Phân lập gen mã hóa protein Lc điều hòa sinh tổng hợp Anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ KHUYÊN

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA PROTEIN Lc ĐIỀU HÒA
SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN TỪ CÂY NGÔ NẾP
ĐỊA PHƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ KHUYÊN

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA PROTEIN Lc ĐIỀU HÒA
SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN TỪ CÂY NGÔ NẾP
ĐỊA PHƯƠNG
Ngành: Di truyền học
Mã ngành: 8.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Thị Thanh Nhàn

THÁI NGUYÊN - 2018

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Mọi trích dẫn
trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận
văn là trung thực và chưa được ai công bố.
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Khuyên

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Thị
Thanh Nhàn đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá
trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của cô Trần Thị
Hồng kĩ thuật viên Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học
Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên và Viện Khoa học sự sống – Đại
học Nông lâm – Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ
quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại và
Giáo dục sinh học, bộ phận Sau đại học thuộc Phòng đào tạo - Trường Đại học Sư
phạm – Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình
học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích và
giúp đỡ tôi trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình hoàn thiện luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi rất
mong nhận được những đóng góp quý báu để luận văn được hoàn thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Khuyên

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3
1.1. Sơ lược về cây ngô ...............................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây ngô .........................................................................3
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp ........................................................4
1.2. Hạn và phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn .........................................5
1.2.1. Hạn và tính chống chịu stress oxy hóa ..............................................................5
1.2.2. Cơ sở sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở ngô ...............8
1.3. Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa ...............................11
1.3.1. Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn ...................................................11
1.3.2. Gen điều hoà tổng hợp anthocyanin ở cây ngô ...............................................14

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................18
2.1. Vật liệu ...............................................................................................................18
2.2. Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu ..........................................................18
2.2.1. Hóa chất ..........................................................................................................18
2.2.2. Thiết bị ............................................................................................................18
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................18
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................19
2.3.1. Phương pháp gây hạn nhân tạo .......................................................................19

iii


2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số .............................................................19
2.3.3. Phương pháp RT- PCR ...................................................................................20
2.3.4. Tạo vector tái tổ hợp .......................................................................................21
2.3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5 ..............21
2.3.6. Kiểm tra sản phẩm tách dòng ..........................................................................21
2.3.7. Tách plasmid ...................................................................................................21
2.3.8. Phương pháp xác định trình tự gen .................................................................23
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ...............................................................................23
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................24
3.1. Kết quả phân lập gen Lc từ giống ngô nếp địa phương NH .............................24
3.1.1. Kết quả tách dòng phân tử mang gen Lc từ giống NH ...................................24
3.1.2. Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen Lc ở giống ngô nếp NH ........................26
3.2. Đặc điểm trình tự gen Lc của giống ngô nếp địa phương NH ...........................26
3.2.1. So sánh trình tự gen Lc của giống NH với các trình tự trên GenBank.........................26
3.2.2. Phân tích sự tương đồng gen Lc của giống NH với các gen khác trong họ
bHLH .........................................................................................................................33
3.3. Đặc điểm trình tự protein Lc suy diễn của giống ngô nếp địa phương NH .......34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................39

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................40

iv


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

ABA

Abscisic acid

Axit abscisic

ANR

Anthocyanidin reductase

Enzyme chuyển hóa flavan-3-ol

ANS

Anthocyanidin synthase

APX

Ascorbate peroxidase

Enzyme chuyển hoá H2O2 thành H2O

bHLH

Binding helix- loop- helix

Protein họ bHLH

Bp

Base pair

Cặp bazơ nitơ

C1

Colored aleurone 1

Gen C1

cDNA

Complementary DNA

CHS

Chalcone synthase

Enzyme xúc tác tổng hợp chalcon

DEPC

Diethyl pyrocarbonate

Chất ức chế enzyme phân hủy RNA

CLP

Protease CLP

Enzym protease CLP

DFR

Dihydroflavonol 4 reductase

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic (ADN)

dNTPs

Deoxynucleotit triphosphate

Các loại nucleotit triphotphate

DRE

EDTA

EREBP

Enzyme chuyển hóa tạo
anthocyanidin

DNA sợi đôi được tổng hợp từ
mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược

Dehydration responsive
element
Ethylene diamine tetraa acid
cetic
Ethylene-responsive element
binding protein

GSH

Glutathione

LEA

Late embryo abundant

Lc /LC

Leaf colour

Enzyme chuyển hóa tạo
leucoanthocyanidin

Yếu tố đáp ứng với hydrat hóa

Axit etylen diamin tetraxetic
Protein liên kết nguyên tố Ethylene

Protein trong giai đoạn muộn của
quá trình hình thành phôi
Gen Lc

iv


Forward primer/ Reverse

Cặp mồi xuôi ngược trong phản ứng

primer

RT-PCR của mRNA gen Lc

MGPT

Molecular brokerage

Môi giới phân tử

MYB

Myeloblastosis

Gen MYB

MYC

Myelocolour

Gen MYC

mRNA

Messenger RNA

ARN thông tin

Nicotinamide adenine

Coenzym được sử dụng trong phản

dinucleotide phosphate

ứng đồng hóa

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic (ARN)

Reverse transcription-

Phản ứng khuếch đại cDNA từ

polymerase chain reaction

mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược

ROS

Reactive oxygen species

Các dạng oxy hoạt hóa

SOD

Superoxide dismutase

Sol

Solution

TF

Transcription factors

Cs

Cộng sự

LcF/LcR

NADP

RT- PCR

Enzyme xúc tác phản ứng loại bỏ
superoxide
Dung dịch
Các nhân tố phiên mã, hay yếu tố
phiên mã
Người cùng làm chung trong một
công việc

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR .......................................................................20
Bảng 2.2. Thành phần dung dịch tách plasmid .........................................................22
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác về nucleotid giữa gen Lc của giống NH với các
trình tự trên GenBank ..............................................................................32

Bảng 3.2. Bảng hệ số tương đồng di truyền về gen Lc giữa giống NH và các
trình tự trên GenBank. .............................................................................33
Bảng 3.3. Sự sai khác về amino acid trong protein Lc suy diễn giữa giống NH
với các trình tự trên GenBank..................................................................36
Bảng 3.4. Bảng hệ số tương đồng di truyền về protein Lc suy diễn giống NH và
một số trình tự trên GenBank. .................................................................38

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin ..........................................11
Hình 1.2. Vai trò chất chống oxy hóa của anthocyanin ............................................13
Hình 1.3. Ba nhóm gen điều hòa tham gia tổng hợp anthocyanin ở ngô ........................15
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của protein bHLH ....................................................16
Hình 1.5. Các vùng chức năng của nhân tố bHLH ...................................................16
Hình 3.1. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RT- PCR gen Lc..............................24
Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid (A) và sản phẩm clony- PCR (B) ......25
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (B) ................25
Hình 3.4. Ảnh blast trình tự nucleotid của gen Lc giống NH trên NCBI ................26
Hình 3.5. So sánh trình tự nucleotid của gen Lc ở giống NH và trình tự khác
trên GenBank. ..........................................................................................31
Hình 3.6. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa gen Lc của giống
ngô NH với các gen thuộc họ bHLH .......................................................33
Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein Lc ở giống NH và
các trình tự trên GenBank ........................................................................35
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa protein Lc suy diễn
của giống ngô NH với các trình tự trên GenBank ...................................38

vi

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất, cung
cấp lương thực cho loài người và là thức ăn cho gia súc (với 70% chất tinh
trong khẩu phần ăn), là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất và chế biến
lương thực - thực phẩm - dược phẩm, là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá
trị. Giá trị sử dụng rộng rãi của ngô được chứng minh bằng 670 mặt hàng
khác nhau. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa của
nông dân vùng trung du và miền núi phía Bắc, và là cây lương thực chính của
đồng bào các dân tộc thiểu số ở các vùng núi cao. Năm 2016, tỉnh Hà Giang
có diện diện tích trồng lúa là 37500 ha, ngô là 53500 ha; tỉnh Cao Bằng có
diện tích trồng lúa là 28900 ha, ngô là 40100 ha; tỉnh Sơn La có diện tích
trồng lúa là 51700 ha, ngô là 152400 ha; tỉnh Lào Cai có diện tích trồng lúa là
31600 ha, ngô là 37600 ha (theo số liệu của Tổng cục Thống kê) [13].
Nước ta có 75% diện tích là đồi núi, lượng mưa hàng năm không đồng
đều giữa các vùng, tình trạng hạn hán thường xuyên xảy ra dẫn đến năng suất
của các giống cây trồng nói chung, cây ngô nếp địa phương nói riêng bị giảm.
Trong những năm gần đây, các giống ngô nếp địa phương có chất lượng hạt
cao, khả năng chịu hạn tốt và phù hợp với điều kiện canh tác đất dốc của từng
vùng ở miền núi, nhưng do năng suất thấp nên nhiều giống quý bị mất dần do
hướng sản xuất ngô ở nước ta là tăng cường diện tích ngô lai có năng suất cao
trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến. Vì vậy, việc
nghiên cứu và chọn tạo các giống ngô có khả năng chịu hạn là rất cần thiết,
góp phần bảo tồn nguồn gen và tạo vật liệu cho lai giống.
Anthocyanin là một loại sắc tố dịch bào, là sản phẩm thứ cấp của quá
trình trao đổi chất. Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, xuất hiện trong các bộ
phận của thực vật với màu đỏ, đỏ tía, tím và xanh đậm. Ngoài việc tạo màu
sắc đẹp để bảo vệ và thụ phấn, anthocyanin còn có hoạt tính sinh học rất quý

1


là khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào giữ nước khi mất cân bằng áp
suất thẩm thấu. Anthocyanin được coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan
và là một phần trong cơ chế hạn chế tác động tiêu cực đó. Hiện nay, định
hướng nghiên cứu xác định chỉ thị cho đặc tính chịu hạn của cây trồng đang
được quan tâm, trong đó có chỉ thị sắc tố anthocyanin và các gen liên quan.
Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Phân lập
gen mã hóa protein Lc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô
nếp địa phương”.
2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và phân tích được đặc điểm trình tự gen Lc điều hòa sinh tổng
hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo dòng gen Lc từ giống ngô nếp địa phương chịu hạn tốt Nà Hạo
(NH): Tách chiết mRNA tổng số, khuếch đại cDNA bằng kỹ thuật PCR, tách
dòng phân tử cDNA gen Lc.
- Phân tích đặc điểm trình tự gen Lc và protein suy diễn.

2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về cây ngô
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây ngô
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L, thuộc chi Zea, họ Hoà thảo
(Poaceae), bộ Hoà thảo (Poales). Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu trúc nội
nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô được phân thành các loài phụ: ngô đá
rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa.

Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các
thứ. Ngoài ra, ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian
sinh trưởng và thương phẩm [7].
Ngô có lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100 cm và rộng 5-10 cm. Thân
cây thẳng, cao 2–3 m, nhiều mấu, các lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn. Dưới
các lá này và ôm sát thân cây là các bắp. Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một
số rễ [7].
Các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông được bao bọc trong một số lớp
lá, và được các lá này bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra cho đến
khi xuất hiện các râu ngô. Râu ngô là các núm nhụy thuôn dài, ban đầu màu
xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng. Hạt ngô là
dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt. Các hạt ngô bám chặt thành
các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp
ngô dài khoảng 10- 25cm, chứa khoảng 200- 400 hạt. Các hạt có màu như ánh
đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng. Khi được nghiền thành bột, ngô tạo ra
nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì [7].
Ngô nếp (Zea mays L. subsp. Ceratina Kulesh), là một trong những loài
phụ chính của Zea mays L. Bề ngoài hạt ngô nếp tương tự với ngô đá, nhưng
bóng hơn. Lớp ngoài cùng của mặt cắt nội nhũ không có lớp sừng như ở ngô
tẻ, có tính chất quang học giống như lớp sáp. Do vậy, ngô nếp còn có tên gọi
3


khác là ngô sáp. Tinh bột của ngô nếp chứa gần như 100% amylopectin, trong
khi ngô thường chỉ chứa 75% amylopectin và 25% amylase [7]. Theo Peter
Thompson (2005), đặc tính của ngô nếp được quy định bởi đơn gen lặn đó là
gen wx [52].
Ngô có 10 cặp nhiễm sắc thể (n=10). Chiều dài tổng cộng của các nhiễm
sắc thể là 1500 cM. Một số nhiễm sắc thể của ngô có "bướu nhiễm sắc thể" các vùng lặp lại cao với vết màu sẫm. Mỗi bướu riêng biệt là đa hình trong số
các giống của cả ngô lẫn cỏ ngô. Barbara McClintock đã sử dụng các bướu

này để chứng minh thuyết “Yếu tố di truyền vận động” [66]. Năm 2005, Quỹ
Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ và Bộ Năng
lượng Hoa Kỳ (DOE) đã xác định trình tự chuỗi bộ gen của ngô. Bộ gen ngô
có 50000– 60000 gen nằm rải rác trong 2,5 tỷ base [65].
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp
Ngô nếp được sử dụng chủ yếu làm lương thực và thức ăn cho con
người. Khi nấu chín có độ dẻo, mùi vị thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao,
dễ hấp thu hơn so với tinh bột của ngô tẻ [68]. Một trong những nguyên
nhân là do trong ngô nếp có hàm lượng các amino acid không thay thế
như triptophan và lyzin cao.
Hàm lượng lipit cao (3,5- 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự
nhiên. Lipit được tập trung ở phôi và tầng alơron. Dầu ngô chứa đến 50% axit
linoleic liên kết với các glyxerit, axit oleic, panmitic, rixinic. Hàm lượng lipit
là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt.
Protein của ngô được chia thành ba loại chính: protein hoạt tính (chủ yếu
là enzyme), protein cấu trúc và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm
tỷ lệ cao nhất. Hàm lượng protein dao động từ 4,8- 16,6% ở mỗi giống. Lợi
dụng tính chất hoà tan của protein trong các dung môi, người ta có thể tách
chiết protein tan từ ngô phục vụ cho nhiều mục đích nghiên cứu như đánh giá
chất lượng, khả năng chịu hạn...[65].
4


Thân cây ngô được sử dụng chủ yếu để nuôi gia cầm và gia súc: cỏ khô,
cỏ ủ chua. Hạt ngô cũng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: tổng hợp
chất dẻo hay vải sợi; sản xuất xi rô chứa nhiều fructose, chưng cất một số
dạng rượu. Ethanol từ ngô cũng được dùng ở hàm lượng thấp (10% hoặc ít
hơn) như là phụ gia của xăng làm nhiên liệu cho một số động cơ để gia tăng
chỉ số octan, giảm ô nhiễm và giảm mức tiêu thụ xăng (ngày nay gọi chung là
"các nhiên liệu sinh học"). Trong nhiều nền văn hóa, người ta sử dụng các

món cháo ngô, bánh ngô, bánh mèn mén. Một vài dạng ngô cũng được trồng
làm cây cảnh do lá hay bắp nhiều màu, kích thước lớn, bắp dài [65].
Cũng như tình trạng chung trên thế giới, các nghiên cứu về ngô ở Việt Nam
tập trung chủ yếu vào ngô tẻ. Đối với các giống ngô nếp địa phương, đến nay chỉ
có một số ít công trình được công bố [3]. Thời gian gần đây, các nhà tạo giống
Việt Nam đã bắt đầu chuyển sang hướng tạo giống nếp lai và đã tạo được một số
giống nếp lai không quy ước có triển vọng như các giống lai VN2, MX2, MX4,
Bạch ngọc... Trong khi đó, các giống ngô nếp địa phương có ưu điểm chất lượng
hạt cao, khả năng chịu hạn và kháng sâu bệnh tốt, có thể gieo trồng trên nhiều
loại đất khác nhau đang đứng trên nguy cơ bị suy giảm quỹ gen vì năng suất
thường thấp. Vì vậy, việc sưu tập, nghiên cứu và đánh giá một cách toàn diện
nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết cho công tác giống
và bảo tồn nguồn gen quý.
1.2.

Hạn và phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn

1.2.1. Hạn và tính chống chịu stress oxy hóa
1.2.1.1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa
Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi
trường gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển. Những cây có
khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô
hạn gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể làm giảm thiếu hụt
mức độ tổn thương do thiếu nước gây ra gọi là tính chịu hạn.
5


Có hai loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn
diện), và hạn sinh lí. Hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ của
cây không thể lấy nước từ đất vào tế bào dẫn đến cây có hiện tượng bị héo lâu

dài. Hạn đất tác động mạnh lên bộ rễ của cây. Hiện tượng này gây ra các biểu
hiện thích ứng tại vùng xảy ra yếu tố cực đoan và ở mức độ cao hơn, biểu
hiện thích ứng toàn cơ thể. Hạn có thể tạo ra những hạt khô, nhăn nheo,
không có phẩm chất tốt và thậm chí mất mùa hoàn toàn. Ở ngô sự trỗ cờ và
phun râu phải xảy ra đồng thời. Hiện tượng phun râu ngô chậm gắn liền với
sự chịu hạn bởi vì râu ngô chứa phần lớn là nước. Chọn giống theo hướng
phun râu đồng thời (không bị chậm) là phương pháp hữu hiệu để chọn được
giống chịu hạn ở ngô ở các vùng Mỹ, Canada [6].
Hạn không khí thường xảy ra ở những vùng gió nóng, nhiệt độ cao (3942oC) và độ ẩm thấp <62%. Hạn không khí tác động chủ yếu lên các bộ phận
bên trên mặt đất như lá, hoa... Phản ứng của cây theo chiều hướng giảm
cường độ thoát hơi nước và như vậy sẽ làm tăng nhiệt độ cơ thể. Đồng thời
với tăng nhiệt độ không khí, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng lớn nhất đến quá trình
hình thành hạt phấn và thụ phấn của ngô. Cần phải nhấn mạnh rằng trong quá
trình phát triển của cây có những giai đoạn bị khủng hoảng: bắt đầu từ lúc
hình thành các cơ quan sinh sản, kết thúc vào lúc thụ phấn hoàn toàn. Đây là
thời kỳ cây cần nước nhất và kém chịu đựng nhất. Hạn xảy ra trong thời gian
này làm giảm năng suất một cách đáng kể.
Hạn sinh lí khác với hai loại hạn trên ở chỗ môi trường vẫn đầy đủ nước
nhưng rễ cây không có khả năng hút nước do mất cân bằng áp suất thẩm thấu
giữa môi trường nội bào và ngoại bào.
Nước tồn tại ở dạng liên kết trong tế bào. Màng tế bào là nơi bị tổn
thương đầu tiên khi xảy ra mất nước. Thiếu nước nhẹ chỉ làm thay đổi một
phần cấu trúc của protein, lipit trên màng tế bào. Lớp lipit cấu trúc chuyển từ
trạng thái hoạt hoá tinh thể lỏng sang dạng gel không còn linh hoạt, và kém
6


nhất là chuyển sang trạng thái lục lăng ngược. Trong trạng thái cuối cùng
màng lipit kép bị gián đoạn, các phức enzyme bị phá hủy, dịch tế bào có thể
dò rỉ ra ngoài. Tiếp sau đó, các hệ thống màng khác trong tế bào như màng

lưới nội chất, màng lục lạp, màng ty thể cũng bị thiếu nước và không còn khả
năng trao đổi chất [6].
Hiện tượng nóng hạn còn tạo ra các gốc tự do của hydroxyl, superoxide...
oxy hoá các đại phân tử và làm mất hoạt tính của chúng. Ngoài ra, các sản
phẩm phân hủy của các đại phân tử và nồng độ ion cao khi mất nước gây độc
cho tế bào. Khi bắt đầu mất nước sự tổng hợp protein được tăng cường,
nhưng hạn kéo dài sẽ xảy ra hiện tượng thủy phân protein. Stress oxy hóa xảy
ra trong điều kiện hạn tạo ra hàng loạt các dạng oxy hoạt hóa (ROS) gây tổn
thương, thậm chí làm chết tế bào [45]. Những yếu tố môi trường gây stress
oxy hóa có thể kể đến là: nồng độ ozon hoặc SO2 quá cao, chất diệt cỏ bị ôxy
hóa, kim loại nặng, hạn, nóng, lạnh, tổn thương cơ học, UV, chiếu sáng liên
tục, sự xâm nhập của mầm bệnh, sự lão hóa... Ở những điều kiện này, chúng
thúc đẩy hiện tượng ức chế quang hợp [26].
1.2.1.2. Các dạng oxy hoạt hóa (ROS) và hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác
động của của oxy hóa
ROS tồn tại trong tự nhiên và cơ thể sống có thể kể đến là: oxy phân tử
(O2); oxy dạng đơn (singlet oxy), superoxide anion (O 2-), hydro peroxide tự
do (OH*), hydro peroxide (H2O2), pehydroxyl tự do (O2H*), ozon (O3)...
Phần lớn chúng tạo ra trong chu trình chuyển hóa electron trong ty thể hoặc
lục lạp. Tuy nhiên, những hợp chất oxy hoạt hóa như superoxide anion (O 2-),
H2O2 cần cho sự hóa gỗ (sự hóa lignin) và thực hiện chức năng như tín hiệu
phản ứng bảo vệ đối với hiện tượng nhiễm bệnh [18].
Hệ thống bảo vệ cây trồng bao gồm các enzyme và hợp chất không phải
enzyme, đó là: superoxide dismutase (SOD), catalasse, các enzyme chuyển
hoá ascorbate, glutathion (GSH). Ngoài các hợp chất có bản chất enzyme trên,
7


các chất khác không có hoạt tính xúc tác sinh học cũng tham gia trực tiếp
chuyển hóa các gốc tự do như: vitamin E, vitamin C, carotenoid, polyamin,

zeaxanthin và flavonoid. Chúng tương tác với các gốc carbocyl tự do, hạn chế
sự chuyển hóa thành các gốc tự do khác. Carotenoid và flavonoid còn nhận
năng lượng ánh sáng, hạn chế tác động của ánh sáng và các gốc tự do sinh ra
trong quá trình quang hợp [45], [49].
1.2.2. Cơ sở sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở ngô
Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật rất phức tạp liên quan đến các đặc
điểm hình thái giải phẫu, sinh lí, hoá sinh, và các gen chịu hạn. Hiện nay có
nhiều quan điểm khác nhau giải thích cơ chế chịu hạn, trong đó có hai quan
điểm được chấp nhận hơn cả là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp
suất thẩm thấu.
Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về tính chịu
hạn của cây ngô. Tính chịu hạn của cây ngô có liên quan tới sự sinh trưởng và
phát triển của bộ rễ. Trong môi trường bị hạn rễ thường phát triển theo chiều
sâu hoặc chiều ngang và số lượng rễ tăng lên [37]. Tốc độ vươn dài của lá phụ
thuộc vào sự thay đổi về thế nước của lá và khả năng cung cấp nước của đất.
Khi gặp điều kiện khô hạn hoặc nhiệt độ cao, các tính chất lí hoá của keo
nguyên sinh thay đổi ví dụ như: tính đàn hồi và độ nhớt bị giảm, đồng thời
trao đổi chất cũng giảm, tế bào bị mất nước. Kết quả tế bào sẽ bị chết do mất
tính bán thấm, không có hiện tượng co nguyên sinh chất [6]. Đặc điểm này là
cơ sở xây dựng các phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng của
cây: phân tích protein, axít amin, ABA...
Axit abscicic có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu hạn ở ngô. Kết
quả nghiên cứu của các tác giả Hu và cs (2012), Jiang và cs (2013) chứng
minh vai trò trung tâm trong việc điều khiển sự đóng mở khí khổng duy trì
cân bằng nước của cây ngô bị hạn. Sự xuất hiện ABA trong điều kiện hạn có
liên quan đến các gen đặc hiệu [34], [38].
8


Những thực vật sống trong môi trường mất cân bằng về áp suất thẩm

thấu đòi hỏi phải có khả năng chống lại được điều kiện khắc nghiệt đó. Tồn
tại 2 cơ chế khắc phục sự bất lợi này: (1) Khả năng thích nghi đặc biệt của cấu
trúc và hình thái rễ, lá để tránh cho tế bào khỏi mất nước; (2) Khả năng chịu
mất nước dựa trên sự thay đổi tinh vi trong sinh hoá tế bào dẫn đến sự xuất
hiện và tích lũy các chất hoà tan, protein, amino acid đặc hiệu (proline) [21].
Tính chịu nóng hạn của cây trồng được hình thành trong quá trình tiến
hoá tự nhiên, do một hệ đa gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát
triển khác nhau của cây [21]. Các gen chịu hạn của những cây hạn sinh lý vẫn
là vấn đề nghiên cứu lý thú đối với các nhà khoa học. Nghiên cứu cơ sở phân
tử của tính chống chịu theo hướng khả năng bảo vệ của tế bào khỏi tác động
của điều kiện cực đoan gồm hai nhóm:
Nhóm 1: nhóm có chức năng chịu hạn bao gồm MGPT, protein LEA,
protein kênh chuyển nước qua màng, đường, proline,... Protein LEA, MGPT
và mRNA binding protein đã được nghiên cứu về mặt hóa sinh, và chỉ ra rằng
chúng tham gia bảo vệ các cấu trúc đại phân tử như các enzyme, lipit và
mRNA khỏi bị mất nước. Proline, glycine, betaine và đường thực hiện chức
năng như các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu [21], [41].
Nhóm 2: các protein có chức năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể
có chức năng trong việc phản ứng đối với tình trạng hạn như protein kinase,
nhân tố phiên mã và các enzyme trong chuyển hoá phospholipit. Gen mã hoá
cho nhân tố phiên mã có chứa DNA binding motif. Chúng có vai trò điều hoà
các gen chức năng dưới tác động của điều kiện cực đoan [40].
Phần lớn các gen chịu cảm ứng điều hiện khô hạn đều cảm ứng với điều
kiện mặn. Một trong số gen này còn chịu cảm ứng điều kiện lạnh. Những
đường dẫn truyền tín hiệu này chia thành 2 loại: (1) Phụ thuộc vào ABA (đòi
hỏi tổng hợp protein MYC, MYB hoặc không cần); (2) Không phụ thuộc vào
ABA, yếu tố phản ứng với mất nước DRE tham gia vào việc điều hòa biểu
hiện gen.
9

DRE được đặt tên cho trình tự gồm 9 bp TACCGACAT. Yếu tố protein
gắn với trình tự DRE (DREBS) ở vùng promoter. Những protein này chứa các
các vùng bảo thủ như các protein EREBP (tham gia biểu hiện ethylene
responsive gene), AP2 (tham gia trong quá trình biểu hiện kiểu hình của thực
vật có hoa). Các gen rd19, rd21 mã hóa cho thiol protease; erd1 mã hóa cho
tiểu phần điều hòa của protease CLP, là những gen chỉ cảm ứng bởi hạn, mà
không cảm ứng bởi ABA [6].
Hướng tiếp theo về nghiên cứu sử dụng công nghệ gen tăng cường tính
chống chịu là: điều khiển sự biểu hiện và hoạt tính của các hệ vận chuyển K +
(qua hoạt tính của protein tạo kênh chuyển - aquaporin); tăng cường sự thoát
các ion Na+ của tế bào rễ, tonoplast; tăng cường điều chỉnh áp suất thẩm thấu;
tăng cường cơ chế bảo vệ tế bào bằng các phản ứng trao đổi chất đặc hiệu
trong tế bào nhờ có protease, protein sốc nhiệt, loại bỏ các gốc tự do... [6].
Một trong những cơ chế để nâng cao khả năng chịu hạn và chịu muối là điều
chỉnh áp suất thẩm thấu và loại bỏ các gốc tự do. Những thử nghiệm đầu tiên
về hướng này đã được thực hiện. Nguyễn Thị Thuý Hường (2011) đã chuyển
gen P5CS mã hóa enzyme tham gia tổng hợp proline vào cây thuốc lá. Sau
khi gây hạn nhân tạo, hàm lượng proline tăng rất mạnh so với trước gây hạn ở
tất cả các dòng cây nghiên cứu, đặc biệt các dòng cây chuyển gen. Sau 9 ngày
gây hạn, proline ở cây đối chứng không chuyển gen tăng 206,8 %, trong khi ở
cây chuyển gen tăng từ 259,5- 451,8% [4].
Từ những năm 90 của thế kỷ XX đến nay, đã có nhiều công trình trong
nước quan tâm nghiên cứu đến khả năng chịu hạn của cây ngô. Đó là các kết
quả đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô trên đồng ruộng [10]; đánh giá
khả năng chịu hạn của cây ngô non trong điều kiện hạn nhân tạo [8], [14];
phân lập gen dehydrin dhn1/rab17 từ DNA hệ gen [5], [6]; nghiên cứu chọn
tạo dòng thuần ngô bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn [2], [12]; nghiên cứu
hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở ngô [11]... Hiện nay trên thế giới cũng
đã và đang tiến hành một hướng nghiên cứu về sắc tố anthocyanin liên quan

10


đến hạn ở một số đối tượng thực vật. Ở Việt Nam, còn ít công trình đề cập
đến sắc tố chỉ thị này, đặc biệt đối với các giống ngô nếp địa phương.
1.3. Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa
1.3.1. Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn
Hiện nay có nhiều giả thuyết khác nhau giải thích về đặc tính chịu hạn
của thực vật và cây ngô. Các cơ chế tập trung theo hai hướng cơ bản: hướng
chống hạn và hướng chịu hạn. Theo hướng thứ nhất, thực vật có sự biến đổi
hình thái cơ thể để hạn chế sự mất nước. Hướng thứ hai diễn ra nhiều cơ chế:
sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu, sự đóng bớt khí khổng, tăng hàm lượng các
chất hoà tan, tăng kích thước bộ rễ, tăng tổng hợp các chất chỉ thị
(anthocyanin, polyamine)...

Hình 1.1. Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin
Anthocyanin là những glucozit, thuộc họ flavonoid, do gốc đường
glucose, galactose... kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin).
Aglucon của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 1.1. Các gốc
đường thường được gắn vào vị trí 3 và 5, ít gắn vào vị trí 7. Các aglucon của
anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thường
là H, OH hoặc OCH3.
Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá
phân cực, có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại
tại bước sóng 510- 540nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu
sắc của các anthocyanin, chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ
anthocyanin. Khi pH < 7 các anthocyanin thường có màu đỏ, khi pH> 7 có màu
xanh. Ở pH 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ,
11

ở pH 4- 5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không
màu, ở pH 7- 8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh [25].
Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng rất an toàn trong thực
phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin còn là
hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý như khả năng chống oxy hóa cao
nên được sử dụng để chống lão hóa, chống oxy hóa thực phẩm; hạn chế sự
suy giảm sức đề kháng; làm bền thành mạch; chống viêm; hạn chế sự phát
triển của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ [20], [58].
Anthocyanin được tìm thấy trong không bào của tế bào biểu bì, mô mạch dẫn.
Chúng xuất hiện trong rễ, trụ dưới lá mầm, bao lá mầm, thân (cuống), củ, thân
rễ, thân bò, thân hành, lá [19], [33], [57]. Những bộ phận mầu đỏ trong các
quần xã đều thể hiện sự đa dạng về màu của anthocyanin. Ở lá, anthocyanin
tạo màu cho cả bề mặt lá, mép lá, viền sọc, các vết đốm. Ở nhiều loài,
anthocyanin chỉ được tổng hợp khi chúng không khoẻ hay phản ứng với điều
kiện bất lợi của môi trường [62].
Các nhà nghiên cứu di truyền học khẳng định rằng, sự có mặt dồi dào
của ROS là nguyên nhân của sự phá huỷ không giới hạn các thành phần tế
bào. Trong tế bào thực vật, ty thể và lạp thể là hai nguồn tạo ra ROS thông
qua các phản ứng của quang hợp và hô hấp. Nguồn enzyme của ROS gồm
NADPH oxidase trên màng, oxilate oxidase và amine oxidase trong
apoplasm, peroxidase trên thành tế bào [39]. Các tác nhân bất lợi của môi
trường có thể làm tăng hàm lượng ROS gấp 3 lần so với bình thường [53].
Anthocyanin là loại sắc tố phổ biến có khả năng chuyển hoá ROS gấp 4 lần so
với vitamin E, C. Nghiên cứu in vitro cho thấy các flavonoid làm vô hiệu hoá
hầu hết các ROS và các gốc nitơ quan trọng [16], [61]. Có hai cơ chế
anthocyanin có thể làm giảm oxy hoá ở lá. Cơ chế thứ nhất, anthocyanin có
thể hạn chế hay điều hoà phản ứng pha sáng, pha tạo ra ROS, bằng cách làm
giảm một lượng các lượng tử cao năng [35], [44], [47]. Thứ hai, anthocyanin
12

có thể trực tiếp loại ROS. Sự có mặt của các enzyme chuyển hoá ROS (SOD
và APX) trong lục lạp là kết quả của sự ức chế quang hợp và quang oxy hoá.
Những enzyme này chuyển hoá O2, và H2O2 rất hiệu quả. Tuy nhiên, ánh sáng
mạnh kèm theo tress lạnh làm bất hoạt APX, SOD dẫn đến tăng nồng độ
H2O2. Anthocyanin có thể bảo vệ các enzyme chống oxi hoá bằng cách hạn
chế lượng ánh sáng vào tế bào quang hợp, do đó giảm sự phát sinh ROS [54],
[60]. Một thực nghiệm khác cũng cho thấy, khi cây bị chiếu sáng mạnh, lục
lạp không thực hiện được chức năng và sản sinh ra các gốc O 2-, gốc này được
dạng không màu và màu đỏ của cyanidin glycosides loại bỏ.

Nguồn: www.Sciencedirect.com (theo Hernández J) [64]
Hình 1.2. Vai trò chất chống oxy hóa của anthocyanin
Như vậy, anthocyanin được cho là có chức năng bảo vệ quang hoá và
phục hồi quang tổng hợp ở lá [15], [19], [26], [33]. Một số nghiên cứu gần
đây cho thấy, anthocyanin loại cyanindin-3- O -glucose chloride có tác dụng
lớn trong việc bảo vệ chống lại sự phân hủy vitamin C, E, beta carotene (hình
1.2) [58]. Thực nghiệm cho thấy, anthocyanin bảo vệ quang hoá khi có mặt ở
13


lá già và cây rụng lá, cây trưởng thành, lá già qua đông của cây thường xanh,
hay lá non [22], [31], [35].
Sau cùng, anthocyanin có thể phản ứng với các chất trung gian thứ cấp
trong con đường chuyển hoá ROS, ví dụ như sucrose. Quá trình sinh tổng hợp
anthocyanin được tăng cường mạnh bởi sucrose trong cây củ cải (Raphanus
sativus), cây thường xuân (Hedera helix), Arabidopsis thaliana. Các loại
đường hoà tan (sucrose, glucose, fructose) có liên quan đến sự điều chỉnh cân
bằng chất oxy hoá và chất chống oxy hoá trong tế bào [62].

1.3.2. Gen điều hoà tổng hợp anthocyanin ở cây ngô
Hiện nay, các TF được coi là chìa khóa chuyển hóa chính hoặc điều hòa
quá trình phát triển thông qua điều khiển sự biểu hiện gen, phân chia tế bào và
cân bằng nội môi. Cơ chế điều hoà phổ biến của TF là các TF liên kết với trình
tự tăng cường (enhancer) hoặc promoter bằng lực hút tĩnh điện (đặc biệt là liên
kết hydro và lực Van der Waals) làm tăng cường hoặc ức chế hoạt động phiên
mã của gen cấu trúc mà chúng tiếp giáp. Chúng hoạt động theo nhiều cách: (i)
ổn định hoặc ngăn chặn sự gắn kết của RNA polymerase vào promoter; (ii)
xúc tác acetyl hóa hoặc deacetyl hóa các histone, trong đó acetyl hóa làm suy
yếu liên kết giữa DNA và histone làm cho DNA dễ được tiếp cận hơn để sao
chép (deacetyl hóa là quá trình ngược lại) làm DNA ít có cơ hội được tiếp xúc
để sao chép, do đó điều tiết phiên mã giảm; (iii) sự có mặt của các protein hoạt
hóa hoặc kìm hãm [42].
Sinh tổng hợp anthocyanin được nghiên cứu đầu tiên trên đối tượng Zea
mays. Sự có mặt của anthocyanin là kết quả của một chuỗi các phản ứng hoá
sinh có sự xúc tác của các enzyme được mã hoá bởi các gen CHS (hay gen
C2), DFR (hay gen A1), CHI, F3’H, F3’5’H, ANS, 3GT (hay bronze1- Bz1).
Đó là các gen cấu trúc [59]. Nếu như enzyme CHS được coi là enzyme “chìa
khóa” mở ra con đường sinh tổng hợp anthocyanin, thì enzyme DFR hỗ trợ
hình thành các màu chỉ thị. Chính vì vậy mà các đột biến gen DFR đều cho ra
14


những hoa có màu trắng [57]. Gen CHS bị ức chế sẽ làm giảm quá trình sinh
tổng hợp anthocyanin, thậm chí không có flavonoid [62].
Sự biểu hiện của các gen cấu trúc trong quá trình sinh tổng hợp
anthocyanin ở các bộ phận cây ngô rất cần sự có mặt của các TF thuộc họ
MYB, MYC (hay bHLH) và WD40 (hình 1.3) [36].

Hình 1.3. Ba nhóm gen điều hòa tham gia tổng hợp anthocyanin ở ngô (theo

Hartmann và cs, 2005 [28]). ACE (ACGT- containing element): điểm bám của
bZip; MRE (MYB-recognition element), RRE (R response element): điểm nhận
biết và bám của MYB và bHLH); Anthocyanin structural gene: gen cấu trúc.
Các gen thuộc họ MYB điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin ở ngô đã
được nghiên cứu nhiều gồm các gen C1 (colorless1), P1 (Pericarp color1), và
Pl (purple leaf). Trong khi các gen thuộc họ MYC được nghiên cứu gồm B
(booster), R (red), Sn và Lc (Leaf color). Trong đó, gen R nằm trên nhiễm sắc
thể số 10 còn gen Lc và Sn nằm trên nhiễm sắc thể số 2. Mỗi gen xác định
một sắc tố cụ thể ở các bộ phận khác nhau của hạt giống và cây trồng. Các
trình tự gen này trong họ khá tương đồng với nhau [55].
Nhóm bHLH được đặc trưng với hai vòng xoắn α được nối với nhau bởi
một vòng lặp (bHLH). Các thành viên của họ này có hai vùng bảo thủ với 60
axít amin. Tính linh hoạt của vòng lặp cho phép sự “dimer” hóa xảy ra bằng
cách gấp và úp vòng xoắn bé hơn lên vòng xoắn còn lại (hình 1.4). Đầu N của
phân tử protein thường có vòng xoắn lớn hơn và là vùng gắn với DNA. Protein
bHLH thường liên kết với một trình tự bảo thủ E- box là CAYRMK, trong đó
Y có thể là C hay T, R có thể là A hay G, M có thể là A hay C, và K có thể là G
hay T. E- box khác nhau ở các phân họ khác nhau [27]. Đầu C có nhiệm vụ liên
kết với các protein khác tạo thành homodimer và phức heterodimer. Vị trí của
15