Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SPP.
PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN
TRUYỀN THỐNG ĐỂ KÉO DÀI
THỜI GIAN BẢO QUẢN BÁNH MÌ

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn:

ThS. Huỳnh Phương Quyên
TS. Nguyễn Hoài Hương

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thái Thiên Dung

MSSV: 1311100223

Lớp: 13DSH01

TP.Hồ Chí Minh, 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc.

TP.HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2017
Học viên thực hiện luận văn

Nguyễn Thái Thiên Dung


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy, Cô trường
Đại học Công Nghệ TP. HCM đã nhiệt tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cũng như
niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho sinh viên trong suốt thời gian học tập.
Để hoàn thành được đồ án “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập
từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì”
trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải không ít
lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của ThS.
Huỳnh Phương Quyên và TS. Nguyễn Hoài Hương, Giảng viên Khoa Công nghệ
Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, cùng những
kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy mà em có thể đạt được thành quả của
ngày hôm nay. Em xin chân thành cảm ơn các Cô.
Em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc
và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe.

Cám ơn các bạn đại học khóa 2013 – 2017 và các em khóa 2015 – 2019 trường
Đại học Công nghệ TP. HCM, luôn bên cạnh và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm
đồ án tại truờng. Cuối cùng, từ tận đáy lòng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia
đình đã luôn dành tình yêu thương vô vàn cho con, đã luôn ủng hộ, động viên và tạo
niềm tin để con luôn vững bước trên con đường mình đã chọn.
TP.HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2017
Sinh viên thực hiện đồ án

Nguyễn Thái Thiên Dung


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT ....................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. vi
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH ..........................vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.

Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................... 1

2.

Tình hình nghiên cứu .............................................................................. 2

3.

Mục tiêu ................................................................................................... 2

4.

Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................. 2

5.

Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 3

6.

Kết quả đạt được của đề tài .................................................................... 3

7.

Kết cấu đồ án ........................................................................................... 3

Chương 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 5
1.1

Tổng quan về vi khuẩn lactic .................................................................. 5
1.1.1

Giới thiệu chung ............................................................................... 5

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus ......................................... 7
1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ......................................... 9
1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn lactic ................................................................. 10
1.1.2

Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic ............... 12

1.1.2.1 Quá trình trao đổi chất ................................................................. 12
1.1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic ....................................................... 13
1.1.3. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic ...................................... 14
1.2

Tổng quan về nấm mốc ......................................................................... 15
1.2.1. Đặc điểm ......................................................................................... 16
1.2.2

Độc tố do nấm tiết ra ....................................................................... 16

1.2.3

Tác hại của nấm.............................................................................. 17
i


Đồ án tốt nghiệp

1.2.4
1.3

Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm .................................... 17

Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì .......................................... 18
1.3.1

Giới thiệu chung ............................................................................. 18

1.3.2

Quy trình làm bánh mì .................................................................... 19

1.3.3

Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì .................. 23

1.3.4

Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì ................................. 24

1.4

Tổng quan về bột chua .......................................................................... 25
1.4.1. Đặc tính của bột chua ..................................................................... 25
1.4.2. Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua ................................. 26
1.4.3. Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với

hương vị của bánh mì ................................................................................... 27
1.4.4. Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua........... 28
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 31
2.1.

Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 31

2.2.

Thời gian thực hiện ............................................................................... 31

2.3.

Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 31

2.3.1. Giống vi sinh vật ............................................................................. 31
2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng .................................................... 31
2.3.2.1. Hoá chất ....................................................................................... 31
2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy ..................................................................... 31
2.4.

Thiết bị và dụng cụ ................................................................................ 32

2.4.1. Thiết bị ............................................................................................ 32
2.4.2. Dụng cụ ........................................................................................... 32
2.5.

Phương pháp luận ................................................................................. 32

2.6.

Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 33

2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................ 33
2.6.2. Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. ............................................. 34
2.6.2.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............... 34
2.6.2.2 Khả năng sinh acid .......................................................................... 37
ii

Đồ án tốt nghiệp

2.6.2.4 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro
................................................................................................................... 38
2.6.3. Xây dựng đường chuẩn................................................................... 41
2.6.3.1. Lactobacillus spp.......................................................................... 41
2.6.3.2. Nấm mốc Aspergillus niger........................................................... 44
2.6.4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh
mì của vi khuẩn LAB với nấm men............................................................... 47
2.6.5

Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì .................. 50

2.6.5.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn
Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau........... 50
2.6.5.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có
bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản .. 52
2.6.5.3 Độ nở bánh mì .............................................................................. 54
2.6.5.4 Độ ẩm bánh mì ............................................................................. 54
3.1

Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. ................................................... 55
3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát về sinh lý, sinh hóa ................ 55
3.1.2 Khả năng sinh acid............................................................................. 56
3.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro

....................................................................................................................... 57
3.2

Xây dựng đường chuẩn ......................................................................... 59
3.2.1. Lactobacillus spp. ........................................................................... 59
3.2.2. Nấm mốc Aspergillus niger ............................................................ 59

3.3

Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng

lên men bánh mì với nấm men ........................................................................ 60
3.4

Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì ....................... 63
3.4.1. Đánh giá cảm quan ........................................................................... 63
3.4.1.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn
Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau........... 63

iii


Đồ án tốt nghiệp

3.4.1.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có
bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản .. 66
3.4.2 Đánh giá độ nở ................................................................................... 68
3.4.3 Đánh giá độ ẩm .................................................................................. 71
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................... 74
1.

Kết luận ................................................................................................. 74

2.

Kiến nghị ............................................................................................... 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 76
Tài liệu tiếng Việt ............................................................................................ 76
Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................ 77
PHỤ LỤC THÀNH PHẨN MÔI TRƯỜNG ........................................................ 1
PHỤ LỤC BẢNG MÃ HÓA MẪU THỬ CẢM QUAN ....................................... 3
PHỤ LỤC KẾT QUẢ ............................................................................................ 9
PHỤ LỤC HÌNH ................................................................................................. 11
PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU ............................................................................... 18

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC VIẾT TẮT
-

VSV:

Vi sinh vật

-

LAB:

Lactic acid bacteria/Lactobacillales

-

MRS agar:

de Man, Rogosa, Sharpe Agar

-

MRS broth:

de Man, Rogosa, Sharpe Broth

-

PDA:

Potato Dextrose Agar

-

PDB:

Potato Dextrose Broth

-

SAS:

Statistical Analysis Systems

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998) .................................................................................... 15
Bảng 2.1: Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì. ... 48
Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn Lactobacillus spp. 55
Bảng 3.2: Độ acid (% TA) của chủng Lactobacillus spp. ...................................... 57
Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế của vi khuẩn Lactobacillus spp. với nấm mốc theo phương
pháp cấy 2 đường vi khuẩn .................................................................................... 57
Bảng 3.4: Kết quả mật độ Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 .................. 60
Bảng 3.5: Bảng tính mật độ nấm mốc để cảm nhiễm. ............................................ 61
Bảng 3.6: Bảng mật độ / khối lượng cần bổ sung .................................................. 61
Bảng 3.7: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu .................................................... 62
Bảng 3.8: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 ............ 64
Bảng 3.9: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.C1 ............ 64
Bảng 3.10: Kết quả đánh giá cảm quan mức độ ưa thích về các chỉ tiêu màu sắc, độ
xốp, mùi, vị của các mẫu bánh mì .......................................................................... 66
Bảng 3.11: Đánh giá chung về mức độ ưa thích của các mẫu bánh mì................... 67
Bảng 3.12: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BML5 ... 69
Bảng 3.13: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BMC1 ... 69
Bảng 3.14: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của các mẫu bánh mì ........ 70
Bảng 3.15: Đánh giá độ ẩm của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 và
Lactobacillus sp.C1 ............................................................................................... 72
Bảng 3.16: Đánh giá độ ẩm của các mẫu bánh mì khi vừa nướng xong và sau 7 ngày
bảo quản ................................................................................................................ 72

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus ................................................................. 7
Hình 1.2: Tế bào nấm Aspergillus niger ................................................................ 16
Hình 1.3: Bánh mì thành phẩm ............................................................................. 18
Hình 1.4: Quy trình làm bánh mì .......................................................................... 20
Hình 1.5: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid
lactic (được chuyển thể từ Liu và những người khác năm 2008) ............................ 30
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu đề tài.......................................................... 33
Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus spp........ 34
Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus spp. ............. 37
Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm
mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. ....................................................... 39
Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi
khuẩn..................................................................................................................... 41
Hình 2.7: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn chủng Lactobacillus spp. ................ 42
Hình 2.8: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn nấm mốc A.niger ............................ 44
Hình 2.9: Vùng đếm hồng cầu .............................................................................. 45
Hình 2.10: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì.
.............................................................................................................................. 47
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar ....................................................... 56
Hình 3.2: Kết quả nhuộm Gram ............................................................................ 56
Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus sp.L5 và
Lactobacillus sp.C1 ............................................................................................... 58

Hình 3.4: Đối kháng nấm Aspergillus niger .......................................................... 58
Hình 3.5: Đường chuẩn củng vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1
.............................................................................................................................. 59
Hình 3.6: Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus niger .............................................. 59

vii


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.7: Khảo sát đối kháng in vivo .................................................................... 63
Hình 3.8: Mẫu bánh mì bổ sung 2 chủng lactic chuẩn bị đánh giá cảm quan ......... 65
Hình 3.9: Tiến hành thí nghiệm cảm quan mẫu bổ sung 2 chủng lactic. ................ 66
Hình 3.10: Mẫu bánh mì chuẩn bị đánh giá cảm quan ........................................... 68
Hình 3.11: Tiến hành thí nghiệm cảm quan ........................................................... 68
Hình 3.12: Độ nở của bánh mì .............................................................................. 71

viii


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết của đề tài
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, chất lượng cuộc sống và nhu cầu của

con người ngày càng cao, nhất là nhu cầu về lương thực thực phẩm. Con người đòi
hỏi thực phẩm đa dạng, tiện dụng, an toàn và hiệu quả.

Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men, để
lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín. Khoảng một nửa số dân trên thế giới
dùng bánh mì làm món ăn vào buổi sáng bởi tính tiện dụng. Trên khắp thế giới, bánh
mì rất đa dạng về cả hình dạng và công thức chế biến cũng như cách bảo quản. Sự hư
hỏng của sản phẩm bánh mì chủ yếu là do sự tăng trưởng của nấm; các loài chủ yếu
liên quan đến là Aspergillus, Fusarium, và Penicillium. Ngoài những thiệt hại kinh tế
lớn bắt nguồn từ sự hiện diện của nấm mốc, mối quan tâm khác là việc nấm mốc sản
xuất độc tố tiềm năng có thể gây ra vấn đề sức khỏe cộng đồng (Legan, 1993). Trong
những năm gần đây, bảo quản sinh học (dùng vi khuẩn và / hoặc các chất chuyển hóa
của vi khuẩn để ngăn chặn sự hư hỏng và để kéo dài thời hạn sử dụng của thực phẩm)
(Stiles, 1996) đã đạt được sự quan tâm ngày càng tăng do nhu cầu của người tiêu
dùng. LAB có lịch sử lâu dài trong việc bảo quản thực phẩm khỏi các vi sinh vật gây
hư hỏng - chúng thường được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm, có thể sản
sinh ra một số chất chuyển hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe và do đó thường được
coi là an toàn (GRAS) (Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari, 2011),
chẳng hạn như axit hữu cơ, axit béo, hydrogen peroxide và bacteriocins. Hoạt tính
kháng nấm của LAB (Hassan & Bullerman, 2008; Magnusson, Strom, Roos, Sjogren,
& Schnürer, 2003; Sjogren, MAG nusson, Broberg, Schnürer, & Kenne, 2003) có thể
sử dụng để chống nấm mốc kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì.
Chính vì thế, tôi thực hiện đề tài về: “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp.
phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì”.

1


Đồ án tốt nghiệp

2.

Tình hình nghiên cứu

Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để tạo chế phẩm trong

nông nghiệp cả trong nước và trên thế giới.
Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng lại
nấm bệnh theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi, 2004) như: “Nghiên cứu
sử dụng vi khuẩn probiotic Lactobacillus plantarum trong chế biến sữa chua” (Đoàn
Anh Dũng, Nguyễn Công Hà, Lý Nguyễn Bình và Lê Nguyễn Đoan Duy - Khoa
Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, 2015), đồ án tốt nghiệp
“Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus niger và Mucor sp. của
vi khuẩn Lactobacillus sp.L5” (Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015).
Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic
được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong- 75, Hàn Quốc
theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và Schnurer, 2001). Ngăn ngừa sự
hư hỏng nấm mốc bằng cách sử dụng vi khuẩn axit lactic có đặc tính chống nấm
(Carla Luciana Gerez, Maria Ines Torino, Graciela Rollán, Graciela Font de Valdez,
2009). Vi khuẩn acid lactic trong bảo quản nâng cao chất lượng bánh mì (Belal J.
Muhialdin, Zaiton Hassan và Nazamid Saari, 2015).

3.

Mục tiêu
Sử dụng Lactobacillus spp. kết hợp nấm men trong lên men bánh mì nhằm kéo

dài thời gian bảo quản bánh mì và cải thiện cảm quan sản phẩm.

4.

Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacullus sp.C1.

-

Xây dựng đường chuẩn của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacullus

sp.C1, nấm Aspergillus niger để xác định mật độ tế bào, bào tử từng chủng.
-

Khảo sát khả năng kháng nấm mốc của vi khuẩn LAB in vitro.

2


Đồ án tốt nghiệp

-

Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men

bánh mì với nấm men.
-

Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì.

Phương pháp nghiên cứu

5.

a) Phương pháp luận

Chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ nem chua, cơm mẻ nên bản thân chủng
vi khuẩn đã có tính an toàn thực phẩm. Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của
vi khuẩn lactic đối với các nấm gây hư hỏng thực phẩm, người thực hiện đề tài tiếp
tục nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm thực phẩm. Từ đó ứng
dụng chủng vi khuẩn lactic để ức chế nấm mốc trên thực phẩm và cụ thể là bánh mì.
b) Phương pháp xử lý số liệu
-

Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị.

-

Sử dụng phần mềm SAS9.4 để xử lí số liệu.

6.

Kết quả đạt được của đề tài
-

Khẳng định được hoạt tính sinh học của chủng Lactobacillus spp..

-

Xác định được mật độ tế bào của Lactobacillus spp., A.niger.

-

Đánh giá tỉ lệ ức chế nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương pháp kháng

nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual Culture Two Line

Culture Method).
-

Xác định và kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì.

Kết cấu đồ án

7.
-

Mở đầu

-

Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên

quan đến tài liệu nghiên cứu.

3


Đồ án tốt nghiệp

-

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến

các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
-

Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà

đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biến chứng cho kết quả thu được.
-

Kết luận và kiến nghị - nội dung chương tóm tắt lại những kết quả mà đề tài

đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.

4


Đồ án tốt nghiệp

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1

Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.1.1 Giới thiệu chung
Lịch sử phát hiện ra vi khuẩn lactic:
-

Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hoá học người Thuỵ Điển Scheele đã tách được

acid lactic từ sữa bò lên men chua.
-

Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả

hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic.

-

Vào năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là

Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic).
-

Đến năm 1881, ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình

thành.
Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năng
tạo bào tử. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ nghi, không chứa cytochrom
và enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng
phân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển. Chính do sự sinh acid lactic, một
acid yếu nên vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong các thực phẩm lên men, dùng
để ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây hư hỏng. LAB có thể lên men các loại
đường monosaccharide và disaccharide nhưng không phải bất cứ chủng vi khuẩn
lactic nào cũng có thể lên men đường disaccharide: một số chủng không thể lên men
saccharose, một số lại không thể sử dụng được lactose, các vi khuẩn latic không lên
men được tinh bột (ngoại trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các loại
polysaccharide khác.
Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình
thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác
nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu
được acid hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và
các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại
5


Đồ án tốt nghiệp

cũng được sử dụng trong phân loại. Theo khóa phân loại của Bergey, họ
Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacieae.
- Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc.
- Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus.
Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên. Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là cỏ
khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột. Một số loài trong họ vi khuẩn
lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng
gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hình que...Phân
biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Khả năng tổng hợp nhiều hợp
chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp
thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic
từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi.
Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn
etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn,
một số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%). Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển
ở nhiệt độ tương đối thấp (5 oC hoặc thấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng
tối thích là 25 - 35 oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 45 oC. Khi gia
nhiệt tới 60 – 80 oC hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Sự phát triển của nó cần
có sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amin. Chúng có yêu cầu đặc biệt về
chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra
tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5.5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5.5 quá trình lên men
bị dừng lại. Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân huỷ protein của sữa thành các
peptid và acid amin. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn cao
hơn. Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit. Một số loài có khả năng tạo thành
màng nhầy. Một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật
gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic,
các loài này còn có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta
gọi các hợp chất này là bacteriocin). Những chất kháng sinh này không dùng trong y

6


Đồ án tốt nghiệp

học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan. Các vi khuẩn
lactic ngoài việc tạo thành acid còn có 1 số loài tạo được chất thơm ( diacetyl, acetoin,
acid bay hơi...) như Streptococcus diacetylactic.
1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus
Tuỳ theo hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình
cầu và hình que. Kích thước của chúng cũng thay đổi tuỳ theo từng loài.

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus

Phân loại khoa học:
-

Giới:

Vi khuẩn

-

Ngành:

Firmicutes

-

Lớp:

Bacilli

-

Bộ:

Lactobacillales

-

Họ:

Lactobacillacea

-

Giống:

Lactobacillus

Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L.acidophilus, L.brevis,
L.casei, L.fermentum, L.plantarum, L.bulgaricus,...

7


Đồ án tốt nghiệp

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase

âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu
bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes. Các loài
Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt
là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục
người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có
chứa các vi khuẩn này. Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như:
Lactobacillus

pasterian,

Lactobacillus

brevis,

Lactobacillus

axitophilus,

Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, plantarum. Sự phân chia của vi khuẩn lactic
dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài
Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm.
- Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, chúng được gọi là Thermobacterium, có
fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase). Chúng lên men được hexose để
tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 45℃.
- Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có
FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình
và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic.

- Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có
phosphoketolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus có vai trò hữu ích

trong điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột
kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy khi đi du lịch, tiêu chảy do
nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng không dung nạp Lactose, bệnh về da như:
bang đỏ do sốt, chàm, mụn trứng cá, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường
hô hấp.

8


Đồ án tốt nghiệp

1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi
khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình
thường, ngoài nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như nguồn
carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà chúng còn
có nhu cầu về một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng.
 Nhu cầu dinh dưỡng carbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các
monosaccharide (glucose, fructose, manose) và các disaccaride (saccharose, lactose,
maltose) cho đến các polysaccaride (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon
này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình
lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,..
 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi
khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì
vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ
có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt,
cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,.. Hiện nay, cao nấm men
là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy mô công

nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
 Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào,
nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không
có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại
vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà
rốt hay dịch tự phân nấm men.
 Nhu cầu các chất hữu cơ khác


Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ
khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ.
Một số acid hữu cơ có

9


Đồ án tốt nghiệp

ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid
oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm
thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.
Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng
đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng
các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
 Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các
muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho,
lưu huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo
chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu
trúc tế bào.
 Nhu cầu dinh dưỡng oxy

Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí (microaerophile), sinh trưởng trên
bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí (B.J.B
Wood and Holzapfel W.H, 1995). Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong
môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy. Tuy nhiên, trong
điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện
kị khí.
1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn lactic
Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát
triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu
suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh
dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình
nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm
sinh khối sau này.

10


Đồ án tốt nghiệp

 Thành phần môi trường nuôi cấy
Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết
cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất
với môi trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic
có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình
nuôi cấy vi khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển
hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng
làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin),
vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh
dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng

cao hiệu suất lên men.
 Yếu tố môi trường
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng rất
lớn đối với vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây
ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến
quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men
càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40℃. Một
số có thể sinh trưởng dưới 15℃ và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới
5℃ (B.J.B Wood and Holzapfel W.H, 1995).
- Ảnh hưởng của pH
Vi khuẩn lactic nói chung có thể phát triển được trong môi trường acid, khoảng
pH của chúng có thể từ 4.5 – 8.5. Trong quá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh ra acid
lactic, khi pH thấp hơn 4 một mặt nó sẽ ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nó
cũng ức chế sự phát triển của chính nó, do đó cần phải theo dõi suốt quá trình lên
men, dùng bazơ để điều chỉnh pH về thích hợp.
11


Đồ án tốt nghiệp

- Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men
Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở
những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá
trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men.

1.1.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic
1.1.2.1Quá trình trao đổi chất
Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc
lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn

lactic làm hai nhóm:
 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình
Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic
tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol,
di-acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:
𝐶6 𝐻12 𝑂6 → 2𝐶𝐻3 CHOHCOOH + 21,8.104 J .
Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose được chuyển hóa theo chu
trình EMP (Embden-Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho
quy trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đến
pyruvat. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase
cho nên acid pyruvic không thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic.
 Lên men lactic dị hình


Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài các sản phẩm phụ
như acid acetic, ethanol, acid succinic, C𝑂2. Phương trình chung biễu diễn quá trình
lên men:
12


Đồ án tốt nghiệp

𝐶6 𝐻12 𝑂6 → 𝐶𝐻3 CHOHCOOH + HOOC(CH2 )COOH + CH3 𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 + 𝐶𝑂2
Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu
etylic và acid acetic 10% các loại khí 20%, đôi khi không có các khí mà thay vào đó
là sự tích lũy một lượng lớn acid formic. Như vậy, trong quá trình lên men lactic dị
hình có nhiều sản phẩm phụ khác nhau đáng kể được tạo thành, chứng tỏ quá trình
này phức tạp hơn nhiều so với quá trình lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm
tiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học, người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là
hướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình.

1.1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tính
kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều
trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược
và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Khi ứng dụng trong bảo quản
thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý
nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản
vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp
ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn
liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như
giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic còn
sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngoài
ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như
reuretin, acid lactic,...

13


Đồ án tốt nghiệp

1.1.3. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic
LAB được biết đến bởi khả năng kháng nấm của chúng, điều đó liên quan đến
việc sản xuất 1 loạt các loại hợp chất bao đồm acid, alcohol, CO2, diacetyl, H2O2,
phenyllactic acid, bacteriocin và cycle peptide. Đặc tính nổi bật của hợp chất bề mặt
của LAB là tính ổn định nhiệt của các hợp chất kháng nấm có trong nó. Điều này thúc
đẩy việc sử dụng các hợp chất bề mặt của LAB hoặc các hợp chất chống nấm trong
các thực phẩm được xử lý nhiệt. Các hợp chất bề mặt của LAB hoạt động trong phổ
pH rộng, kéo dài từ 3 đến 9 tùy thuộc vào từng chủng khác nhau. Đây có thể coi là
một yếu tố chính khi LAB được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm khi so

sánh với chất bảo quản hóa học (Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid
Saari, 2011). Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi
đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt động
kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt
độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và cộng sự, 2001). Nghiên cứu về tiềm năng
kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại
nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.2).;
Lavermicocca và cộng sự, 2000; Niku- Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003;
Sjogren và cộng sự, 2003; Sjogren, 2005). Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được
2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng
nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus
subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus
NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp.. Nấm Aspergillus IARI được
xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996)

14