Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc và hiệu lực của hai phác đồ điều trị tại miền Trung - Tây Nguyên (2001 - 2005)

Bộ giáo dục v đo tạo - bộ quốc phòng
Học viện quân y




Lê ngọc anh



Nghiên cứu một số đặc điểm
dịch tễ học phân tử
ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc
v hiệu lực của hai phác đồ điều trị
tại Miền Trung - Tây Nguyên
(2001 2005)



Chuyên ngành : Dịch tễ học
Mã số : 3.01.11



Tóm tắt luận án tiến sĩ y học

h nội - 2007
Luận án đợc hon thnh
tại học viện quân y


Cán bộ hớng dẫn khoa học:
- GS.TS. Lê Bách Quang
- PGS.TS. Vũ Quang Huy

Phản biện 1: GS. TSKH. Lê Đăng Hà
Phản biện 2: GS. TS. Dơng Đình Thiện
Phản biện 3: PGS. TS. Lê Khánh Thuận








Luận án đã đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc,
tại Học viện Quân y, hồi 8 giờ 30 ngày 12 tháng 02 năm 2007






Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Th viện Quốc gia
- Th viện Học viện Quân y

Danh mục các công trình
liên quan luận án đ công bố

1. Lê Ngọc Anh, Lý Bá Lộc, Nguyễn Xuân Thành, Vũ Quốc Bình
(2004) Tính nhạy cảm của P.falciparum với pyrimethamine và
cycloguanil tại một vùng sốt rét ở Bắc miền Trung, Tạp chí y học
dự phòng số 6 (70), tr. 48-53.
2. Lê Ngọc Anh, Lý Bá Lộc, Ngô Văn Lâm, Hồ Sỹ Mậu, Phạm
Xuân Vinh và Vũ Quốc Bình (2005) Nhận xét về tình hình sốt
rét tại một số đơn vị Quân đội ở khu vực Tây Nguyên (2001
2004), Tạp chí Y học Quân sự số 4 (235), tr. 38-42.
3. Le Ngoc Anh, Nguyen Xuan Thanh, Vu Quoc Binh, Ly Ba
Loc, Bui Đai , Rieckmann. KH, Edstein. MD, Cooper. RD
(2005) Chloroquine may still be effective in treating P.
falciparum malaria in Quangbinh Province, Central Vietnam, 15
th

Annual Asia Pacific Military Medicine Conference Hanoi, May
2005.
4. Vũ Quốc Bình, Lê Ngọc Anh, Nguyễn Văn Dũng, Kotecka. B,
Chen. N, Rieckmann. KH, Bùi Đại (2003) Tính nhạy cảm in
vitro với thuốc của P.falciparum và P.vivax tại một vùng sốt rét ở
Miền Trung Việt Nam, Tạp chí Y dợc học quân sự Học viện
Quân y phụ san 3/2003, tr. 33-39.

Danh mục các chữ viết tắt

AS Artesunat
AZ Azithromycin
CQ Chloroquin
CRT Men vận chuyển kháng chloroquin (Chloroquine Resitance
Transporter)
CYC Cycloguanil
D Ngày (Day)
DHFR Men khử Dihydrofolate (Dihydrofolate Reductase)
DNA Deoxyribonucleic acid
DO Doxycyclin
GLURP Protein giàu glutamate (Glutamate - Rich Protein)
IC
50
Nồng độ ức chế 50% (Inhibition Concentration 50%)
KSTSR Ký sinh trùng sốt rét
MEF Mefloquin
MSP Protein bề mặt thể t dỡng (Merozoite Surface Proteins)
PCR Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction)
PCSR Phòng chống sốt rét
PYR Pyrimethamin
QS Quân số
R Kháng (Resistance)
RFLP Cắt phân đoạn đa hình (Restriction Fragment Length
Polymorphism)

S Nhạy (Sensitivity)
SL Số lợng
SRAT Sốt rét ác tính
SRLS Sốt rét lâm sàng
WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)













1
mở đầu

1. Tính cấp thiết của đề tài
Theo Tổ chức Y tế thế giới hiện nay có khoảng 40% dân số thế giới
có nguy cơ bị sốt rét, ở 107 quốc gia, hàng năm ớc tính khoảng 350 - 500
triệu ca sốt rét lâm sàng, trên 1 triệu ngời chết vì sốt rét. Ký sinh trùng sốt
rét kháng thuốc, muỗi Anopheles kháng hoá chất diệt côn trùng, biến động
môi trờng sinh thái và xã hội đã làm cho tình hình sốt rét thêm xấu đi.
Việt Nam là một trong những nớc thuộc khu vực châu á - Tây Thái
Bình Dơng có bệnh sốt rét lu hành nặng, 46% dân số (2005) sống trong
vùng sốt rét lu hành. P. falciparum kháng chloroquin, Fancidar, quinin,

thậm chí cả mefloquin.
Miền Trung - Tây Nguyên là một địa bàn chiến lợc quan trọng về
Kinh tế - Quốc phòng song lại là vùng sốt rét lu hành vừa và nặng, ký
sinh trùng sốt rét kháng thuốc cao nhất toàn quốc. Muỗi Anopheles kháng
hoá chất diệt côn trùng. Nhiều năm qua, miền Trung - Tây Nguyên với
những biến động lớn về dân c, môi trờng, sinh thái làm cho sốt rét ở khu
vực này thêm phức tạp. Bệnh sốt rét đã ảnh hởng lớn tới đời sống kinh tế
và xã hội. Sức khoẻ của bộ đội tại các đơn vị đứng chân trên địa bàn miền
Trung - Tây Nguyên làm nhiệm vụ bảo vệ Tổ quốc và xây dựng kinh tế bị
giảm sút do sốt rét.
Trong những năm gần đây những ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử
cho thấy mối liên quan giữa kháng thuốc và các đột biến gen của ký sinh
trùng sốt rét với một số thuốc chống sốt rét đã đợc Tổ chức Y tế thế giới
công nhận.
Trong khuôn khổ Dự án "Phòng chống sốt rét Quân đội Việt Nam -
Australia và Hoạt động Giám sát dịch tễ sốt rét của Viện Vệ sinh phòng
dịch Quân đội. Nhằm đánh giá tình hình sốt rét, thực trạng ký sinh trùng
sốt rét kháng thuốc và đánh giá hiệu lực điều trị sốt rét kháng thuốc của
phác đồ phối hợp thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài:
Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử ký sinh trùng sốt
rét kháng thuốc và hiệu lực của hai phác đồ điều trị tại miền Trung -
Tây Nguyên (2001 2005).

2. Mục tiêu của đề tài
- Xác định tỷ lệ ký sinh trùng sốt rét mang gen đột biến kháng thuốc và một
số đột biến trên gen kháng, tại các đơn vị Quân đội ở miền Trung - Tây
Nguyên (2001 - 2005).
- Đánh giá hiệu lực hai phác đồ điều trị sốt rét kháng thuốc: Artesunat +
doxycyclin và chloroquin + azithromycin

2
3. Những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn của đề tài

- Luận án đã đa ra bức tranh toàn cảnh về đặc điểm bệnh sốt rét và ký
sinh trùng sốt rét (KSTSR) kháng thuốc ở mức cấu trúc gen của KSTSR
(dịch tễ học phân tử), tại một số đơn vị Quân đội ở miền Trung - Tây
Nguyên (2001-2005).
- Luận án đã đánh giá hiệu lực hai phác đồ điều trị sốt rét kháng thuốc:
artesunat + doxycyclin và chloroquin + azithromycin bằng thử nghiệm 28
ngày (theo dõi đáp ứng lâm sàng, theo dõi đáp ứng của KSTSR bằng kính
hiển vi và PCR).
- Luận án đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nh: PCR, PCR - RFLP,
sequencing so sánh với kết quả thử nghiệm in vitro - micro. Các kỹ thuật
ứng dụng đợc thực hiện tại: Viện Vệ sinh phòng dịch quân đội và Viện
Sốt rét Lục quân Australia. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử luận án đã xác
định đợc một số đặc điểm KSTSR mang gen đột biến kháng thuốc và một
số đột biến trên gen kháng, xác định kiểu gen của KSTSR. Kết quả của kỹ
thuật sinh học phân tử đã góp phần đánh giá tính nhạy cảm của KSTSR với
một số thuốc sốt rét và đánh giá hiệu lực của 2 phác đồ điều trị sốt rét
kháng thuốc.
- Luận án đã bớc đầu thể hiện là một nghiên cứu sâu về cấu trúc phân tử
của một số gen đột biến, ảnh hởng tới tính nhạy cảm của KSTSR với một
số thuốc sốt rét mà một số luận án trong nớc trớc đây cha có điều kiện
thực hiện.
Những kết quả thu đợc của luận án góp phần phục vụ công tác
phòng chống bệnh sốt rét, đảm bảo sức khoẻ cho Bộ đội tại các đơn vị
đóng quân ở miền Trung - Tây Nguyên thực hiện tốt nhiệm vụ Kinh tế -
Quốc phòng .

4. Bố cục luận án

Luận án gồm 134 trang (không kể phần tài liệu tham khảo và phụ
lục), kết cấu thành 4 chơng
- Đặt vấn đề: 2 trang
- Chơng 1 Tổng quan: 36 trang (7 hình)
- Chơng 2 Đối tợng và phơng pháp: 26 trang (2 bảng, 3 hình)
- Chơng 3 Kết quả: 45 trang (33 bảng, 1 biểu đồ, 17 hình)
- Chơng 4 Bàn luận: 22 trang
- Kết luận: 2 trang
- Kiến nghị: 1 trang
- Tham khảo 171 tài liệu (86 tiếng Việt, 85 tiếng Anh)
- Phụ lục


3
Chơng 1
Tổng quan

1.1. Tình hình ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc trên thế giới
Hiện tợng ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) kháng thuốc đợc phát
hiện năm 1910 ở Braxin, khi một ca sốt rét điều trị bằng quinin không đạt
kết quả. Tiếp đó P.falciparum kháng proguanil cũng tại Braxin (1949),
kháng pyrimethamin ở Gambia (1952), kháng chloroquin ở Colombia
(1960), kháng amodiaquin ở Braxin (1961) và kháng Fancidar tại
Campuchia. Từ những phát hiện ban đầu có tính chất lẻ tẻ, rồi sau đó hiện
tợng P. falciparum kháng thuốc phát triển mạnh trên cả 3 phơng diện:
mức độ kháng, diện kháng và phạm vi kháng. Tình hình sốt rét thế giới
thêm xấu đi khi P.vivax cũng trở nên kháng chloroquin, thông báo đầu tiên
vào năm 1989 ở Papua New Guinea và sau đó là Indonesia, Myanmar,
Vanuatu và Solomon. Đến năm 1991 đã có 73 quốc gia thông báo có
P.falciparum kháng thuốc. Khu vực Đông Nam á nh Thái Lan,

Campuchia và Việt Nam là những quốc gia có hiện tợng kháng phức tạp.
1.2. Tình hình ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc ở Việt Nam
Việt Nam là một trong những nớc có P. falciparum kháng thuốc
đợc ghi nhận sớm trên thế giới, lần đầu tiên hiện tợng P.falciparum
kháng chloroquin đợc phát hiện tại Nha Trang vào năm 1961. Trong quá
trình PCSR việc chỉ định dùng thuốc rộng rãi kéo dài (uống phòng) đã tạo
thành áp lực thuốc là yếu tố quan trọng làm cho tình trạng kháng thuốc
của KSTSR lan rộng ra khắp miền Trung - Tây Nguyên và cả nớc.
Đến những năm 1990, P.falciparum kháng thuốc tăng cao đến mức
nghiêm trọng: kháng chloroquin in vivo 78,2%, in vitro 84,6%; kháng
Fancidar 73,6% và mefloquin là 3,4%, chloroquin không còn hiệu lực để
điều trị sốt rét do P.falciparum.
KSTSR kháng thuốc luôn là một thách thức, và luôn là mối quan tâm
lớn trong chơng trình Quốc gia PCSR của Việt Nam.
1.3. Một số nghiên cứu về gen kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét
Các nghiên cứu sequencing (giải trình tự các nucleotid) DNA của
P.falciparum đã phát hiện cấu trúc gen giữa chủng kháng và nhạy
chloroquin có những khác biệt. Gen Pfcrt (P.falciparum chloroquine
resistance transporter) mã hoá tổng hợp các acid amin chủng nhạy ở dạng
tự nhiên M74, N75, K76, nhng ở chủng kháng xuất hiện đột biến là: 74I
,
75D
/E, 76T. Cấu trúc phân tử giữa chủng kháng và nhạy pyrimethamin
cũng có những khác biệt, gen Pfdhfr (P.falciparum dihydrofolate
reductase) mã hoá tổng hợp các acid amin ở chủng nhạy có cấu trúc dạng

4
tự nhiên: N51, C59, S108, ở chủng kháng xuất hiện đột biến: 51I, 59R,
108N
. Cấu trúc gen đa kháng Pfmdr1 (P. falciparum multidrug resistant)

khi đột biến cũng liên quan đến tính nhạy cảm của P.falciparum với một số
thuốc sốt rét nh: chloroquin, mefloquin, artemisinin.
Việc nuôi cấy P.vivax là rất phức tạp khó đánh giá đợc tính nhạy
cảm bằng in vitro, kỹ thuật sinh học phân tử đã xác định đợc gen Pvdhfr
(P.vivax dihydrofolate reductase). Cấu trúc phân tử giữa chủng nhạy và
kháng pyrimethamin có những khác biệt, chủng nhạy gen Pvdhfr có cấu
trúc tự nhiên S117, chủng kháng xuất hiện đột biến là 117N
.
Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu dịch tễ học bệnh sốt
rét và đánh giá tính nhạy cảm của KSTSR với một số thuốc chống sốt rét là
kỹ thuật hiện đại có tỷ lệ thành công và độ tin cậy cao đã đợc WHO
khuyến cáo sử dụng.
1.4. Một số nghiên cứu về điều trị sốt rét kháng thuốc ở Việt Nam và
trên thế giới
Tìm thuốc mới và sử dụng phối hợp thuốc là chiến lợc điều trị sốt
rét kháng thuốc của WHO.
Chloroquin là thuốc kinh điển với nhiều u thế: dung nạp tốt và an
toàn cao, thời gian bán huỷ dài và không đắt tiền. Mặc dù KSTSR đã kháng
cao với chloroquin song sau một thời gian dài không sử dụng P.falciparum
đã nhạy tăng dần với chloroquin. Nếu có thể phối hợp chloroquin với một
thuốc khác làm tăng đợc hiệu lực điều trị và tránh đợc sự tiếp tục kháng
thì hoàn toàn phù hợp?
Artemisinin và các dẫn chất là một thuốc mới có nhiều u thế với khả
năng cắt sốt và cắt KSTSR nhanh. Tuy nhiên, hạn chế của thuốc này là tình
trạng tái phát sớm của P.falciparum sau điều trị. Để khắc phục nhợc điểm
này, đã có một số nghiên cứu sử dụng phối hợp với một số thuốc sốt rét
khác.
Doxycylin tác động tới KSTSR ở giai đoạn tổ chức gan và giai đoạn
hồng cầu có tác dụng điều trị tiệt căn, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu
sử dụng phối hợp doxycyclin với artemisinin để điều trị sốt rét kháng thuốc

và SRAT do P. falciparum, phác đồ này tỏ ra có hiệu lực cao.
Azithromycin là một kháng sinh bán tổng hợp, có phổ tác động rộng,
an toàn cao, phân bố rộng trong cơ thể, nồng độ thuốc đạt tới đỉnh trong
huyết tơng chỉ sau 2 giờ và thời gian bán huỷ tới 60 giờ. Thử nghiệm lâm
sàng azithromycin điều trị sốt rét do P.falciparum cho thấy nếu dùng đơn
thuần hiệu quả là 21 38%, phối hợp phối hợp với chloroquin thì hiệu quả
đạt tới 96%. Nghiên cứu in vitro cũng cho thấy, azithromycin phối hợp với
chloroquin làm tăng hiệu lực diệt P.falciparum kháng chloroquin, song ở
Việt Nam cha có nghiên cứu nào sử dụng azithromycin để điều trị sốt rét.

5
Chơng 2
Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu

2.1. Đối tợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tợng nghiên cứu:
- Gồm 4 đơn vị đóng quân và hoạt động tại miền Trung - Tây Nguyên:
S185 - Quảng Bình, D10 - Kon Tum, D721- Gia Lai, D584 - Đắc Lắc
- Các mẫu KSTSR và mẫu DNA đợc thu thập tại các đơn vị nghiên cứu:
+ 269 mẫu DNA của KSTSR cho phân tích gen
+ 67 mẫu KSTSR cho thử nghiêm in vitro micro
- 91 bệnh nhân sốt rét tại đơn vị ở Quảng Bình cho thử nghiệm in vivo
(Các mẫu thử nghiệm in vivo, in vitro trong số mẫu phân tích gen)
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Quảng Bình, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc.
2.1.3. Thời gian nghiên cứu
- Từ 1/2001 đến 12/ 2005.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Dịch tễ học mô tả
2.2.1.2. Mô tả đặc điểm bệnh sốt rét và ký sinh trùng sốt rét kháng

thuốc
- Đặc điểm mắc sốt rét lâm sàng (SRLS), đặc điểm nhiễm KSTSR.
- Diễn biến SRLS, nhiễm KSTSR, KSTSR kháng thuốc.
2.2.1.3. Mô tả đặc điểm ký sinh trùng sốt rét mang gen đột biến kháng
thuốc và một số đột biến trên gen kháng
- Đặc điểm chủng loại KSTSR, đặc điểm kiểu gen của P. falciparum và
P.vivax.
- Đặc điểm P.falciparum mang gen đột biến và đột biến tại gen Pfcrt kháng
chloroquin.
- Đặc điểm P.falciparum mang gen đột biến và đột biến tại gen Pfdhfr
kháng antifolat.
- Đặc điểm P.falciparum mang gen đột biến và đột biến tại gen Pfmdr1 đa
kháng.
- Đặc điểm P.vivax mang gen đột biến Pvdhfr kháng pyrimethamin.
2.2.2. Dịch tễ học can thiệp (thử nghiệm lâm sàng)
- Đánh giá hiệu lực 2 phác đồ điều trị sốt rét kháng thuốc (thử nghiệm 28
ngày):
+ Artesunat phối hợp doxycyclin
+ Chloroquin phối hợp azithromycin
- So sánh với hiệu lực phác đồ artesunat đơn thuần.

6
2.3. Các kỹ thuật ứng dụng trong nghiên cứu
- Kỹ thuật sinh học phân tử:
+ Xác định chủng loại ký sinh trùng sốt rét.
+ Xác định kiểu gen P.falciparum: MSP1, MSP2, GLURP.
+ Xác định kiểu gen của P. vivax: PvMSP1, PvMSP 3.
+ Tìm những dấu ấn phân tử liên quan đến tính kháng thuốc:
Xác định P.falciparum mang gen Pfcrt đột biến kháng chloroquin
bằng kỹ thuật PCR - RFLP và sequencing DNA.

Xác định P.falciparum mang gen Pfdhfr đột biến kháng
pyrimethamin bằng kỹ thuật PCR - RFLP và sequencing DNA.
Xác định P.falciparum mang gen Pfmdr1 đột biến đa kháng thuốc
bằng kỹ thuật sequencing DNA.
Xác định P.vivax mang gen Pvdhfr đột biến kháng pyrimethamin
bằng kỹ thuật PCR - RFLP và sequencing DNA.
- Kỹ thuật thử nghiệm in vitro - micro đánh giá tính nhạy cảm của
P.falciparum với các thuốc: CQ, MEF, AS, PYR, CYC bằng sử dụng
microscoper test (soi kính hiển vi), isotopic test (đồng vị phóng xạ).
- Kỹ thuật thử nghiệm in vivo đánh giá hiệu lực phác đồ điều trị (thử
nghiệm 28 ngày).

2.4. Phơng pháp xử lý số liệu
- IC
50
đợc tính bằng cách sử dụng Non-linear Equation (DoseRespLgstc)
trong phần mềm Tabcure 2D (Jandel Scientific).
- Số liệu đợc xử lý trên phần mềm SigmaStat 3.00 copyright 1992- 2003
(Jandel Scientific).

2.5. Giới hạn phạm vi nghiên cứu của đề tài luận án
Đặc điểm dịch tễ học phân tử KSTSR kháng thuốc là một vấn đề rộng
lớn, điều trị KSTSR kháng thuốc là một nghiên cứu rộng. Do điều kiện thời
gian và kinh phí, đề tài luận án khu trú nghiên cứu:
- Xác định tỷ lệ KSTSR mang gen đột biến kháng thuốc và một số đột biến
trên gen kháng: Pfcrt, Pfdhfr, Pfmdr1, Pvdhfr và so sánh với kết quả thử
nghiệm in vitro - micro đáp ứng của P.falciparum với: CQ, MEF, AS,
PYR, CYC.
- Đánh giá hiệu lực hai phác đồ điều trị sốt rét kháng thuốc:
+ Artesunat phối hợp doxycyclin

+ Chloroquin phối hợp azithromycin



7
Chơng 3
Kết quả

3.1. Đặc điểm ký sinh trùng sốt rét mang gen đột biến kháng thuốc và
một số đột biến trên gen kháng, tại một số đơn vị Quân đội ở miền
Trung - Tây Nguyên (2001 - 2005).
3.1.1. Đặc điểm bệnh sốt rét và ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc
3.1.1.1. Đặc điểm mắc sốt rét lâm sàng
Bảng 3.1: Tỷ lệ () mắc sốt rét lâm sàng trung bình tháng (2001 - 2005)


Đơn vị


2001

2002


2003

2004

2005

S185
(Quảng Bình)

61,21

35,43

28,32

16,76


8,23
D10
(Kon Tum)

5,64

3,25

2,64

2,17

1,37
D721
(Gia Lai)

39,37

34,52

20,91

16,45

4,84
D584
(Đắc Lắc)

13,15

6,61

5,63

3,26


2,75

- Đặc điểm mắc SRLS có xu hớng giảm dần từ 2001 2005.
- Tỷ lệ mắc SRLS tại các đơn vị khác nhau: S185 là đơn vị làm đờng có tỷ
lệ mắc cao, sau đó là D721 đơn vị bảo vệ biên giới, D10 là đơn vị hoạt
động tĩnh tại - doanh trại kiên cố có tỷ lệ mắc thấp.
3.1.1.3. Đặc điểm nhiễm ký sinh trùng sốt rét
Bảng 3.2: Tỷ lệ (%) nhiễm ký sinh trùng sốt rét (2001 - 2005)
(theo điều tra cắt ngang mỗi năm 2 đợt vào tháng 5 và tháng 10)

Lam điều tra Phân loại
P. falciparum P. vivax

Đơn vị

SL

(+)
Tỷ lệ
%
SL % SL %
S185 4218 114 2,70 81 71,05 33 28,95
D10 8529 58 0,68 43 74,14 15 25,86
D721 1781 44 2,47 34 77,27 10 22,73
D584 4240 53 1,25 40 75,47 13 24,53

Chung cả vùng

18768

269

1,43

198

73,61

71

26,39


- Tỷ lệ nhiễm KSTSR tại một số đơn vị trung bình trong 5 năm là 1,43%,
P.falciparum chiếm u thế là 73,61%, P.vivax là 26,39%.

8
- Tỷ lệ nhiễm KSTSR cao ở S185 đơn vị làm đờng và D721, thấp ở D10
đơn vị hoạt động tĩnh tại - doanh trại kiên cố.

3
Cha phát hiện thấy P.malariae và P.ovale bằng soi kính hiển vi

3.1.1.5. Diễn biến P. falciparum kháng chloroquin
Bảng 3.4: Diễn biến P. falciparum kháng chloroquin - in vitro

Năm
Chỉ số

2001 2002

2003

2004

2005



Tỷ lệ kháng

6/11
(54,55%)


11/23
(47,83%)


8/18
(44,44%)


6/15
(40,00%)


Mức độ kháng
IC
50
(nM)


266,85
87,63

264,43
86,95

251,57
85,66

213,33
78,78

* Ngỡng kháng CQ là 160 nM
- P.falciparum kháng chloroquin từ 6/11 (54,55%) năm 2001-2002, giảm
dần xuống 6/15 (40,00%) năm 2005, giảm 1,36 lần.
- Mức độ kháng IC
50
= 266,85 87,63nM (2001-2002) giảm xuống
IC
50
= 213,33 78,78 nM (2005), giảm 1,25 lần.

3.1.1.6. Diễn biến P. falciparum kháng pyrimethamin
Bảng 3.5: Diễn biến P. falciparum kháng pyrimethamin - in vitro

Năm
Chỉ số

2001 2002

2003

2004

2005

Tỷ lệ kháng

9/11
(81,82%)

18/22
(81,82%)

15/19
(78,95%)

11/15
(73,33%)


Mức độ kháng
IC
50
(nM)

1965,71
1539,64

1833,33
1172,18

1760,00

1528,32

1625,00
1170,15


* Ngỡng kháng PYR là 100 nM
- P.falciparum kháng pyrimethamin tỷ lệ là 9/11 (81,82%) năm 2001-2002
giảm dần xuống 11/15 (73,33%) năm 2005,giảm 1,11 lần.
- Mức độ kháng từ IC
50
= 1965,71 1539,64nM năm 2001-2002 xuống
IC
50
= 1625,00 1170,15 nM năm 2005, giảm 1,21 lần.

9
3.1.2. Đặc điểm ký sinh trùng sốt rét mang gen đột biến kháng thuốc
và một số đột biến trên gen kháng.
3.1.2.1. Đặc điểm chủng loại ký sinh trùng sốt rét.
Bảng 3.6: Kết quả xác định chủng loại Plasmodium
trên bệnh nhân sốt rét có ký sinh trùng bằng PCR


P. falciparum

P. vivax

P.f + P.v

Đơn vị

SL
mẫu
SL % SL % SL
%
S185 114 76 66,66 32 28,07 6 5,27
D10 58 39 67,24 15 25,86 4 6,90
D721 44 32 72,72 9 20,45 3 6,83
D584 53 37 69,81 12 22,64 4 7,55

Chung cả vùng

269

184

68,40

68

25,27

17

6,33


- P.falciparum chiếm u thế với tỷ lệ 68,40%, P. vivax là 25,27%

- Nhiễm phối hợp P. falciparum và P. vivax là 6,33%.
3
Cha phát hiện đợc P. malariae và P.ovale bằng PCR trên bệnh
nhân nhiễm KSTSR tại địa điểm nghiên cứu.
3.1.2. 2. Đặc điểm kiểu gen của P. falciparum
Bảng 3.7: Tỷ lệ kiểu gen khác nhau trong một quần thể P. falciparum
và hiện tợng nhiễm P.falciparum trên một bệnh nhân

Số kiểu gen

Đơn vị
SL
mẫu
SL %
Đa nhiễm
(%)
Đơn nhiễm
(%)
S185 76 40 52,63 26,31 73,69
D10 39 22 56,41 10,25 89,75
D721 32 21 65,62 21,87 78,13
D584 37 23 62,16 16,22 83,74

- Tỷ lệ P.falciparum mang kiểu gen khác nhau trong một quần thể, thể
hiện tính đa dạng của chúng. Tính đa dạng về kiểu gen gián tiếp thể hiện
khả năng lan truyền sốt rét của vùng sốt rét lu hành. Kết quả cho thấy:
P.falciparum có khả năng lan truyền cao ở Gia Lai (tỷ lệ kiểu gen khác
nhau 65,62%), thấp Quảng Bình (tỷ lệ kiểu gen khác nhau là 52,63%).
- Tỷ lệ P.falciparum đa nhiễm trên một bệnh nhân gián tiếp thể hiện mức
độ phơi nhiễm của cộng đồng trong vùng sốt rét lu hành. Kết quả cho

thấy: S185 ở Quảng Bình là đơn vị làm đờng mức độ phơi nhiễm cao (tỷ
lệ đa nhiễm 26,31%). S10 ở Kon Tum hoạt động tĩnh tại - doanh trại kiên
cố nên mức độ phơi nhiễm thấp (tỷ lệ đa nhiễm là 10,25%).

10
3.1.2.3. Đặc điểm kiểu gen của P. vivax
Bảng 3.8: Tỷ lệ kiểu gen khác nhau trong một quần thể P. vivax
và hiện tợng nhiễm P.vivax trên một bệnh nhân


Số kiểu gen

Đơn vị
SL
mẫu
SL %
Đa nhiễm
(%)
Đơn nhiễm
(%)
S185 32 25 78,12 21,87 78,13
D10 5 10 66,66 6,66 93,34
D721 9 7 77,77 11,11 88,89
D584 12 9 75,00 8,33 91,67

- Tỷ lệ P.vivax mang kiểu gen khác nhau trong một quần thể và hiện
tợng đa nhiễm P.vivax trên một bệnh nhân tơng đơng kết quả trên.
3.1.2.4. Đặc điểm P.falciparum mang gen Pfcrt đột biến và một số đột
biến trên gen Pfcrt kháng với chloroquin
- So sánh kết quả xác định P.falciparum mang gen Pfcrt đột biến bằng

kỹ thuật PCR - RFLP, sequencing và in vitro
Bảng 3.10: Cấu trúc gen Pfcrt và đáp ứng in vitro với chloroquin
(một số phân lập ví dụ)

Sequencing In vitro

TT

Phân
lập

PCR-
RFLP

74

75

76

S/R
IC
50
(nM)

S/R
1 V21
R I

E

T
R
231,26
R
2 V34
R I

E

T
R
216,35
R
3 V5
R I

E

T
R
212,73
R
4 V3
R I

D

T
R
192,42

R
5 V19
R I

D

T
R
185,26
R
6 V9
R I
D T R
168,64
R
7 V8 S M N K S 121,93 S
8 V10 S M N K S 98,67 S
9 V11 S M N K S 52,81 S
10 V2 S M N K S 14,26 S
11 V40 S M N K S 13,72 S

* I, E/D, T amino acid của gen mã hoá đột biến
* Thứ tự sắp sếp theo mức độ kháng từ cao xuống thấp
- Kết quả PCR - RFLP, sequencing và in vitro là đồng nhất. Đột biến gen
Pfcrt tại codon 76 có ý nghĩa quyết định đến tính kháng, đột biến tại codon
74, 75 ảnh hởng tới mức độ kháng của P.falciparum với chloroquin.

11
- Các phân lập P.falciparum mang gen Pfcrt đột biến, kháng chloroquin
theo mức độ khác nhau. Gen Pfcrt mã hoá tổng hợp amino acid có cấu trúc:

I
E T kháng ở mức cao (IC
50
= 241,16 54,55 nM), I D T ở mức độ thấp
hơn (IC
50
= 177,9 12,99 nM).

- Tỷ lệ P. falciparum mang gen Pfcrt đột biến kháng chloroquin
Bảng 3.11: Nhạy cảm của P. falciparum với chloroquin

Gen Pfcrt
Kháng (76T) Nhạy (K76)

Đơn vị

SL
mẫu
SL % SL %
S185
(Quảng Bình)

76

39

51,31

37

48,69
D10
(Kon Tum)

39

16

41,02

23

58,98
D721
(Gia Lai)

32

14

43,75

18

56,25
D584
(Đắc Lắc)

37

17

45,94

20

54,06

Chung cả vùng


184

86

46,74

98

53,26

- Tỷ lệ P.falciparum mang gen Pfcrt đột biến kháng chloroquin tại một số
đơn vị Quân đội ở miền Trung - Tây Nguyên là 86/184 (46,74%) trong đó:
Quảng Bình là 51,31%, Kon Tum là 41,02%, Gia Lai là 43,75, Đắc Lắc là
45,94%
3.1.2.5. Đặc điểm P.falciparum mang gen Pfdhfr đột biến và một số đột
biến trên gen Pfdhfr kháng với antifolat
- Đáp ứng in vitro của P. falciparum với pyrimethamin và cycloguanil
Bảng 3.12: Đáp ứng in vitro của P. falciparum
với pyrimethamin, cycloguanil

Kháng Nhạy

Thuốc
SL IC
50
(nM) SL IC
50
(nM)

PYR

53

1771,76 1263,24

14

71,32 24,53

CYC

18

127,25 89,49

49

17,44 13,21

* Ngỡng kháng: PYR là 100 nM; CYC là 40nM

12
- Kết quả in vitro cho thấy P.falciparum nhạy với cycloguanil tỷ lệ cao
(73,14%) và ngợc lại kháng cao với pyrimethamin (79,10%), sự khác biệt
này là có ý nghĩa thống kê p < 0,001.

- So sánh kết quả xác định P.falciparum mang gen Pfdhfr đột biến
bằng kỹ thuật PCR - RFLP, sequencing và in vitro

Bảng 3.13: Cấu trúc gen Pfdhfr và đáp ứng in vitro với pyrimethamin
(một số phân lập ví dụ)

Sequencing In vitro
TT

Phân
lập

PCR-
RFLP

108

59

51

S/R
IC

50
(nM)

S/R
1 V9
R
N
R I
R
2721,16
R
2 V3
R
N
R I
R
1042,37
R
3 V2
R
N
R
N
R
313,52
R
4 V11
R
N
R

N
R
312,43
R
5 V4
R
N
R
N
R
298,54
R
6 V12
R
N

C N
R
254,71
R
7 V10 S S C
I

S 36,58 S
8 V5 S S C N S 31,15 S
9 V8 S S C N S 25,32 S
10 V32 S S C N S 24,41 S
11 V36 S S C N S 22,41 S

* N, R, I amino acid của gen mã hoá đột biến

* Thứ tự các mẫu đợc sắp xếp theo mức độ kháng giảm dần.

- Đột biến gen Pfdhfr tại codon 108 có ý nghĩa quyết định đến tính kháng
pyrimethamin của P.falciparum.
- Đột biến gen Pfdhfr ở codon 59 và 51 ảnh hởng tới mức độ kháng
pyrimethamin của P.falciparum.
- Những phân lập P.falciparum đa đột biến (108N
, 59R, 51I) mức độ
kháng cao hơn so với những phân lập mang 2 đột biến (108N
, 59R) và cao
hơn những phân lập chỉ có 1 đột biến đơn thuần (108N
). Vì vậy bên cạnh
những phân lập kháng rất cao (2721,16 nM) có những phân lập kháng rất
thấp (254,71 nM), thấp hơn 10,68 lần.



13
- Tỷ lệ P.falciparum mang gen Pfdhfr đột biến kháng pyrimethamin
Bảng 3.15: Nhạy cảm của P.falciparum với pyrimethamin

Gen Pfdhfr
Kháng (108N) Nhạy (S108)

Đơn vị

SL
mẫu
SL % SL %
S185

(Quảng Bình)

76

63

82,89

13

17,02
D10
(Kon Tum)

39

33

84,61

6

15,39
D721
(Gia Lai)

32

28

87,50

4

12,50
D584
(Đắc Lắc)

37

33

89,18

4

10,82

Chung cả vùng

184

157

85,33

27

14,67

- P.falciparum tại một số đơn vị Quân đội ở miền Trung - Tây Nguyên
kháng pyrimethamin với tỷ lệ cao 157/184 (85,33%). Vì vậy
pyrimethamin và các thuốc phối hợp nh Fancidar, viên SR2 không còn
hiệu lực để điều trị và dự phòng ở khu vực này.
3.1.2.6. Đặc điểm P.falciparum mang gen Pfmdr1 đột biến và một số
đột biến tại gen Pfmdr1 đa kháng thuốc
Bảng 3.17: Tỷ lệ P. falciparum mang gen Pfmdr1 đột biến đa kháng
Sequencing gen Pfmdr1
Đột biến 184F


Khu vực

SL
Đột biến
86Y

SL %
Miền Trung 54 0 6 11,11
Tây Nguyên 31 0 5 16,13

Chung cả vùng

85

0

11

12,94

- Đột biến 86Y của gen Pfmdr1 ảnh hởng đến tính kháng của
P.falciparum với mefloquin, artemisinin không phát hiện thấy.
- Đột biến 184F
của gen Pfmdr1 ảnh hởng rất ít đến tính kháng
P.falciparum với mefloquin, artemisinin là 11/85 (12,94%).
- Đáp ứng in vitro của P.falciparum với mefloquin IC
50
= 153,71 - 943,16
nM, với artesunat IC
50
= 23,62 12,54 nM.

14
3.1.2.7. Đặc điểm P.vivax mang gen Pvdhfr đột biến kháng
pyrimethamin
Bảng 3.18: Nhạy cảm của P.vivax với pyrimethamin

Pvdhfr
Kháng (117N) Nhạy (S117)

Đơn vị

SL
mẫu
SL % SL %
S185
(Quảng Bình)

32

18

56,25

14

43,75
D10
(Kon Tum)

15

9

60,00

6

40,0
D721
(Gia Lai)

9

6

66,66

3

33,34
D584
(Đắc Lắc)

12

9

75,00

3

25,0

Chung cả vùng

68

42

61,76


26

38,24

- Tỷ lệ P.vivax tại một số đơn vị Quân đội ở miền Trung - Tây Nguyên

mang gen Pvdhfr đột biến kháng pyrimethamin là 42/68 (61,76%) trong
đó: ở Quảng Bình là 56,25%, ở Kon Tum là 60,00%, ở Gia Lai là 66,66%,
ở Đắc Lắc là 75,0%.

3.2. Đánh giá hiệu lực hai phác điều trị sốt rét kháng thuốc
3.2.1. Hiệu lực điều trị sốt rét thờng do P. falciparum bằng phác đồ
artesunat phối hợp doxycyclin và artesunat đơn thuần
3.2.1.3. Thời điểm cắt sốt trong quá trình điều trị

Bảng 3.21: Thời điểm cắt sốt của các phác đồ

AS + DO
(SL = 30)
AS
(SL = 30)

Phác đồ

Thời điểm SL % SL %
D
0
(0 giờ) 0 0 0 0
D
0
(12 giờ) 15 50,0 13 43,3
D
1
(24 giờ) 9 30,0 8 26,7
D
2

(48 giờ) 6 20,0 9 30,0
D
3
(72 giờ) 0 0 0 0
Thời điểm cắt sốt
trung bình (giờ)

22,8 13,9

26,0 15,5

15
- Tốc độ cắt sốt của phác đồ artesunat phối hợp với doxycyclin tuy nhanh
hơn phác đồ artesunat đơn thuần, song sự khác biệt này là không có ý
nghĩa thống kê với p > 0,05.

3.2.1.4. Thời điểm sạch ký sinh trùng sốt rét trong quá trình điều trị
Bảng 3.22: Thời điểm sạch KSTSR của các phác đồ

AS + DO
(SL = 30)
AS
(SL = 30)

Phác đồ
Thời điểm
SL % SL %
D
0
(0 giờ) 0 0 0 0

D
0
(12 giờ) 17 56,7 14 46,7
D
1
(24 giờ) 9 30,0 11 36,7
D
2
(48 giờ) 4 13,3 5 16,7
D
3
(72 giờ) 0 0 0 0
Thời điểm sạch KSTSR
trung bình (giờ)

20,4 12,3

22,3 12,9


- Tốc độ sạch KSTSR của phác đồ artesunat phối hợp với doxycyclin tuy
nhanh hơn phác đồ artesunat đơn thuần, song sự khác biệt này là không có
ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

3.2.1.7. Hiệu lực điều trị của phác đồ artesunat phối hợp với
doxycyclin và artesunat đơn thuần
Bảng 3.25: So sánh hiệu lực điều trị của artesunat phối hợp với
doxycyclin và artesunat đơn thuần

Phác đồ

Đáp ứng lâm sàng
AS + DO
(SL = 30)
AS
(SL = 30)

So sánh
Thời điểm cắt sốt (giờ)
22,8 13,9 26,0 15,5
p > 0,05
Thời điểm sạch KST (giờ)
20,4 12,3 22,3 12,9
p > 0,05
Điều trị khỏi 28/30 (93,3%) 23/30 (76,7%) p > 0,05
Điều trị thất bại sớm 0 0
Điều trị thất bại muộn 2/30 7/30 (23,33) p > 0,05
Tác dụng phụ 0 0

- Tỷ lệ điều trị khỏi ở phác đồ artesunat phối hợp với doxycyclin (93,3%)
có cao hơn tỷ lệ điều trị khỏi ở phác đồ artesunat đơn thuần (76,7%), tuy sự
khác biệt này là không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05, song cũng đã cho
một nhận định có dấu hiệu khả quan hơn.

16
- Điều trị thất bại muộn: phác đồ artesunat phối hợp với doxycyclin là 2/30
ca, phác đồ artesunat đơn thuần là 7/30 (23.3%).

3.2.2. Hiệu lực điều trị sốt rét thờng do P.falciparum bằng phác đồ
chloroquin phối hợp azithromycin và artesunat đơn thuần
3.2.2.3. Thời điểm cắt sốt trong quá trình điều trị

Bảng 3.28: Thời điểm cắt sốt của các phác đồ

CQ + AZ
(SL = 31)
AS
(SL = 30)
Phác đồ

Thời điểm
SL % SL %
D
0
(0 giờ) 0 0 0 0
D
0
(12 giờ) 11/31 35,5 13 43,3
D
1
(24 giờ) 4/31 12,9 8 26,7
D
2
(48 giờ) 14/31 45,2 9 30,0
D
3
(72 giờ) 2/30 * 6,67 0 0
Thời điểm cắt sốt
trung bình (giờ)

33,7 19,6

26,0 15,5

* 1 ca bệnh thất bại sớm

- Tốc độ cắt sốt của phác đồ artesunat đơn thuần tuy nhanh hơn phác đồ
choloroquin phối hợp với azithromycin, nhng sự khác biệt này là không
có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

3.2.2.4. Thời điểm sạch ký sinh trùng sốt rét trong quá trình điều trị
Bảng 3.29: Thời điểm sạch KSTSR của các phác đồ

CQ + AZ
(SL = 31)
AS
(SL = 30)
Phác đồ

Thời điểm
SL % SL %
D
0
(0 giờ) 0 0 0 0
D
0
(12 giờ) 3/31 9,7 14/30 46,7
D
1
(24 giờ) 3/31 9,7 11/30 36,7
D
2

(48 giờ) 14/31 45,2 5/30 16,7
D
3
(72 giờ) 11/30 * 36,7 0 0
Thời điểm sạch KSTSR
trung bình (giờ)

50,7 19,8

22,3 12,9


* 01 ca bệnh thất bại sớm

17
- Tốc độ sạch KSTSR của phác đồ artesunat đơn thuần tuy nhanh hơn phác
đồ chloroquin phối hợp với azithromycin, song 100% bệnh nhân ở phác đồ
phối hợp sạch KSTSR tại thời điểm 72giờ.
3.2.2.7. Tỷ lệ ca bệnh có P.falciparum mang gen Pfcrt đột biến kháng
chloroquin
Bảng 3.32: Tỷ lệ ca bệnh P.falciparum mang gen Pfcrt đột biến

Số ca bệnh mang gen Pfcrt đột biến
CQ + AZ
(SL = 31)
AS
(SL = 30)

Phác đồ
Kết quả

SL % SL %
Lô điều trị khỏi 12/14 85,7 10/13 43,5
Lô điều trị thất bại sớm 1/1 0 0
Lô điều trị thất bại muộn 1/1 3/7 42,8

Tổng số

14/31

45,2

13/30

43,3


- Kết quả điều trị ở phác đồ chloroquin phối hợp với azithromycin cho
thấy:
+ Những ca điều trị thất bại sớm và thất bại muộn (2/2 ca bệnh) nhiễm
P.falciparum mang gen Pfcrt đột biến kháng chloroquin.
+ Có 12/14 (85,71%) ca bệnh nhiễm P.falciparum mang gen Pfcrt đột biến
kháng chloroquin vẫn đợc điều trị khỏi.

3.2.2.8. Hiệu lực điều trị của phác đồ chloroquin phối hợp với
azithromycin và artesunat đơn thuần
Bảng 3.33: So sánh hiệu lực điều trị của phác đồ chloroquin phối hợp với
azithromycin và artesunat đơn thuần

Phác đồ
Đáp ứng lâm sàng

CQ + AZ
(SL = 31)
AS
(SL = 30)

So sánh
Thời điểm cắt sốt (giờ)
33,7 19,6 26,0 15,5
p > 0,05
Thời điểm sạch KST (giờ)
50,7 19,8 22,3 12,9
p < 0,001
Điều trị khỏi 29/31 (93,5%) 23/30 (76,7%) p > 0,05
Điều trị thất bại sớm 1/31 0
Điều trị thất bại muộn 1/30 7/30 (23,3%) p > 0,05
Tác dụng phụ 0 0

- Tỷ lệ điều trị khỏi ở phác đồ chloroquin phối hợp với azithromycin là
29/31 (93,5%) có cao hơn tỷ lệ điều trị khỏi ở phác đồ artesunat đơn thuần

18
là 23/30 (76,7%). Tuy sự khác biệt này là không có ý nghĩa thống kê với
p > 0,05, song cũng đã cho một nhận định có dấu hiệu khả quan hơn.
- Tỷ lệ điều trị thất bại muộn ở phác đồ chloroquin phối hợp azithromycin
là 1/30 thấp hơn ở phác đồ artesunat đơn thuần là 7/30 (23,3%). Tuy sự
khác biệt này là không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05, song cũng đã cho
một nhận định khả quan hơn.

Chơng 4
bn luận

4.1. Tính nhạy cảm của P. falciparum với chloroquin và antifolat tại
một số đơn vị Quân đội ở miền Trung Tây Nguyên
4.1.1. P.falciparum tăng nhạy cảm với chloroquin
ở Việt Nam P.falciparum kháng chloroquin lần đầu tiên đợc phát
hiện tại Nha Trang vào năm 1961. Tình trạng kháng ngày càng lan rộng và
mức độ kháng này càng tăng cao, đến năm 1990 có những vùng tỷ lệ
kháng tới 85 - 100%. Vì vây chloroquin không đợc dùng để điều trị sốt
rét do P.falciparum nữa. Trong một thời gian dài 10 15 năm qua ở Viêt
Nam chloroquin không còn đợc sử dụng áp lực thuốc không còn đã dẫn
đến tình trạng tái nhạy của KSTSR với chloroquin nh kết quả của một
số nghiên cứu.
Trong nghiên cứu của chúng tôi đáp ứng in vitro của P.falciparum
với chloroquin nhạy dần theo thời gian, năm 2001 tỷ lệ kháng là 54,55%
đến năm 2005 tỷ lệ kháng là 40,00%. Mức độ kháng IC
50
= 266,85
87,63nM (2001), giảm xuống IC
50
= 213,33 78,78 (2005), tuy rằng sự
khác nhau không có ý nghĩa thống kê, song kết quả đã thể hiện hiện tợng
nhạy gia tăng dần. Kết quả này đồng nhất với một số nghiên cứu khác:
Nguyễn Mai Hơng tại một số điểm ở Bình Phớc cho thấy, tỷ lệ nhạy gia
tăng dần theo thời gian: 83% (1988), 84% (1999), 96% (2000). Hiện tợng
tái nhạy không chỉ có ở Việt Nam mà cũng đã xuất hiện ở một số nơi
khác nh Trung Quốc và Thái Lan.
Nghiên cứu sequencing DNA của P.falciparum những phân lập nhạy
mang gen Pfcrt ở dạng tự nhiên (không đột biến), trình tự các nucleotid từ
codon 74 - 76 có cấu trúc ATG (M74), AAT (N75), AAA (K76). Những
phân lập kháng gen Pfcrt đột biến, cấu trúc thay đổi ATT

(74I),
G
AT(75E)/GAA(75D), ACA (76T). Cấu trúc codon 76 có ý nghĩa quyết
định tính nhạy kháng, cấu trúc codon 75 ảnh hởng tới mức độ kháng với
chloroquin. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cấu trúc: I
E T kháng ở mức
cao (IC
50
= 241,16 54,55 nM), I D T ở mức độ thấp hơn (IC
50
= 177,9

19
12,99 nM). MNK không kháng (IC
50
= 63,2 49,03 nM). Kết quả này là
hoàn toàn đồng nhất với một số nghiên cứu khác trên thế giới và ở Việt
Nam.

4.1.2. Tính nhạy cảm của P.falciparum với Pyrimethamin
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ P.faciparum mang gen Pfdhfr
đột biến kháng pyrimethamin là 85,33% và tỷ lệ kháng in vitro 79,10%.
Đáp ứng in vitro của P.falciparum với pyrimethamin nhạy dần theo thời
gian từ thời gian từ năm 2001-2005, tỷ lệ kháng giảm 1,11 lần, mức độ
kháng giảm 1,21 lần. Bên cạnh số ít những chủng còn rất nhạy (IC
50
=
71,3 24,5nM) thì đại đa số các chủng kháng rất cao với pyrimethamin
(IC
50

= 1771,76 1263nM).
Nghiên cứu sequencing các mẫu DNA cũng cho kết quả tơng tự với
một số nghiên cứu khác trên thế giới và trong nớc. Sự thay đổi trình tự các
nucleotid của gen Pfdhfr tại các codon 108, 59 và 51 cho thấy: những phân
lập nhạy mang gen Pfdhfr ở dạng tự nhiên AGC (S108), TGT (C59), AAT
(S51) nhạy với pyrimethamin, những phân lập mang đột biến AA
C(108N),
C
GT(59R), ATT (51I) kháng với pyrimethamin. Đột biến tại codon 108 có
ý nghĩa quyết định đến tính kháng pyrimethamin của P.falciparum. Đột
biến ở các codon 59 và 51 ảnh hởng tới mức độ kháng, các mẫu đa đột
biến (108N
, 59R, 51I) kháng cao hơn so với những mẫu chỉ có 1đột biến
đơn thuần (108N
) hoặc 2 đột biến (108N, 59R)/(108N, 51I). Kết quả của
chúng tôi cho thấy P.falciparum tại vùng nghiên cứu ngoài phần nhiều các
phân lập mang gen Pfdhfr đa đột biến còn có những phân lập chỉ có 1 đột
biến duy nhất tại codon 108. Vì vậy bên cạnh những phân lập kháng rất
cao với pyrimethamin (IC
50
= 2721,16 nM) còn có những phân lập kháng
rất thấp (IC
50
= 264,71 nM), thấp hơn 10,28 lần.
Trong nghiên cứu của chúng tôi đáp ứng in vitro của P.falciparum
với cycloguanil cho thấy tỷ lệ nhạy rất cao 73,13%, đáp ứng in vitro IC
50
=
17,44 - 127,25nM. Điều đáng lu ý ở đây là theo các nghiên cứu trên thế
giới những đột biến của gen Pfdhfr đợc xác định kháng pyrimethamin thì

có nghĩa là kháng cycloguanil. ở Việt Nam, cycloguanil tuy thuộc nhóm
antifolat, song ít đợc dùng từ năm 1970 trở lại đây. Trên 35 năm qua áp
lực của cycloguanil không còn nữa, cho nên P.falciparum nhạy cao với
cycloguanil là hợp lý.
Nghiên cứu của chúng tôi thể hiện rõ nhận định chung: khi áp lực
thuốc không còn thì hiện tợng tái nhạy theo thời gian đợc phục hồi, cho
dù cấu trúc phân tử của KSTSR có phần ảnh hởng tới tính nhạy cảm của
KSTSR với một thuốc chống sốt rét nào đó.

20
4.2. Hiệu lực của hai phác đồ điều trị sốt rét kháng thuốc

4.2.1. Phác đồ artesunat phối hợp với doxycyclin điều trị sốt rét
thờng do P.falciparum
4.2.1.1. Thời điểm cắt sốt
Nghiên cứu của chúng tôi thời điểm cắt sốt trung bình ở phác đồ phối
hợp là 22,8 13,9 giờ, tơng đơng với nghiên cứu của Awad tại Su Đăng,
Looareesuwan tại Thái Lan, song sớm hơn so với nghiên cứu của Vũ Bằng
Đình - Bùi Đại, Lý Bá Lộc ở Tây Nguyên. Chúng tôi đồng nhất với ý kiến
của Vũ Bằng Đình - Bùi Đại: trong phác đồ phối hợp thì kháng sinh bên
cạch tác dụng diệt KSTSR còn ý nghĩa về mặt lâm sàng trong điều trị
chống bội nhiễm. Nên thời điểm cắt sốt phác đồ phối hợp sớm hơn phác đồ
artesunat đơn thuần.

4.2.1.2. Thời điểm sạch ký sinh trùng
Thời điểm sạch KSTSR trong nghiên cứu của chúng tôi là 20,4 12,3
giờ tơng đơng với nghiên cứu của Awad tại Su Đăng, Looareesuwan tại
Thái Lan, sớm hơn so với nghiên cứu của Vũ Bằng Đình - Bùi Đại, Lý Bá
Lộc. Tốc độ sạch KSTSR của phác đồ phối hợp nhanh hơn phác đồ
artesunat đơn thuần, tuy sự khác biệt là không có ý nghĩa, song cũng đã

đồng nhất khẳng định tác dụng diệt KSTSR của doxycyclin nh một số
nghiên cứu khác.

4.2.1.3. Hiệu lực điều trị
Hiệu lực điều trị của phác đồ phối hợp trong nghiên cứu của chúng
tôi: Tỷ lệ điều trị khỏi là 93,3%, điều trị thất bại muộn là 6,7%. Theo
nghiên cứu của Vũ Bằng Đình - Bùi Đại: Tỷ lệ điều trị khỏi là 52,8%, điều
trị thất bại muộn là 47,2%, không có biến chứng nhiễm trùng. Theo Lý Bá
Lộc điều trị khỏi là 77,4%, điều trị thất bại muộn 22,3%.
Một số nghiên cứu khác trên thế giới: Awad tại Su Đăng tỷ lệ điều trị
khỏi là 100%. Duarte tại Braxin và Looareesuwan tại Thái Lan tỷ lệ này là
80%.
Từ kết quả nghiên cứu của chúng tôi và một số nghiên cứu khác thấy
rằng: Hiệu lực điều trị của phác đồ artesunat phối hợp doxycyclin cao hơn
phác đồ artesunat đơn thuần. Tuy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê,
song đã cho khẳng định khi artesunat phối hợp với doxycyclin, thì
doxycyclin có vai trò diệt KSTSR chống tái phát, hơn thế nữa tác dụng
kháng sinh của doxycyclin trong chống bội nhiễm trên lâm sàng là vấn đề
cần thiết ở vùng sốt rét lu hành.


21
4.2.2. Phác đồ chloroquin phối hợp azithromycin điều trị sốt rét
thờng do P.falciparum
4.2.2.1. Thời điểm cắt sốt
Trong nghiên cứu của chúng tôi thời điểm cắt sốt trung bình: phác đồ
chloroquin phối hợp với azithromycin là 33,7 19,6 giờ.
Theo Nông Thị Tiến khi dùng chloroquin đơn thuần tại một số địa
điểm ở miền Trung - Tây Nguyên, thời điểm cắt sốt trung bình là 36 21,6
giờ. Nguyễn Thị Mai Hơng phối hợp chloroquin với artesunat thời điểm

cắt sốt tại Bình Phớc là 38,4 18 giờ.
Có thể thấy rằng chloroquin phối hợp với azithromycin đã làm tăng
nhanh tốc độ cắt sốt so với dùng chloroquin đơn thuần trong nghiên cứu
của Nông Thị Tiến và nghiên cứu Nguyễn Thị Mai Hơng dùng chloroquin
phối hợp artesunat ở khu vực Bình Phớc (bởi tỷ lệ P.falciparum mang gen
Pfcrt đột biến trong nghiên cứu của chúng tôi tại Quảng Bình là 51,31%,
tại các nghiên cứu trên 48%).

4.2.2.2. Thời điểm sạch ký sinh trùng sốt rét
Trong nghiên cứu của chúng tôi thời điểm sạch KSTSR trung bình là
50,7 19,8 giờ.
Theo Nông Thị Tiến dùng chloroquin đơn thuần là 60 24 giờ.
Nguyễn Mai Hơng chloroquin phối hợp với artesunat tại Bình Phớc là 60
21,6 giờ. Có thể thấy rằng dùng chloroquin phối hợp với azithromycin đã
làm tăng nhanh tốc độ sạch KSTSR so với dùng choloroquin đơn thuần của
Nông Thị Tiến và phối hợp chloroquin với artesunat trong nghiên cứu của
Nguyễn Thị Mai Hơng.

4.2.2.3. Hiệu lực điều trị của phác đồ.
Hãng Pfizer đã bớc 2 sử dụng thử nghiệm cho thấy nếu dùng
azithromycin đơn thuần để điều trị sốt rét do P.falciparum hiệu quả điều trị
là 21 - 38%, nhng khi phối hợp chloroquin với azithromycin thì hiệu quả
đạt đợc 96%. Dunne ở ấn Độ (2005) sử dụng chloroquin phối hợp với
azithromycin để điều trị sốt rét thờng do P.falciparum cho thấy hiệu quả
điều trị khỏi là 97%.
Trong nghiên cứu của chúng tôi: Điều trị khỏi là 29/31 (93,55%),
điều trị thất bại sớm là 1/31 ca bệnh, điều trị thất bại muộn là 1/31 ca bệnh.
Phân tích gen Pfcrt các mẫu DNA của KSTSR ở nghiên cứu này: 2
ca bệnh điều trị thất bại sớm và muộn đều nhiễm P.falciparum mang gen
Pfcrt đột biến, có 12/14 (85,71%) ca bệnh nhiễm P.falciparum mang gen

Pfcrt đột biến vẫn đợc điều trị khỏi bằng phác đồ này. Có thể thấy rằng