Phân lập và tuyển chọn lactobacillus sp từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản xuất probiotic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN LACTOBACILLUS sp.
TỪ THỰC VẬT Ủ CHUA CÓ TIỀM NĂNG
SẢN XUẤT PROBIOTIC

Ngành:

Công nghệ SH-TP-MT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hƣớng dẫn : TS. Hoàng Quốc Khánh
Sinh viên thực hiện

: Trần Quang Huy

MSSV: 1311101070

Lớp: 13DSH05

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong đồ án này đều trung thực và bắt nguồn từ thực tiễn nghiên cứu. Các
tài liệu tham khảo đều có nguồn gốc xác thực.
Ngƣời thực hiện
Trần Quang Huy


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Hoàng Quốc Khánh,
ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn,chia sẻ những khó khăn và chỉnh sửa đồ án cho em
trong thời gian em thực hiện đồ án tại viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh.
Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời đã động viên và giúp em
có thêm động lực để hoàn thành đồ án này.
Xin cảm ơn thầy Ngô Đức Duy, đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong quá
trình định danh bằng sinh học phân tử.
Xin cảm ơn các anh, chị và các đồng nghiệp tại viện sinh học nhiệt đới đã giúp đỡ
tôi trong quá trình thực hiện đồ án.
Xin cảm ơn viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh, đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho em thực hiện các thí nghiệm để hoàn thành đồ án này.
Xin cảm ơn trƣờng ĐH Công nghệ TP Hồ Chí Minh nói chung và các thầy cô
trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm và Môi Trƣờng nói riêng đã tận tình
dạy dỗ, cung cấp các kiến thức vững vàng cho em trong bốn năm học tập tại trƣờng.
Cuối cùng xin cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con và cho con điều kiện để học tập để trở
thành ngƣời nhƣ hôm nay.

Xin chân thành cảm ơn!
Ngƣời thực hiện

Trần Quang Huy


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
Phiếu giao đề tài ĐATN.
Lời cam đoan.
Lời cảm ơn.
Mục lục.
Danh mục các từ viết tắt.
Danh mục các bảng.
Danh mục biểu đồ, đồ thị, sơ đồ, hình ảnh.
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1 Tổng quan về rau quả lên men ..........................................................................3
1.2 Tổng quan về probiotic .....................................................................................4
1.3 Lịch sử nghiên cứu về probiotic........................................................................7
1.4 Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp ................................................................9
1.4.1 Chi Lactibacillus ........................................................................................9
1.4.2 Chi Bifidobacterium .................................................................................10
1.4.3 Chi Sacharomyces ....................................................................................10
1.4.4 Chi Bacillus ..............................................................................................11
1.5 Hƣớng dẫn lựa chọn các chủng probiotic .......................................................13
1.5.1 Chi, loài và chủng probiotic .....................................................................14
1.5.2 Các thử nghiệm invitro để sàng lọc chủng có tiềm năng probiotic .........14
I


Đồ án tốt nghiệp

1.5.3 Nguồn phân lập probiotic .........................................................................15
1.5.4 Probiotic an toàn ......................................................................................15
1.6 Vi khuẩn lactic ................................................................................................17
1.6.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic ...................................................................17
1.6.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, phân loại......................................................17
1.6.3 Chi Lactobacillus .....................................................................................18
1.6.4 Quá trình lên men lactic ...........................................................................22
CHƢƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................24
2.1 Vật liệu ............................................................................................................24
2.1.1 Nguyên liệu ..............................................................................................24
2.1.2 Hóa chất ...................................................................................................24
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ...................................................................................24
2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy.................................................................................25
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................27
2.2.1 Phƣơng pháp phân lập và tuyển chọn ......................................................27
2.2.2 Phƣơng pháp quan sát hình thái khuẩn lạc...............................................27
2.2.3 Phƣơng pháp xác định khả năng sinh acid lactic .....................................27
2.2.4 Phƣơng pháp nhuộm Gram ......................................................................27
2.2.5 Phƣơng pháp khảo sát khả năng di động .................................................28
2.2.6 Phƣơng pháp xác định kiểu hô hấp ..........................................................28
2.2.7 Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính catalase ............................................29
2.2.8 Phƣơng pháp xác định hoạt tính protease ................................................29
II


Đồ án tốt nghiệp

2.2.9 Phƣơng pháp xác định hoạt tính amylase ................................................30
2.2.10 Phƣơng pháp xác định khả năng kháng khuẩn.......................................30

2.2.11 Phƣơng pháp định danh bằng sinh học phân tử .....................................31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..............................................................33
3.1 Phân lập LAB từ nguồn thực vật ủ chua .........................................................33
3.2 Đặc điểm sinh học của 2 chủng LAB đƣợc tuyển chọn ..................................36
3.2.1 Đặc điểm hình thái của 2 chủng CP1 và MC3. ........................................36
3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 2 chủng CP1 và MC3. .....................37
3.3 Phổ kháng khuẩn của hai chủng lactic nghiên cứu .........................................40
3.4 Định danh chủng Lactobacillus CP1và Lactobacillus MC3 bằng sinh học
phân tử ...................................................................................................................42
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................45
4.1 Kết luận ...........................................................................................................45
4.2 Kiến nghị .........................................................................................................45
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

III


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
VK Vi khuẩn
DC Đối chứng
G- Gram âm
G+ Gram dƣơng
KS Kháng sinh
LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic)
MT Môi trƣờng
MRS De Man - Rogosa – Sharpe
ST Sinh trƣởng

VSV Vi sinh vật

IV


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các vi sinh vật có tiềm năng probiotic ........................................................... 12
Bảng 1.3 Phân loại Lactobacillus dựa vào sản phẩm .................................................... 19
Bảng 3.1. Kết quả hình thái khuẩn lạc của 11 chủng đƣợc phân lập.............................. 32
Bảng 3.2. Kết quả xác định hình thái tế bào ................................................................... 34
Bảng 3.3. Tổng hợp các đặc điểm sinh lý sinh hóa của hai chủng nghiên cứu ......... 38-39
Bảng 3.4. Kết quả thử phổ kháng khuẩn của hai chủng Lactobacillus CP1 và
Lactobacillus MC3 .......................................................................................................... 41

V


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1 Kim Chi và một số loại rau củ lên men truyền thống ....................................... 4
Hình 1.2. Hƣớng dẫn lựa chọn chủng probiotic của FAO & WHO ............................... 16
Hình 1.3 Quá trình lên men lactic .................................................................................. 22
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của một số mẫu sau khi làm thuần ................................. 33
Hình 3.2. Định tính aicid lactic bằng thuốc thử Uphemen ............................................. 35
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng CP1 nhuộm

Gram trên kính hiển vi x100 ........................................................................................... 36
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng MC3 nhuộm
Gram trên kính hiển vi x100 ........................................................................................... 36
Hình 3.5 Cây phát sinh loài của hai chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus
MC3 và các loài có liên quan .......................................................................................... 43
.

VI


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, khi chất lƣợng cuộc
sống không ngừng đƣợc nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe con ngƣời ngày càng
đƣợc chú trọng. Do vậy, việc tạo ra các chế phẩm sinh học nhằm cải thiện và tăng
cƣờng sức khỏe con ngƣời đƣợc tạo ra ngày càng nhiều. Một trong những chế phẩm
sinh học đó chính là probiotic, chúng đƣợc tạo ra từ việc ứng dụng vi sinh vật có lợi
bổ sung vào hệ tiêu hóa của con ngƣời. Việc sử dụng vi sinh vật probiotic thực tế đã
mang lại nhiều ảnh hƣởng tích cực đối với sức khỏe con ngƣời, thông qua các đặc
tính probiotic vốn có của chúng. Điển hình là điều trị các chứng bệnh rối loạn
đƣờng tiêu hóa, khắc phục một số hạn chế do việc điều trị kháng sinh dài ngày, giúp
đồng hóa lactose trong sữa uống đối với các bệnh nhân không có khả năng dung nạp
lactose trong sữa. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng ảnh hƣởng đến hoạt tính
biến dƣỡng nhƣ đồng hóa cholesterol, tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme
có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn, hấp thu các chất dinh dƣỡng cần
thiết, khử các chất có khả năng gây ung thƣ và các hợp chất độc hại, kích thích điều
hòa hệ miễn dịch, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ,...
Những chủng vi sinh vật probiotic thƣờng đƣợc nghiên cứu và ứng dụng chủ yếu

là vi khuẩn lactic (LAB), nhờ chúng có các đặc tính ƣu việt phù hợp cho việc sử
dụng tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời cũng nhƣ vật nuôi. Những đặc tính đó là:
khả năng sống sót và phát triển tốt trong điều kiện bất lợi ở đƣờng tiêu hóa của
ngƣời nhƣ acid mật, pH thấp, kháng sinh,... Đồng thời, chúng còn có khả năng sản
sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn nhƣ acid lactic, bacteriocin, H2O2, diacetyl,… tạo
môi trƣờng bất lợi, từ đó ức chế vi sinh vật gây bệnh và thiết lập sự cân bằng hệ vi
sinh vật đƣờng ruột. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng sản sinh nhiều enzyme
thúc đẩy quá trình tiêu hóa hấp thu các chất của cơ thể vật chủ.

Trang 1


Đồ án tốt nghiệp

Xuất phát từ lí do trên nên ngƣời thực hiện đã chọn đề tài “ Phân lập và tuyển
chọn Lactobacillus. sp từ nguồn thực vật ủ chua, tiềm năng sản xuất probiotic”.
2. Mục tiêu của đề tài: Phân lập và khảo sát các đặc tính probiotic của các chủng vi
khuẩn phân lập từ các nguồn thực vật ủ chua.
3. Nhiệm vụ của đề tài:
Phân lập đƣợc ít nhất 01 chủng Lactobacillus
Tìm hiểu các đặc tính sinh lý, sinh hoá của chủng phân lập đƣợc.
Khảo sát phổ kháng khuẩn của chủng Lactobacillus phân lập đƣợc với các VSV
gây bệnh đƣờng ruột ở ngƣời..
Phân loại chủng nghiên cứu đến loài bằng sinh học phân tử.
4.Đối tƣợng nghiên cứu: các chủng Lactobacillus.sp đƣợc phân lập từ rau , củ lên
men trong khu vực thành phố Hồ Chí Minh.

Trang 2

Đồ án tốt nghiệp

1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về rau quả lên men
Lên men thực phẩm là một trong những công nghệ bảo quản thực phẩm đƣợc con
ngƣời phát minh ra từ rất sớm, những ngƣời ở vùng ven biển của Châu Á đƣợc cho
là đã lên men rau quả trƣớc khi phát triển nền nông nghiệp cây trồng. Lên men sữa
ở Trung Đông xuất hiện sau khi thuần hoa vật nuôi. Bia ở Ai Cập và rƣợu gạo ở
Đông Bắc Á đƣợc cho là xuất hiện vào 4000 năm trƣớc công nguyên. Ngƣời ta đã
cho rằng dƣa chuột là nguyên liệu đầu tiên đƣợc lên men, sau đó là các sản phẩm
khác nhƣ kim chi, bắp cải…và cho đến ngày nay đã và đang có rất nhiều các sản
phẩm lên men với sự đa dạng về chủng loại.
Thực phẩm lên men đƣợc phân loại dựa vào sản phẩm của quá trình lên men
chẳng hạn nhƣ cồn ( rƣợu, bia), acid hữu cơ bao gồm acid lactic và acid axetic
(trong rau củ lên men), cacbondioxide (CO2) ( trong bánh mì), các acid amin và các
peptide từ protein.
Trong các sản phẩm lên men thì rau, củ, quả lên men nhƣ kim chi, cà pháo, bắp
cải là những sản phẩm có từ lâu đời và mang đặc trƣng bản sắc dân tộc của từng
vùng miền và từng quốc gia. Quá trình lên men có thể giúp bảo quản rau quả lâu
hơn 1 năm mà không cần sử dụng bất kì một phƣơng pháp bảo quản nào khác.
Trong rau, củ, quả hoặc nƣớc ép rau củ có chƣa rất nhiều dinh dƣỡng giúp cho các
vi sinh vật bao gồm cả các loại gây hƣ hỏng nhƣ Pseudomonas, Erwinia,
Enterobacter, nấm men và nấm mốc có thể phát triển đƣợc. Các vi sinh vật gây hƣ
hỏng khi phát triển tới số lƣợng từ 104-106 cfu/g. Tuy nhiên có thể ức chế hoặc tiêu
diệt các vi sinh vật gây hƣ hỏng này bằng phƣơng pháp lên men. Rau quả sau khi
lên men sẽ có vị chua là do các acid hữu cơ đƣợc tiết ra bởi các vi khuẩn lên men
đƣờng trong rau quả, đặc biệt là các vi khuẩn thuộc nhóm lactic.

Trang 3

Đồ án tốt nghiệp

Vi khuẩn lactic tồn tại trong rau quả hoặc nƣớc ép trái cây với số lƣợng rất thấp
từ 102-103 cfu/g. Trong quá trình lên men, các acid hữu cơ sẽ tạo vị chua và làm
giảm pH của môi trƣờng, từ đó ức chế hoạt động của các vi sinh vật gây hƣ hỏng,
riêng vi khuẩn lactic không chịu ảnh hƣởng của việc giảm pH này là do nhóm vi
khuẩn này có khả năng sống sót trong điều kiện acid cao hơn so với các loại vi sinh
vật khác, nên sự phát triển của chúng sẽ chiếm ƣu thế hơn.
Ngoài hƣơng vị đặc trƣng, các sản phẩm rau quả lên men còn đƣợc chứng minh là
có tác động tốt đến sức khỏe nhƣ giúp tiêu hóa tốt và phòng bệnh đƣờng ruột. Đặc
biệt vi khuẩn lactic còn tạo nên hệ vi khuẩn có ích cho đƣờng tiêu hóa. Rau quả
muối chua tuy không phải là thuốc thuần túy nhƣng làm thức ăn rất tốt cho ngƣời bị
bênh béo phì, tiểu đƣờng vì nó ít glucid và ít sinh năng lƣợng.
Chính vì những tác động có lợi ,gần gũi với con ngƣời và có hệ vi sinh vật đa
dạng nên rau, củ, quả lên men là một trong những nguồn nguyên liệu đƣợc các nhà
khoa học quan tâm nhằm phân lập các dòng vi sinh vật có lợi đối với sức khỏe của
con ngƣời và vật nuôi, từ đó sản xuất các chế phẩm probiotic.

Hình 1.1 Kim Chi và một số loại rau củ lên men truyền thống
1.2 Tổng quan về probiotic
Ruột ngƣời đƣợc định cƣ bởi một loạt các loài vi khuẩn, mang tầm quan trọng
trong chức năng trao đổi chất cũng nhƣ chức năng miễn dịch, tất cả đều dẫn đến
những ảnh hƣởng rõ rệt đến tình trạng dinh dƣỡng và sức khoẻ của vật chủ [19].
Trang 4


Đồ án tốt nghiệp

Các probiotics đƣợc định nghĩa là "các vi sinh vật sống, khi tiêu hóa với một số

lƣợng nhất định có lợi cho sức khoẻ ngoài dinh dƣỡng cơ bản”[6],[ 32].
Ngoài ra, probiotic còn đƣợc biết đến là vi sinh vật sống tự nhiên có ít hoặc
không gây bệnh, nhƣng có chức năng quan trọng đối với sức khỏe, tình trạng chung
của vật chủ và đƣợc chú trọng để sử dụng làm thuốc [10],[ 25]. Probiotics ban đầu
đƣợc sử dụng để tác động đến sức khoẻ con ngƣời thông qua sự thay đổi hệ vi sinh
đƣờng ruột. Hiện nay, các probiotic và những ảnh hƣởng của chúng đối với sức
khoẻ con ngƣời đã đƣợc chứng minh bằng cách kết hợp chúng vào các loại thực
phẩm truyền thống nhƣ chế phẩm nuôi vi sinh đơn hoặc hỗn hợp, tức là sản xuất các
thực phẩm chức năng / dinh dƣỡng hoặc chế phẩm dƣợc để có đƣợc nhiều lợi ích về
sức khoẻ [25]. Tác động của probiotic đến sức khoẻ con ngƣời đƣợc khẳng định và
xác định rõ trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh khác nhau nhƣ nhiễm trùng
đƣờng tiêu hóa cấp tính hoặc mãn tính (tiêu chảy, không tiêu hóa lactose, bệnh viêm
ruột [7], các triệu chứng dị ứng [16],[ 30], ung thƣ [18] và AIDS (hội chứng suy
giảm miễn dịch)[8], hô hấp và nhiễm trùng đƣờng tiết niệu. Chế độ ăn uống phù
hợp, bao gồm các loại thực phẩm dinh dƣỡng / thực phẩm chức năng / thực phẩm
bổ sung với probiotic, prebiotic và synbioitcs, với những lợi ích về dinh dƣỡng và
điều trị là kết quả của một hệ thống tiêu hóa (Gastro Integinal) hoạt động tốt, tác
động đến sinh lý của con ngƣời, từ đó tác động đến sức khỏe.
Trong những thập kỷ qua, ngành công nghiệp thực phẩm đã đƣợc cách mạng hoá
hƣớng tới sản xuất thực phẩm chức năng do nhận thức ngày càng cao của ngƣời tiêu
dùng về vai trò tích cực của thực phẩm và sức khoẻ [26]. Một số lợi ích có đƣợc là
do sự phát triển và hoạt động của vi khuẩn trong quá trình sản xuất thức ăn và một
số do sự phát triển và hoạt động của một số loài vi khuẩn lactic trong đƣờng ruột
sau khi ăn các thực phẩm có chứa chúng (Ali, 2010).(Trích tài liệu [32]).
Để hệ thống miễn dịch và đƣờng tiêu hóa của con ngƣời hoạt động tốt, đòi hỏi
phải có sự hiện diện đa dạng và số lƣợng lớn của các vi sinh vật. Hệ vi sinh cộng
Trang 5


Đồ án tốt nghiệp

sinh cƣ trú và duy trì sự cân bằng trong hệ thống đƣờng tiêu hóa con ngƣời, bất kì
sự thay đổi nào về số lƣợng hoặc thành phần của hệ vi sinh điều ảnh hƣởng trực tiếp
đến sức khỏe của vật chủ. Ví dụ khi sử dụng kháng sinh làm giảm số lƣợng của một
số vi khuẩn, các mầm bệnh có cơ hội để phát triển và gây nhiễm trùng. Phƣơng
pháp thay thế hệ vi sinh đƣờng ruột bằng các vi khuẩn có lợi đã khai sinh ra lĩnh
vực khoa học chuyên nghiên cứu về probiotic. Probiotics đƣợc định nghĩa là 'Các vi
sinh vật sống mà khi đƣợc bổ sung với số lƣợng thích hợp sẽ đem lại lợi ích cho sức
khoẻ của vật chủ” [13].
Probiotic đang dần dần đóng vai trò quan trọng trong chức năng miễn dịch, hô
hấp và giảm các bệnh truyền nhiễm ở con ngƣời. Vi khuẩn lactic acid (LAB) là các
vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ probiotic và có những lợi ích nhất định trong
ứng dụng công nghiệp và y tế [32]. Thuật ngữ "probiotic" có nguồn gốc từ từ Hy
Lạp "probios" có nghĩa là "cho sự sống" (trái ngƣợc với "antibiotic", có nghĩa là
"chống lại sự sống") [22]. Trong nhiều thế kỷ, LAB đã đƣợc sử dụng để bảo quản
thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng. LAB là một nhóm lớn các vi sinh vật thuộc Gram
âm, hiếu khí hoặc vi hiếu khí, không sinh bào tử, lên men và sinh acid, thƣờng có
trong ruột của ngƣời và các động vật khác, rau sống, thịt và các sản phẩm từ thịt,
ngũ cốc [9]. LAB và Bifidobacteria đƣợc sử dụng nhƣ là probiotic. Nhƣng một số
loại nấm men và bacilli cũng đƣợc sử dụng trong sản xuất probiotic. Ngày nay có
rất nhiều sản phẩm probiotic đang có mặt trên thị trƣờng nhƣ kem probiotic,
probiotic uống,v.v.
Để đƣợc sử dụng làm probiotic, các vi sinh vật phải tồn tại đƣợc trong đƣờng tiêu
hóa, bằng cách kháng acid và mật, ngoài ra chúng còn phải có khả năng nhân nhanh
số lƣợng. Việc sử dụng các sản phẩm probiotic giúp duy trì sự cân bằng hệ vi sinh
trong đƣờng ruột từ đó giúp ngăn ngừa các bệnh nhƣ đái tháo đƣờng type 2, rối loạn
chuyển hóa, gan nhiễm mỡ và bệnh mạch vành. [32]

Trang 6

Đồ án tốt nghiệp

Lợi ích của các thực phẩm lên men có đƣợc là do sự phát triển của các vi khuẩn
trong suốt quá trình sản xuất. Vai trò của vi khuẩn probiotic trong việc lên men sữa
là để hổ trợ: bảo quản sữa bằng cách tạo ra acid lactic và các hợp chất kháng khuẩn,
tạo hƣơng vị (ví dụ acetaldehyde trong sữa chua và phô mai) và cung cấp một số
chất hữu cơ khác (nhƣ polysaccharide ngoại bào) mà ngƣời tiêu dùng mong muốn,
cải thiện giá trị dinh dƣỡng của thực phẩm, ví dụ nhƣ giải phóng các acid amin tự
do hoặc tổng hợp các vitamin và cung cấp các chất đặc biệt có khả năng điều trị
hoặc phòng ngừa ung thƣ, cũng nhƣ kiểm soát nồng độ cholesterol [27]. Các lợi ích
của việc tiêu thụ các sản phẩm sữa lên men có đƣợc chủ yếu là do sự thay đổi theo
hƣớng có lợi của hệ sinh thái trong đƣờng tiêu hóa.
Trên khắp thế giới, có khoảng 20 dòng probiotic, trong đó chủ yếu là các
Lactobacilli nhƣ: Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. reuterii và các loài khác,
Bifidobacteria, các bào tử vi khuẩn sinh acid lactic nhƣ Lactospore, nấm men nhƣ
Saccharomyces boulardii, đƣợc sử dụng trong thực phẩm bổ sung, thực phẩm chức
năng hoặc thực phẩm chính [23].
Các dòng probiotic khác nhƣ Pediococcus, cùng với các vi khuẩn lactic khác nhƣ
Leuconostoc và Lactobacillus đƣợc sử dụng để lên men bắp cải, làm kim chi. Một
số dòng Pediococcus sản xuất ra diacetyl tạo hƣơng vị cho bơ, một số loại rƣợu
vang và bia. P. pentosaceus, P. acidilactici, P. damnosus, P. claussenii,
P.inopinatus, P. parvulus, P. stilesii, P. ethanolidurans and P. cellicola là các
chủng thuộc Pediococcus đƣợc sử dụng làm probiotic. Trong Enterococci,
Enterococuus faecalis và Enterococcus faecium là những loài chính đƣợc sử dụng
làm probiotic.
1.3 Lịch sử nghiên cứu về probiotic
Thuật ngữ probiotic có nghĩa là “ cho sự sống” hiện đang đƣợc sử dụng để chỉ
các vi khuẩn có lợi đến sức khỏe của con ngƣời và động vật. Các sản phẩm sữa lên
Trang 7

Đồ án tốt nghiệp

men đƣợc con ngƣời sử dụng từ thời Vedic ( Ấn Độ cổ), những khái niệm khoa học
về probiotic đƣợc phát triển vào khoảng năm 1900, khi Henry Tissier, một bác sĩ
nhi khoa ngƣời Pháp đã nhận xét sự hiện diện với số lƣợng rất ít các vi khuẩn có
hình thái chữ Y trong phân của trẻ em bị tiêu chảy. Những vi khuẩn này ngƣợc lại
có rất nhiều ở trẻ em khỏe mạnh [32]. Ông ta đặt tên cho vi khuẩn này là Bacillus
bifidus communis và sau này đƣợc đổi tên thành chi Bifidobacterium. Khái niệm
probiotic đƣợc báo cáo lần đầu tiên bởi nhà khoa học Nga và đoạt giải Nobel, Elie
Metchnikoff vào năm 1907 , ngƣời đã cho rằng tuổi thọ và sức khỏe của ngƣời
Bungari là kết quả của việc tiêu thụ sữa lên men, và đề xuất rằng việc sử dụng sữa
lên men sẽ cung cấp cho ruột các vi khuẩn lactic, làm giảm độ pH của đƣờng ruột sẽ
ức chế các vi khuẩn gây hại [29]. Ông cũng chỉ ra rằng tiêu thụ Lactobacillli giúp
kiểm soát nội độc tố sinh ra bởi các loại thành phần khác trong hệ sinh thái ruột [24]
Thuật ngữ probiotic ban đầu đƣợc đề xuất nhƣ một từ trái ngƣợc với kháng sinh,
và đƣợc dùng để mô tả sự hổ trợ tăng trƣởng cho các vi sinh vật bởi Lilley and
Stillwell vào năm 1965 [21],[32]. Fuller sau đó miêu tả probiotic là “các vi sinh vật
sống đƣợc bổ sung vào thức ăn có tác động có lợi đến động vật chủ bằng cách cải
thiện sự cân bằng vi sinh đƣờng ruột” [14]. Định nghĩa về probiotic đã đƣợc làm rõ
hơn nữa vào năm 1998 là "các vi sinh vật sống, khi tiêu hóa với một số lƣợng nhất
định, có ảnh hƣởng đến sức khoẻ ngoài dinh dƣỡng cơ bản”[15]. Tiến sĩ Minoru
Shirota năm 1930 đã phân lập Lactobacillus casei Shirota (LcS) với các tính chất
probiotic và đƣa ra thị trƣờng thức uống sữa lên men có chứa probiotic ( Yakult)
này trong hơn bảy thập kỷ để cải thiện sức khoẻ đƣờng ruột [20]. Các công trình
nghiên cứu của Tissier và Metchnikoff là tiền đề trong việc sử dụng vi khuẩn
probiotic. Từ đó có rất nhiều các nghiên cứu về vai trò probiotic của LAB và ứng
dụng các tế bào sống .
Những quan sát của Tissier và Metchnikoff thu hút đƣợc nhiều sự chú ý và đƣợc

thƣơng mại hóa. Tuy nhiên, không phải kết quả lúc nào cũng đƣợc nhƣ mong đợi,
Trang 8


Đồ án tốt nghiệp

và hầu hết các quan sát này điều trở thành giai thoại. Do đó, khái niệm probiotic
đƣợc coi là không có cơ sở khoa học và ít đƣợc quan tâm trong nhiều thập kỉ với
một số nghiên cứu về chất thay thế cho chất tăng trƣởng sử dụng cho động vật. Tuy
nhiên trong 20 năm qua, nghiên cứu về probiotic đã có những bƣớc tiến đáng kể và
chú trọng vào việc lựa chọn,mô tả cụ thể các môi trƣờng nuôi cấy probiotic, chứng
minh các lợi ích của chúng đối với sức khỏe, và đảm bảo sự sống sót của các loại vi
khuẩn này khi ở trong dạ dày-ruột [32].
Các chủng trong chi Lactobacillus và Bifidobacterium đƣợc sử dụng chủ yếu,
nhƣng không phải là duy nhất, số lƣợng các probiotic và các sản phẩm chứa
probiotic luôn không ngừng gia tăng.
1.4 Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp
Vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau nhƣ VK, xạ
khuẩn, nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên, vì những đặc tính ƣu việt của LAB phù hợp
với việc tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời cũng nhƣ vật nuôi nên thành phần của
hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB.
Một số nhóm vi sinh vật probiotic thƣờng gặp
1.4.1 Chi Lactibacillus
Chi Lactobacillus bao gồm các chủng thuộc Gram âm, hiếu khí bắt buộc hoặc vi
hiếu khí, tế bào hình que. Chúng là một phần chủ yếu trong nhóm vi khuẩn lactic
(LAB) (bao gồm Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus và Leuconostoc) có thể chuyển đổi đƣờng hexose thành
acid lactic rồi tiết ra môi trƣờng để ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại. Trong
cơ thể ngƣời, Lactobacilli thƣờng đƣợc tìm thấy trong cơ quan sinh dục, đƣờng tiêu
hóa, và một số nơi khác cùng với Bifidobacterium. Trình tự gen hoàn chỉnh của một

số chủng Lactobacillus thƣờng gặp đã đƣợc công bố nhƣ: Lactobacillus plantarum,
L. johnsonii, L. acidophilus, L. sakei, L. bulgaricus, L. salivarius.
Trang 9


Đồ án tốt nghiệp

Một vài chủng Lactobacilli đƣợc sử dụng để sản xuất yogurt, phô mai, nƣớc
tƣơng, kim chi, rƣợu và một số thực phẩm lên men khác. Trong tất cả các trƣờng
hợp trên, đƣờng sẽ đƣợc chuyển hóa thành acid lactic, tạo thành môi trƣờng ức chế
các vi sinh vật gây hƣ hỏng và cho phép bảo quản thực phẩm.
Các loài Lactobacilli thƣờng đƣợc chọn là probiotic vì chúng biểu hiện nhiều đặc
tính quan trọng nhƣ: khả năng chịu acid và mật cao, khả năng bám dính vào bề mặt
ruột, chống lại pH thấp, dịch dạ dày, ức chế các vi khuẩn gây bệnh, kháng kháng
sinh, sản xuất exopolysaccharides và loại bỏ cholesterol [28].
1.4.2 Chi Bifidobacterium
Chi Bifidobacterium thuộc Gram âm, không di động, hô hấp hiếu khí.Chúng sống
cộng sinh trong đƣờng tiêu hóa và âm đạo của động vật có vú bao gồm cả con
ngƣời.Các dòng thuộc chi Bifidobacterium đƣợc sử dụng làm probiotic vì sự đa
dạng trong cơ chế kháng muối mật của chúng, điều này là rất quan trọng vì để thể
hiện đƣợc đặc tính có lợi thì trƣớc tiên vi sinh vật phải tồn tại đƣợc trong dịch sinh
học này. Một vài chủng thuộc chi Bifidobacteria đƣợc coi là các probiotic quan
trọng bao gồm: Bifidobacterium infantis, B. adolescentis, B. animalis subsp
animalis, B. animalis subsp lactis, B. bifidum, B. longum, B. breve.
Bifidobacterium cùng với các probiotic khác đã đƣợc chứng minh là có khả năng
chữa táo bón, tiêu chảy du lịch, tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, giảm hoạt động
của bệnh viêm đại tràng và viêm loét đại tràng, cũng nhƣ điều trị viêm ruột hoại tử
ở trẻ sơ sinh, giảm sự phát triển của bệnh eczema, dị ứng thực phẩm, giảm
cholesterol [28].
1.4.3 Chi Sacharomyces

Các chủng thuộc chi Saccharomyces bao các các chủng nấm nhƣ: Saccharomyces
cerevisiae ( sử dụng cho làm rƣợu, bánh mì, bia), Saccharomyces bayanus ( đƣợc
sử dụng để làm rƣợu), và Saccharomyces boulardii đƣợc sử dụng để tạo chế phẩm
Trang 10


Đồ án tốt nghiệp

probiotic dƣới dạng đông khô để điều trị bệnh tiêu chảy, trong khi vẫn đảm bảo an
toàn tuyệt đối [28].
Saccharomyces boulardii: đƣợc dùng nhƣ probiotic từ năm 1950. Là thành phần
chính của một số chế phẩm probiotic nhƣ ultralevure (Pháp), florastor, bioflora
(Pháp). Tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp. Ngừa tiêu chảy
do kháng sinh và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori, S. boulardii tác động
thông qua cơ chế [1]
1. Tiết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh
phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra.
2. Tăng lƣợng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và Naminopeptidase, tăng hấp thu ở ngƣời tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi
ngắn cần thiết cho cho việc hấp thu nƣớc và chất điện giải.
Ngoài ra, chúng còn tác dụng giảm viêm ở đƣờng ruột do kích thích tế bàoT.
1.4.4 Chi Bacillus
1.4.4.1 Bacillus subtilis
Bacillus subtilis là vi khuẩn ứng dụng làm probiotic từ rất sớm. Chúng đƣợc sử
dụng qua đƣờng uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa nhƣ tiêu chảy sau khi
dùng kháng sinh. Bacillus subtilis có tác dụng hồi phục hệ vi sinh vật tự nhiên trong
đƣờng tiêu hóa của ngƣời sau khi dùng kháng sinh kéo dài. Các chế phẩm B.
subtilis đƣợc bán ở hầu hết các nƣớc Châu Âu, mặc dù ngƣời ta còn chƣa biết nhiều
về cơ chế tác dụng của chúng. Bào tử của B.subtilis có thể vƣợt qua rào chắn đƣờng
tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong ruột non và sinh sôi trong đƣờng ruột.
Một số tác dụng lâm sàng của B. subtilis đã đƣợc biết nhƣ làm tác nhân kích thích

miễn dịch trong một số bệnh [1] .

Trang 11


Đồ án tốt nghiệp

1.4.4.2 Bacillus clausii
Thuộc giống Bacillus, Gram dƣơng, không di động, nuôi cấy dễ dàng với các môi
trƣờng dinh dƣỡng thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp vi khuẩn tồn tại trong
điều kiện khắc nghiệt. Bào tử của B.clausii có thể qua dạ dày với tỷ lệ sống sót cao,
có thể sống đƣợc trong môi trƣờng dịch vị với pH = 2 ít nhất l2 giờ. Chúng đề
kháng rất tốt với nhiều loại kháng sinh. Vì thế, có thể dùng chung trong thời gian
điều trị kháng sinh. Khi vào ruột non, bào tử B. clausii sẽ nảy mầm thành dạng sinh
trƣởng (ST) và tiếp tục sinh sôi nảy nở trong ruột. Nhờ đó lấp đầy lại đƣợc khoảng
trống rối loạn hệ vi khuẩn trong đƣờng ruột. Đồng thời sự sinh trƣởng của B. claussi
sẽ tái lập đƣợc điều kiện kị khí, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trở lại của
các VK có lợi ở đƣờng ruột (nhƣ Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides) đã bị
rối loạn vì các nguyên nhân khác nhau. B. clausii thƣờng đƣợc dùng tạo chế phẩm
probiotic cho ngƣời nhƣ chế phẩm Enterogermina ở dạng lỏng. Bào tử đƣợc bào
chế dƣới dạng hỗn dịch không màu, không mùi, không vị trong từng ống nhựa nhỏ
nên tiện lợi khi sử dụng, đặc biệt là cho trẻ em [1],[ 5].
Ngoài ra còn rất nhiều chủng vi khuẩn khác đƣợc cho rằng có tiềm năng probiotic
(Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Các vi sinh vật có tiềm năng probiotic
Probiotic

Lợi ích đối với con ngƣời

Lợi ích đối với động vật

Nấm men
Saccharomyces boulardii

Nhiễm trùng Clostridium difficile

Citro rodentium-viêm đại tràng

Vi khuẩn Gram (-)
Escherichia coli Nissle 1917

DSS-gây viêm đại

NA

tràng

Vi khuẩn Gram ( +)
Bifidobacteria bifidum

NA

Trang 12

Viêm ruột hoại tử ở chuột


Đồ án tốt nghiệp

Bifidobacteria infantis

IBS29

NA

Lactobacillus rhamnosus GG

Nhiễm nấm ở trẻ sơ sinh

NA

(Sử dụng với lactoferrin)
Lactococcus lactis

Viêm đại tràng do DSS

Bệnh Crohn

Lactobacillus plantarum 299v

Tiêu chảy do kháng sinh

Lactobacillus acidophilus

IL-10-/- mice
Tăng nhãn áp 40 và viêm

NA

đại tràng do C.rodentium

Lactobacillus rhamnosus

Tiêu chảy do kháng sinh ở trẻ em

-

Lactobacillus casei

NA

Viêm đại tráng do DNBS

Bacillus polyfermenticus

NA

Viêm đại tràng do DSS và TNBS

Phác đồ phối hợp
Lactobacillus rhamnosus GG phối hợp

Nhiễm khuẩn

NA

Bifidobacterium lactis
Lactobacillus rhamnosus phối hợp

NA

Viêm đại tràng do C.rodentinum

Lactobacillus helveticus

stress mãn tính

VSL#3 (Lactobacillus casei, Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus acidophilus,

Viêm túi mật và

Viêm đại tràng do DSS

viêm loét đại tràng ở trẻ em

Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium
longum, Bifidobacterium breve,
Bifidocacterium infantis and Streptococcus
thermophilus)

Chú thích: DNBS:dinitrobenzene sulfonic acid; DSS: dextran sodium sulfate;
IL10:interleukin 10; NA:not available; TNBS:trinitrobenzene sulfonic acid.[17]
1.5 Hƣớng dẫn lựa chọn các chủng probiotic
Để lựa chọn các chủng vi khuẩn làm probiotic, một số tiêu chí nhất định cần phải
đƣợc áp dụng để đảm bảo an toàn, sản xuất, quản lý và ứng dụng. Các thí nghiệm in
vitro cần đƣợc sử dụng để điều tra xem liệu các dòng vi khuẩn có đáp ứng đƣợc các
Trang 13


Đồ án tốt nghiệp

tiêu chí trên hay không. Dựa trên các tiêu chí đó để sàng lọc các dòng vi khuẩn có
tiềm năng probiotic. Có thể kiểm chứng thêm trên ngƣời và động vật.
1.5.1 Chi, loài và chủng probiotic
Cần phải biết chi, loài và chủng probiotic. Đƣợc công nhận là có tác dụng
probiotic. Việc xác định chủng loại đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp kiểu hình và
kiểu gen. Danh pháp của vi khuẩn phải chính xác với tên khoa học đƣợc công bố
hiện nay. Việc sử dụng các danh pháp cũ hoặc gây hiểu nhấm trên nhãn bao bì của
sản phẩm là không thể chấp nhận đƣợc [12].DNA là phƣơng pháp đƣợc sử dụng để
xác định chủng nào thuộc loài nào và phƣơng pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA
đƣợc sử dụng phố biến để xác định .
1.5.2 Các thử nghiệm invitro để sàng lọc chủng có tiềm năng probiotic
Thử nghiêm in vitro rất quan trọng để đánh giá sự an toàn của vi sinh vật
probiotic. Các thử nghiệm này rất hữu ích trong việc xác định các chủng và cơ chế
của các tác dụng probiotic. Probiotic đƣợc sử dụng cho con ngƣời cần phải có các
thử nghiệm chứng minh hiệu quả đối con ngƣời. Các thử nghiệm này cần có kết quả
phù hợp với các kết quả đã công bố. Ví dụ- khả năng kháng muối mật tƣơng đồng
với khả năng sống sót trong dạ dày. Hiện nay, các thử nghiệm in vitro đƣợc sử dụng
trong nghiên cứu probiotic [12],[ 13].
1. Khả năng kháng acid trong dạ dày.
2. Kháng muối mật.
3. Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh.
4. Kháng acid mật.
5. Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột.
6. Khả năng cạnh tranh vị trí bám trên bề mặt với mầm bệnh.

Trang 14


Đồ án tốt nghiệp

Kĩ thuật gen
Việc sử dụng công nghệ gen để cải tiến vi sinh vật hứa hẹn cho sự phát triển của
các chủng probiotic trong tƣơng lai. Có thể phân lập các gen quy định một yếu tố cụ
thể và chuyển các gen này sang các chủng probiotic mà không làm thay đổi các đặc
tính có lợi khác [13].
1.5.3 Nguồn phân lập probiotic
Nguồn phân lập có thể có nguồn gốc từ con ngƣời nhƣ ruột già, ruột non, hoặc
sữa mẹ; nguồn gốc từ động vật, thực phẩm nhƣ sữa hoặc thực phẩm lên men. Các
chủng probiotic đƣợc phân lập từ con ngƣời có khả năng bám dính vào thành ruột
và an toàn hơn so với các chủng từ nguồn khác. Các chủng đƣợc sử dụng đóng vai
trò quan trọng trong việc [12].
1. Định cƣ trong đƣờng ruột, hô hấp, cơ quan sinh dục
2. Chuyển hóa cholesterol, ngăn ngừa ung thƣ
3. Chuyển hóa lactose, hấp thu canxi và tổng hợp các vitamin
4. Điều trị nhiễm trùng và nhiễm nấm âm đạo
5. Táo bón và tiêu chảy
6. Viêm loét dạ dày
7. Mụn trúng cá và các vấn đề về da
8. Sản xuất các kháng sinh tự nhiên, acid lacitc, hydrogen peroxide.
1.5.4 Probiotic an toàn
Các dòng probiotic nhƣ Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus có lịch sử
lâu dài về sử dụng an toàn và đƣợc công nhận đạt tiêu chuẩn GRAS. Các vi sinh vật
khác cần đƣợc nghiên cứu độc tính trƣớc khi đƣợc sử dụng. Các vi sinh vật từ đất
hoặc bào tử cần có các dữ liệu an toàn trƣớc khi đƣợc sử dụng nhƣ probiotic. Các
Trang 15


Đồ án tốt nghiệp

nghiên cứu về an toàn bao gồm: phân loại, xét nghiệm invitro, thử nhiệm trên động
vật, thử nghiệm trên con ngƣời, xác định trình tự gen [12].
Quy trình chọn lọc chủng probiotic đƣợc tóm tắt trong hình 1.1.
Tuyển chọn và xác định chủng dựa trên kiểu hình và kiểu gen
 Tên chi, loài, ký hiệu chủng.
 Đăng kí trong bảo tàng giống quốc tế nào?
Pha 1:Đánh giá độ an toàn

Xác định chức năng
 In-vitro

 In-vitro và trên động vật

 Trên động vật

 Trên ngƣời

Pha 2:Thử nghiệm lâm sàng ở ngƣời, thử nghiệm mù kép,

Tốt nhất nên thử

kiểm soát giả dƣợc (DBPC) để xác định xem chủng/sản phẩm

nghiêm DBPC 2 lần độc

có hiệu quả

lập với nhau để khẳng
định kết quả

Pha 3: kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên ngƣời. So sánh hiệu
PROBIOTIC

quả điều trị 1 bệnh đặc trƣng bằng probiotic với phƣơng pháp
thông thƣờng
DÁN NHÃN
Tên chi,loài, kí hiệu chủng

Số lƣợng tối thiểu vi khuẩn có thể tồn tại cuối thời hạn
sử dụng
Điều kiện bảo quản thích hợp
Thông tin liên hệ với khách hàng

Hình 1.2. Hƣớng dẫn lựa chọn chủng probiotic của FAO & WHO
Trang 16