh học của fucoidan nhánh từ 6 loài
rong trên.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là sulfated polysaccharides (fucoidan) phân lập từ một số loài
rong nâu. Rong nâu được thu thập tại các vùng biển ở vịnh Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam. Đối tượng
nghiên cứu của luận án cụ thể như sau:
Fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium (FSA) và Turbinaria decurrens (FTD), các
fucoidan này dùng để nghiên cứu cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của luận án. Hai loài rong nâu này là
đối tượng chính của luận án.
Fucoidan từ 6 loài rong nâu: Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum
oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) và Tubinaria ornata (Fto), các
fucoidan này đã được nghiên cứu cấu trúc, dùng để nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh
học.
Fucoidan từ các loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum, Sargassum denticapum
và Sargassum binderi, là đối tượng nghiên cứu về thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của fucoidan.
2.2. Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng là: Chiết tách các fucoidan từ rong nâu bằng các phương
pháp chiết tách thông thường, tham khảo các công bố trên thế giới phù hợp với đối tượng và mục đích
nghiên cứu của luận án.
Các phương pháp chính để xác định thành phần và cấu trúc của các fucoidan là kết hợp các phương
pháp sắc ký, phương pháp hóa học, phổ hiện đại (IR, NMR, MS, SAXS) và các phép thử hoạt tính sinh học.
Xác định cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách
thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường. Cấu trúc của fucoidan chiết từ rong nâu thường hết
sức phức tạp, bao gồm nhiều vấn đề như thành phần các đường đơn, các dạng đồng phân của đường, mức độ
phân nhánh và polymer hóa của chúng. Vì vậy, để xác định được cấu trúc của fucoidan cần phải phân tích,
xác định được các thông số sau: Thành phần các gốc đường và hàm lượng sulfate, vị trí nhóm sulfate trong
các gốc đường, vị trí liên kết giữa các gốc đường, trật tự sắp xếp của các gốc đường.


4

Chương 3. THỰC NGHIỆM
3.1. Thu thập và xử lý rong
Rong nâu được thu thập tại các vùng biển ở Vịnh Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam. Thời gian thu
mẫu rong nâu vào tháng 5 năm 2014. Các mẫu rong nâu được phân loại bởi TS. Lê Như Hậu (Viện Nghiên
cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang), tất cả các tiêu bản được lưu giữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Rong nâu được thu hoạch, rửa sạch
bằng nước biển để loại bỏ cát, đất, các chất bẩn khác,…Sau khi thu hoạch tiếp tục được phơi khô tự nhiên.
Mẫu rong sau khi phơi khô được cắt nhỏ trước khi đem tách chiết fucoidan.
3.2. Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu

Hình 3.3. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Sargassum aquifolium

Hình 3.4. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Turbinaria decurrens

5

Hình 3.5. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ các loài rong nâu S.polycystum (Fsp), S.mcclurei (Fsm),
S.oligocystum (Fso), S.denticarpum (Fsd), S.swatzii (Fsw) và T.ornata (Fto)

Hình 3.6. Qui trình chiết theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) [109]


6

3.3. Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan
3.3.1. Xác định hàm lượng tổng carbohydrate
3.3.2. Xác định thành phần monosaccharide
3.3.3. Xác định hàm lượng sulfate
3.3.4. Phương pháp khử sulfate
3.3.5. Xác định hàm lượng axít uronic
3.3.6. Phân tích liên kết bằng methyl hóa
3.3.7. Thủy phân tạo oligosaccharide
3.3.8. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC)
3.3.9. Phổ IR
3.3.10. Phổ NMR
3.3.11. Phổ ESI-MS/MS
3.3.12. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)
3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan
Chúng tôi sử dụng quy trình chiết tách fucoidan của Bilan và cộng sự [87] để nghiên cứu cấu trúc và
hoạt tính sinh học của fucoidan.
4.2. Hàm lượng fucoidan và một số polysaccharide tan trong nước của 06 loài rong nâu sinh trưởng ở
biển Nha Trang, thành phần hóa học của các fucoidan thu được.

Trong nội dung nghiên cứu này, 06 loài rong nâu sinh trưởng ở vịnh Nha Trang được khảo sát về
các thành phần polysaccharide tan trong nước, bao gồm fucoidan, laminaran và alginat. Hàm lượng fucoidan
được xác định bằng cách phân lập trực tiếp theo phương pháp của Bilan và cs. Hàm lượng laminaran và
alginat được xác định bằng tách chiết thông thường trong quy trình tách fucoidan.
Kết quả phân tích cho thấy:


Fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ 9.2 - 62.9% trong tất cả các mẫu fucoidan, trong đó hàm lượng
fucose cao nhất là fucoidan chiết từ rong Turbinaria decurrens (62.9%) và thấp nhất là fucoidan chiết từ
rong Sargassum aquifolium (9,2%).



Hàm lượng galactose của fucoidan chiết từ các loài rong thuộc chi Sargassum chiếm tỉ lệ tương đối cao
chỉ đứng sau hàm lượng fucose. Trong khi đó, các mẫu fucoidan chiết từ Turbinaria decurrens có hàm
lượng galactose gần bằng một nửa so với fucose.



Ngoài hai thành phần chính là fucose và galactose, tất cả các mẫu fucoidan của các loài rong nghiên cứu
đều có thêm các đường đơn khác với hàm lượng nhỏ hơn là mannose, xylose và glucose.


7



Hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng chi rong và từng loài rong khác nhau, tuy nhiên trong
cùng chi rong chúng biến đổi không nhiều. Các kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố
trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của fucoidan [6,20].



Bên cạnh thành phần là các gốc đường, trong phân tử của fucoidan còn chứa các gốc sulfate và các axít
uronic. Hàm lượng sulfate của các mẫu fucoidan khác nhau không nhiều (bảng 4.2), dao động trong
khoảng 21.9-25.6% so với lượng mẫu phân tích, trong đó lớn nhất là fucoidan của rong Sargassum
binderi (25.6%) và nhỏ nhất là fucoidan chiết từ rong Sargassum duplicatum (21.9%).
Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của fucoidan trong các loài rong khác nhau,

thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt Nam và của Brasil cũng có thành phần rất khác
nhau. Nhìn chung fucoidan của rong nâu sinh trưởng ở vùng biển ôn đới thường có thành phần đường tương
đối đơn giản, chúng hầu như chỉ có một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn khác. Trong
khi đó fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung và biển Việt Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm
galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các
gốc đường khác như rhamnose, xylose, mannose, glucose,... Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các
đường đơn của fucoidan từ các loài rong khác nhau một lần nữa khẳng định rằng điều kiện môi trường có
ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp polysaccharide của rong nâu.
4.3. Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai loài rong nâu S. binderi và S. duplicatum
Trong nội dung này, chúng tôi nghiên cứu sơ bộ một số đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai
loài rong nâu Sargassum binderi và S. duplicatum. Quá 4.trình chiết tách, hiệu suất phân lập và các thành
phần cấu tạo của các fucoidan tổng của hai loài rong nâu này được trình bày trong nội dung 4.2. của luận án.
Các kết quả được trình bày trên Bảng 4.1 và Bảng 2.
4.3.1. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum binderi
Tách phân đoạn fucoidan tổng FSB của rong nâu Sargassum binderi trên cột sắc ký trao đổi anion
DEAE-cellulose rửa giải lần lượt với các dung dịch muối NaCl 0.5M, 1M, 1.5M và 2.0M cho 04
Như vậy, các phân đoạn fucoidan của rong nâu Sargassum binderi với thành phần đường chính là
fucose và galactose cùng một lượng lớn sulfat được gọi là các galactofucan sulfat hóa. Trong khi đó fucoidan
của một số loài rong nâu khác thuộc cùng bộ Fucales sống ở vùng ôn đới như Fucus evanescens, Fucus
vesiculosus trong thành phần của chúng chỉ chứa fucose và sulfat được gọi là các fucan sulfat hóa [68,35].
Phổ 13C-NMR của phân đoạn F2 tách từ rong nâu Sargassum binderi được trình bày trên Hình 4.4.

Phổ có nhiều tín hiệu mạnh ở vùng anomeric (99.7 - 103.18 ppm) và ở vùng từ trường cao (15.40 ppm và
16.16 ppm) là tín hiệu điển hình của gốc α-L-fucopyranoside. Các tín hiệu trong vùng 67 -84 ppm là của các
nguyên tử C2 - C5 của vòng pyranoid. Các tín hiệu ở 61.5 ppm ứng với nhóm CH2OH của gốc β-Dgalactopyranose và tín hiệu ở 65.0 ppm là của nhóm CH2OR được cho là của gốc O-6-β-D-galactopyranose.
Một số tín hiệu mạnh ở 173.7 - 174.6 ppm và 20.92 ppm khẳng định sự hiện diện của nhóm O-acetyl.
Phổ 1H-NMR của F2 bao gồm một vài tín hiệu mạnh trong vùng α-anomeric (5.09 - 5.23 ppm) và vùng
trường cao (1-1.5 ppm). Trong khi đó tín hiệu trong vùng 2.0 - 2.2 ppm xác định sự hiện diện của nhóm Oacetyl.


8

Cấu trúc của fucoidan tách từ rong nâu Sargassum binderi của Malaysia đã được nghiên cứu và công
bố vào năm 2016 [84].
4.3.2. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum
Kết quả xác định thành phần hóa học (Bảng 4.4.) cho thấy 2 phân đoạn SDAuF1 và SDAuF2 đều có
đường fucose và galactose là các thành phần đường trung tính chính. Fucose của phân đoạn SDAuF2 cao
hơn (59,5 %) phân đoạn SDAuF1 (40 %), phân đoạn SDAuF2 không có sự xuất hiện của đường mannose.
Cả 2 phân đoạn không có sự xuất hiện đường glucose, phân đoạn SDAuF2 hàm lượng xylose chỉ chiếm một
lượng nhỏ.
Fucoidan tổng FSDu được phân lập từ rong nâu S. duplicatum với hiệu suất 2,28% theo phươn pháp
của Bilan và cs.. Trên phổ hồng ngoại IR chỉ ra ở hình 4.6 của FSDu xuất hiện tín hiệu hấp thụ ở 1.244 cm-1
(vùng dao động đặc trưng của liên kết S=O). Vùng tín hiệu đặc trưng cho liên kết C – O – S ở 800-845 cm-1
không được thể hiện rõ.
Giống như nhiều fucoidan chiết xuất từ rong nâu khác trên thế giới, fucoidan FSDu từ rong nâu S.
duplicatum cũng có phổ 1H-NMR rất phức tạp do có rất nhiều pic chồng chất lên nhau (Hình 4.7.). Tuy nhiên
trên phổ 1H-NMR cũng có những tín hiệu cộng hưởng đặc trưng giúp cho việc nhận biết fucoidan. Đó là các
tín hiệu xuất hiện trong vùng proton anomer (5,0 – 5,5 pm) và các tín hiệu ở vùng trường cao (1,2 - 1,5 ppm)
của nhóm CH3 của vòng α-L-Fucopyranose.
Trên phổ 1H-NMR của fucoidan từ rong nâu S. duplicatum cũng xuất hiện những tín hiệu đặc trưng
giúp ta nhận biết fucoidan. Đó là các tín hiệu ở vùng 1,2 - 1,4 ppm (nhóm methyl của fucose) và 5,1-5,3 ppm
(H-anomer của gốc →3)-α-L-Fucp(1). Các tín hiệu ở 5,3 ppm và 3,5 ppm đặc trưng cho H-1 và H-6 của

gốc β-D-galactose. Ngoài ra tín hiệu ở 2,1 - 2,3 ppm còn xác nhận sự có mặt của nhóm O-acetyl trong phân
tử của fucoidan này.
Trong một công trình nghiên cứu độc lập với luận án này, cấu trúc chính xác của fucoidan FSDu đã
được xác định bới Usoltseva và cộng sự thuộc Viện Hàn lâm khoa học Nga ở Viễn đông [113]. Theo đó
fucoidan này là một galactofucan sulfat hóa và acetyl hóa. FSDu có cấu trúc phân nhánh rất phức tạp làm
cho các phổ NMR của nó rất khó giải thích. Mạch chính của nó được cấu tạo chủ yếu bởi các gốc 4)-α-LFuc-(1 và β-D-Gal luân phiên liên kết với nhau. Mạch nhánh liên kết với O-6 của galactose và cấu tạo bởi
các gốc fucose có liên kết mạch ở O-3 và có các nhóm thế sulfat ở các vị trí O-2 và O-4. Mạch nhánh có đến
5 gốc đường hoặc có thể nhiều hơn nữa.
Kết luận chung cho các nội dung nghiên cứu 4.2. và 4.3. nhằm lựa chọn đối tượng rong nâu để nghiên
cứu sâu về cấu trúc và hoạt tính:


Kết quả phân tích fucoidan và các thành phần polysaccharid tan trong nước khác chỉ ra rằng fucoidan
của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau, các loài rong thuộc cùng một chi rong hay
trong cùng một loài rong cũng khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đường đơn. Điều này
cho thấy thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc của fucoidan vô cùng phức tạp. Tuy nhiên, fucoidan của
các loài rong trên đều có một đặc điểm chung là bên cạnh hàm lượng sulfat cao, hai đường fucose và
galactose luôn chiếm hàm lượng lớn hơn so với các gốc đường khác, với đặc điểm này chúng được gọi là
các galactofucan sulfat hóa. Theo các tài liệu đã công bố, fucoidan rong nâu nói chung và galactofucan


9

sulfat hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rất rộng và đa dạng như hoạt tính kháng ung thư,
kháng đông tụ máu, kháng vi rút,... [95].


Các fucoidan tách chiết và phân lập từ các loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum,
Sargassum denticarpum và Sargassum binderi là các fucogalactan sulfat hóa chứa nhóm este sulfat và
nhóm axít uronic, cùng các thành phần đường chính là fucose và galactose, với một lượng nhỏ các đường

đơn mannose, xylose và glucose. Cấu trúc của các fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum
và Sargassum binderi đã được nghiên cứu kỹ lưỡng [84,113].



Sau khi nghiên cứu thành phần hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu chúng tôi chọn các đại
diện của mỗi chi Sargassum, Turbinaria mỗi loài đại diện để nghiên cứu sâu về cấu trúc và hoạt tính sinh
học. Các loài đó bao gồm Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens. Các loài này cũng là loài rong
nâu tương đối phổ biến ở biển Việt Nam nói chung và vịnh Nha Trang nói riêng.



Đại diện cho chi rong nâu Turbinaria chúng tôi chọn loài rong nâu Turbinaria decurrens vì loài này
chưa có nhà khoa học nào nghiên cứu ra cấu trúc hoàn thiện của chúng.



Đại diện cho chi Sargassum chúng tôi chọn loài rong nâu Sargassum aquifolium vì loài rong nâu này
chưa từng được nghiên cứu ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Mặt khác fucoidan này có thêm một
thành phần cấu tạo là axít uronic. Điều này hứa hẹn khả năng tìm ra một dạng cấu trúc fucoidan có tính
mới cao.

4.4. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum
aquifolium.
4.4.1. Chiết xuất và làm sạch fucoidan
Tương tự như các fucoidan khác, FSA là một hỗn hợp của nhiều polysaccharid anionic khác nhau về
thành phần cấu tạo và mật độ điện tích, vì thế chúng có thể được tách ra thành các phân đoạn có tính chất
đồng nhất hơn bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion. Cụ thể FSA đã được tách thành các phân đoạn có hàm
lượng sulfate tăng dần trên cột sắc ký trao đổi anion như sau:


FSA là một hỗn hợp không đồng nhất của các polysaccharide có các đặc trưng về thành phần cấu tạo
khác nhau.



Hàm lượng sulfat của các phân đoạn tăng dần lên cùng với nồng độ của dung dịch muối rửa giải, trong
khi hàm lượng của axít uronic giảm dần đi.



Phân đoạn FSA-0.5M (4,7% tính theo FSA) có hàm lượng axít uronic và glucose cao có thể được giải
thích bởi sự hiện diện của các tạp chất trong mẫu là alginat và laminaran.



Phân đoạn chính là FSA-1.0M (21,9% tính theo FSA) có các thành phần đường đơn đặc biệt phức tạp
với sự có mặt đáng kể của fucose, galactose, xylose và mannose, ngoài ra còn thêm lượng lớn các nhóm
sulfat và axit uronic.



Phân đoạn FSA-1.5M (9,8% tính theo FSA) cấu tạo chủ yếu từ các thành phần chính là fucose, galactose
và sulfat. Các thành phần khác chỉ có hàm lượng nhỏ.


10



Phân đoạn FSA-2M (2,3% tính theo FSA) có thành phần cấu tạo đơn giản nhất, gần như chỉ gồm fucose,
galactose và sulfat. Tuy nhiên hàm lượng của nó trong FSA lại quá nhỏ.

4.4.2. Xác định cấu trúc của fucoidan
4.4.2.1. Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation)
Kết quả xác định thành phần của các sản phẩm (Bảng 4.6) cho thấy 1,0M-deS tuy còn chứa một
lượng vết sulfat, các thành phần đường đơn của nó đã tăng lên như mong đợi, tuy nhiên hàm lượng tương đối
của fucose lại giảm đi rõ rệt. Nguyên nhân có thể là do đã xảy ra phản ứng chia cắt một phần các liên kết
glycosid yếu của fucose.
Bảng 4.6. Thành phần (%) của các fucoidan tách loại sulfat 1,0M-deS và 1,5M-deS so sánh với fucoidan
mẹ của chúng (FSA-1,0M và FSA-1,5M).
Fucoidan

H%

Fuc

Xyl

Man

Glc

Gal

Axít Uronic

SO3Na

FSA-1.0M

21.9b

15.9

5.9

3.5

2.2

11.3

13.6

21.8

8.1

4.0

7.8

4.3

14.0

30.6

2.8

19.2

4.6

2.2

1.7

25.5

5.3

29.2

12.8

5.3

2.7

1.8

31.6

10.4

4.1

1.0MdeS

FSA-1.5M
1.5MdeS
b

9.8b

% của FSA

4.4.2.2. Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA
Phổ NMR cung cấp các thông tin quí giá về cấu trúc của các polysaccharid, nhưng việc áp dụng các
phương pháp của CHTHN trên các fucoidan chiết xuất từ tảo biển bị hạn chế bởi sự đa dạng của các thành
phần phân tử của chúng [7]. Thực tế chỉ có một số rất ít công bố về kết quả giải trực tiếp cấu trúc của
fucoidan tự nhiên chưa bị biến đổi bằng các kỹ thuật NMR [31]. Cách tiếp cận thực tế hơn là kết hợp các
phép phân tích CHTHN và hóa học để xác định các yếu tố cấu trúc của cả polysaccharid tự nhiên và
polysaccharid đã tách loại sulfat.
Riêng trong trường hợp FSA và các phân đoạn sắc ký trao đổi anion của nó, các phổ NMR quá phức
tạp (Hình 4.11, 4.12, 4.13 và phụ lục), không thể sử dụng trực tiếp để giải cấu trúc được. Ngay cả phân đoạn
FSA-2.0M (một galactofucan sulfat hóa) có thành phần đơn giản nhất, phổ 13C-NMR của nó cũng chỉ ra tối
thiểu là sáu tín hiệu trong vùng C-anomer 105-95 ppm cũng như cùng một số lượng các tín hiệu C-methyl
của các gốc fucose trong vùng 20-17 ppm (Hình 4.11). Kết hợp với việc các tín hiệu ứng với các nhóm
CH2OH tự do của galactose vắng mặt, các dữ kiện này cho thấy FSA-2.0M có cấu trúc phân nhánh không
có qui luật, mức độ phân nhánh rất cao, các nhóm sulfat gắn với nhiều vị trí khác nhau, các đường đơn gắn
kết với nhau theo nhiều kiểu khác nhau.
Phù hợp với dự đoán từ thành phần cấu tạo đa dạng, phổ 13C-NMR của phân đoạn FSA-1.5M còn
phức tạp hơn (Hình 4.12). Cụ thể trên phổ xuất hiện nhiều tín hiệu hơn ở vùng C-anomer. Một số tín hiệu
xuất hiện trong vùng CH2OH không thế ở 63-61 ppm.


11

Trên phổ NMR của phân đoạn FSA-1.0M (Hình 4.13) xuất hiện cụm tín hiệu ở vùng 17 ppm ứng
với nhóm methyl của các gốc fucose. Tại vùng C-anomer (110 - 95 ppm) xuất hiện rất nhiều tín hiệu với
cường độ gần tương đương nhau chứng tỏ sự có mặt của nhiều loại đường cũng như của nhiều kiểu liên kết
glycosid trong mẫu nghiên cứu. Trong phổ cũng xuất hiện tín hiệu của nhóm CH2OH của galatose không thế
trong vùng 63-61 ppm và của nhóm cacboxyl của axit uronic tại 175,6 ppm.
Phổ 1H-NMR của FSA và của tất cả các phân đoạn sắc ký đều không tách bạch, vì thế không thể áp
dụng kỹ thuật HMBC để gán đặc điểm cấu trúc cho các tín hiệu.
4.4.2.3. Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis)
Kết quả phân tích cho thấy có 3 dẫn xuất của xylose, 9 dẫn xuất của fucose và 16 dẫn xuất của
hexose (manose và galactose) đã được phát hiện. Thành phần của chúng trong các đối tượng nghiên cứu
được trình bày trên Bảng 4.7.
Bảng 4.7. Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa
Vị trí nhóm О-

Suy diễn vị trí của

FSA-1.0M ,

1.0MdeS,

FSA-

1.5MdeS,

Me trong:

nhóm thế

mol%

mol%

1.5M ,

mol%

mol%
Xyl:
2,3,4

Xylp→

3

10

2

2,4

→3Xylp→

2

-

tr.

tr.

3*

4

7

2,3(3,4)

4

Fuc:
2,3,5

Fucf→

1

1

2

1

2,3,4

Fucp→

3

14

4

7

2,3

→4(5)Fucp(f)→

6

6

3

4

3,5

→2Fucf→

-

-

3

-

2,4

→3Fucp→

6

6

3**

6

2

→3,4(5)Fucp(f)→

6

1

11

2

3

→2,4(5)Fucp(f)→

9

1

7***

-

4

→2,3Fucp→

-

3

+

-

Fuc

→2,3,4Fuc→

4

-

9

-

2,3,4,6-Man

Manp→

tr.

2

tr.

1

2,3,4,6-Gal

Galp→

1

5

2

12

3,4,6

→2Hexp→

-

5

-

-

Hex:


12

2,3,6

→4Hexp→

4

10

2

15

2,3,6

→4Hexp→

3

4

1

2

2,4,6

→3Hexp→

4

6

1

-

2,3,4

→6Hexp→

2

4

8

21

2,6

→3,4Hexp→

7

-

7

2

4,6

→2,3Hexp→

8

9

1

3

3

-

tr.

3,6+4,6
3,6

→2,4Hexp→

3

3

tr.

2

2,3

→4,6Hexp→

2

2

1

2

2,4

→3,6Hexp→

5

3

10

-

-

3,4+2,4
2

→3,4,6Hexp→

5

tr.

4

→2,3,6Hexp→

-

1

3

→2,4,6Hexp→

-

1

3
10

3(4)

9

2

-

3(4)

9

2

2

Gal

1

5

4

-

Các kết quả phân tích trình bày trên Bảng 4.7 cho thấy:


Có khá nhiều fucitol methyl hóa có nguồn gốc từ các gốc fucofuranose. Đây là điểm đặc biệt vì trước
đây chỉ có một trường hợp tìm thấy sự có mặt một lượng đáng kể của fucofuranose trong loài Chordaria
flagelliformis [8].



Các polysaccharid sulfat hóa bao gồm chủ yếu các gốc fucose thế hai, thậm chí đến ba lần. Như vậy, khi
nằm trong chuỗi mạch thẳng chúng sẽ phải gắn với một nhóm sulfat hoặc một mạch nhánh.



Các mẫu tách loại sulfat chứa nhiều gốc fucose đầu mạch không khử (terminal nonreducing residues).
Có khả năng là chúng liên kết với các đường đơn khác loại nằm trên mạch chính.



Hàm lượng mannose trong 1,5M-deS là không đáng kể. Vì vậy tất cả các hexitol methyl hóa bắt nguồn
từ các gốc galactose. Phần lớn các gốc này có gắn kết ở C-4 và C-6.



Phân đoạn fucoidan mẹ FSA-1,5M có một ít gốc galactose chỉ có gắn kết ở C-6, nhưng hầu hết số còn lại
có thêm các nhóm thế khác, có khả năng là fucose hoặc sulfat.



Phân đoạn 1,0M-deS có hàm lượng mannose và galactose không khác nhau nhiều. Điều đó làm cho việc
phân tích các dữ kiện methyl hóa của FSA-1,0M và 1,0M-deS trở nên phức tạp vì các dẫn xuất methyl
hóa của hai hexose này không thể phân biệt được bằng phương pháp phổ khối lượng.


13

4.4.2.4. Tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion
Bảng 4.8. Hiệu suất và thành phần (%) của các phân đoạn tách 1,0M-deS trên cột
sắc ký trao đổi anion so sánh với fucoidan mẹ của chúng.
Fucoidan

H%

Fuc

Xyl

Man

Glc

Gal

Axít

SO3Na

Uronic
FSA-1.0M

21.9 c

1.0MdeS

15.9

5.9

3.5

2.2

11.3

13.6

21.8

8.1

4.0

7.8

4.3

14.0

30.6

2.8

deS-1

3.1 c

5.7

15.9

5.4

8.0

30.1

2.5

n.d.

deS-2

13.8 c

15.4

12.1

2.3

3.3

38.8

7.1

2.3

deS-3

15.4 c

16.4

10.1

4.5

5.1

24.1

12.1

1.9

deS-4

34.6 c

6.7

2.4

8.4

2.9

4.2

40.9

n.d.

deS-5

13.8 c

11.4

3.7

4.4

3.1

5.3

47.0

1.5

deS-6

7.6c

7.4

2.6

4.0

2.7

3.0

51.1

1.5

c

% của 1,0MdeS

4.4.2.5. Các đặc điểm cấu trúc của deS-2 và deS-3
Các tín hiệu mạnh nhất trên vùng H-anomer của phổ 1H-NMR của phân đoạn deS-2 được tìm thấy ở
δH 5,3 (d, J = 3 Hz), 4,45, 4,47 và 4,49 ppm (d, J = 8 Hz). Các phổ COSY, TOCSY và ROESY chỉ ra rằng
các tín hiệu này lần lượt thuộc về α-Galp, β-Xylp, và β-Galp. Phổ HSQC của deS-2 (Hình 4.15) cho phép
gán các tín hiệu chính trong phổ 13C của deS-2 như trình bày trên Bảng 4.9.

Hình 4.15. Một phần của phổ HSQC của deS-2


14

Hình 4.16. Các mảnh cấu trúc của fucoidan desulfat hóa deS-2 (các gốc đường đều ở dạng pyranose)
Bảng 4.9. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-2
H-1

H-2

H-3

H-4

H-5

H-6

C-1

C-2

C-3

C-4

C-5

C-6

5.31

3.88

3.96

4.25

4.18

3.85,385

101.7

70.6

70.0

80.0

73.0

61.9

4.45

3.81

3.77

4.15

3.73

3.77,3.77

104.4

71.7

81.6

69.6

76.3

62.2

4.45

3.81

3.77

4.11

3.80

4.06,3.97

104.4

71.7

81.6

69.7

74.2

70.7

4.49

3.30

3.48

3.65

4.00,3.32

-

102.9

74.2

77.0

70.5

66.4

-

4.47

3.32

3.58

3.80

4.12,3.40

-

104.6

74.0

75.0

77.5

64.2

-

4.49

3.56

3.69

4.02

3.98

4.04,4.04

104.6

72.1

74.0

70.5

74.7

71.8

deS-2
A

B

C

4)-α-D-Gal -(1

3)- -D-Gal -(1

3,6)- -D-Gal -(1

D - -D-Xyl -(1

E

F

4)- -D -Xyl -(1

6)- -D-Gal -(1

Các dữ kiện NMR nêu trên cho phép rút ra các kết luận về một số đặc điểm cấu trúc của deS-2 như sau:


Tất cả các gốc α-Galp có vị trí liên kết ở C-4.



Gốc β-Galp có một vị trí liên kết ở C-3 hoặc C-6, hoặc 2 vị trí liên kết ở C-3 và C-6.



Còn gốc β-Xylp có vị trí liên kết ở C-4 hoặc chiếm giữ vị trí đầu mút không khử của mạch nhánh.


15

ppm

1D/6C

1А/3А

70

72

1А/5А
74

76

1E/4E

1D/4E

1B/4А

78

80

1А/3B
82

Hình 4.17. Một phần của phổ HMBC của deS-2
Cấu trúc chuỗi mạch của deS-2 được kết xuất trên cơ sở phân tích phổ HMBC (Hình 4.17). Cụ thể
trên phổ HMBC xuất hiện các tín hiệu ứng với các tương tác 1H/13C giữa các gốc đường như sau:
H-1(α-Galp, A)/C-3(β-Galp, B và C), H-1(β-Galp, B)/C-4(α-Galp, A), H-1(β-Xylp, D)/C-6(β-Galp,
C), H-1(β-Xylp, D)/C-4(β-Xylp, E), và H-1(β-Galp, F)/C-6(β-Galp, F) (thành phần thứ yếu).
Các dữ kiện nêu trên gợi ý sự có mặt của một mạch chính có cấu trúc như sau:
→4)-α-Galp- (1→3)-β-Galp-(1→
Trong cấu trúc đó, một phần gốc β-Galp được thế chỉ bởi một gốc β-Xylp hoặc bởi một chuỗi ngắn
(1→4)-β-Xylp có từ 2 gốc đường trở lên. Hàm lượng fucose và xylose của phân đoạn deS-2 là giống nhau,
nhưng những cố gắng xác định vị trí của gốc fucose bằng phương pháp phổ NMR đã không cho ra kết quả.
Các phổ NMR hai chiều của deS-2 cũng chỉ ra sự có mặt của một lượng nhỏ homopolymer của
(1→6)-β-Galp. Nó có thể là một mạch nhánh nằm bên cạnh mạch xylose và gắn với mạch chính tại C-6 của
gốc →3)-β-Galp-(1→. Nó cũng có thể là một polysaccharid riêng rẽ, không liên kết với polymer chính.
Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa của mẫu deS-2 (Bảng 4.7) xác nhận sự có mặt của một
mạch chính với các gốc Galp luân phiên liên kết với nhau tại C-4 và C-3 và mang mạch nhánh tại C-6. Hơn
nữa, chúng cũng cho thấy sự có mặt của:


Một lượng nhỏ Galp có liên kết mạch ở C-6.



Các Fuc ở cả hai dạng fucopyranose và fucofuranose và có các liên kết mạch khác nhau.



Các Xyl đầu mạch và Xyl liên kết mạch ở C-4.

Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa cho thấy mạch polysaccharid của deS-3 cho thấy deS-3

có các đặc điểm cấu trúc tương tự như deS-2. Tuy nhiên nó cũng có những điểm khác biệt như sau:


Chứa nhiều Gal liên kết ở C-4 hơn Gal liên kết ở C-3.



Các gốc Gal liên kết ở C-6 gần như hoàn toàn vắng mặt.



Gốc Xyl đầu mạch chiếm ưu thế vượt trội so với Xyl liên kết ở C-4.


16
Trước đây đã có một số công bố về các fucogalactan, ví dụ từ các loại rong nâu Undaria pinnatifida
[115,116,117] và Laminaria japonica [118,119]. Các kết quả nghiên cứu nêu trên đã làm rõ được một phần
các đặc điểm cấu trúc của các fucogalactan deS-2 và deS-3 từ S. aquifolium. Tuy nhiên, cấu trúc chính xác
của các polysaccharid phân nhánh này còn là câu hỏi cho các nghiên cứu trong tương lai.
4.4.2.6. Các đặc điểm cấu trúc của deS-4
Phổ HSQC của deS-4 được trình bày trên Hình 4.18, phổ HMBC trên Hình 4.19.

Hình 4.18. Phổ HSQC của deS-4

Hình 4.19. Một phần của phổ HMBC của deS-4
Kết quả phân tích các phổ NMR hai chiều của deS-4 theo cách tương tự như trình bày ở trên cho
thấy:


Polysaccharid chính có mạch chủ tạo thành bởi sự gắn kết luân phiên nhau của các gốc 2)-α-DManp-(1 và )4-β-D-GlcpA-(.



Khoảng một nửa số các gốc mannose có mạch nhánh ở O-3 là một gốc đường α-L-Fucp hoặc 4-β-DGlcpA với tỉ lệ 4:1.


17
Trình tự của các gốc đường đơn trong mạch chính được xác định bởi phổ HMBC căn cứ trên các
tương tác xa của các proton anomer như sau (ký hiệu xem Hình 4.19):
H-1(α-Manp, S)/C-4(β-GlcpA, R), H-1(α-Manp, U)/C-4(β-GlcpA, T), H-1(β-GlcpA, R)/C-2(αManp, U), và H-1(β-GlcpA, T)/C-2(α-Manp, S).
Vị trí của α-Fucp và β-Xylp ở O-3 của α-Manp được xác nhận bởi các tương tác tương ứng sau:
H-1(α-Fucp, V)/C-3(α-Manp, U), và H-1(β-Xylp, G)/C-3(α-Manp, U).
Các đặc điểm cấu trúc trên được xác nhận bởi kết quả phân tích các dẫn xuất metyl hóa.
Trước đây, các fucoglucuronomannan tương tự như polysaccharid chính của deS-4 đã được tìm thấy
trong nhiều loài rong nâu khác nhau. Đặc biệt, một polysaccharid từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia có
cấu trúc phân nhánh với mạch chính cấu tạo bởi các đơn vị trisaccharid lặp đi lặp lại (Các polysaccharid
tương tự có khả năng có mặt trong các loài Saccharina latissima và Laminaria bongardiana. Gần đây, có
nghiên cứu cho thấy cấu trúc gồm các mạch nhánh fucooligosaccharide ngắn nằm kề bên với mạch nhánh chỉ
có một nhóm Fucp có mặt trong một fucoglucuronomannan từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia. Còn cấu
trúc mà mạch nhánh chỉ có một gốc Xylp duy nhất như trong deS-4 của S. aquifolium là lần đầu tiên được
tìm thấy.

Hình 4.20. Mảnh cấu trúc của deS-4
Bảng 4.10. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-4
deS-4

S

Uv

UG

T

R

2)- -D-Man -(1

- -D-Man -(1

2,3)- -D-Man -(1

- -D-Gle A-(1

4)- -D-Gle A-(1

V -L-Fuc -(1

H-1

H-2

H-3

H-4

H-5

H-6

C-1

C-2

C-3

C-4

C-5

C-6

5.38

4.14

3.81

3.69

3.69

3.84,3.79

100.0

79.0

70.9

68.0

74.0

61.5

5.36

4.32

3.89

3.83

3.74

3.84,3.79

99.8

74.6

74.7

66.0

74.0

61.5

5.36

4.34

3.84

3.80

3.74

3.84,3.79

99.8

73.9

76.5

65.9

74.0

61.5

4.46

3.38

3.65

3.78

3.75

-

102.8

74.2

77.5

78.8

77.6

176.0

4.46

3.38

3.65

3.78

3.75

-

103.0

74.2

77.5

78.0

77.6

176.0

5.08

3.79

3.93

3.81

4.22

1.20

96.4

69.2

70.5

73.1

67.9

16.6

4.38

3.30

3.44

3.62

4.00,3.29

-


18

G -D-Xyl -(1

104.6

74.4

77.0

70.6

66.5

-

4.4.2.7. Các đặc điểm cấu trúc của deS-6
Phổ HSQC của deS-6 được trình bày trên Hình 4.21, phổ HMBC trên Hình 4.22.

Hình 4.21. Phổ HSQC của deS-6

Hình 4.22. Một phần của phổ HMBC của deS-6
Phân đoạn deS-6 nổi bật ở hàm lượng axít uronic cao. Phổ HSQC (Hình 4.21) cho thấy thành phần
chính của nó là một glucuronan. Nó có mạch chính là các β-D-GlcpA thế bởi một gốc β-D-Xylp hoặc α-LFucp (thứ yếu) ở vị trí C-4 và liên kết với nhau qua C-3 (Hình 4.21).
Cấu trúc của mạch chính được xác định bởi cường độ mạnh của tín hiệu tương tác của β-GlcpA H1/C-3 trên phổ HMBC (Hình 4.22). Vị trí của α-Fucp và β-Xylp ở O-4 của β-GlcpA được xác định bởi tín
hiệu có cường độ mạnh của các tương tác H-1(β-Xylp, K)/C-4(β-GlcpA, YK) và H-1(α-Fucp, H)/C-4(βGlcpA,YH) (thứ yếu). Một fucoglucuronan tương tự đã được tìm thấy với vai trò là một thành phần nhỏ
trong fucoidan chiết xuất từ rong nâu Saccharina latissima. Bên cạnh fucoglucuronan, deS-6 còn chứa một
lượng đáng kể fucoglucuronomannan, thành phần chính của phân đoạn deS-4.


19

Hình 4.23. Mảnh cấu trúc của deS-6
Bảng 4.11. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-6

4.4.2.8. Các đặc điểm cấu trúc của deS-5
Phân đoạn deS-5 về cơ bản là một hỗn hợp có tỉ lệ gần bằng 1:1 của fuco(xylo)glucuronomannan và
xylo(fuco)glucuronan, lần lượt là thành phần chính của deS-4 và deS-6.
4.4.2.9. Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn FSA-1,5M bằng phương pháp phân tích methyl

hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS
Tất cả các dữ kiện thu được cho phép ta rút ra các đặc điểm khái quát về cấu trúc như sau cho
fucoidan FSA-1,5M:


Fucoidan FSA-1,5M có hàm lượng sulfat cao (31,5%), cấu tạo chủ yếu từ α-L-fucose (19,2%) và
galatose (5,5%). Đường fucose tồn tại dưới cả hai dạng vòng pyranose và furanose. Đường galactose chỉ
có dạng pyranose.



Fucoidan FSA-1,5M có cấu trúc phân nhánh cao. Mạch chính cấu tạo chủ yếu bởi các gốc fucose liên kết
luân phiên với nhau ở vị trí O-3 và O-4. Các gốc galactose nằm ở đầu không khử và liên kết với O-3 của
fucose tạo thành các mạch nhánh.



Trong cấu trúc lõi, các nhóm sulfat chủ yếu nằm ở vị trí O-2 trên cả gốc fucose và galactose.

4.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học
4.4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào
Hoạt tính gây độc tế bào của FSA và các phân đoạn tách sắc ký của nó được thử nghiệm trên các
dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, ung thư phổi LU-1 và ung thư mô liên kết RD theo phương pháp hiện hành
của Viện nghiên cứu ung thư quốc gia USA [120,121]. Thử nghiệm sơ bộ được thực hiện ở nồng độ 100
g/ml với chứng dương là ellipticin. Hoạt tính gây độc tế bào được biểu diễn bằng tỉ lệ phần trăm các tế bào


20

sống sót khi có mặt chất thử ở nồng độ nhất định (Bảng 4.13). Các kết quả thử nghiệm cho thấy FSA-1,5M

thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng ung thư gan Hep-G2 và ung thư phổi LU-1, các giá trị IC50
tương ứng là 60,7 và 80,0 µg/mL. Còn FSA-2,0M thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng ung thư
gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD, các giá trị IC 50 tương ứng là 46,7 và 81,0 µg/mL.
Bảng 4.13. Tỉ lệ sống sót của các tế bào ung thư khi có mặt các phân đoạn fucoidan từ FSA.
TT

Nồng độ

Chất thử

Tỉ lệ tế bào sống sót CS (%)

(g/mL)

Hep-G2

LU-1

RD

1

FSA-1.5M

100

40,50,8

41,20,3

70,21,3

2

FSA-2.0M

100

29,30,5

78,250,2

40,51,3

3

Ellipticin

5

0,50,5

1,10,2

0,030,0

4.4.3.2. Hoạt tính chống khối u in vitro
Các kết quả nêu trên cho phép đưa ra kết luận rằng cả hai mẫu thử nghiệm đều có khả năng ức chế rõ
rệt sự hình thành khối u tế bào ung thư dòng Hep-G2 ở nồng độ 100 μg/ml, trong đó mẫu 2,0M thể hiện hoạt
tính mạnh hơn mẫu 1,5M. Hoạt tính ức chế này có khả năng là do tác động của các fucoidan tới quá trình

apoptosis của tế bào.
Bảng 4.14. Tác dụng của chất thử tới kích thước trung bình và mật độ của các quần thể tế bào
Nồng độ
Mẫu thử

Kích thước của quần thể tế bào

Tỷ lệ giảm mật độ

mẫu

Đường kính

Tỷ lệ giảm so với

(g/ml)

(µm)

đối chứng (%)

41,35  1,85

0

0

Đối chứng (-)

(% )

1.5M

100

31,13  1,42

24,72

22,14  1,12

2.0M

100

27,28  0,95

34,03

41,11  0,88

Đối chứng (-)

1,5M (100 g/ml)

2,0M (100 g/ml)


21
Hình 4.28. Hình ảnh dưới kính hiển vi ngược của các quần thể tế bào Hep-G2 nuôi cấy trên thạch mềm dưới

tác dụng của cácchất thử
4.4.3.3. Hoạt tính chống đông máu
Hoạt tính chống đông máu tương tự heparin của các phân đoạn FSA được xác định bằng phương
pháp APTT (activated partial thromboplastine time, phương pháp đo thời gian đông máu với thromboplastin
không có yếu tố mô và có tác nhân kích hoạt) [122]. Phép thử được tiến hành trên máy Coatron®M2 (TECO,
Đức) theo quy trình đã được thiết lập bởi công ty cung cấp máy. Các mẫu fucoidan và chứng dương là
Clexan, một heparin khối lượng phân tử thấp, được thử nghiệm ở 3 nồng độ 1, 5, và 10 µg/mL.
Kết quả trình bày trên Hình 4.29. cho thấy phân đoạn FSA-0,5M không có hoạt tính, trong khi hoạt
tính chống đông máu của các fucoidan còn lại tăng từ FSA-1,0M tới FSA-2,0M tỉ lệ thuận với mức độ sulfat
hóa. Giá trị 2APTT (được định nghĩa là nồng độ của chất thử cần thiết để kéo dài gấp đôi thời gian hình
thành cục máu đông) được xác định cho mẫu FSA-2,0M là 6.5 ± 0.4 µg/mL, cho chứng dương enoxaparin là
3.9 ± 0.4 µg/mL. Điều đó chứng tỏ, ngay cả mẫu fucoidan có mức độ sulfat hóa cao nhất là FSA-2,0M cũng

Thời gian đông tụ máu (s)

chỉ có hoạt tính chống đông máu bằng nửa enoxaparin.

Nồng độ (µg/ml)

Hình 4.29. Hoạt tính chống đông máu của các fucoidan từ S. aliqualium đo được bằng phương pháp APTT.
Tóm tắt các kết quả nghiên cứu của nội dung nghiên cứu 4.4:


Từ rong nâu Sargassum aquifolium ở vùng biển Nha Trang đã chiết xuất được một fucoidan tổng số gọi
tên là FSA với hiệu suất 3.7% tính trên nguyên liệu khô.



FSA có KLPT trung bình cao (110 kDa) và có cấu tạo phức tạp với các thành phần chính bao gồm LFucose, D-galactose, D-mannose, axit D-glucuronic, D-xylose và sulfat. Việc nghiên cứu cấu trúc của
FSA trực tiếp bằng các phương pháp phổ MS và NMR không thể thực hiện được.



FSA đã được tách thành 04 phân đoạn (ký hiệu lần lượt là FSA-0,5M, FSA-1,0M, FSA-1,5M, và FSA2,0M) có hàm lượng sulfat tăng dần bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion.



Các phân đoạn chính là FSA-1,0M và FSA-1,5M (21,0 và 9,8% từ FSA) được phân tích bằng phương
pháp methyl hóa trước và sau khi tách loại sulfat.



Sản phẩm tách loại sulfat của FSA-1,0M là 1,0M-deS được tách thành 06 phân đoạn (ký hiệu lần lượt là
deS-1 tới deS-6) có hàm lượng axit uronic tăng dần bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion. Các đặc
điểm cấu trúc của chúng được xác định bằng phép phân tích methyl hóa và bằng các dữ kiện NMR. Kết
quả đã nhận biết được 03 polysaccharid có cấu trúc cơ bản khác nhau:


22
 Polysaccharid thứ nhất có mạch chính gồm các gốc 2)-α-D-Gal-(1 và 4)-β-D-GlucA-(1
liên kết luân phiên với nhau. Khoảng một nửa gốc 2)-α-D-Gal-(1 có nhóm thế là α-L-Fucp
hoặc β-D-Xylp ở O-3.
 Polysaccharid thứ hai có mạch chính là một (13)-β-D-glucopyranuronan được thế một phần
bởi duy nhất một gốc β-D-Xylp hoặc α-L-Fucp ở O-4.
 Polysaccharid thứ ba có mạch chính là một xylo(fuco)galactan có mạch chính thẳng cấu tạo từ
các gốc 4)-α-D-Gal-(1 và 3)-α-D-Gal-(1 liên kết luân phiên với nhau. Gốc 3)-α-DGal-(1 mang nhóm thế là một gốc β-D-Xylp hoặc một mạch ngắn gồm 4)-β-D-Xylp-(1,
6)-α-D-Gal-(1 và α-L-Fuc có liên kết ở các vị trí khác nhau.
 Trong FSA các polysaccharid này mang các nhóm thế sulfat ở các vị trí khác nhau, không có qui
luật xác định.


Phân đoạn sắc ký FSA-1,5M có hàm lượng sulfat cao (31,5%), có thành phần đơn giản, cấu tạo chủ yếu
từ α-L-fucose (19,2%) và galatose (5,5%), nhưng có cấu trúc phức tạp, không trực tiếp nghiên cứu được
bằng các phổ MS và NMR. Nghiên cứu FSA-1,5M bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với
phổ ESI-MS/MS của sản phẩm thủy phân từng phần với TFA cho thấy:
 Fucoidan FSA-1,5M cấu tạo chủ yếu từ α-L-fucose (19,2%) và D-galatose (5,5%). Đường
fucose tồn tại dưới cả hai dạng vòng pyranose và furanose. Đường galactose chỉ có dạng
pyranose.
 Fucoidan FSA-1,5M có cấu trúc phân nhánh cao. Mạch chính cấu tạo chủ yếu bởi các gốc fucose
liên kết luân phiên với nhau ở vị trí O-3 và O-4. Các gốc galactose nằm ở đầu không khử và liên
kết với O-3 của fucose tạo thành các mạch nhánh.
 Trong cấu trúc lõi, các nhóm sulfat chủ yếu nằm ở vị trí O-2 trên cả gốc fucose và galactose.



Các phân đoạn fucoidan của FSA có hoạt tính chống đông máu, gây độc tế bào và chống khối u. Các
hoạt tính này tăng theo hàm lượng fucose và mức độ sulfat hóa.

4.5. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của các fucoidan phân lập từ rong nâu Turbinaria
decurrens.


Fucoidan tổng FTD được phân lập từ với hiệu suất 2,19%. FTD có KLPT trung bình là 227 kDa, có hàm
lượng sulfat là 24,3% và có các thành phần đường đơn khá đơn giản chỉ gồm chủ yếu là fucose và
galactose với tỉ lệ 1:0,5.



Đã phân lập từ FTD được 03 fucoidan là FTD-0,5N, FTD-1,0N và FTD-2,0N với các hiệu suất tương
ứng là 20, 30, và 46%.



FTD-2,0N có KLPT trung bình là 227 kDa, có hàm lượng sulfat là 34,5% và có các thành phần đường
đơn giản, chỉ gồm fucose và galactose với tỉ lệ 1:0,65.



Fucoidan FTD-2,0N có khả năng ức chế sự hình thành khối u của tế bào ung thư dòng HepG2 ở nồng
độ 100 μg/ml.


23


Các kết quả nghiên cứu phổ IR, NMR (1D và 2D) và ESI-MS/MS cho thấy FTD-2,0N là một
galactofucan tạo thành từ 2 loại đường (1→3)-α-L-Fuc với nhóm thế sulfat tại vị trí C-2 và -Dgalactose mang nhóm sulfat tại vị trí C-6. Galactose nối với fucose qua liên kết glucoside 1→4. Mảnh
cấu trúc cơ bản của FTD-2,0N được đề xuất như sau:
[→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3-)-1→]n

4.6. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của 6 fucoidan phân lập từ rong nâu Việt Nam, phân tích liên
hệ của chúng với hoạt tính gây độc tế bào


Đã chiết xuất, phân lập, xác định các thành phần cấu tạo và khối lượng phân tử trung bình của các
fucoidan từ 06 loài rong nâu của Nha Trang là: S. polycystum (Fsp), S. mcclurei (Fsm), S. oligocystum
(Fso), S. denticarpum (Fsd), S. swatzii (Fss), và T. ornata (Fto).



Hình dáng và kích thước của các mẫu fucoidan được nghiên cứu bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ.
Kết quả phân tích đồ thị Kratky của sự tán xạ tia X góc nhỏ cho thấy các mẫu fucoidan có hình dáng kiểu
que (rod-like) với các mạch nhánh cồng kềnh và mức độ phân nhánh khác nhau. Kết quả tính toán cho
các mô hình lý thuyết cho thấy các mạch nhánh có khả năng nằm kề nhau và có độ dài tới 5 gốc đường.



Kết quả phân tích đồ thị Guinier cho phép ước lượng bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang phân tử cho
mỗi mẫu fucoidan. Rgc nằm trong khoảng 0,78 - 1,51 nm đại diện cho mức độ cồng kềnh của các mạch
nhánh.



Đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên hai dòng tế bào ung thư gan Hep-G2
và ung thư mô liên kết RD. Kết quả cho thấy các mẫu đều thể hiện hoạt tính. Hai mẫu có hoạt tính cao
nhất là Fto (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 3,1 và 1,6 µg/mL) và Fsp (IC 50 đối với Hep-G2 và RD là 5,5
và 5,7 µg/mL).



Khảo sát mối liên hệ giữa hoạt tính gây độc tế bào với một số đặc điểm cấu tạo và cấu trúc của các mẫu
fucoidan sơ bộ cho thấy: a) khối lượng phân tử trung bình có tương quan rõ rệt nhất với hoạt tính gây
độc tế bào. Các mẫu có khối lượng phân tử trung bình cao nhất cũng có hoạt tính cao nhất. Các mẫu có
khối lượng phân tử trung bình thấp nhất cũng có hoạt tính thấp nhất; b) Mức độ sulfat hóa của các đường
cũng thể hiện ở một mức độ nhất định tương quan với hoạt tính gây độc tế bào. Tỉ lệ sulfat/đường cao
gắn liền với hoạt tính cao và ngược lại; c) Không thấy có biểu hiện tương quan rõ rệt giữa mức độ cồng
kềnh (độ dài) của các mạch nhánh (thể hiện qua bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang Rgc) với hoạt
tính gây độc tế bào. Các dữ kiện trên gợi ý rằng khối lượng phân tử cao và cấu trúc phân nhánh với tỉ lệ
sulfat/đường cao là các yếu tố cần thiết cho hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan.
KẾT LUẬN

Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam, chúng tôi

đã thu được kết quả như sau:
1. Đã khảo sát hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ 11 loài rong nâu thuộc hai chi Sargassum
và Turbinaria sinh trưởng ở vùng biển Nha Trang. Kết quả này cho thấy cái nhìn tổng thể hơn về
thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của fucoidan. Dựa trên các kết quả này, các fucoidan phân