Nghiên cứu phát triển phương pháp LC MS MS phân tích CHLOTETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE và TETRACYCLINE trong thực phẩm trên địa bàn thành phố hạ long

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Hoàng Thị Phƣợng

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS PHÂN TÍCH
CHLOTETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE VÀ TETRACYCLINE
TRONG THỰC PHẨM TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẠ LONG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Hoàng Thị Phƣợng
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS PHÂN TÍCH
CHLOTETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE VÀ TETRACYCLINE
TRONG THỰC PHẨM TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẠ LONG
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS Nguyễn Văn Ri

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. Tạ Thị Thảo

HÀ NỘI – 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các số liệu và kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình
nào trƣớc đó.
Hà Nội, ngày 28 tháng 2 năm 2018
Tác giả
Hoàng Thị Phƣợng


Lời cảm ơn
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới BS.CK2 Ninh
Văn Chủ – Giám đốc Trung tâm Y tế dự phòng, Sở Y tế tỉnh Quảng Ninh và TS.Vũ
Quyết Thắng -PGĐ Trung tâm Y tế dự phòng, Sở Y tế tỉnh Quảng Ninh đã tạo mọi
điều kiện và nguồn lực để tôi hoàn thành luận văn này.
Xin gửi lời trân trọng cảm tới PGS .TS. Tạ Thị Thảo cùng các thầy cô khoa
Hóa học , Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điề u kiê ̣n

, giúp đỡ tôi trong

quá trình triển khai nghiên cứu, thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và thầy cô
lớp Cao học khóa 2015- 2017 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học

tập và làm luận văn.

Hà nội, ngày 21 tháng 12 năm 2017
Học viên
Hoàng Thị Phƣợng


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1

- TỔNG QUAN ................................................................................3

1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm Tetracycline .................................................3
1.1.1. Giới thiệu chung ...........................................................................................3
1.1.2 Tính chất lý hóa của nhóm tetracycline .........................................................3
1.2. Các phƣơng pháp chuẩn bị mẫu thực phẩm phân tích tetracycline .............7
1.2.1. Phƣơng pháp chiết tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thực phẩm ................7
1.2.1.1. Phƣơng pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ lực cơ học ..................................7
1.2.1.2. Phƣơng pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ áp suất (PLE) ............................7
1.2.2. Các phƣơng pháp làm sạch dịch chiết mẫu ..................................................8
1.2.2.1. Phƣơng pháp chiết pha rắn (SPE)..........................................................8
1.2.2.2. Phƣơng pháp chiết lỏng lỏng .................................................................9
1.3.Các phƣơng pháp phân tích kháng sinh tetracycline ......................................9
1.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng ..............................................................................9
1.3.1.1. Phƣơng pháp sắc kí lỏng ghép nối detector Diode array ( LC/DAD) ...9
1.3.1.2. Phƣơng pháp sắc kí lỏng ghép nối detector huỳnh quang (LC/FL) ....10
1.3.1.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép nối detector khối phổ (LC-MS/MS) ..10
1.3.2. Phƣơng pháp điện di mao quản ..................................................................11
1.3.3. Phƣơng pháp sử dụng kit elisa ....................................................................12

CHƢƠNG 2

- THỰC NGHIỆM.........................................................................14

2.1. Hóa chất và thiết bị ..........................................................................................14
2.1.1. Hóa chất ......................................................................................................14


2.1.2. Thiết bị ........................................................................................................15
2.1.3. Dụng cụ .......................................................................................................16
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ...........................................................17
2.2.1. Nội dung .....................................................................................................17
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................17
2.2.2.1. Lấy mẫu, bảo quản mẫu.......................................................................17
2.2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu .......................................................................18
2.2.2.3. Phƣơng pháp phân tích ........................................................................19
2.2.2.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp phân tích .........................23
CHƢƠNG 3

- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................26

3.1.Tối ƣu hóa các điều kiện phân tích các tetracycline trên hệ thống sắc kí
lỏng khối phổ LC/MS-MS ......................................................................................26
3.1.1.Nghiên cứu tối ƣu hóa các thông số của detector MS/MS ..........................26
3.1.2. Tối ƣu hóa các điều kiện của sắc kí lỏng ....................................................30
3.2 Nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình xử lý mẫu....................................................33
3.2.1 Chiết tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu:..................................................33
3.2.1.1 Lựa chọn dung môi chiết chất phân tích ..............................................33
3.2.1.2 Lựa chọn pH .........................................................................................36
3.2.2.Tối ƣu hóa quá trình làm sạch mẫu..............................................................37

3.3. Các kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp .............................42
3.3.1. Giới hạn phát hiện của thiết bị ....................................................................42
3.3.2. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL) .............................................43
3.3.4. Phƣơng trình hồi qui tuyến tính ..................................................................45
3.3.5. Độ chính xác của phƣơng pháp ..................................................................49
3.3.6.Đánh giá kết quả phân tích mẫu so sánh liên phòng....................................51
3.3.7. Độ đặc hiệu/chọn lọc của phƣơng pháp ......................................................51


3.3.8. Độ ổn định của phƣơng pháp ......................................................................53
3.3.9. Độ không đảm bảo đo .................................................................................53
3.4. Phân tích mẫu thực tế ......................................................................................55
KẾT LUẬN ..............................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................65


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AOAC

Hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thống(Association of Official
Analytical Chemists)

CTC

Kháng sinh Chlotetracycline

DAD

Detetctor bán dẫn sử dụng mảng diode (DiodeArray Detector)

HPLC

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

IDL

Giới hạn phát hiện của thiết bị (Identify detection limit)

MDL

Giới hạn phát hiện (Minimum detection limit)

MQL

Giới hạn định lƣợng (Maximum quantitation limit)

MRL

Giới hạn tối đa cho phép (Maximum Residue Limit)

MS

Detectơ khối phổ (Mass Spectrometry)

OTC

Kháng sinh Oxytetracycline

PLE

Chiết lỏng hỗ trợ áp suất (Pressure liquid extraction)

R

Hiệu suất thu hồi (Recovery)

RSD

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Devitation)

SD

Độ lệch chuẩn (Standard Devitation)

TC

Kháng sinh Tetracycline

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

tR

Thời gian lƣu (Rettention time)

WHO

Tổ chức y tế thế giới (World Helth Organization)

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1Thông tin về nhóm tetracycline ....................................................................6
Bảng 2.1Thông số phân tích đƣợc cài đặt trong phần mềm phân tích của hệ MS/MS
...................................................................................................................................19
Bảng 2.2 Các điều kiện phân tích cho hệ thống sắc kí lỏng .....................................22
Bảng 3.1 Kết quả tối ƣu hóa của MS/MS .................................................................26
Bảng 3.2 Cơ chế phân mảnh cho tetracycline, oxytetracycline và chlotetracycline .27
Bảng 3.3 Chương trình Gradient dung môi đã tối ưu ...............................................30
Bảng 3.4 Độ thu hồi và lặp lại khi chiết bằng đệm McILvaine EDTA và acetonitril
...................................................................................................................................33
Bảng 3.5 Độ thu hồi và lặp lại của mẫu trắng thêm chuẩn khi chiết bằng đệm
McILvaine ở các pH 3-4-5-6 .....................................................................................36
Bảng 3.6 Hiệu suất thu hồi khi thay đổi các điều kiện chiết pha rắn SPE ................37
Bảng 3.7Tỷ số S/N đối với từng chất (TC,OTC,CTC) ở từng nồng độ chuẩn (lặp lại
10 lần) ........................................................................................................................42
Bảng 3.8 Kết quả tính S/N đối với từng chất (TC,OTC,CTC) ở từng nồng độ mẫu
thêm chuẩn ................................................................................................................43
Bảng 3.9 : Độ lặp lại, thu hồi của phƣơng pháp tại nồng độ MQL =5,0 µg/kg đối
với từng chất (TC,OTC,CTC) ...................................................................................44
Bảng 3.10 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ TC,OTC và CTC ...............45
Bảng 3.11Độ chệch các điểm chuẩn của đƣờng chuẩn xác định tetracycline ..........46
Bảng 3.12 Độ chệch các điểm chuẩn của đƣờng chuẩn xác định oxytetracycline ...47
Bảng 3.13 Độ chệch các điểm chuẩn của đƣờng chuẩn xác định chlotetracycline ..48
Bảng 3.14 Độ lặp lại, thu hồi của phƣơng pháp tại nồng độ 20 µg/kg, n=12 đối với
từng chất (TC,OTC và CTC) ....................................................................................49
Bảng 3.15 Độ lặp lại, thu hồi của phƣơng pháp tại nồng độ 50 µg/kg, n=12đối với
từng chất (TC, OTC, CTC) .......................................................................................50

Bảng 3.16 Kết quảphân tích 3 chất TC,OTC và CTC trong mẫu chuẩn so sánh ......51
Bảng 3.17 Áp suất bơm và diện tích peak so sánh giữa lần bơm đầu tiên và lần bơm
thứ 1000.....................................................................................................................53
Bảng 3.18 Tính độ không đảm bảo đo ......................................................................54
Bảng 3.19 Kết quả phân tích các mẫu thủy sản ........................................................57
Bảng 3.20 Kết quả phân tích các mẫu thịt ................................................................60


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Mô hình phƣơng pháp chiết hỗ trợ áp suất ..................................................8
Hình 1.2 Miêu tả 3 loại phản ứng Elisa ....................................................................12
Hình 3.1 Phổ khối của tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline ở nồng độ
20 ppb ........................................................................................................................28
Hình 3.2Mảnh phổ của tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline ở nồng độ
20 ppb ........................................................................................................................29
Hình 3.3 Phổ khối của chƣơng trình gradient chƣa tối ƣu ........................................31
Hình 3.4 Phổ đồ của chƣơng trình gradient đã tối ƣu ...............................................32
Hình 3.5 Kết quả chiết mẫu bằng acetonitrile ..........................................................34
Hình 3.6 Kết quả chiết mẫu bằng đệm McILvaine - EDTA .....................................35
Hình 3.7. Đƣờng chuẩn xác định tetracycline ...........................................................46
Hình 3.8 Đƣờng chuẩn xác định oxytetracycline ......................................................47
Hình 3.9 Đƣờng chuẩn xác định CTC.......................................................................48
Hình 3.10 Phổ khối TC, OTC và CTC của mẫu trắng ..............................................52
Hình 3.11 Phổ khối CTC của mẫu trắng thêm chuẩn ở 10 ppb ................................52


MỞ ĐẦU
Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đã trở thành vấn đề chung đƣợc toàn xã
hội quan tâm. Nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên quan giữa bệnh tật và thực phẩm

mất an toàn. Có rất nhiều nguyên nhân và nguy cơ, trong đó kể đến việc nuôi, trồng,
vận chuyển, chế biến và bảo quản không đúng qui trình, qui cách. Thêm vào đó là
việc cố ý tạo ra sản phẩm không an toàn của không ít các nhà kinh doanh thực phẩm
vì chạy theo lợi nhuận kinh tế.
Một trong các vấn đề nóng hiện nay chính là tồn dƣ kháng sinh trong các sản
phẩm thực phẩm. Nguyên nhân dẫn đến việc tồn dƣ kháng sinh là việc lạm dụng
kháng sinh trong chăn nuôi để phòng chống bệnh tật cho vật nuôi, kích thích sinh
trƣởng cũng nhƣ dùng làm chất bảo quản, giúp thực phẩm tƣơi lâu.
Khi ngƣời tiêu dùng sử dụng những thực phẩm chứa tồn dƣ kháng sinh vƣợt
ngƣỡng giới hạn cho phép sẽ dẫn đến hậu quả khôn lƣờng. Phản ứng xảy ra tức thời
là một số kháng sinh gây dị ứng đối với một số ngƣời, phản ứng lâu dài sẽ là sự
kháng thuốc của vi sinh vật đối với các loại kháng sinh. Trên thế giới đã có những
ca bác sĩ không thể cứu đƣợc bệnh nhân vì bệnh nhiễm khuẩn do kháng tất cả các
loại kháng sinh hiện có.
Tại Việt Nam, việc sử dụng kháng sinh trong bảo quản thực phẩm bị cấm
tuyệt đối. Theo thông tƣ 10/2016 kí ngày 1/6/2016 của Bộ Nông nghiệp và phát
triển nông thôn thì có 24 loại hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong chăn nuôi
thủy sản nhƣ Chloramphenicol, Nitrofuran, Enrofloxacin, Ciprofloxacin… và 16
loại hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh động vật trên cạn
nhƣ

Chloramphenicol, Furazolidon và

dẫn xuất của nhóm Nitrofuran,

Dimetridazole, Metronidazole, Dipterex Ciprofloxacin, Ofloxacin….Theo Bộ Nông
nghiệp và Phát triển Nông thôn (NN&PTNT), Thông tƣ 06/2016 kí ngày 31/5/2016
cũng quy định 15 loại hóa chất, kháng sinh đƣợc phép sử dụng trong thức ăn chăn
nuôi gia súc, gia cầm với mục đích kích thích sinh trƣởng, bao gồm:
Bambermycins, BMD (Bacitracin Methylnene-Disalicylate), Chlortetracyline,

Colistin sulphate, Enramycin…. nhƣng sẽ bị cấm sử dụng bắt đầu từ 31/12/2017.

1


Trong số đó, tetracycline là nhóm kháng sinh đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Hiện có
khoảng gần 10 tetracycline tự nhiên nhƣng trên thực tế chỉ sử dụng 4 loại là
chlortetracycline, tetracycline, oxytetracycline và demechlocycline dƣới dạng thuốc
và các chế phẩm bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Tại Việt Nam chỉ sử dụng phổ biến
3 loại kháng sinh Tetracycline, Oxytetracycline và Chlortetracycline.
Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “nghiên cứu phát triển phương pháp LCMS/MS phân tích chlortetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm
trên địa bàn thành phố Hạ Long” với mục tiêu là :xây dựng phƣơng pháp xác định
hàm lƣợng chlotetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm và áp
dụng để phân tích thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long.

2


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm Tetracycline
1.1.1. Giới thiệu chung
Các tetracycline đƣợc phát hiện rất sớm, từ năm 1948, là kháng sinh phổ
rộng đầu tiên ức chế hầu hết các vi khuẩn gram âm, gram dƣơng và Ricketsisa…
nên đƣợc sử dụng rộng rãi cho đến những năm 80 của thế kỉ XX, nhất là ở các nƣớc
đang phát triển. Hiện nay, các kháng sinh tự nhiên của nhóm này nhƣ tetracycline,
chlortetracycline, oxytetracycline chủ yếu đƣợc sử dụng trong chăn nuôi để điều trị
bệnh cho gia súc, gia cầm và đƣợc phối hợp bổ sung với vitamin B12 vào thức ăn
trong chăn nuôi có tác dụng kích thích tăng trọng. Các kháng sinh nhóm
tetracyclines bán tổng hợp đƣợc dùng rộng rãi hơn để điều trị các bệnh nhiễm trùng
nhƣ bệnh đau mắt hột, mắt đỏ, viêm giác mạc, viêm phế quản, viêm tiết niệu do lậu

cầu và đặc biệt để điều trị các bệnh dịch hạch [2].
Các tetracycline đều dễ bị kháng thuốc, ở Việt Nam có 92,9 % Salmonella
typhi, 41,4% H. influenza, 87,8% Klebsiella pnuemoniae kháng lại thuốc
tetracyclin… Cơ chế tác dụng của các tetracyclin là phong tỏa hoạt động của nhiều
ezym tham gia vào các quá trình trao đổi chất, ức chế quá trình tổng hợp protein của
vi khuẩn. Khi kháng thuốc: vị trí gắn của tetracycline trên ribosom bị biến đổi do đó
tetracycline không gắn đƣợc vào ribosom và mất đi tác dụng. Các đại diện tiêu biểu
cho

nhóm

bao

gồm

các

chất

sau:

Tetracycline,

Oxytetracycline,

Chlortetracycline,Minocyclin, Doxycyclin [2].
1.1.2 Tính chất lý hóa của nhóm tetracycline
Các tetracycline tồn tại dạng tinh thể màu vàng sáng, tan kém trong nƣớc, 1g
/2500 mL nƣớc, hoặc 50 mL cồn. Tan tốt trong dung dịch kiềm và axit, đặc biệt

3


không tan trong dung môi chloroform và ether. Nhóm tetracycline bền vững với axit
nên dùng để uống đƣợc nhƣng do có nhiều tác dụng phụ, đặc biệt là tạo phức canxi
bền vững làm cho răng bị ố vàng nên bị cấm dùng cho trẻ em dƣới 10 tuổi.
Tetracycline có tính chất lƣỡng tính, do trong phân tử của chúng chứa nhóm
dimethylamino có khả năng tạo muối với canxi, các nhóm hydroxyl có khả năng tạo
muối với kiềm hoặc với các ion Ca2+, Mg2+ (tạo tetracyclinate). Bên cạnh đó,
tetracycline không bền vững với các tác nhân oxy hóa ngay cả với oxy trong không
khí, bị phân hủy bởi ánh sáng.
Trong dung dịch kiềm, tetracycline dễ bị oxy hóa thành dẫn chất có màu
thẫm. Do cấu trúc hydronaphtaxenic mà tetracycline dễ bị đồng phân hóa trong
dung dịch pH từ 2,0 đến 6,0 tạo ra các epitetracycline không có tác dụng kháng
sinh. Hiện tƣợng đồng phân hóa xảy ra nhanh hơn ở tetracycline và
chlotetracycline. Trong môi trƣờng kiềm hay quá axit (pH lớn hơn 9 hay pH nhỏ
hơn 1) các tetracycline bị khử hoạt tính do tạo thành các dẫn chất anhydro và
isotetracycline.Trong môi trƣờng axit loãng, tetracycline bị mất nƣớc để tạo thành
anhydrotetracycline. Anhydrotetracycline bị phân hủy và lacton hóa tiếp tục để tạo
thành apoterramycine.

Apoterramycine
Trong môi trƣờng kiềm nhẹ, carbon vị trí 11a của tetracycline, đƣợc biến đổi
thành isotetracycline.

4


11a

Isotetracycline
Tetracycline có khuynh hƣớng hình thành phức hợp với một số chất hoá học
tại các nguyên tử oxy vòng B và C.

Phức chelate
Tetracycline tạo phức chủ yếu với Fe 3+, Fe 2+, Cu 2+, Ni 2+, Co 2+, Zn 2+,
Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+, Be 2+, Al 3+, phosphate, citrates, salicylat, p-hydroxybenzoat,
anion saccharin, caffiene, urê, thiourea, polivinylpyrolidone, albumin huyết thanh,
lipoprotein, globulins, và RNA.
Các thông tin chung về nhóm tetracycline đƣa ra trong bảng 1.1

5


Bảng 1.1Thông tin về nhóm tetracycline
Tetracycline

Oxytetracycline

Danh pháp (4S,4aS,5aS,6S,12aR)
quốc tế

Chlotetracycline

4-

(4S,4aS,5aS,6S,12aR)-

-4-(dimethylamino)-

(Dimethylamino)-

7-chloro-4-

1,6,10,11,12a-

1,4,4a,5,5a,6,11,12aoc

(dimethylamino)-

pentahydroxy-6-

tahydro-

1,6,10,11,12a-

methyl-3,12-dioxo-

3,5,6,10,12,12a

4,4a,5,5a-

hexahydroxy-6methyl- 3,12-dioxo-4,4a,5,5a-

- pentahydroxy-6-methyl-

tetrahydrotetracene-2- 1,11-dioxo-2-

tetrahydrotetracene-2-

carboxamide

carboxamide

naphthacenecaboxami
de

Công thức

C22H24N2O8

C22H24N2O9

C22H23 ClN2O8

phân tử
Công thức
cấu tạo

Hợp chất

Khối lƣợng

R1

R4

TC

Tetracycline

H

H

OTC

Oxytetracycline

H

OH

CTC

Chlotetracycline

Cl

H

444,44g/mol

460,44 g/mol

478.88 g/mol

1720 C

184,50 C

2150 C

phân tử
Nhiệt

độ

sôi

6


1.2. Các phƣơng pháp chuẩn bị mẫu thực phẩm phân tích tetracycline
1.2.1. Phƣơng pháp chiết tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thực phẩm
1.2.1.1. Phƣơng pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ lực cơ học
Chiết lỏng rắn là quá trình dung môi thẩm thấu vào nền mẫu rắn, dựa vào khả
năng hòa tan của dung môi với chất phân tích kết hợp lực lắc, rung siêu âm chất phân
tích đƣợc tách ra khỏi nền mẫu rắn hòa tan trong dung môi.
Tetracycline đƣợc chiết ra khỏi mẫu thực phẩm (thịt, thủy sản, trứng, sữa, mật ong..)
bằng dung dịch đệm McILvaine - EDTA pH 4± 0,05 theo các tiêu chuẩn của Việt Nam
[10], [11], [12], tiêu chuẩn quốc tế [18], [19]và có rất nhiều công trình nghiên cứu sử
dụng đệm này [23], [26], [41], [48], [50], [51], [56], [52], [62] cho kết quả về độ lặp lại
rất tốt, ở khoảng nồng độ từ 1 – 200 µg/kg hệ số biến thiên CV nhỏ hơn 8,9%.
Ngoài ra, sử dụng một số dung dịch chiết khác hỗn hợp Acetonitril + nƣớc để
chiết mẫu thịt [23], [47],[61], dung dịch muối succinate điều chỉnh pH 4 để chiết mẫu
trứng, sữa, thịt [23], [31] đƣa ra các két quả hệ số biến thiên CV nhỏ hơn 11,2 % đối
với khoảng nồng độ từ 20 – 1200 µg/kg. Tuy nhiên không có thông tin về hiệu suất thu
hồi của quá trình chiết mẫu của tất cả các tiêu chuẩn và công trình nghiên cứu.
1.2.1.2. Phƣơng pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ áp suất (PLE)

Dựa trên nguyên tắc nhiệt độ sôi của dung môi đƣợc tăng lên dƣới áp suất cao,
độ nhớt dung môi và sức căng bề mặt giảm, khả năng hòa tan của chất phân tích
tăng làm suy yếu liên kết giữa chất phân tích với nền mẫu. Do áp suất cao cho phép
các dung môi thâm nhập sâu hơn vào nền mẫu, tạo thuận lợi cho việc chiết các chất
phân tích ra khỏi nền mẫu, làm quá trình chiết nhanh hơn và độ thu hồi tốt hơn
(xem Hình 1.1).

7


Bơm

Dung môi

(1500-2000 psi)

Van thanh trùng

Lò

(100-1800C)

Van chiết
Van tĩnh
Bình thu

Nitrogen

Hình 1.1 Mô hình phƣơng pháp chiết hỗ trợ áp suất

Trong phƣơng pháp này, mẫu đƣợc nghiền nhỏ, trộn với tinh thể EDTA sau đó
đƣợc đƣa vào hệ thống chiết PLE, dung môi đƣợc chọn là acetonitril[43],
[69]methanol điều chỉnh pH =4 [40]. Phƣơng pháp cho hiệu suất thu hồi rất tốt
trong khoảng 95 – 99,8% với khoảng nồng độ 20 – 500 µg/kg.
1.2.2. Các phƣơng pháp làm sạch dịch chiết mẫu
1.2.2.1. Phƣơng pháp chiết pha rắn (SPE)
Chiết pha rắn là quá trình phân bố của chất phân tích giữa 2 pha, trong đó lúc
đầu chất phân tích tồn tại trong pha lỏng (pha nƣớc hoặc pha hữu cơ) còn chất chiết
(pha tĩnh) ở dạng rắn, là các hạt silica trung tính, nhôm oxit, hay hạt sislica bị ankyl
hóa nhóm -OH bằng nhóm carbon mạch thẳng - C2, -C4, -C8, -C18… hay nhân
phenyl.. Khi xử lý mẫu, dịch chiết đƣợc đƣa lên cột chiết SPE, nhóm chất cần phân
tích đƣợc giữ lại trên cột, các chất khác không tƣơng tác đi ra khỏi cột cùng dung
môi. Chất phân tích đƣợc rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi thích hợp
Các phƣơng pháp tiêu chuẩn của Việt Nam[10], [11], [12], tiêu chuẩn quốc tế
[18], [19] sử dụng cột chiết SPE C18 để làm sạch tạp chất sau khi chất phân tích đƣợc
chiết ra khỏi nền mẫu. Bên cạnh đó, có một số công trình nghiên cứu đã đƣợc công bố

8


cũng sử dụng cột chiết SPE C18 [23],[47],[51],[56],[57],[58],[62], [67] phù hợp với
hầu hết các nền mẫu thực phẩm.
Ngoài ra có một số công trình khác sử dụng loại cột SPE OASIS ( HLB) cũng
cho hiệu quả làm sạch rất tốt [22][25] ,[26],[31],[39],[71], đặc biệt phù hợp với nền
mẫu có tính phân cực cao nhƣ mật ong.
1.2.2.2. Phƣơng pháp chiết lỏng lỏng
Dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích vào 2 pha dung môi không trộn lẫn,
hệ số phân bố Kd là yếu tố quyết định đến hiệu quả của quá trình chiết, bên cạnh đó
nhiệt độ, pH cũng rất quan trọng đối với quá trình chiết.
Chất phân tích sau khi đƣợc chiết rắn lỏng ra khỏi nền mẫu, đƣợc làm sạch bằng

phƣơng pháp chiết lỏng lỏng, mục đích chủ yếu là loại bỏ các tạp chất không tan
trong dung môi hữu cơ. Các dung môi chiết sử dụng là n.hexane, chloroform [32]
và acetonitrile [42], hỗn hợp methanol+diclomethan [41]. Phƣơng pháp này rất hiệu
quả đối với những nền mẫu nhiều chất béo, tuy nhiên hiệu suất thu hồi không cao
trong khoảng 75 – 82%.
1.3.Các phƣơng pháp phân tích kháng sinh tetracycline
1.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng
Nguyên tắc: Dựa vào ái lực của 2 pha rắn và lỏng đối với chất phân tích mà
xảy ra quá trình hấp thụ và nhả hấp liên tiếp giữa pha rắn và pha lỏng trên các đĩa lý
thuyết mà các chất phân tích đƣợc tách ra khỏi nhau và tách ra khỏi nền mẫu.
Trong phƣơng pháp này, sử dụng 3 loại detector để phát hiện Tetracycline.
1.3.1.1. Phƣơng pháp sắc kí lỏng ghép nối detector Diode array ( LC/DAD)
Tetracycline giống nhƣ các hợp chấy hữu cơ khác, trong phân tử chứa các
vòng thơm, các nối đôi và nối đôi liên hợp, chứa các nhóm chức nhƣ nhóm amin,
halogen, OH… do vậy chúng có khả năng hấp thụ bƣớc sóng vùng UV- Vis sử dụng
detector DAD để phát hiện các chất nhóm tetracycline.

9


Tiêu chuẩn Việt Nam [10], [11], [12] và một số công trình nghiên cứu [39],
[51], [62], sử dụng cột C18 để tách chất, hệ dung môi pha động là acetonitril và axit
oxalic 0,01M. Bƣớc sóng hấp phụ chọn là 360 nm.
Theo tiêu chuẩn quốc tế [18], [19] và một số nghiên cứu [30], [44], [56], [66],
[69] sử dụng cột C18 để tách chất, hệ dung môi pha động là acetonitrile, methanol
và axit oxalic 0,01M. Bƣớc sóng hấp phụ chọn là 350 nm.
Các kết quả công bố hiệu suất thu hồi tốt trong khoảng (80 – 95%) tuy nhiên
giới hạn phát hiện của phƣơng pháp khá cao khoảng 20 µg/kg.
1.3.1.2. Phƣơng pháp sắc kí lỏng ghép nối detector huỳnh quang (LC/FL)
Các tetracycline có khả năng phát huỳnh quang khi đƣợc kích thích bởi sóng

điện từ có bƣớc sóng phù hợp. Vì vậy sử dụng detector huỳnh quang để phát hiện
tetracycline cho kết quả rất đặc hiệu. Một số công trình nghiên cứu sử dụng cột
tách C8,pha động là methanol+nƣớc, bƣớc sóng kích thích 370 /390nm, bƣớc sóng
huỳnh quang 450/512nm [22], [51]. Các kết quả công bố hiệu suất thu hồi của
phƣơng pháp rất tốt trong khoảng 87 – 95 %, giới hạn phát hiện khoảng 5 µg/kg.
1.3.1.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép nối detector khối phổ (LC-MS/MS)
Trong phép đo khối phổ, chất phân tích đƣợc ion hóa mềm trong buồng ion
hóa tạo ra mảnh ion phân tử, qua tứ cực Q1 lọc và chọn mảnh khối, đƣợc phân
mảnh tạo ra các ion con qua bát cực Q2, lọc và chọn mảnh khối phù hợp qua tứ cực
Q3. Theo yêu cầu của EC/657/2002 [20] để xác nhận một chất trong phƣơng pháp
sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS cần xác định đƣợc một ion mẹ và 2 ion con đặc
trƣng cho chất phân tích và mảnh ion con có cƣờng độ cao nhất đƣợc dung để định
lƣợng chất phân tích.
Tetracycline đƣợc xác định rất tốt bằng phƣơng pháp phân tích LC-MS/MS,
sử dụng cột C18 và pha động bao gồm Methanol chứa 0,1% axit formic và nƣớc cất
deion chứa 0,1% axit formic [23], [34], [48], [52], [58], [68] và pha động gồm
acetonitril chứa 0,1% axit formic và nƣớc cất deion chứa 0,1% axit formic [24],

10


[28], [50], [60], [61]. Phƣơng pháp phân tích này cho hiệu suất thu hồi tốt 78 –
103% với khoảng nồng độ từ 5- 100 µg/kg, giới hạn phát hiện thấp khoảng 1 µg/kg,
đặc biệt có thể phân biệt các đồng phân quang học dạng epi của nhóm TCs khi sử
dụng hệ dung dịch pha động phù hợp.
1.3.2. Phƣơng pháp điện di mao quản
Nguyên tắc: Phƣơng pháp dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất
tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đƣờng kính 25 - 100 µm ID)
trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dƣới tác dụng
của một từ trƣờng điện E nhất định đƣợc cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều

( 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách đƣợc thực
hiện trong mao quản nhờ lực từ điện trƣờng E điều khiển sự tách của các chất. Việc
dùng cột mao quản có nhiều ƣu việt, nhƣ tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ
cho sự tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao
Kĩ thuật điện di mao quản mới đƣợc phát triển những năm trở lại đây, có thời
gian phân tích nhanh, tốn ít dung môi và hóa chất. Việc xác định kháng sinh
tetracycline trong thực phẩm hiện nay vẫn đang đƣợc nghiên cứu và có khả năng
ứng dụng cao. Hơn nữa phƣơng pháp này vận hành đơn giản, có tính ứng dụng cao
khi mang ra hiện trƣờng
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là: thời gian di chuyển của mẫu giữa các lần
phân tích không giống nhau, do vậy tính ổn định của phƣơng pháp chƣa cao hay độ
lặp lại kém. Những năm gần đây ngƣời ta đã cố gắng khắc phục và hoàn thiện dần
những nhƣợc điểm của phƣơng pháp này.
Theo nghiên cứu [41], detector UV đƣợc kết nối với hệ thống điện di, ống mao
quản có chiều dài 57 cm và đƣờng kính 75µm, sử dụng phƣơng pháp tiêm mẫu thủy
động với áp suất 3,45kPa. Nhiệt độ cột mao quản duy trì ở 220C, điện thế đặt là
20kV. Dung dịch điện giải có thành phần acid Boric 20mM, monosodium
phosphate 10 mM và điều chỉnh pH=2,7 bằng acid phosphoric đặc.

11


1.3.3. Phƣơng pháp sử dụng kit elisa
Phƣơng pháp Elisa (Enzym linked immunosorbent assay) là kĩ thuật thực hiện
trên đĩa 96 giếng hoặc 384 giếng để phát hiện và định lƣợng peptide, protein, kháng
thể và các phân tử sinh học. Nguyên tắc của phƣơng pháp là một kháng nguyên
đƣợc cố định trên bề mặt đĩa sẽ tạo phức với kháng thể đặc hiệu liên kết với một
enzym. Phân tích kết quả bằng tín hiệu phát ra khi cơ chất enzym đƣợc giải phóng
và phát tín hiệu huỳnh quang.
Các phƣơng pháp Elisa chủ yếu gồm 3 loại Elisa trực tiếp, Elisa gián tiếp và

phƣơng pháp Elisa “Sandwich” Hình 1.2 mô tả 3 phƣơng pháp.

Hình 1.2 Miêu tả 3 loại phản ứng Elisa
Phương pháp Elisa trực tiếp: Sử dụng một kháng thể có gắn cơ chất enzym
sẽ liên kết trực tiếp với kháng nguyên trên bề mặt đĩa phản ứng. Khi phản ứng bắt
cặp xảy ra sẽ giải phóng cơ chất phát tín hiệu huỳnh quang
Phương pháp Elisa gián tiếp: Một kháng thể thứ cấp sẽ đƣợc bổ sung và bắt
cặp đặc hiệu với kháng thể sơ cấp đã bắt cặp với kháng nguyên. Kháng thể sơ cấp
có gắn cơ chất sẽ phát tín hiệu khuếch đại khi xảy ra phản ứng bắt cặp kháng
nguyên với kháng thể đặc hiệu
Phương pháp Elisa “Sandwich”: Một kháng thể gắn sẽ đƣợc sử dụng để gắn
kháng thể sơ cấp, tiếp theo kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất enzym đƣợc bổ sung
để bắt cặp với kháng thể thứ cấp trong phản ứng. Tín hiệu khuếch đại thu đƣợc khi

12


có sự bắt cặp kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu [33], [40], [60]. Các kết quả công
bố cho giới hạn phát hiện rất thấp khoảng 4 µg/kg đối với mẫu thịt, thủy sản và
khoảng 2 µg/kg đối với mật ong và sữa.
Kết luận phần tổng quan
Qua nghiên cứu kết quả các bài báo quốc tế, các tiêu chuẩn phân tích
tetracycline của Việt Nam, AOAC , chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp chiết rắn lỏng
kết hợp kỹ thuật lắc để tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thịt và thủy sản, sử dụng
dung môi chiết là đệm McILvaine – EDTA pH 4, khử tạp chất bằng dun dịch axit
trichloacetic, làm giầu và làm sạch mẫu bằng chiết pha rắn SPE sử dụng cột C18 và
định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ (LC/MS-MS).

13

CHƢƠNG 2 - THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
Các loại hóa chất đều sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA) riêng đối với chất
chuẩn và dung môi pha động sử dụng loại đặc biệt tinh khiết dành cho khối phổ
(PR).
Chất chuẩn nhóm tetracycline dạng bột khan bao gồm: tetracycline,
oxytetracycline và chlotetracycline với độ tinh khiết 99,99% của hãng Sigma
Aldrich – Đức
Dung dịch chuẩn gốc riêng biệt oxytetracycline, tetracycline, clotetracycline
Cân trên cân phân tích (độ đọc 0,01 mg) khoảng 10 mg mỗi chất chuẩn vào 3
bình định mức dung tích 10 mL. Hoà tan và định mức đến vạch bằng methanol. Dung
dịch chuẩn gốc đƣợc bảo quản ở -20 0C trong 1 tháng.
Hỗn hợp dung dịch chuẩn trung gian, 1 μg/mL mỗi chất: đƣợc pha hai tuần một
lần trong methanol từ dung dịch chuẩn gốc, bảo quản sau khi sử dụng ở 40C
Hỗn hợp dung dịch chuẩn làm việc(5,10,20,40,60,80,100 ng/mL) đƣợc pha mới
hàng ngày trong methanol từ các dung dịch chuẩn trung gian.
Dung dịch đệm McIlvaine pH ( 4  0,05): Cân 28,40 g Na2HPO4 khan hoà tan
bằng nƣớc cất vào bình định mức 1 lít rồi định mức tới vạch, lắc đều hỗn hợp. Cân
21,00 g axit citricmonohydrat hoà tan bằng nƣớc cất vào bình định mức 1 lít khác,
và định mức tới vạch, lắc kỹ. Trộn 1 lít axit citric ở trên với 625 ml dung dịch
Na2HPO4. Điều chỉnh pH bằng 4  0,05 dùng máy đo pH, dung dịch này sử dụng
đƣợc trong 2 tuần.

14