Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học từ lá cây trứng cá muntingia calabura l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
-----------------------------

PHẠM HỮU TUẤN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH
HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA
CALABURA L.

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 60420201

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng…năm 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
-----------------------------

PHẠM HỮU TUẤN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH
HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA
CALABURA L.

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 60420201

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN NGỌC HỒNG
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng…năm 2017


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM
ngày 11 tháng 11 năm 2017
Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

TT

Họ và tên

Chức danh Hội đồng

1

PGS TS. Nguyễn Tiến Thắng

Chủ tịch

2

TS. Nguyễn Hoàng Dũng

Phản biện 1

3

PGS TS. Thái Văn Nam

Phản biện 2

4

TS. Võ Đình Lệ Tâm

Ủy viên

5

TS. Nguyễn Thị Hai

Ủy viên, Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa
(nếu có).
Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV


TRƯỜNG ĐH CƠNG NGHỆ TP. HCM

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..…

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: ...............Phạm Hữu Tuấn...............................Giới tính: Nam .................
Ngày, tháng, năm sinh: ............18/04/1993................................Nơi sinh: TP.HCM..........
Chuyên ngành: .....................Công nghệ sinh học......................MSHV: 1541880011 ......
I- Tên đề tài:
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT
TÍNH SINH HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA CALABURA L.
II- Nhiệm vụ và nội dung:
Nhiệm vụ: Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học của lá
cây trứng cá.
Nội dung: Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, định tính thành phần hóa học bằng phương
pháp hóa, khảo sát năng chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn, khả năng điều hòa đường
huyết, khả năng giải độc gan, khả năng điều trị tiêu chảy, định tính một số thành phần
hóa học nhờ sắc ký cao áp ghép khối phổ.
III- Ngày giao nhiệm vụ: (Ngày bắt đầu thực hiện LV ghi trong QĐ giao đề tài)
15/02/2017
IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/08/2017
V- Cán bộ hướng dẫn: (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên)
Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký)


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng
trình nào khác.
Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên thực hiện Luận văn


ii

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại
học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, q thầy cơ giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh
học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức
quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.
Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Ngọc Hồng
người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cơ ở
Phịng Thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Thực phẩm - Mơi trường cùng các bạn
đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt đề tài của
mình.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã ln bên cạnh, động viên
con những lúc khó khăn, nản lịng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như
trong cuộc sống.

iii

TÓM TẮT
Cây trứng cá (Muntingia calabura) được trồng nhiều ở miền Nam Việt Nam
và thường dùng để làm bóng mát nhưng hoạt tính sinh học ít được nghiên cứu. Trong
nghiên cứu này dịch chiết ethanol 70% (EMC70), ethanol 90% (EMC90) và dịch
chiết nước (AMC) từ lá cây trứng cá được sử dụng để đánh giá sơ bộ thành phần hóa
học và khảo sát một số hoạt tính sinh học bao gồm: Khả năng chống oxi hóa, khả
năng kháng khuẩn, khả năng điều hòa đường huyết, khả năng trị tiêu chảy, khả năng
giải độc gan đồng thời định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp
LC-MS/MS. Kết quả định tính cho thấy có nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid,
tannin và steroid trong các dịch chiết EMC70 và EMC90, trong khi AME chứa
saponin và amino acid tự do. Kết quả định tính cũng cho thấy hàm lượng pholyphenol,
flavonoid và tannin tổng số trong dịch chiết EMC70 là cao nhất. Khả năng kháng
khuẩn của EMC70 và EMC90 là tương đương nhau đối với các chủng E.coli-ETEC,
Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Listeria innocua và Staphylococcus
aureus. Dịch chiết EMC90 có khả năng hạ đường huyết tốt nhất trong tổng số 2 loại
dịch chiết còn lại tại nồng độ 200 mg/kg. Khả năng ức chế tiêu chảy của dịch chiết
EMC70 tại nồng độ 750 mg/kg lên tới 78,87 % và tương đương với đối chứng
loperamide 3 mg/ml. Khả năng giải độc gan của 3 loại dịch chiết được xác định dựa
trên chỉ số men gan ALT và AST. Dịch chiết EMC70 tại nồng độ 50 mg/kg với kết
quả giá trị ALT giảm đáng kể so với lúc trước khi được chữa trị. Phân tích HPLCMS của dịch chiết EMC70 cho kết quả hướng tới sự hiện diện của chrysoeriol có khả
năng bảo vệ gan nhiễm độc cũng như tác động tích cực trong điều trị bệnh tiểu đường.
Một số chất khác thuộc nhóm flavonoid cũng được tìm thấy trong dịch chiết này. Kết
quả tổng hợp cho thấy cây Muntingia calabura có hoạt tính chống oxi hóa, tiềm năng
kháng khuẩn đối với một số chủng vi sinh gây bệnh đường ruột, khả năng trị tiêu
chảy, điều hòa đường huyết và bảo vệ gan của dịch chiết ethanol.

iv

ABTRACT
Muntingia calabura L. was grown in southern Vietnam. Until now there are
not many scientific articles published on the bioactivity of Muntingia calabura
leaves. In this study, ethanol 70% extract (EMC70), ethanol 90% extract (EMC90)
and aqueous extract (AMC) from Muntingia calabura leaves are used to test
phytochemical and evaluation of bioactivities such as antioxidant, antimicrobial
activity, hypoglycemia, anti-diarrhea and hepatoprotective activity. Determination of
compounds by high performance liquid chromatography ‒ mass spectrometry
(HPLC/MS). The result of phytochemical screening showed that phenolics,
flavonoids, tannins and steroids in EMC70 and EMC90. AMC with saponins and free
amino acids. Result of EMC70 in total polyphenol content, total flavonoid content
and total tannin content were highest. Antimicrobial activity of EMC70 and ECM90
were the same in E.coli-ETEC, Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Listeria
innocua and Staphylococcus aureus. Anti-diarrhea activity of EMC70 was reached
78.87% and it was equivalent to the group was treated by loperamide 3 mg/ml.
Hepatoprotective activity of EMC70, EMC90 and AMC was determined based on
ALT and AST. EMC70 resulted in a significant reduction in ALT at 50 mg/kg
compared with prior to treatment. Qualitative HPLC/MS analysis of EMC70 was
showed the results toward the presence of chrysoeriol that is capable of protecting the
liver from toxicity as well as positive effects in treatment of diabetes. Other flavonoid
compounds were found in this extract. The results in this study were showed that
Muntingia calabura had antioxidant activity, potential antimicrobial activity, antidiarrhea activity, hypoglycemia and hepatoprotective activity of ethanol extracts.


v

MỤC LỤC

TRANG
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii
TÓM TẮT ................................................................................................................ iii
ABTRACT ................................................................................................................ iv
MỤC LỤC .................................................................................................................. v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... ix
DÁNH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... x
DANH SÁCH CÁC HÌNH.................................................................................... xiii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
1.1. Tổng quan về cây Muntingia calabura ............................................................. 4
1.1.1. Nguồn gốc ......................................................................................................... 4
1.1.2. Phân loại ........................................................................................................... 4
1.1.3. Đặc điểm chung của cây Muntingia calabura ................................................ 4
1.1.4. Công dụng ........................................................................................................ 6
1.1.5. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây Muntingia calabura ......... 6
1.1.6. Cây trứng cá và các bài thuốc dân gian .......................................................... 8
1.1.7. Các nghiên cứu trong và ngoài nước .............................................................. 9
1.2.Tổng quan về chất chống oxi hóa .................................................................... 11
1.2.1. Khái niệm chất chống oxi hóa ....................................................................... 11
1.2.2. Cơ chế chống oxi hóa của các hợp chất tự nhiên ........................................ 11
1.2.3. Một số chất tự nhiên từ thực vật có khả năng chống oxi hóa ..................... 11
1.3. Vi sinh vật chỉ thị.............................................................................................. 12
1.3.1. Nhóm vi khuẩn thuộc dịng Escherichia....................................................... 12
1.3.2. Nhóm vi khuẩn thuộc dịng Listeria .............................................................. 13
1.3.3. Nhóm vi khuẩn thuộc dịng Shigella ............................................................. 15
1.3.4. Nhóm vi khuẩn thuộc dịng Staphylococcus ................................................. 17
1.4. Hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ................................................................ 19
1.4.1. Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật .............................................. 19

vi

1.4.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật ...................................... 19
1.5. Giới thiệu về bệnh tiểu đường ......................................................................... 22
1.5.1. Khái niệm........................................................................................................ 22
1.5.2. Phân loại ......................................................................................................... 23
1.5.3. Thuốc trị tiểu đường glibenclamide .............................................................. 24
1.6. Giới thiệu về bệnh tiêu chảy ............................................................................ 25
1.6.1. Khái niệm........................................................................................................ 26
1.6.2.Nguyên nhân gây bệnh ................................................................................... 26
1.6.3. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy ............................................................................. 28
1.6.4. Cơ chế gây tiêu chảy bằng tác nhân castor oil ............................................. 29
1.6.5. Thuốc trị tiêu chảy loperamide ...................................................................... 29
1.7. Giới thiệu các bệnh về gan và acetaminophen .............................................. 30
1.7.1. Các bệnh về gan ............................................................................................. 30
1.7.2. Các loại enzyme của gan ................................................................................ 30
1.7.3. Cơ chế gây độc gan của acetaminophen ....................................................... 31
1.7.4. Thuốc giải độc gan Silymarin........................................................................ 33
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 34
2.1.Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 34
2.1.1. Thời gian......................................................................................................... 34
2.1.2. Địa điểm .......................................................................................................... 34
2.2. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 34
2.2.1. Nguyên liệu thực vật ...................................................................................... 34
2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị ........................................................................................... 34
2.2.3. Đối tượng động vật ......................................................................................... 34
2.2.4. Hóa chất, dụng cự và thiết bị ......................................................................... 34
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 35

2.3.1. Thu hái và xử lý mẫu ..................................................................................... 35
2.3.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn dược liệu .............................................. 35
2.3.3. Phương pháp xác định thành phần hóa học ................................................ 38
2.3.4. Hàm lượng flavonoid tổng số ........................................................................ 39
2.3.5. Hàm lượng phenolic tổng số ......................................................................... 39


vii

2.3.6. Hàm lượng tannin tổng số ............................................................................. 39
2.3.7. Phương pháp FRAP....................................................................................... 39
2.3.8. Khả năng chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH ........................................... 40
2.3.9. Phương pháp xác định năng lực khử ........................................................... 40
2.3.10. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................................ 40
2.3.11. Xác định độc tính cấp diễn .......................................................................... 40
2.3.12. Mơ hình chuột tiểu đường cấp tính............................................................. 41
2.3.13. Mơ hình cḥt bi ̣nhiễm đợc acetaminophen ............................................. 41
2.3.14. Mơ hình chuột tiêu chảy castor oil ................................................................. 41
2.3.15. Phương pháp sắc ký cao áp ghép khối phổ (HPLC-MS) ........................... 41
2.3.16. Xử lý số liệu .................................................................................................. 41
2.4. Bố trí thí nghiệm............................................................................................... 41
2.4.1. Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết EMC70, EMC90 và AMC từ cây
Muntingia calabura.................................................................................................. 43
2.4.2. Thí nghiệm 2: Định tính một số thành phần hóa học có trong cây ............ 43
2.4.3. Thí nghiệm 3: Hàm lượng flavonoid tổng số................................................ 46
2.4.4. Thí nghiệm 4: Hàm lượng phenolic tổng số ................................................. 46
2.4.5. Thí nghiệm 5: Hàm lượng tannin tổng số .................................................... 47
2.4.6. Thí nghiệm 6: Khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp FRAP ........... 47
2.4.7. Thí nghiệm 7: Khả năng chống oxi hóa qt gốc tự do DPPH ................... 48
2.4.8. Thí nghiệm 8: Xác định năng lực khử .......................................................... 49

2.4.9. Thí nghiệm 9: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70,
EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura .......................................................... 51
2.4.10. Thí nghiệm 10: Xác định độc tính cấp diễn ................................................ 52
2.4.11. Thí nghiệm 11: Mơ hình chuột tiểu đường cấp tính .................................. 53
2.4.12. Thí nghiệm 12: Mơ hình cḥt bi ̣nhiễm đợc acetaminophen ................... 54
2.4.13. Thí nghiệm 13: Mơ hình chuột tiêu chảy castor oil ................................... 55
2.4.14. Thí nghiệm 14: Định tính bằng phương pháp sắc ký sắc ký lỏng cao áp
ghép khối phổ HPLC................................................................................................ 56
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................ 57
3.1. Bước đầu góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu ...................................... 57
3.1.1. Khảo sát vi phẩu và soi bột dược liệu ............................................................ 57


viii

3.1.2. Độ tinh khiết của dược liệu ........................................................................... 61
3.1.3. Hàm lượng cắn thu được từ dịch chiết lá cây trứng cá ............................... 62
3.2. Thành phần hóa học có trong cây Muntingia calabura ................................ 62
3.3. Định lượng flavonoid phenolic và tannin ....................................................... 65
3.4. Khả năng chống oxy hóa.................................................................................. 65
3.4.1. Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP ..................................... 65
3.4.2. Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp xác định năng lực khử.......... 67
3.4.3. Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ........................................... 68
3.5. Hoạt tính kháng khuẩn .................................................................................... 72
3.5.1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Muntingia calabura ............ 72
3.5.2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC . 76
3.6. Độc tính cấp diễn .............................................................................................. 79
3.7. Khả năng điều hịa đường huyết trên mơ hình chuột tiểu đường cấp tính 80
3.8. Khả năng trị tiêu chảy trên mơ hình castor oil ............................................. 82
3.9. Khả năng giải độc gan trên mô hình acetaminophen ................................... 85

3.10. Phân tích sắc kí HPLC-MS ........................................................................... 89
KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 93
4.1. Kết luận ............................................................................................................. 93
4.2. Đề nghị............................................................................................................... 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 95


ix

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AMC: Aqueous extract of Muntingia calabura (Dịch chiết nước từ lá cây Muntingia
calabura)
EMC70: 70% ethanol extract of Muntingia calabura (Dịch chiết ethanol 70% từ lá
cây Muntingia calabura)
EMC90: 90% ethanol extract of Muntingia calabura (Dịch chiết ethanol 70% từ lá
cây Muntingia calabura)
FRAP: Ferric reducing antioxidant power (Khả năng chống oxi hóa thơng qua việc
khử sắt).
HPLC/MS: High performance liquid chromatography / mass spectrometry (Sắc ký
lỏng cao áp ghép khối phổ)
PSMs: Plant secondary metabolites: (Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật)


x

DANH MỤC CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 1.1. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật............................ 20
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................................. 52
Bảng 3.1. Độ ẩm của lá cây và bột dược liệu ........................................................... 61

Bảng 3.2. Định tính thành phần hóa học có trong Muntingia calabura L. .............. 63
Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol, flavonoid và tannin tổng số ............................... 65
Bảng 3.4. Kết quả tính tốn giá trị FRAP ................................................................. 66
Bảng 3.5. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng
chống oxi hóa theo phương pháp FRAP ................................................................... 66
Bảng 3.6. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng
chống oxi hóa theo theo năng lực khử ...................................................................... 68
Bảng 3.7. Kết quả IC50 chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ................................... 70
Bảng 3.8. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng
chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ......................................................................... 70
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100
mg/ml) đối với các chủng vi sinh vật khác ............................................................... 74
Bảng 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn từ cây Muntingia calabura L. tại nồng độ 100
mg/ml ........................................................................................................................ 75
Bảng 3.11. Nồng độ ức chế tối thiểu EMC70 ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml,
12.5 mg/ml ................................................................................................................ 77
Bảng 3.12. Nồng độ ức chế tối thiểu EMC90 ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml,
12.5 mg/ml ................................................................................................................ 77
Bảng 3.13. Nồng độ ức chế tối thiểu AMC ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5
mg/ml ........................................................................................................................ 78
Bảng 3.14. Kết quả phân tích một số hợp chất từ dịch chiết cây Muntingia calabura
bằng phương pháp sắc ký HPLC-MC ...................................................................... 89


xi

DANH MỤC CÁC HÌNH
TRANG
Hình 1.1. Ảnh chụp cây Muntingia calabura L ......................................................... 5
Hình 1.2. Mơ phỏng hình thái cây Muntingia calabura L ......................................... 5

Hình 1.3. Mơ phỏng cấu tạo bầu nhụy, nhị và cánh hoa ............................................ 6
Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa ............................................... 11
Hình 1.5. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử ................................................. 12
Hình 1.6. Khuẩn lạc E.coli trên mơi trường EMB ................................................... 13
Hình 1.7. Hình thái Listeria monocytogenes trên kính hiển vi điện tử .................... 14
Hình 1.8. Khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên mơi trường thạch thường .......... 14
Hình 1.9. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử ............................................. 15
Hình 1.10. Khuẩn lạc Shigella trên mơi trường Macconkey .................................... 16
Hình 1.11. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử................................ 17
Hình 1.12. Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker bổ sung
egg yolk ..................................................................................................................... 18
Hình 1.13. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm
................................................................................................................................... 20
Hình 1.14. Cơ sở đánh giá các loại phân .................................................................. 26
Hình 1.15. Sơ đồ chuyển hóa acetaminophen trong cơ thể ...................................... 32
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát ......................................................................................... 42
Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận cắn chiết từ cây Muntingia calabura .............................. 43
Hình 2.3. Quy trình định tính dịch chiết EMC70 EMC90 và AMC từ cây Muntingia
calabura .................................................................................................................... 44
Hình 2.4. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP .. 47
Hình 2.5. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ........ 48
Hình 2.6. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa theo năng lực khử ............. 50
Hình 2.7. Quy trình thực hiện khả năng kháng khuẩn ............................................. 51
Hình 2.8. Mơ hình chuột tiểu đường cấp tính .......................................................... 53
Hình 2.9. Mơ hình giải độc gan acetaminophen....................................................... 54
Hình 2.10. Mơ hình tiêu chảy castor oil ................................................................... 55
Hình 3.1. Lơng tiết.................................................................................................... 57
Hình 3.2. Mặt cắt biểu bì lá ...................................................................................... 57

xii

Hình 3.3 A. Mặt cắt ngang thân B. Mặt cắt dọc thân ............................................... 58
Hình 3.4. Mặt cắt dọc hoa cây Muntingia calabura. ................................................ 58
Hình 3.5 A. Cấu tạo nhị hoa. B. Chỉ nhị C. Bao phấn ............................................. 59
Hình 3.6. Hình thái hạt phấn .................................................................................... 59
Hình 3.7. Bề mặt cánh hoa ....................................................................................... 60
Hình 3.8. Cấu tạo nỗn ............................................................................................. 60
Hình 3.9. Bột dược liệu ............................................................................................ 61
Hình 3.10. Hàm lượng của 3 loại cắn thu được từ lá cây Muntingia calabura........ 62
Hình 3.11. A Định tính saponin B. Định tính flavonoid (thử nghiệm shinoda), C.
Định tính alkaloid trên AMC, D. Định tính amino acid trên AMC, E. Định tính
phenolic, F. Định tính steroid. .................................................................................. 64
Hình 3.12 Đường chuẩn Fe2+-TPTZ ......................................................................... 66
Hình 3.13. Khả năng khử của 3 dịch chiết EMC70, EMC90, AMC và đối chứng acid
ascorbic...................................................................................................................... 67
Hình 3.14. Đường chuẩn acid ascorbic nồng độ từ 20 đến 70 µg/ml ...................... 68
Hình 3.15. Hoạt tính quét gốc tự do ở các nồng độ từ cây Muntingia calabura ..... 69
Hình 3.16. Hoạt tính chống oxi hóa của acid ascorbic ............................................. 69
Hình 3.17. Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do của EMC70 ở các nồng độ khác
nhau ........................................................................................................................... 70
Hình 3.18. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100
mg/ml) đối với chủng E.coli-ETEC. ......................................................................... 73
Hình 3.19. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100
mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri và Shigella boydii. ..................................... 73
Hình 3.20. A. Hoạt tính kháng khuẩn của EMC90 (100 mg/ml) đối với chủng Shigella
flexneri, B. AMC (100 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes, C. EMC70
(100 mg/ml) đối với chủng E.coli-ETEC, D. EMC70 (100 mg/ml) đối với chủng
Staphylococcus aureus .............................................................................................. 76
Hình 3.21. Chỉ số đường huyết của các nhóm chuột uống cao chiết, nhóm tăng đường,

đối chứng và glibenclamide 10 mg/kg ...................................................................... 80
Hình 3.22. Tỷ lệ ức chế tiêu chảy............................................................................. 82
Hình 3.23. Thời gian tiêu chảy ................................................................................. 83
Hình 3.24. Chỉ số men gan ALT của các nhóm chuột uống dịch chiết EMC70,
EMC90, AMC, sylimarin, nhóm tăng men gan và nhóm chuột đối chứng .............. 86


xiii

Hình 3.25. Chỉ số men gan AST của các nhóm chuột uống dịch chiết EMC70,
EMC90, AMC, sylimarin, nhóm tăng men gan và nhóm chuột đối chứng .............. 87
Hình 3.26. Sắc ký đồ HPLC-MS dịch chiết EMC70 từ lá cây Muntingia calabura 90


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây thuốc dân gian từ lâu đã được nhiều người quan tâm đến. Từ những năm
đầu thế kỷ XX con người ta đã biết sử dụng thực vật như một nguồn thuốc chữa bệnh
bằng kinh nghiệm dân gian. Theo đà phát triển của lịch sử, kho tàng kinh nghiệm dân
gian phòng chống bệnh tật ngày càng phong phú và đa dạng. Đây là nguồn tài nguyên
thực vật có giá trị cao trong việc phịng chữa nhiều loại bệnh thay cho một số loại
thuốc Tây y. Trong chẩn đoán và điều trị bệnh, một số loại thuốc Tây y luôn đi kèm
với nhiều tác dụng phụ không mong muốn như nơn mửa, rối loạn tiêu hóa, chóng
mặt, nhức đầu, có nguy cơ tái bệnh,… Bên cạnh một hiện trạng thực tế là việc kháng
thuốc kháng sinh ngày càng trở nên phổ biến ở các nước phát triển thì việc tìm đến
các loại thảo dược thiên nhiên để chữa bệnh thay cho các loại thuốc tây là điều tất
yếu và dần đang trở thành một xu thế. Trong những năm trở lại đây, từ xu hướng sử
dụng các loại cây thuốc dân gian để chữa bệnh, các nước phát triển đầu tư vào nghiên

cứu nhiều loại cây thuốc dân gian nhằm tách chiết cũng như trích ly các hợp chất thứ
cấp có hoạt tính sinh học để tìm ra hướng ứng dụng và điều chế nhiều loại thuốc mới.
Cây mật sâm (trứng cá) trên một số nghiên cứu trên thế giới có tác dụng
chống oxi hóa, kháng khuẩn cùng với kháng viêm. Tại Việt Nam, cây trứng cá chủ
yếu được trồng khắp nơi để làm bóng mát với số lượng đáng kể, nhưng hoạt tính sinh
học ít được nghiên cứu đến. Thậm chí, ở nhiều nơi cịn bắt đầu chặt phá lồi cây này.
Tannin, một thành phần hóa học được biết đến với khả năng ức chế quá trình tiêu
chảy được tìm thấy nhiều trong cây trứng cá nhưng cho tới hiện nay vẫn chưa có bất
cứ nghiên cứu nào liên quan tới khả năng này. Nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu
tiềm năng trong chữa trị một số bệnh cũng như khẳng định tầm quan trọng cây trứng
cá trong từ điển trị liệu Đông y. Chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Bước đầu
nghiên cứu thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học từ lá cây trứng cá
Muntingia calabura L.” nhằm tìm hiểu sâu hơn về tác dụng sinh học, cũng như hướng


2

ứng dụng thực tiễn cùng với khả năng chữa bệnh của cây trứng cá theo một góc nhìn
khoa học.
2. Mục đích
Đánh giá một số thành phần hóa học có trong cá dịch chiết từ cây Muntingia
calabura.
Khảo sát một số hoạt tính sinh học tiềm năng trong dịch chiết từ cây
Muntingia calabura.
3. Nội dung nghiên cứu
Đánh giá sơ bộ hoạt tính hóa học.
Khảo sát khả năng chống oxy hóa của cây Muntingia calabura.
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các dịch chiết từ lá cây Muntingia calabura.
Đánh giá khả năng hạ đường huyết của cây Muntingia calabura trên mơ hình
động vật.

Đánh giá khả năng trị tiêu chảy của cây Muntingia calabura trên mơ hình
động vật
Đánh giá khả năng bảo vệ gan chống lại chất độc từ cây Muntingia calabura.
Định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp HPLC/MS.
4. Ý nghĩa khoa học
Lá cây Muntingia calabura có hoạt tính chống oxi hóa, kháng một số vi
khuẩn gây hại ở đường ruột, có tiềm năng bảo vệ gan và ổn định đường huyết.
Bên cạnh đó, hoạt tính lá cây Muntingia calabura có tiềm năng phịng ngừa
và hỗ trợ điều trị bệnh tiêu chảy mà các nghiên cứu trong và ngoài nước chưa thấy
nghiên cứu về tác dụng sinh học này.
5. Ý nghĩa thực tiễn


3

Nguyên liệu lá cây Muntingia calabura trong nghiên cứu có tác dụng điều
hòa đường huyết, giải độc gan cũng như chống lại một số chủng gây bệnh đường ruột
hỗ trợ điều trị tiêu chảy nên có thể ứng dụng làm thực phẩm chức năng. Một sản phẩm
hướng ứng dụng của lá cây này là làm trà thảo mộc ngăn ngừa béo phì và các biến
chứng về tim mạch, ngăn ngừa các bệnh về gan và tốt cho hệ tiêu hóa. Sản phẩm này
mang lại hiệu quả về mặt kinh tế vì có nguồn ngun liệu phong phú, giá rẻ. Nghiên
cứu cũng chứng minh được hoạt tính dược lý của bộ phận lá nên cũng góp phần tạo
nên thu nhập cho người dân trồng loại cây này.
6. Phạm vi nghiên cứu
Khảo sát chỉ giới hạn trên đối tượng là bộ phận lá
Các khảo sát chỉ thực hiện trên 3 loại dung môi ethanol 70%, ethanol 90% và
nước.
Giới hạn khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chỉ trên 9 chủng vi sinh vật chỉ thị
Khảo sát khả năng giải độc gan chỉ dựa trên 2 loại enzyme alanine
transaminase và aspartate transaminase

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây Muntingia calabura L.
1.1.1. Nguồn gốc
Cây trứng cá hay còn gọi là cây mật sâm có tên khoa học là Muntingia
calabura, thuộc họ Elaeocarpaceae (Morton, 1987), loài duy nhất của giống
Muntingia, là cây có hoa ở phía nam Mexico, Caribean, trung Mỹ và đông nam Mỹ,
các quần đảo Bắc Mỹ, các mẫu cây cịn được tìm thấy ở Jamaica. Ngồi ra nó cịn
được trồng ở khu vực ấm áp như Ấn Độ hay một số quốc gia trong khu vực Đông
Nam Á như Malaysia, Indonesia, Philippines và Việt Nam (Jensen, 1999). Lá, vỏ cây
và hoa có giá trị làm thuốc chữa bệnh.
1.1.2. Phân loại
Giới (regnum)

Plantae

(không phân hạng)

Angiospermae

(không phân hạng)

Eudicots

(không phân hạng)

Rosids

Bộ (ordo)

Malvales

Họ (familia)

Muntingiaceae

Chi (genus)

Muntingia

Loài (species)

Muntingia calabura L.

1.1.3. Đặc điểm chung của cây Muntingia calabura
Muntingia calabura là loài cây mọc phát triển nhanh chóng chiều cao có thể
đạt được từ 7,5 - 12 m, cùng với cành dang rộng xung quanh. Lá dài 5 – 12,5 cm
thuông dài nhọn ở cuối lá, mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt sau lá có nhiều lơng tơ
nhỏ mịn. Hoa nhỏ mọc nơi lá, gắn vào các nhánh, hoa rộng 1,25 – 2 cm, hoa mau tàn
khoảng một ngày, thường rụng vào buổi chiều. Cây mọc nhiều trái nhỏ 1 – 1,25 cm,


5

quả Muntingia calabura có màu xanh, vàng và đỏ khi chín, bề mặt nhẵn bóng và
mỏng, quả chứa nhiều hạt nhỏ li ti có vị ngọt và mùi thơm đặc trưng (Morton, 1987).

Hình 1.1. Ảnh chụp cây Muntingia calabura
(David H. Lorence)

Hình 1.2. Mơ phỏng hình thái cây Muntingia calabura
(J.S. Kerner)


6

Hình 1.3. Mơ phỏng cấu tạo bầu nhụy, nhị và cánh hoa
1.1.4. Công dụng
Cây trứng cá được sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau nhưng chủ yếu
được dùng nhiều trong thực phẩm và trong y học. Quả Muntingia calabura được ăn
trực tiếp khi vừa hái khỏi cây. Chúng cũng có thể được nấu chín trong bánh nướng
hoặc làm thành mứt quả. Lá cây có thể được ứng dụng làm trà hoặc làm tăng hương
vị của trà khi ngâm trong nước ấm (Zakaria và ctv, 2007).
1.1.5. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây Muntingia calabura
1.1.5.1. Saponin
Saponin thuộc nhóm glycosides, dưới tác dụng của các enzyme thực vật, vi
khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần
glucid thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong
aceton, ether, hexan, hòa tan vào nước từ đó làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch
và tạo bọt. Phát hiện trong mẫu có saponin bằng thử nghiệm lắc tạo bọt.
Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi
lỏng), một số saponin có tác dụng chống viêm, một số có tác dụng kháng khuẩn,
kháng nấm, ức chế virus, kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt (Hoàng Sầm và Hứa
Văn Thao, 2012).
1.1.5.2. Flavonoid
Flavonoid là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc
của hoa, giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa. Bộ khung cơ bản gồm 2

vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon, có độ tan khơng giống


7

nhau. Flavonoid glycosid, flavonoid sulfat khơng tan hoặc ít tan trong dung môi hữu
cơ, tan được trong nước, cồn, aglycon flavonoid tan trong dung môi hữu cơ, không
tan trong nước. Flavonoid được phân loại dựa trên vị trí của gốc aryl đính vào.
Flavonoid được xác định bằng các thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm acid clohydric
và thử nghiệm Benidict.
Flavonoid có vai trị là chất bảo vệ, chống oxy hố, bảo tồn acid ascorbic
trong tế bào, ngăn cản 1 số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng…),
tham gia q trình lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa.
Một số hợp chất Flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn có thể kể đến như
catechin. Chúng là một trong những hợp chất flavonoid có khả năng ức chế Vibrio
cholera, Streptococcus mutans, Shigella và một số vi sinh vật khác. Catechin hoạt
động bằng cách vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế enzyme
glucosyltransferase của Streptococcus mutans, cơ chế hoạt động là do khả năng tạo
phức không thuận nghịch với các amino acid ái nhân trong protein từ đó làm bất hoạt
chức năng gây bệnh của protein trong vi sinh vật. Galangin có hoạt tính chống lại vi
khuẩn Gram dương cũng như nấm sợi và virus, đặc biệt là HSV-1 và Coxsackie B
type I (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010).
1.1.5.3. Tannin
Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết
bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và
alkaloid), có vị chát, tan trong nước, kiềm lỗng, cồn, glycerin và aceton, đa số không
tan trong các dung môi hữu cơ, tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân,
kẽm, sắt). Có thể chia tannin làm hai loại tannin thủy phân được (Tannin pyrogalic)
và tannin không thủy phân được (Tannin pyrocatechic). Tannin thủy phân được thì
được thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo thành phần đường (glucose) và

phần không đường (các acid), nối với nhau theo dây nối este, tủa xanh đen với muối
sắt III, dễ tan trong nước, ví dụ: Ðại hồng, Ðinh hương, lá cây Bạch đàn. Tannin
khơng thủy phân được thì dễ tạo thành chất phlobaphen không tan, thường là chất


8

trùng hợp từ catechin (hoặc từ leucoanthoxyanidin), (hoặc là những chất đồng trùng
hợp của hai loại), tủa xanh với muối sắt III, ví dụ: Vỏ Quế, Ơ mơi, Ðại hồng. Tannin
thường được định tính bằng thử nghiệm Gelatin, thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm
FeCl3, thử nghiệm KMnO4.
Tannin có vai trị bảo vệ thực vật khỏi các lồi cơn trùng, tác dụng như thuốc
trừ sâu, tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng, công dụng chữa
viêm ruột, tiêu chảy.
1.1.5.4. Terpen
Terpen là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon của terpen được
tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8, terpen có nhiều ở thực vật đặc biệt là lồi
họ thơng. Terpen có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và các động vật nguyên
sinh (Nguyễn Tiến Thắng, 2011).
1.1.6. Cây trứng cá và các bài thuốc dân gian
Theo y học cổ truyền, lá cây trứng cá có thể được sử dụng như trà để điều trị
viêm, sưng và hạ sốt. Lá trứng cá cũng có thể giúp bảo vệ tim khỏi các cơn đau do có
chứa chất chống oxy hóa ngăn ngừa viêm động mạch dẫn đến nhồi máu cơ tim. Cây
trứng cá chứa một lượng lớn oxit nitric, một hóa chất tự nhiên giúp làm giãn mạch
máu, giúp máu lưu thông, hạ huyết áp. Quả trứng cá có chứa nhiều hợp chất kháng
khuẩn mạnh, biến nó trở thành nguồn chất kháng khuẩn mới nên nó đặc biệt tốt cho
điều trị nhiễm trùng tụ cầu khuẩn, Staphylococcus epidermidis, Proteus vulgaris,
Kocuria rhizophila, Corynebacterium diphtheriae và các vi khuẩn khác nên người
xưa thường dùng dịch chiết đắp lên các vết thương tránh nhiễm trùng (Nhật Linh,
2015). Đây là điều quan trọng vì hiện nay có rất nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh. Ở

Campuchia cũng như ở Việt Nam cụ thể là tỉnh Khánh Hòa, rễ cây được dùng phối
hợp với các vị thuốc khác làm thuốc điều kinh và trị các bệnh về gan. Qua nhiều thế
kỷ, nhiều quốc gia sử dụng quả trứng cá để ngăn chặn cơn đau liên quan với bệnh
gout, ăn 9-12 quả trứng cá ba lần một ngày có tác dụng tốt cho điều trị cơn đau. Quả
trứng cá có chứa một số lượng lớn vitamin C là một chất chống oxy hóa mạnh giúp