Bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét plasmodium spp và hướng ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

TRẦN MINH QUÍ

BẢO TỒN CHỦNG KÝ SINH TRÙNG
SỐT RÉT Plasmodium spp.
và HƯỚNG ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 60420201

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

TRẦN MINH QUÍ

BẢO TỒN CHỦNG KÝ SINH TRÙNG
SỐT RÉT Plasmodium spp.
và HƯỚNG ỨNG DỤNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 60420201

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2017


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM
ngày 1 tháng … năm …
Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

TT
1
2
3
4
5

Họ và tên

Chức danh Hội đồng
Chủ tịch
Phản biện 1
Phản biện 2
Ủy viên
Ủy viên, Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa
chữa (nếu có).
Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV


TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM
VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..…

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: TRẦN MINH QUÍ

Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 10/02/1991

Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

MSHV: 1541880009

I- Tên đề tài:
Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng.
II- Nhiệm vụ và nội dung:
 Thu thập và bảo tồn nguồn chủng KST SR bằng cách nuôi cấy chủng KST SR

và bảo quản chủng KST SR trong Nitơ lỏng.
 Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được.
III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2017
IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ:
V- Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS, NGUYỄN TIẾN THẮNG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan nghiên cứu “Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét
Plasmodium spp. và hướng ứng dụng” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng.
Đề tài được thực hiện tại khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký sinh
trùng – Côn trùng Tp. Hồ Chí Minh. Các số liệu, kết quả, đánh giá đưa ra trong luận
văn chưa được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây.
Những kết quả nghiên cứu, số liệu của tác giả khác trích dẫn trong luận văn
này điều được chú thích đầy đủ.
Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm với nhà trường về cam đoan này.
Học viên thực hiện Luận văn
(Ký và ghi rõ họ tên)


ii

LỜI CÁM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn:
Trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh; Ban lãnh đạo Viện Sốt rét –
Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh; Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện
Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện
cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng là người Thầy trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành
luận văn.
Các anh chị đồng nghiệp Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ
Chí Minh, Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, cùng bạn bè, và gia đình đã động viên, giúp đỡ
em trong quá trình hoàn thành luận văn này.
(Họ và tên của Tác giả Luận văn)


iii

TÓM TẮT
Đặt vấn đề:
Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra, bệnh thường
gặp ở các nước thuộc khu vực nhiệt đới. Bệnh truyền từ người bệnh qua người
lành nhờ vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi đòn xóc (muỗi Anopheles). Hiện
nay, có 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người là: Plasmodium
falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, và
Plasmodium knowlesi. Bệnh SR là vấn đề y tế ảnh hưởng đến sức khỏe, điều kiện
kinh tế của người dân sống trong vùng sốt rét lưu hành. Trong những năm gần
đây, tình hình KST SR có chiều hướng giảm mạnh, do đó việc bảo tồn chủng KST
SR Plasmodium spp. là vấn đề quan trọng để phục vụ cho các nghiên cứu đến KST
SR sau này.
Đề tài “Bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp. và hướng ứng

dụng” đã được tiến hành từ tháng 2/2017 đến tháng 8/2017.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là: Bảo tồn nguồn chủng KST SR, bước đầu
xây dựng ngân hàng Gene KST SR và hướng ứng dụng. Đồng thời tiến hành nuôi
cấy chủng KST SR tại phòng thí nghiệm.
Đề tài tập trung vào các nội dung sau:
 Thu thập, lưu trữ và bảo tồn nguồn chủng KST SR trong Nitơ lỏng.
+ Nuôi cấy chủng KST SR tạo chủng thuần tại phòng thí nghiệm các
nguồn máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và
Plasmodium vivax đơn thuần được thu thập từ thực địa.
+ Lưu trữ nguồn mẫu KST SR từ các mẫu thu thập được trong nghiên
cứu, thử nghiệm,...
 Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được.
+ Chạy PCR định danh những mẫu máu nhiễm KST SR.
+ Giải trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome đặc trưng cho từng loài
KST SR.


iv

+ Giải trình tự đoạn Gene kháng thuốc artemisinin đối với chủng
Plasmodium falciparum
Phương pháp thực hiện đề tài:
Đề tài chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu tại tỉnh Bình Phước, đây là vùng
dịch tể SR lưu hành nặng ở khu vực Nam bộ - Lâm Đồng cũng như cả nước.
Với kích cỡ mẫu là 30 mẫu được khẳng định dương tính với KST SR bằng kỹ
thuật nhuộm Giêm – sa. Chúng tôi sẽ định danh lại các chủng thu thập được bằng
kỹ thuật Nested – PCR, giải trình tự. Các chủng được xác định nhiễm P.
falciparum, P. vivax đơn thuần bằng kỹ thuật Nested – PCR sẽ được tiến hành
nuôi cấy dài ngày chủng KST SR bằng phương pháp nuôi bình nến của Trager và
Jensen (1976) với hồng cầu người, môi trường RPMI 1640, 10% huyết thanh AB

trong điều kiện nồng độ 5% CO2 và O2 thấp, ở nhiệt độ 37°C.
Kết quả nghiên cứu:
Trong quá trình tiến hành đề tài, chúng tôi đã thu thập được 30 mẫu máu dương
tính với ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa, tiến hành định danh 30
mẫu KST SR bằng kỹ thuật Nested – PCR và giải trình tự các mẫu thu thập được tại
phòng thí nghiệm.
Bên cạnh đó, với 14 chủng KST SR nhiễm P. falciparum đơn thuần được phân
lập, chúng tôi tiến hành giải trình tự phát hiện 9/14 chủng KST SR P. falciparum
đơn thuần thu thập được tại Bình Phước có đột biến cánh quạt K13 liên quan đến
kháng artemisinin (chiếm 64,3% các chủng P. falciparum đơn thuần).
Với tần suất xuất hiện các điểm đột biến K13 cánh quạt liên quan đến kháng
artemisinin như sau: C447G có 1 chủng chiếm 7,1%; I543T có 1 chủng chiếm tỉ lệ
7,1%; P553L có 3 chủng chiếm 21,4%; C580Y có 4 chủng chiếm 28,6%. Trong đó
đột biến C580Y có tần suất xuất hiện cao ở Bình Phước, cũng như trong các nghiên
cứu khác ở khu vực Cam-pu-chia, Myanmar đã được công bố.


v

ABSTRACT
Background:
Plasmodium spp. is caused of malaria disease, a common disease in the tropical
countries. Disease is spreaded from patient to person healthy by mosquito (Anopheles
spp.). Currently, there are five species of malaria parasites infecting human:
Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium
ovale and Plasmodium knowlesi. Malaria disease is the issues affecting health and
economic conditions of people living in malaria endemic areas. In recent years, the
situation of malaria tends to decline, so conservation species malaria Plasmodium
spp. is very important to help malaria researchers in the future.
Study "Conservation of species Plasmodium spp. and applications" was

conducted from February to August in 2017.
The objective of this research is conservation malaria species, building initially
the bank Gene malaria and applications. Simultaneously, malaria species are cultured
in the Laboratory.
The subject focuses on the following:
 Collecting, storing and conserving strains of Plasmodium spp. in liquid
nitrogen.
+ Culturing Plasmodium strains to produce pure strains on blood at
Labratory, such as: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax isolated from
patients.
+ Plasmodium strains from this research are stored
 Analyzing the gene of malaria parasites from the samples collected.
+ Using PCR method to identify Plasmodium spp.
+ Anlayzing the gene translation to 18S Ribosomes for each species
Plasmodium.
+ Anlayzing the resistant artemisinin gene of P. Falciparum strains.


vi

Methods:
Our study collected samples in Binh Phuoc province, it is the endemic malaria
epidemiology in the South Vietnam - Lam Dong.
We found 30 samples positive with malaria by staining Giem - sa. We will
identifize strains by Nested – PCR method. And then, the strains of Plasmodium spp.
are cultured at Labratory by candle jar method of Trager and Jensen (1976) with
human erythrocytes, RPMI 1640 medium, 10% serum concentrations AB, in terms
5% of CO2 and O2 low, at a temperature 37°C. Finally, storing on liquid nitrogen.
Results:
In this study, we have collected 30 blood samples were positive for Plasmodium

spp. by staining Giem – sa method, identification 30 samples of malaria by Nested PCR method and analyzing DNA of samples at Labratory.
With 14 cases injected P. falciparum, we conducted to analyzing DNA to
detected P. falciparum malaria species on 9/14 samples collected in Binh Phuoc has
mutant K13 propeller involving artemisinin resistance (accounting for 64.3% of the
isolates of P. falciparum samples).
With the point mutatant of K13 propeller involving artemisinin resistance as:
C447G 1 strains accounted for 7.1%; 1 strains I543T proportion of 7.1%; P553L
strains accounted for 21.4% 3; C580Y 4 strains of 28.6%. C580Y have high
frequency appearance in Binh Phuoc, as well as in other studies in Cambodia,
Myanmar has been published.


vii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... I
LỜI CÁM ƠN............................................................................................................II
TÓM TẮT ............................................................................................................... III
ABSTRACT .............................................................................................................. V
MỤC LỤC ..............................................................................................................VII
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... X
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... XI
DANH MỤC CÁC HÌNH .....................................................................................XII
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2. Tính cấp thiết của đề tài........................................................................................ 1
1.3. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2
1.4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 2
1.5. Ý nghĩa đề tài ........................................................................................................ 3
1.5.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................... 3

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................ 4
1.6. Tổng quan về bệnh sốt rét .................................................................................... 4
1.6.1. Lịch sử phát hiện bệnh sốt rét ....................................................................... 4
1.6.2. Định nghĩa bệnh sốt rét ................................................................................. 5
1.6.3. Sơ lược về dịch tể học sốt rét ........................................................................ 8
1.6.3.1. Tình hình dịch tể sốt rét trên thế giới ...................................................... 8
1.6.3.2. Tình hình dịch tể sốt rét tại Việt Nam ................................................... 10
1.6.3.3. Tình hình dịch tể sốt rét tỉnh Bình Phước ............................................. 13
1.7. Chu kỳ và hình thể của ký sinh trùng sốt rét...................................................... 14
1.7.1. Giai đoạn phát triển trong cơ thể người ..................................................... 14
1.7.2. Giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi ....................................................... 16
1.8. Tình hình kháng thuốc hiện nay của ký sinh trùng sốt rét ................................. 17
1.8.1. Định nghĩa kháng thuốc .............................................................................. 17


viii

1.8.2. Trên thế giới ................................................................................................ 18
1.8.3. Tại Việt Nam ................................................................................................ 20
1.9. Tình hình nghiên cứu, bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét trên thế giới và
Việt Nam............................................................................................................. 22
1.9.1. Trên thế giới ................................................................................................ 22
1.9.2. Việt Nam ...................................................................................................... 23
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................24
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ............................................................... 24
2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ................................................................. 24
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 24
2.2.2. Thiết kế nghiên cứu ..................................................................................... 24
2.2.3. Phương pháp phân tích mẫu ....................................................................... 24
2.2.3.1. Phát hiện KST Plasmodium spp. bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa........ 25

2.2.3.2. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR .............. 31
2.2.3.2.1. Giới thiệu khái quát về kỹ thuật PCR và phương pháp phát hiện
KST SR bằng kỹ thuật PCR ......................................................................... 31
2.2.3.2.2. Kỹ thuật tách chiết DNA KST SR Plasmodium spp. ....................... 33
2.2.3.2.3. Kỹ thuật Nested – PCR phát hiện KST SR: ..................................... 35
2.2.3.2.4. Kỹ thuật Nested – PCR để phát hiện điểm đột biến K13 liên quan
đến kháng artemisinin ................................................................................. 36
2.2.3.2.5. Đọc kết quả điện di:.......................................................................... 37
2.2.3.3. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật giải trình tự .................. 38
2.2.3.4. Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm DNA để giải trình tự ............................... 39
2.2.3.4.1. Kỹ thuật PCR giải trinh tự ............................................................... 40
2.2.3.4.2. Phân tích kết quả giải trình tự: ........................................................ 41
2.2.4. Kỹ thuật cất đông chủng ký sinh trùng sốt rét............................................. 42
2.2.5. Kỹ thuật nuôi cấy dài ngày để tạo chủng Plasmodium spp. thuần ............. 42
2.2.5.1. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P. falciparum thuần: ...................................... 43
2.2.5.2. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P. vivax thuần ................................................ 43


ix

2.4.5.3. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 43
2.4.5.4. Chuẩn bị hồng cầu lành ......................................................................... 44
2.4.5.5. Chuẩn bị huyết thanh nuôi cấy .............................................................. 44
2.4.5.6. Phá đông chủng KST SR Plasmodium spp. .......................................... 45
2.2.6. Điều kiện nuôi cấy ....................................................................................... 45
2.2.6.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro Plasmodium spp. ....................................... 45
2.2.6.2. Điều kiện trong lấy mẫu tại thực địa ..................................................... 46
2.3. Thống kê và xử lý số liệu ................................................................................... 47
2.4. Y đức .................................................................................................................. 47
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................48

3.1. Kết quả xác thu thập mẫu và xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật
nhuộm giêm – sa ................................................................................................. 48
3.2. Kết quả xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR ............... 50
3.3. Kết quả giải trình tự Plasmodium spp. ............................................................... 53
3.4. Kết quả giải trình tự kháng K13 ......................................................................... 55
3.5. Kết quả nuôi cấy chủng Plasmodium spp. thuần bằng phương pháp nuôi cấy
trong phòng nuôi cấy tại phòng thí nghiệm ........................................................ 57
3.6. Kết quả bảo tồn chủng sốt rét Plasmodium spp. và phát hiện kháng K13 liên
quan đến kháng artemisinin. ............................................................................... 59
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................60
4.1. Kết luận............................................................................................................... 60
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62
PHỤ LỤC .................................................................................................................70


x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AA

:

Amino acid

ACD

:

Dung dịch chống đông máu

ATSH

:

An toàn sinh học

BYT

:

Bộ Y tế

BNSR

:

Bệnh nhân sốt rét

Hồng cầu O

:

Hồng cầu của người nhóm máu O

Huyết thanh AB

:

Huyết thanh của người nhóm máu AB

Huyết thanh O

:

Huyết thanh của người nhóm máu O

KST

:

Ký sinh trùng

KHV

:

Kính hiển vi

NC

:

Nuôi cấy

NCBI

:

Ngân hàng Gene thế giới

Nested – PCR

:

Phản ứng PCR lồng

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

PCSR

:

Phòng chống sốt rét

PRG

:

Plasmodium Genenomics Resource

Test

:

Kiểm tra

RPMI 1640

:

Môi trường nuôi cấy ký sinh trùng
sốt rét (R8758, Glutamine, và NaHCO3)

RPM

:

Vòng trên phút

RPS

:

Môi trường nuôi cấy không huyết thanh

RPHS

:

Môi trường nuôi cấy có huyết thanh

SR

:

Sốt rét

SRAT

:

Sốt rét ác tính

TVSR

:

Tử vong do bệnh sốt rét

WHO

:

Tổ chức Y tế thế giới

Ziplock

:

Túi đựng mẫu có khóa kéo


xi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp 2009 ............................................11
Bảng 1.2. Thời gian xuất hiện P. falciparum kháng với các loại thuốc SR.............. 19
Bảng 2.1. Trình tự mồi của phản ứng PCR – Nested 1, PCR – Nested 2. ................35
Bảng 2.2. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR – Nested xác định
loài Plasmodium spp. ..............................................................................35
Bảng 2.3. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR – Nested 2 xác định
loài 04 loài Plasmodium spp. ...................................................................36
Bảng 2.4. Trình tự mồi khuếch đại đọan K13 ...........................................................36
Bảng 2.5. Phản ứng Nested – PCR khếch đại K13 lần 1: .........................................37
Bảng 2.6. Phản ứng Nested – PCR khếch đại K13 lần 2: .........................................37
Bảng 2.7. Thành phần các hóa chất sử dụng trong PCR của giải trình tự ................40
Bảng 2.8. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng control giải trình tự .........40
Bảng 3.1. Kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật giêm – sa ............................... 49
Bảng 3.2. Kết quả xác định chủng bằng kỹ thuật Nested –PCR ............................... 52


xii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây phát sinh loài của Plasmodium spp. gây bệnh cho người và
động vật ....................................................................................................7
Hình 1.2. Bản đồ phân bố tỷ lệ tử vong bệnh sốt rét năm 2010 – 2013 ..................10
Hình 1.3. Bản đồ tỷ lệ ký sinh trùng gây bệnh sốt rét tại Việt Nam ........................12
Hình 1.4. Biểu đồ thể hiện số ca nhập viện và tử vong do KST SR tại
Việt Nam .................................................................................................13
Hình 1.5. Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét ở muỗi và người ...................17
Hình 1.6. Phân bố các vị trí đột biến dựa trên mô hình 3D của kháng K13 .............21
Hình 1.7. Sự phân bố đa kháng thuốc sốt rét 2016 ..................................................21
Hình 2.1. Các bước tiến hành trong kỹ thuật nhuộm giêm – sa................................ 26
Hình 2.2. Hình thể KST SR P. falciparum soi bằng kỹ thuật nhuộm

giêm – sa .................................................................................................27
Hình 2.3. Hình thể KST SR P. vivax soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa ..............28
Hình 2.4. Hình thể KST SR P. malariae soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa ........29
Hình 2.5. Hình thể KST SR P. ovale soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa .............30
Hình 2.6. Hình minh họa các bước trong phản ứng PCR .........................................33
Hình 2.9. Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tư dùng gel polyacrylamide. .......39
Hình 3.1. Hình thể KST SR P. falciparum bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa. ...........48
Hình 3.2. Hình thể KST SR P. vivax bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa. ....................49
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm DNA Plasmodium spp.....................................51
Hình 3.4. Biểu đồ sánh kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật giêm – sa và kỹ
thuật Nested – PCR..................................................................................52
Hình 3.5. Kết quả trình tự DNA P. falciparum với NCBI ........................................53
Hình 3.6. Sơ đồ cây P. falciparum với NCBI ...........................................................53
Hình 3.7. Kết quả trình tự DNA P. vivax với NCBI .................................................54
Hình 3.8. Sơ đồ cây P. vivax với NCBI ....................................................................54
Hình 3.9. Sơ đồ cây P. falciparum và P. vivax với NCBI ........................................55
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm DNA kháng K13 của P. falciparum ..............56


xiii

Hình 3.11. Kết quả trình tự aa K13 của P. falciparum với PGR ............................. 57
Hình 3.12. KST SR Plasmodium spp. được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm.............58
Hình 3.13. Hình thể P. falciparum được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm ..................58


1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra, bệnh thường

gặp ở các nước thuộc khu vực nhiệt đới

[12] [17]

. Bệnh truyền từ người bệnh qua

người lành nhờ vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi đòn xóc (muỗi Anopheles) [3]
[5] [17] [45] [58] [74]

. Hiện nay, có 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người là:

Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium
ovale, và Plasmodium knowlesi

[4] [5] [12]

, trong đó Plasmodium falciparum và

Plasmodium vivax là 2 loài thường gặp [3] [6] [7] [45] [74].
Ngày nay, tuy tình hình bệnh SR có chiều hướng giảm so với những thập niên
gần đây, nhưng nó vẫn một vấn đề liên quan đến sức khỏe con người và nhận được
sự quan tâm của toàn cầu, là bệnh truyền nhiễm làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến
sức khỏe, kinh tế [4] [71] và gây nhiều thiệt hại, tổn thất cho nhân loại [35], đặc biệt là
đối với phụ nữ mang thai và trẻ em

[68]

. Hàng năm, trên toàn cầu có khoảng 350 -

500 triệu người mắc SR và hơn 1 triệu người chết do SR. Đến năm 2010, trên thế

giới có 216 triệu người mắc SR và 655.000 người chết do SR và có khoàng 3,3 tỷ
người sống trong vùng dịch tể sốt rét và có nguy cơ mắc bệnh sốt rét [65].
Theo ước tính của WHO khoảng 40% dân số thế giới hiện nay đang sống
trong vùng có nguy cơ mắc SR. Dân số Việt Nam năm 2013 là 89,9 triệu người, với
khoảng 14,4 triệu người sống ở những vùng có SR lưu hành (khoảng 16% dân số),
có 35.406 ca SR được ghi nhận, trong đó có 17.128 ca xác định có KST SR (60% số
ca xác nhận SR là do KST Plasmodium falciparum gây ra. 6 ca tử vong do SR [1].
1.2. Tính cấp thiết của đề tài
Tỷ lệ mắc sốt rét ở Việt Nam đã liên tục giảm, từ 2,8 ca/1.000 dân năm 1991
xuống 0,87 ca/1.000 dân năm 2001 và năm 2013 chỉ còn 0,2 ca/1.000 dân [28] [66]. Tỷ
lệ mắc sốt rét giảm là do áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật để hạn chế số
lượng mắc và tử vong do KST SR, nhưng vẫn còn hơn 11 triệu người sống trong
vùng dịch tể sốt rét [2]. Theo một báo cáo khác về tình hình tử vong do sốt rét ở Việt
Nam, được đăng trên tạp chí The Guardian năm 2012, số ca tử vong do sốt rét/1.000


2
dân ở các năm 1980, 1990, 2000 và 2010 lần lượt là: 57,5 ca; 36,2 ca; 15,0 ca; 1,4
ca [59].
Trước tình hình bệnh SR có chiều hướng giảm mạnh

[7]

, áp lực điều trị thuốc

SR tăng, di biến động dân từ vùng dịch tể SR diễn biến phức tạp,... làm cho tình
trạng kháng thuốc sốt rét ngày càng tăng cao [62] [63] [69], gia tăng nguy cơ thành dịch
SR. Do đó việc tìm kiếm KST SR để phục vụ nghiên cứu gặp nhiều khó khăn; trong
khi đó các nghiên cứu, thử nghiệm đánh giá đáp ứng thuốc điều trị bệnh sốt rét của
KST SR có vai trò rất quan trọng việc loại trừ SR. Từ các vấn đề trên, đòi hỏi phải

có sẵn nguồn chủng KST SR. Với mong muốn tạo tiền đề cho việc thành lập thư
viện Genenome, thư viện chủng KST SR để phục vụ cho công tác nghiên cứu về
các kỹ thuật chuyên sâu trong chuẩn đoán và điều trị bệnh SR và phát triển vaccine
kháng sốt rét sau này, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bảo tồn chủng Ký sinh trùng
sốt rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng”.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu


Bảo tồn chủng KST SR các mẫu được thu thập ở thực địa, trong quá

trình làm đề tài tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Thành phố Hồ Chí
Minh.


Bước đầu xây dựng trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome từ các mẫu

KST SR thu thập được trong quá trình thực đề tài.
1.4. Nội dung nghiên cứu


Thu thập, lưu trữ và bảo tồn nguồn chủng KST SR trong Nitơ

lỏng – 196oC.
+ Nuôi cấy chủng KST SR tạo chủng thuần tại phòng thí nghiệm các nguồn
máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax đơn
thuần được thu thập từ thực địa.
+ Lưu trữ nguồn mẫu KST SR từ các mẫu thu thập được trong nghiên cứu, thử
nghiệm,...


Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được.


3
+ Chạy PCR định danh những mẫu máu nhiễm KST SR [40] [46].
+ Giải trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome đặc trưng cho từng loài KST
SR [33] [41] [44] [46].
+ Giải trình tự đoạn gene kháng thuốc Artemisinin đối với chủng Plasmodium
falciparum
1.5. Ý nghĩa đề tài
Nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên kết hợp giữa giám sát ca bệnh chủ
động, thu thập và bảo tồn chủng KST SR, đồng thời thời bước đầu xây dựng được
trình tự đoạn Gene bảo tồn các chủng KST SR, làm tiền đề cho việc so cho các
nghiên cứu sau này.
Bên cạnh đó, việc bảo tồn chủng KST SR tại phòng thí nghiệm, cũng góp
phần duy trì nguồn chủng KST, Gene trong điều kiện KST SR đang giảm mạnh như
hiện nay.
Việc bảo tồn chủng KST SR cũng có vai trò quan trọng trong việc cung cấp
chứng dương cho các kỹ thuật sinh học phân tử, cung cấp mẫu cho công tác nghiên
cứu tạo vaccine, kháng thuốc sốt rét, tiêu bản mẫu hình thể KST SR trong công tác
đào tạo nguồn nhân lực y tế.
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau từ các kỹ thuật truyền
thống (Giêm – sa) cho đến áp dụng các kỹ thuật hiện đại (sinh học phân tử) trong
chuẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, đồng thời áp dụng kỹ thuật giải trình tự để xác
định trình tự đoạn Gene đặc trưng của từng loài KST SR để phát hiện KST SR, đã
góp phần vào việc chuẩn đoán chính xác các chủng KST SR gây bệnh SR để có
phát đồ điều trị thích hợp.
Góp phần bảo tồn và duy trì nguồn chủng KST SR, nguồn dữ liệu về Gene
trong giai đoạn KST SR đang giảm dần, và tình hình kháng thuốc ngày càng gia

tăng [40] [62] [69] [75], cũng như phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu về sốt rét
và phát triển thuốc, vaccine sau này.


4
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Bình Phước là vùng có sốt rét lưu hành, lưu hành nặng nhất là ở các xã vùng
sâu, vùng xa, giáp ranh với rừng, biên giới Cam-pu-chia [18]. Trước tình trạng dân di
biến động, dân đi rừng, ngủ rẫy [24], thì việc chuẩn đoán nhanh và chính xác ca bệnh
sốt rét sẽ giúp y bác sĩ đề ra những biện pháp phòng tránh, có phác đồ điều trị hiệu
quả, kịp thời. Góp phần cho công tác phòng chống sốt rét ở tỉnh Bình Phước riêng
và sự thành công của chương trình phòng chống sốt rét Quốc gia nói chung.
Bên cạnh đó việc bảo tồn được nguồn chủng, nguồn gene KST SR để phục vụ
cho công tác nghiên cứu sau này như: đánh giá hiệu lực của các thuốc điều trị SR
thế hệ mới, cũng như nuôi cấy để thử nghiệm trong điều kiện in vitro, nghiên cứu về
đáp ứng miễn dịch, sinh học phân tử, phát triển vaccine chống sốt rét,... là những
đóng góp có ý nghĩa của luận văn này.
1.6. Tổng quan về bệnh sốt rét
1.6.1. Lịch sử phát hiện bệnh sốt rét
Bệnh sốt rét được biết đến cách đây hơn 2000 năm, đã được Hipocrates (Hy
Lạp) và bệnh sốt rét được ông mô tả chi tiết từ thế kỷ V trước Công nguyên. Ông
phân chia bệnh SR ra nhiều loại như sốt định kỳ mỗi ngày, sốt mỗi hai ngày hoặc
mỗi bốn ngày

[58]

. Nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu về bệnh này và đặt ra

những tên gọi khác nhau như: ở Trung Quốc gọi là nghịch tật, Việt Nam gọi là sốt
rét rừng hay sốt ngã nước, tuy nhiên mới chỉ nêu lên một số đặc điểm lâm sàng và

vài yếu tố liên quan [10].
Từ những năm 1600, ở Pêru người da đỏ đã dùng vỏ cây Cinchona để chữa sốt
rét, đến năm 1820 Pelletier và Caventou đã chiết xuất ra hoạt chất alkaloide quinine
và cinchonin từ vỏ cây Cinchona [21].
Đến thế kỷ XIX từ những hiểu biết khá đầy đủ về nguyên nhân gây bệnh sốt
rét, tác nhân gây bệnh sốt rét, véc tơ truyền bệnh sốt rét, cơ chế lan truyền và chu kỳ
phát triển của KST SR.
Vào năm 1880, giáo sư Alphonse Laveran (Đại học Rome) lần đầu tiên phát
hiện và mô tả KST SR trong máu người, đã mở ra một kỷ nguyên mới về quá trình


5
nghiên cứu sinh bệnh học và các yếu tố liên quan về bệnh sốt rét làm cơ sở cho việc
tìm kiếm những chiến lược phòng chống quy mô góp phần giảm thiểu tối đa những
thiệt hại do bệnh sốt rét gây nên.
Năm 1885, nhà bệnh học Ettore Marchiafava (người Ý) tìm thấy những sinh
vật gây bệnh có trong hồng huyết cầu người bệnh và ông đặt tên là Plasmodium.
Năm 1897, bác sĩ Sir Ronald Ross (người Anh), chứng minh có sự hiện diện
của Plasomodium trong muỗi Anopheles cái.
Năm 1924, Schuleman (Đức) đã phát hiện ra thuốc Pamaquine (Plasmoquine)
đến năm 1930 – 1952 hàng loạt thuốc chống sốt rét tổng hợp lần lượt ra đời như
Chloroquine, Proguanil, Primaquine.
Năm 1974 – 1982, Trung Quốc phát triển thuốc trị sốt rét từ cây Quing Hao
Su (Artemisia annua) [21].
Năm 1985 – 1990 Việt Nam đã chiết xuất thành công Artemisinine từ hoạt
chất của cây Thanh Hao hoa vàng mọc hoang ở vùng núi phí Bắc làm giảm rõ rệt tử
vong sốt rét và sốt rét ác tính [10].
Từ những nghiên cứu trên, các nhà khoa học đã đúc kết lại rằng nguyên nhân
của bệnh sốt rét do ký sinh trùng sốt rét (mầm bệnh phát triển trong máu bệnh nhân)
được muỗi Anopheles (trung gian truyền bệnh) đốt truyền từ người bệnh sang người

lành (cơ thể cảm thụ).
1.6.2. Định nghĩa bệnh sốt rét
Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng sốt rét ký sinh trong hồng cầu người
bệnh và gây ra bệnh SR với các triệu chứng toàn thân. Bệnh SR có thể gây ra tổn
thương ở nhiều cơ quan khác nhau, có thể gây ra tử vong (ở thể sốt rét ác tính)
[12]

[3]

.
Với các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như: cơn sốt rét run,

sốt, vã mồ hôi hoặc có kèm theo gan to, lách to hoặc thiếu máu [6] [17] [58].
Bệnh SR lưu hành chủ yếu vùng rừng, đồi, núi, ven biển nước lợ; bệnh xảy ra
quanh năm, phát triển mạnh vào mùa mưa [6].


6
Bệnh sốt rét là bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp.
gây ra và có tính chất chu kỳ [17] [30].
Ký sinh trùng sốt rét thuộc:
Giới

: Động vật (Animalia),

Ngành

: Đơn bào (Protozoa),

Lớp

: Bào tử trùng (Sporozoa),

Bộ

: Phụ huyết bào tử trùng (Hemosprodidae,)

Họ

: Plasmodidae,



Giống: Plasmodium (Có 2 tiểu giống: Plasmodium, Laverania)



Tiểu giống Plasmodium gồm 3 loài vivax, ovle, malariae (giao bào có

hình tròn hay bầu dục).


Tiểu giống Laverania gồm loài falciparum (có giao bào hình liềm)



Loài: Có khoảng 120 loài kí sinh trùng gây bệnh sốt rét cho người và các

động vật có xương sống, một số loài tiêu biểu như sau:


Kí sinh loài khỉ: Plasmodium cynomolgi, Plasmodium rhodhaini,

Plasmodium knowlesi, Plasmodium simii, Plasmodium inui,...


Kí sinh loài động vật gặm nhấm: Plasmodium berghei, Plasmodium

gonderi,...


Kí sinh loài chim: Plasmodium gallinaceum, Plasmodium lophurae,

Plasmodium relictum, Plasmodium cathemerium,...


Kí sinh loài bò sát: Plasmodium mexicanum.



Kí sinh loài lưỡng thê: Plasmodium bufonis, Plasmodium
catesbiana.


7

Hình 1.1. Cây phát sinh loài của Plasmodium spp. gây bệnh cho người và
động vật [19]

8


Kí sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người thuộc giống Plasmodium spp..

Cho đến nay, kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax,
Plasmodium malariae là những loài làm tăng gánh nặng mô hình bệnh tật, gây tốn
kém về mặt sức khỏe và kinh tế, bệnh cũng gây tai họa cho các nước châu Á, Mỹ la
tinh, khu vực Trung Đông và thậm chí ở một vài vùng của châu Âu, đặc biệt là ở
các vùng cận sa mạc Sahara châu Phi [4].


Tùy theo loài KST SR mang trong người mà bệnh nhân sốt mỗi ngày một

cơn (P. falciparum), hai ngày một cơn (P. vivax), ba ngày một cơn (P. malariae),
cơn sốt thường xuất hiện đúng giờ, có tính chu kỳ rõ rệt, trùng khớp với nhũng đợt
phát triển của KST SR [9].
Chu kỳ sống của KST SR trong cơ thể người có hạn định. Tùy theo loại KST
SR mà chúng tồn tại trong cơ thể người từ 6 tháng đến 3 năm, một số trường hợp có
thể tồn tại lâu hơn, trên 10 năm như P. malariae [6].


Người mang KST SR có thể có biểu hiên những triêu chứng lâm sàng điển

hình như rét run, nóng, ra mồ hôi và khát nước

[17]

. Cũng có thể biểu hiện những

triệu chứng không điển hình như sốt cao, ớn lạnh, đau toàn thân. Nhưng cũng có thể
không biểu hiện gì cả , đó là trường hợp người mang KST lạnh (người mang ký sinh
trùng sốt rét nhưng không có biểu hiện bênh sốt rét) [6] [9].

giờ

[74]

Bệnh có thể chữa khỏi nếu được xác định và uống thuốc trong vòng 24
. Phát hiện trễ, bệnh gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm có thể dẫn tới tử

vong (TVSR) do P. falciparum gây ra [5] [9] [12].
1.6.3. Sơ lược về dịch tể học sốt rét
1.6.3.1. Tình hình dịch tể sốt rét trên thế giới
Trên thế giới, bệnh sốt rét phân bố rộng khắp từ vùng nhiệt đới đến ôn đới,
P. falciparum phân bố chủ yếu các vùng khí hậu nhiệt đới và P. vivax phân bố rộng
khắp các vùng ôn đới và nhiệt đới [7]. Bệnh sốt rét đã gây ra nhiều vụ dịch lớn giết
chết nhiều người như vụ dịch ở Pen Giáp ở Ấn Độ (1898) có 307.000 người tử
vong, ở Sri Lanka và Ceylon (1934 -1935) làm 82.000 người tử vong; ở Brazil
(1938) số người mắc bệnh sốt rét là 100.000 người, số chết do sốt rét là 14.000.