Khảo sát vi khuẩn escherichia coli sinh beta lactamase phổ rộng trên gà tại một số trại chăn nuôi ở đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÙI THỊ LÊ MINH

KHẢO SÁT VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
SINH BETA-LACTAMASE PHỔ RỘNG
TRÊN GÀ TẠI MỘT SỐ TRẠI CHĂN NUÔI
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI
MÃ NGÀNH: 62 64 01 02

2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÙI THỊ LÊ MINH

KHẢO SÁT VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
SINH BETA-LACTAMASE PHỔ RỘNG
TRÊN GÀ TẠI MỘT SỐ TRẠI CHĂN NUÔI
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI
MÃ NGÀNH: 62 64 01 02

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
PGS. TS. LƢU HỮU MÃNH

2018


LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án, ngoài sự nổ lực và phấn
đấu của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của rất nhiều người. Nhân đây, tôi gửi
lời cảm ơn chân thành đến những người đã luôn quan tâm, lo lắng và hỗ trợ tận tình
cho tôi trong suốt thời gian qua.
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ và những người thân yêu
trong gia đình. Cám ơn ba mẹ đã không quản khó khăn, vất vả, luôn bên cạnh động
viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc để giúp tôi có thể tiếp bước trên con đường
học vấn đến ngày hôm nay. Cảm ơn chồng và các con của tôi đã tạo điều kiện tốt

cho tôi có thời gian học tập, luôn giành cho tôi tất cả tình yêu, sự khuyến
khích và ủng hộ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành luận án tiến sĩ.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lưu Hữu Mãnh và PGS.TS.
Nguyễn Nhựt Xuân Dung đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dành nhiều thời gian
và công sức giúp cho tôi có định hướng đúng đắn trong quá trình học tập, thực
hiện nghiên cứu và hoàn thành luận án tiến sĩ. Thầy và cô là người đã khơi dậy
và truyền cho tôi lòng tự tin, niềm đam mê nghiên cứu khoa học.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban
Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Ban Chủ nhiệm Bộ môn
Thú y đã tạo điều kiện cho tôi được học tập nâng cao trình độ chuyên môn.
Cảm ơn quý thầy cô và các bạn đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian học tập.
Xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ của Chi cục thú y, Trạm thú y, các
chủ hộ và trại chăn nuôi ở tỉnh Vĩnh Long, Trà Vinh, Sóc Trăng, Hậu Giang

và các học viên cao học, sinh viên đã đồng hành với tôi trong quá trình thực
hiện luận án.
Kính chúc mọi người thật dồi dào sức khỏe, hạnh phúc và thành công

trong cuộc sống.
Bùi Thị Lê Minh

i


TÓM TẮT
Luận án được thực hiện để nghiên cứu về E. coli sinh ESBL trên gà ở Đồng
bằng sông Cửu Long. Mục tiêu của luận án là (i) Xác định sự lưu hành của E. coli
sinh ESBL trên gà ở quy mô chăn nuôi trang trại và hộ gia đình, các yếu tố có liên
quan như trứng gà, người chăn nuôi, thịt gà ở cơ sở giết mổ và các yếu tố môi trường
tại khu vực chăn nuôi và cơ sở giết mổ gia cầm ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu
Long; (ii) Xác định đặc tính đề kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL đối với một
số loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trên gà và (iii) Đánh giá sự tương đồng di
truyền của các gen CTX-M và TEM ở vi khuẩn E. coli sinh ESBL phân lập từ gà,
trứng, người chăn nuôi và môi trường chăn nuôi.
Mẫu nghiên cứu được thu thập từ 304 hộ gia đình, 104 trang trại nuôi gà công
nghiệp và 12 cơ sở giết mổ gia cầm ở tỉnh Vĩnh Long, Trà Vinh, Hậu Giang và Sóc
Trăng. Vi khuẩn E. coli sinh ESBL được phân lập bằng phương pháp đĩa kết hợp.
Tính nhạy cảm của E. coli sinh ESBL đối với kháng sinh được kiểm tra bằng phương
pháp khuếch tán trên thạch; 14 loại kháng sinh thử nghiệm là ampicillin, cefaclor,
cefuroxime, gentamicin, streptomycin, kanamycin, amikacin, tetracycline,
doxycycline, norfloxacin, ofloxacin, trimethoprim/sulfamethoxazole, fosfomycin và
colistin. Các vi khuẩn E. coli sinh ESBL chọn lọc được từ phương pháp đĩa kết hợp
và kết quả kháng sinh đồ được dùng để xác định sự hiện diện các gen TEM, CTX-M
và SHV bằng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu. Phân tích trình tự

nucleotide của các gen được thực hiện tại công ty Macrogen, Hàn Quốc. Kết quả
phân tích trình tự nucleotide của gen TEM và CTX-M được so sánh tương đồng

di truyền với các gen TEM và CTX-M trên thế giới trong cơ sở dữ liệu Ngân
hàng gen thuộc Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ Sinh học, Hoa kỳ
(NCBI) bằng chương trình Blast. Phần mềm Mega 6.0 được sử dụng để xây
dựng cây phả hệ di truyền bằng phương pháp Maximum-likelihood.
Kết quả nghiên cứu thu được như sau:
(i) Tỉ lệ lưu hành vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên gà ở Đồng bằng sông Cửu
Long là 62,01%. Tỉ lệ lưu hành vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên gà ở hộ gia đình
(58,89%) thấp hơn trên gà ở trang trại (70,32%). Gà ở mọi lứa tuổi đều nhiễm E. coli
sinh ESBL. Người chăn nuôi tiếp xúc trực tiếp với gà nhiễm E. coli sinh ESBL với tỉ
lệ cao 62,5%. Vi khuẩn E. coli sinh ESBL không được phát hiện ở vỏ trứng gà từ
trang trại trong khi có 6% vỏ trứng gà từ hộ gia đình nhiễm E. coli sinh ESBL. Các
yếu tố môi trường chăn nuôi gồm nước sinh hoạt, thức ăn ở máng ăn, nước ở máng
uống và không khí chuồng nuôi đều có sự hiện của vi khuẩn E. coli sinh ESBL. Tại
12 cơ sở giết mổ, tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên mẫu phân, thịt, gan và
phổi lần lượt là 48,33% (87/180), 11,11% (20/180), 11, 67% (21/180) và 5% (9/180).
E. coli sinh ESBL cũng được phát hiện trong các yếu tố môi trường như sàn giết mổ,
nước vặt lông và nước thải.

ii


(ii) Vi khuẩn E. coli sinh ESBL phân lập từ gà và người chăn nuôi gần như
tương đồng về sự nhạy cảm và đề kháng các loại kháng sinh. Các vi khuẩn E. coli
sinh ESBL phân lập từ gà và người chăn nuôi đề kháng cao với ampicillin (96,6798,87%),
cefaclor
(92,6-97,5%),
cefuroxime

(91,4-100%)
và
trimethoprim/sulfamethoxazole (75,0-81,24%). Vi khuẩn E. coli sinh ESBL phân lập
từ gà đa kháng 2 – 14 trong khi các vi khuẩn này phân lập từ người chăn nuôi đa
kháng 3-13 loại kháng sinh. Có 359 kiểu hình đa kháng kháng sinh ở E. coli sinh
ESBL phân lập từ gà trong khi kiểu hình đa kháng kháng sinh ở E. coli sinh ESBL
phân lập từ người chăn nuôi gà là 40 kiểu. Tuy nhiên, các vi khuẩn E. coli sinh ESBL
phân lập từ gà và người chăn nuôi đều nhạy cảm cao đối với amikacin (94,1794,73%), fosfomycin (92,20-96,67%) và colistin (83,33-86,13%).
(iii) Các gen TEM, SHV và CTX-M được phát hiện với tỉ lệ cao trên vi khuẩn
E. coli sinh ESBL phân lập từ các loại mẫu thu thập ở hộ gia đình, trang trại và cơ sở
giết mổ. Tỉ lệ lưu hành gen TEM (86,21%) và CTX-M (84,15%) cao hơn tỉ lệ lưu
hành gen SHV (54,68%). Sự lưu hành đồng thời các gen TEM, CTX-M, SHV trên
một vi khuẩn chiếm ưu thế. Trình tự nucleotide của các gen CTX-M và TEM có sự
tương đồng rất cao với các gen CTX-M-3 và TEM-1 được công bố trên Ngân hàng
gen. Các gen CTX-M và TEM trên vi khuẩn E. coli sinh ESBL phân lập từ gà, vỏ
trứng, người chăn nuôi và các yếu tố môi trường chăn nuôi có mối quan hệ di truyền
gần nhau.
Từ khóa: Đề kháng kháng sinh, gà, E. coli, ESBL, CTX-M, SHV, TEM

iii


ABSTRACT
The dissertation was carried out to research on ESBL producing E. coli in
chickens in Mekong Delta. The aims of the dissertation were: (i) To determine the
prevalence of ESBL producing E. coli on chickens in industrial farms and small
households, relative factors such as eggs, chicken rearers, chicken meat in
slaughterhouses and the environmental factors of husbandry regions and
slaughterhouses in Mekong Delta; (ii) To determine the antibiotic resistance
characterization of ESBL producing E. coli isolated to the most commonly

antibiotics used for chickens and (iii) To evaluate the homologeneity of CTX-M and
TEM genes in ESBL producing E. coli isolated from chicken, egg, chicken rearer
and husbandry environment.
Samples were collected from 304 households, 104 industrial chicken farms,
and 12 chicken slaughterhouses in Vinh Long, Tra Vinh, Hau Giang and Soc Trang
provinces. ESBL producing E. coli was isolated by combination disk method. The
antibiotic resistance of bacteria was performed by disk diffusion method. Fourteen
antibiotics including ampicillin, cefaclor, cefuroxime, gentamicin, streptomycin,
kanamycin, amikacin, tetracycline, doxycycline, norfloxacin, ofloxacin,
trimethoprim/sulfamethoxazole, fosfomycin and colistin were tested. ESBL
producing E. coli isolates selected from the results of combination disk method and
antimicrobial susceptibility test were determined TEM, SHV and CTX-M genes by
PCR method with specific primers. Analyzing genetic sequences of nucleotides of
genes encoding ESBL was carried out at Macrogen company, Korea. The genetic
homologeneity were compared to the data base of genebank of National Center for
Biotechnology Information (NCBI) by Blast software. Mega 6.0 software was

used for building phylogenetic tree and used Maximum-likelihood method.
The results are as follows:
(i) The prevalence of ESBL producing E. coli on chickens in the Mekong Delta
was 62.01%. The prevalence of them on chickens in households (58.89%) was
slower than on chickens in in industrial farms (70.32%). The all of chicken ages
were infected. The farmers (chicken rearers) contacted directly to poultry were
infected at high rate 62.5%. ESBL producing E. coli were not detected in egg
shells from industrial farms while egg shells from households infected 6%. The

husbandry environmental factors including domestic water, feed and water in
trough, air were all detected ESBL producing E. coli. At slaughterhouses, the
prevalence of them in feacal, meat, liver and lung samples were 48.33%, 11.11%,
11.67% and 5% respectively. ESBL producing E. coli were also detected in the

environmental factors such as floor, removing feather water and waste water.
(ii) Susceptibility and antibiotic resistance of ESBL producing E. coli
isolated from chickens and farmers seem to be similarity. They were highly resistant

iv


to ampicillin (96.67-98.87%), cefaclor (92.6-97.5%), cefuroxime (91.4-100%) and
trimethoprim/sulfamethoxazole (75.0-81.24%). ESBL producing E. coli isolated
from chickens were multiresistant to 2–14 antibiotics while those isolated from
farmers were multiresistant to 3-13 antibiotics. There were 359 antibiotic
multiresistant phenotypes in ESBL producing E. coli isolated from chicken while
those from farmers were 40. However, these bacteria were highly sensitive to
amikacin (94.17-94.73%), fosfomycin (92.20-96.67%) and colistin (83.33-86.13%).
(iii) TEM, SHV and CTX-M genes were highly detected in ESBL producing E.
coli isolated from the all of samples collected in households, farms and
slaughterhouses. The prevalence of TEM (86.21%) and CTX-M (84.15%) genes was
higher than the prevalence of SHV gene (54.68%). The occurence of TEM, CTX-M,
SHV gene combination in a bacteria was popular. Nucleotide sequences of TEM and
CTX-M genes were significantly correlative TEM-1 and CTX-M-3 genes published
on Gen Bank. CTX-M and TEM genes in ESBL producing E. coli isolated from
chickens, egg shells, farmers and husbandry environment factors had the high genetic
homologeneity.
Key words: Antibiotic resistance, chickens, E. coli, ESBL, CTX-M, SHV, TEM

v


LỜI CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi
với sự hướng dẫn của PGS.TS. Lưu Hữu Mãnh. Các số liệu và kết quả trình bày
trong luận án là trung thực và chưa được công bố bởi tác giả khác trong bất cứ luận
án cùng cấp nào trước đây.
Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2018
Người hướng dẫn khoa học

Tác giả luận án

PGS.TS. Lưu Hữu Mãnh

Bùi Thị Lê Minh

vi


MỤC LỤC
Lời cảm tạ

i

Tóm tắt tiếng Việt

ii

Tóm tắt tiếng Anh

iv

Lời cam kết kết quả

vi

Mục lục

vii

Danh mục bảng

x

Danh mục hình

xii

Danh mục viết tắt

xiv

Chƣơng 1: Giới thiệu

1

1.1 Tính cấp thiết của luận án

1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

3

1.3 Những điểm mới của luận án

3

Chƣơng 2: Tổng quan tài liệu

4

2. 1 Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli

4

2.1.1 Lịch sử phát hiện

4

2.1.2 Phân loại vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh

4

2.1.3 Đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy

6

2.1.4 Đặc tính sinh hóa

6

2.1.5 Cấu trúc kháng nguyên

8

2.1.6 Các yếu tố độc lực

10

2.1.7 Độc tố đường ruột và cơ chế sinh bệnh

11

2.1.8 Sức đề kháng

12

2.1.9 Dịch tễ học

13

2.2 Thuốc kháng sinh và cơ chế tác động của thuốc kháng sinh

16

2.3 Đề kháng kháng sinh và phân loại đề kháng

18

2.3.1 Đề kháng giả

18

2.3.2 Đề kháng thật

18

2.4 Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

20

2.4.1 Tạo men phân hủy thuốc

21

2.4.2 Thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn

22

2.4.3 Biến đổi vị trí gắn kết

23

2.4.4 Bơm đẩy thuốc kháng sinh

24

2.5 Những lợi ích và tác động tiêu cực của việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi

25

vii

2.6 Tổng quan về beta-lactamase phổ rộng

27

2.6.1 Lịch sử và di truyền của beta-lactamase phổ rộng

27

2.6.2 Phân loại beta-lactamase phổ rộng

30

2.6.3 Phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh beta-lactamase phổ rộng

32

2.7 Tình hình nghiên cứu E. coli sinh ESBL

38

2.7.1 Tình hình nghiên cứu E. coli sinh ESBL trên người

38

2.7.2 Tình hình nghiên cứu E. coli sinh ESBL trong chăn nuôi gà

42

Chƣơng 3: Phƣơng tiện và phƣơng pháp nghiên cứu

49

3.1 Nội dung, thời gian và địa điểm nghiên cứu

49

3.2 Phương tiện nghiên cứu

50

3.2.1 Thiết bị

50

3.2.2 Hóa chất

50

3.3 Phương pháp nghiên cứu

50

3.3.1 Phương pháp thu thập mẫu

50

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập E. coli sinh ESBL

59

3.3.3 Phương pháp khảo sát tính nhạy cảm của E. coli sinh ESBL với kháng
sinh

62

3.3.4 Phương pháp xác định gen CTX-M, TEM và SHV

64

3.3.5 Phương pháp phân tích trình tự nucleotide của gen TEM, CTX-M và xây
dựng cây phả hệ di truyền

66

3.3.6 Các chỉ tiêu theo dõi

67

3.3.7 Phương pháp phân tích thống kê

68

Chƣơng 4: Kết quả và thảo luận

69

4.1 Sự lưu hành của E. coli sinh ESBL tại hộ gia đình và trang trại

69

4.1.1 Sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trên gà theo tỉnh

69

4.1.2 Sự lưu hành E. coli sinh ESBL trên gà theo quy mô chăn nuôi

71

4.1.3 Sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trên gà thịt theo lứa tuổi

74

4.1.4 Sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trên gà tiêu chảy

74

4.1.5 Sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trên trứng

75

4.1.6 Sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trong môi trường chăn nuôi

76

4.1.7 Sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trên người chăn nuôi

78

4. 2 Sự lưu hành của E. coli sinh ESBL tại cơ sở giết mổ

80

4.2.1 Kết quả phân lập E. coli sinh ESBL trên gà

80

4.2.2 Kết quả phân lập E. coli sinh ESBL trên môi trường giết mổ

85

4.3 Sự đề kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL

86

viii


4.3.1 Tính nhạy cảm kháng sinh của E. coli sinh ESBL phân lập từ gà và người
chăn nuôi gà

86

4.3.2 Tính đa kháng thuốc kháng sinh của E. coli sinh ESBL

92

4.4 Kết quả xác định các gen CTX-M, TEM và SHV

101

4.5 Kết quả phân tích trình tự nucleotide của gen TEM, CTX-M và xây dựng
cây phả hệ di truyền

107

Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất

117

5.1 Kết luận

117

5.2 Đề xuất

117

Danh mục các công trình đã công bố
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

ix


DANH SÁCH BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

2.1

Tóm tắt cơ chế tác động của kháng sinh và cơ chế đề kháng của vi
khuẩn

24

2.2

Phân loại beta-lactamase

31

2.3

Thử nghiệm sàng lọc và xác định E. coli sinh ESBL

33

2.4

Độ nhạy và độ đặc hiệu của một số kháng sinh xác định ESBL

34

3.1

Đối tượng mẫu thu thập theo quy mô chăn nuôi

52

3.2

Các loại mẫu và số lượng mẫu thu thập tại hộ gia đình và trang trại

53

3.3

Số lượng gà thu thập theo hướng sản xuất và lứa tuổi

54

3.4

Địa điểm và công suất giết mổ của các cơ sở giết mổ gia cầm

55

3.5

Các loại mẫu và số lượng mẫu thu thập tại cơ sở giết mổ

56

3.6

Tiêu chuẩn đường kính vùng kháng khuẩn đánh giá tính nhạy cảm,
trung gian và đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh

63

3.7

Số vi khuẩn E. coli sinh ESBL được khảo sát gen đề kháng

64

3.8

Thành phần phản ứng PCR

64

3.9

Trình tự nucleotide của các mồi sử dụng cho phản ứng PCR

65

3.10

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

65

3.11

Số mẫu phân tích trình tự nucleotide

66

4.1

Tỉ lệ lưu hành E. coli sinh ESBL trên gà theo tỉnh

69

4.2

Tỉ lệ lưu hành E. coli sinh ESBL trên gà theo quy mô chăn nuôi

71

4.3

Tỉ lệ lưu hành E. coli sinh ESBL trên gà thịt theo lứa tuổi

74

4.4

Tỉ lệ lưu hành E. coli sinh ESBL trên phổi, gan, thịt và phân của
gà tiêu chảy

75

4.5

Tỉ lệ lưu hành E. coli sinh ESBL trên ở mặt ngoài vỏ trứng

76

x


Bảng

Tên bảng

Trang

4.6

Tỉ lệ lưu hành E. coli sinh ESBL trong môi trường chăn nuôi

77

4.7

Tỉ lệ lưu hành E. coli sinh ESBL trên người chăn nuôi gà

78

4.8

Tỉ lệ thân thịt gà dương tính với E. coli sinh ESBL

80

4.9

Tỉ lệ các loại mẫu dương tính với E. coli sinh ESBL

80

4.10

Tỉ lệ nhiễm E. coli sinh ESBL trên môi trường giết mổ

85

4.11

Tỉ lệ E. coli sinh ESBL phân lập từ gà đề kháng với kháng sinh

87

4.12

Tỉ lệ E. coli sinh ESBL phân lập từ gà nhạy cảm với kháng sinh

88

4.13

Tỉ lệ E. coli sinh ESBL phân lập từ người chăn nuôi gà đề kháng

với kháng sinh

89

4.14

Tỉ lệ E. coli sinh ESBL phân lập từ người chăn nuôi gà nhạy cảm
với kháng sinh

90

4.15

Tỉ lệ E. coli sinh ESBL phân lập từ gà đa kháng với kháng sinh

92

4.16

Tỉ lệ E. coli sinh ESBL phân lập từ người chăn nuôi gà đa kháng
với kháng sinh

93

4.17

Các kiểu đề kháng với kháng sinh của E. coli sinh ESBL phân lập
từ người chăn nuôi gà

95

4.18

Số kiểu đề kháng thuốc kháng sinh của E. coli sinh ESBL phân lập
từ gà và người chăn nuôi gà

97

4.19

Số kiểu đề kháng với 14 loại kháng sinh của E. coli sinh ESBL
phân lập từ gà và người chăn nuôi gà

98

4.20

Sự phân bố các gen CTX-M, TEM và SHV trên E. coli sinh ESBL
phân lập từ các loại mẫu

101

4.21

Sự phân bố các gen CTX-M, TEM và SHV trên E. coli sinh ESBL
phân lập từ gà ở hộ gia đình và trang trại

101

4.22

Sự phân bố các gen CTX-M, TEM và SHV trên E. coli sinh ESBL
phân lập từ người chăn nuôi gà

102

4.23

Sự phân bố các gen CTX-M, TEM và SHV trên E. coli sinh ESBL
phân lập từ vỏ trứng và môi trường chăn nuôi

102

4.24

Sự phân bố các gen CTX-M, TEM và SHV trên E. coli sinh ESBL
phân lập từ gà và môi trường tại cơ sở giết mổ

102

4.25

Các kiểu hiện diện gen CTX-M, TEM và SHV trên E. coli sinh
ESBL phân lập từ gà

104

4.26

Các kiểu hiện diện gen CTX-M, TEM và SHV trên E. coli sinh

ESBL phân lập từ người chăn nuôi gà

104

xi


DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

2.1

Quá trình truyền lây E. coli trong cộng đồng

15

2.2

Sự phát triển của vi khuẩn đề kháng kháng sinh

26

2.3

Mô hình lây truyền vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong cộng
đồng

26

2.4

Chuỗi peptid của TEM-1 và các vị trí thay thế acid amin

29

2.5

Chuỗi peptid của SHV-1 và các vị trí thay thế acid amin

30

2.6

Phương pháp đĩa đôi

35

2.7

Phương pháp đĩa kết hợp

35

2.8

Phương pháp E-test ESBL

36

3.1

Trứng gà trên ổ gà đẻ tại hộ gia đình

57

3.2

Trứng gà trên chuồng lồng tại trang trại

57

3.3

Dụng cụ lấy mẫu

59

3.4

Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli sinh ESBL

61

4.1

Chăn nuôi gà thịt ở quy mô trang trại

72

4.2

Chăn nuôi gà đẻ ở quy mô trang trại

73

4.3

Chăn nuôi gà đẻ ở quy mô hộ gia đình

73

4.4

Chăn nuôi gà thịt ở quy mô hộ gia đình

73

4.5

Dây chuyền giết mổ treo ở gà

81

4.6

Gà được giết mổ và pha lóc thịt trực tiếp trên nền sàn

82

4.7

So sánh tỉ lệ đề kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL phân lập
từ gà và người chăn nuôi

91

4.8

Sự phân bố đa kháng thuốc kháng sinh trên gà

94

4.9

Sự phân bố đa kháng thuốc kháng sinh trên người chăn nuôi

94

4.10

So sánh tính đa kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL phân lập
từ gà và người chăn nuôi gà

98

4.11

Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen SHV

105

4.12

Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen CTX-M

105

4.13

Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen TEM

105

4.14

Sự tương đồng trình tự nucleotide của các gen CTX-M

108

4.15

Hình ảnh alignment trình tự nucleotide của gen CTX-M

109

4.16

Sự tương đồng trình tự nucleotide của các gen TEM

110

xii


Hình

Tên hình

Trang

4.17

Hình ảnh alignment trình tự nucleotide của gen TEM

111

4.18

Cây phả hệ di truyền của gen CTX-M

113

4.19

Cây phả hệ di truyền của gen TEM

114

xiii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

Nghĩa tiếng Việt

Ak

Amikacin

AMC

Ampicillin/clavulanic acid

APEC

Avian pathogenic Escherichia coli

BNNPTNT

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn

BPW

Buffered peptone water

Bt

Trimethoprim/sulfamethoxazole

CFU

Colony forming unit

Ci

Citrate

CLSI

The Clinical and Laboratory
Standards Institute

Co

Colistin

Cr

Cefaclor

CRD

Chronic respiratory disease

Ct

Cefotaxime

CTX-M

Cefotaximases

Cu

Cefuroxime

Cz

Ceftazidime

DNA

Deoxyribonucleic acid

Dx

Doxycycline

E. coli

Escherichia coli

EMB

Eosin methylene blue

ESBL

Extended spectrum betalactamase

Fos

Fosfomycin

Ge

Gentamicin

I

Indole

IMViC

Indol, methyl red, VogesProskauer, citrate

Escherichia coli gây bệnh trên
gia cầm

Đơn vị hình thành khuẩn lạc

xiv

Viện tiêu chuẩn lâm sàng và
xét nghiệm

Bệnh hô hấp mãn tính

Beta-lactamase phổ rộng

Thử nghiệm indol, methyl
red, Voges-Proskauer, sử
dụng citrate


Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

Nghĩa tiếng Việt

kDa

Kilodalton

KIA

Kligler iron agar

Kn

Kanamycin

MC

Mac Conkey

MHA

Mueller Hinton agar

MR

Methyl red

Nr

Norfloxacin

Of

Ofloxacin

PCR

Polymerase Chain Reaction

QCVN

Quy chuẩn Việt Nam

RNA

Ribonucleic acid

SHV

Sulphyryl variable

Sm

Streptomycin

TBX

Tryptone Bile X-Glucuronide

Tc

Ceftotaxime + acid clavulanic

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

Te

Tetracycline

TEM

Temoneira

TSA

Tryptone Soy Agar

TSB

Tryptone Soy Broth

VP

Voges – Proskauer

Zc

Ceftazidime/clavulanic acid

xv

Phản ứng chuỗi polymerase


CHƢƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của luận án
Bệnh E. coli là một trong những bệnh nhiễm khuẩn phổ biến ở gà thịt và
gà đẻ nuôi công nghiệp (Raji et al., 2003). Vi khuẩn E. coli thường được tìm
thấy trong đường tiêu hóa của gà và được bài thải trong phân do đó gà có thể
bị nhiễm qua phân, nước uống, bụi và môi trường bị ô nhiễm. Sự nhiễm trùng
E. coli có thể dẫn đến nhiều thể bệnh cục bộ và hệ thống như là viêm ống dẫn

trứng, viêm dịch hoàn, viêm túi noãn hoàng, viêm ruột tiêu chảy, viêm màng
não, viêm mắt, viêm khớp, viêm đường hô hấp. Bệnh E. coli xảy ra ở gà mọi
lứa tuổi, gây bệnh số và tử số cao dẫn đến thiệt hại kinh tế cho người chăn
nuôi (Barnes et al., 2008). Ngày nay, việc sử dụng kháng sinh thường xuyên
trong thức ăn, nước uống để phòng và trị bệnh cũng như kích thích tăng
trưởng dẫn đến áp lực chọn lọc trên vi khuẩn, làm xuất hiện các chủng E. coli
đề kháng với nhiều loại kháng sinh làm cho việc điều trị bệnh bằng kháng sinh
có hiệu quả thấp (Linder, 2015). Trong những năm gần đây, các chủng vi
khuẩn kháng thuốc ngày càng nhiều và đề kháng kháng sinh là vấn đề được
quan tâm nghiên cứu sâu rộng trên thế giới, đặc biệt vi khuẩn E. coli sinh betalactamase phổ rộng (E. coli sinh ESBL). Bởi vì vi khuẩn E. coli sinh ESBL
không chỉ có khả năng bất hoạt hầu hết kháng sinh nhóm beta-lactam đang
dùng phổ biến hiện nay mà còn đề kháng với nhiều nhóm kháng sinh khác
được sử dụng phổ biến như aminoglycoside, macrolide, chloramphenicol,
tetracycline và fluoroquinolone (Lee, 2006).
Nhiều nghiên cứu về E. coli sinh ESBL trên gia súc và trên người đã
được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. Một số báo cáo đã công bố như
Blanc et al. (2006) tìm thấy tỉ lệ nhiễm E. coli sinh ESBL trên gà ở Catalonia,
Tây Ban Nha là 59,8%. Ở Bỉ, Smet et al. (2008) đã xác định sự hiện diện của
E. coli sinh ESBL trên gà 5 tuần tuổi khỏe mạnh là 45%. Nghiên cứu của
Costa et al. (2009) trên 76 mẫu phân gà thịt ở cơ sở giết mổ miền Bắc của Bồ
Đào Nha cho thấy sự hiện diện của E. coli sinh ESBL là 38,2%. Mamza et al.
(2010) nghiên cứu trên gà ở Maiduguri, Nigeria cho thấy tỉ lệ nhiễm E. coli
trên gà khỏe là 4,3% (25/582), trên gà bệnh là 28,7% (64/223) trong đó tỉ lệ
nhiễm E. coli sinh ESBL trên gà là 11,1% (89/805). Báo cáo của Overdevest
et al. (2011) ở Hà Lan năm 2009 cho thấy có 79,8% (68/89) mẫu thịt gà tại
cửa hàng dương tính với vi khuẩn E. coli sinh ESBL và 74,2% (23/31) bệnh
nhân được điều trị từ 4 bệnh viện dương tính với E. coli sinh ESBL.

1

Ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu về E. coli sinh ESBL trên
động vật, sản phẩm chăn nuôi và môi trường đã được công bố: Van Thi Thu
Hao et al. (2008) khảo sát sự hiện diện của E. coli sinh ESBL trên 30 mẫu thịt
gà, 50 mẫu thịt heo được thu thập từ chợ và siêu thị xung quanh thành phố Hồ
Chí Minh, 43 mẫu phân của gà trên 1 tháng tuổi, kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm
vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên thịt gà là 89,5%, trên thịt heo là 75% và trên
phân gà là 95%. Võ Thành Thìn và ctv. (2011) nghiên cứu gen đề kháng
kháng sinh nhóm beta-lactam đối với các chủng E. coli phân lập từ heo con
tiêu chảy ở Nam Trung Bộ và Tây Nguyên cho thấy có 115/184 chủng E. coli
có khả năng sinh ít nhất một loại beta-lactamase, chiếm tỉ lệ cao nhất là betalactamase được mã hóa bởi gen TEM (61,96%) và SHV (0,54%). Kết quả
nghiên cứu của Bùi Thị Ba và ctv. (2012) trên E. coli phân lập từ trâu bò khỏe
mạnh tại một số tỉnh Nam Trung Bộ cho thấy có 64,70% (22/34) chủng E. coli
có khả năng sinh ít nhất một loại beta-lactamase, chiếm tỉ lệ cao nhất là betalactamase có kiểu gen TEM (64,70%) và SHV (11,76%). Hồ Thị Kim Hoa và
ctv. (2013) nghiên cứu trên 45 mẫu chất thải (15 mẫu nước thải tươi, 15 mẫu
nước thải biogas và 15 mẫu phân gà) cho thấy có 82,22% (37/45) mẫu dương
tính với gen mã hóa beta-lactamase phổ rộng TEM, 8,89% (4/45) mẫu dương
tính với SHV, không phát hiện mẫu nào dương tính với CTX-M.
Các kết quả nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam nêu trên cho thấy vi
khuẩn E. coli sinh ESBL không chỉ hiện diện trên gia súc gia cầm mà còn hiện
diện trên nhiều đối tượng khác có liên quan như người chăn nuôi, sản phẩm
thịt và các yếu tố môi trường khác. Đồng bằng sông Cửu Long có nền chăn
nuôi gia cầm khá phát triển, đứng sau các tỉnh miền Đông Nam Bộ, đặc biệt là
chăn nuôi gà công nghiệp và gà thả vườn giống địa phương. Cũng như các
vùng chăn nuôi khác trên cả nước, vấn đề dịch bệnh trên gà nói chung và bệnh
do E. coli đặc biệt là E. coli sinh ESBL nói riêng xảy ra trong vùng Đồng bằng
sông Cửu Long là vấn đề quan tâm của các nhà chăn nuôi và các nhà khoa học
do chúng hiện diện trên nhiều đối tượng và đề kháng với nhiều nhóm kháng
sinh khác nhau. Tuy nhiên, thông tin về sự lưu hành của vi khuẩn E. coli sinh
ESBL vẫn còn rất hạn chế. Vì vậy, để có thêm cơ sở cho việc phòng trị bệnh

do E. coli sinh ESBL trên gia cầm; phòng tránh sự vấy nhiễm từ gia cầm sang
các đối tượng khác đặc biệt là người chăn nuôi, luận án được tiến hành để
nghiên cứu về sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trên gà và các yếu tố khác có
liên quan cũng như thực trạng đề kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL làm
cơ sở khoa học ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo giúp cho việc phòng trị
bệnh do E. coli trên gà có hiệu quả hơn và giảm thiểu sự lan truyền vi khuẩn
đề kháng kháng sinh từ chăn nuôi sang con người.

2


1.2 Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trên gà nuôi ở quy mô
trang trại, hộ gia đình, các yếu tố có liên quan như trứng gà, người chăn nuôi
gà, thịt gà ở cơ sở giết mổ và các yếu tố môi trường tại khu vực chăn nuôi và
cơ sở giết mổ ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.
- Xác định đặc tính đề kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL đối với
một số loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trên gà.
- Đánh giá sự tương đồng di truyền của gen CTX-M và TEM ở E. coli
sinh ESBL phân lập từ gà, trứng, người chăn nuôi gà và môi trường chăn nuôi.
1.3 Những điểm mới của luận án
- Đã xác định được sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trên gà ở quy mô
trang trại và hộ gia đình với tỉ lệ cao. Các yếu tố có liên quan như trứng gà,
người chăn nuôi gà, thịt gà ở cơ sở giết mổ và các yếu tố môi trường tại khu
vực chăn nuôi và cơ sở giết mổ gia cầm được ghi nhận đều có sự hiện diện của
E. coli sinh ESBL.
- Xác định được vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên gà còn nhạy cảm cao
với một số loại kháng sinh như aminkacin, fosformycin và colistin.
- Đã xác định được sự tương đồng di truyền cao của gen CTX-M và
TEM trên vi khuẩn E. coli sinh ESBL phân lập từ gà, trứng, người chăn nuôi

gà và môi trường chăn nuôi.

3


CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2. 1 Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli
2.1.1 Lịch sử phát hiện
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) được phân lập lần đầu tiên từ phân trẻ
em vào năm 1885 bởi nhà khoa học Theodore Escherich (1857-1911). Vi
khuẩn Escherichia coli thuộc giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gamma
proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia,
loài Escherichia coli (Scheutz and Strockbine, 2005).
Trên gia cầm, vi khuẩn E. coli được Lignieres phân lập lần đầu tiên từ
tim, gan và lách của gia cầm chết vào năm 1894. Từ năm 1894 đến năm 1922,
tác giả đã phát hiện bệnh này trên gà gô trắng, bồ câu, thiên nga, gà tây, chim
cút. Ngoài ra, bệnh E. coli nhiễm trùng máu trên những con gà chết có triệu
chứng giống như bệnh tụ huyết trùng được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1907.
Lignieres đã cho rằng trong những điều kiện nhất định E. coli thường trú trong
ruột rời khỏi ruột trở nên có độc lực và gây bệnh nhiễm trùng máu ở gà đẻ, đặc
biệt nếu sức đề kháng của gà bị giảm do đói, khát, lạnh hoặc môi trường chăn
nuôi gà thiếu sự thông thoáng. Vào năm 1923, E. coli gây bệnh viêm ruột trên
gà được mô tả và phân lập. Từ năm 1938 đến 1965, vi khuẩn E. coli được mô
tả và phân lập ở nhiều bệnh tích khác nhau như bệnh u hạt, viêm túi khí, viêm
khớp, viêm da, viêm cuống rốn, viêm mắt, viêm phúc mạc và viêm ống dẫn
trứng (Barnes et al., 2008).
2.1.2 Phân loại vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh
Vi khuẩn E. coli gây bệnh được chia thành hai nhóm là E. coli gây bệnh
trong đường ruột và E. coli gây bệnh ngoài đường ruột

vào các yếu tố gây
bệnh. Các nhóm vi khuẩn này mang các yếu tố độc lực điển hình và gây nên
các bệnh lý khác nhau trên người và động vật, theo Kaper et al. (2004), Barnes
et al. (2008), Croxen and Finlay (2010) chúng gồm các nhóm sau:
EPEC (Enteropathogenic Escherichia coli): vi khuẩn thuộc nhóm này
mang kháng nguyên bám dính và có khả năng xâm nhiễm vào niêm mạc ruột
non, phá hủy lớp tế bào biểu mô ruột nhưng không sản sinh độc tố, gây viêm
ruột kèm theo sốt và tiêu chảy nước trầm trọng. Chúng thường mang các type
huyết thanh O26, O44, O86, O111, O112, O114, O119, O124, O125, O126,
O127, O128, O142.
ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli): vi khuẩn mang một số kháng
nguyên bám dính và sinh độc tố đường tiêu hóa. Vi khuẩn thuộc nhóm này

4


thường thuộc các type huyết thanh O6 H16, O8 H9, O15 H11, O78 H11, O78
H12. Nhóm vi khuẩn ETEC gây bệnh bằng cách tiết ra hai loại độc tố đường
ruột là độc tố LT (heat labile toxin) và độc tố ST (heat stable toxin). Tiêu chảy
trầm trọng và kéo dài thường do nhiễm vi khuẩn tiết cả hai loại độc tố.
EIEC (Enteroinvasive Escherichia coli): vi khuẩn thuộc nhóm này gây
triệu chứng bệnh giống hội chứng lỵ do Shigella vì vi khuẩn xâm nhiễm vào
niêm mạc ruột đặc biệt là kết tràng, làm dung giải thể thực bào gây bệnh
nghiêm trọng cho người, tiêu chảy phân có đàm máu. Các type huyết thanh
thường gặp là O28ac, O112ac, O124, O140, O147 và O152.
EHEC (Enterohaemorrhagic Escherichia coli): vi khuẩn thuộc nhóm này
còn có tên gọi khác là VTEC (Verocytotoxin - producing Escherichia coli)
hay STEC (Shiga toxin – producing Escherichia coli). Nhóm vi khuẩn này
thường sản sinh yếu tố xâm nhiễm vào tế bào niêm mạc ruột và gây biến đổi
bệnh lý, gây xuất huyết ruột. Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của chúng

thường gây nên những bệnh lý tế bào rất nặng. Vi khuẩn thuộc nhóm này là
nguyên nhân chính của viêm đại tràng xuất huyết và hội chứng tan máu – ure
huyết (Hemolytic Uremic Syndrome: HUS). HUS biểu hiện bộ ba triệu chứng
suy thận cấp, giảm tiểu cầu và thiếu máu tán huyết do tổn thương mao mạch.
Vi khuẩn thuộc nhóm này thường mang các type huyết thanh O26, O111,
O113, O124, O145, O157.
EAEC (Enteroaggregative Escherichia coli): vi khuẩn thuộc nhóm này
thường bám dính cục bộ trên tế bào biểu mô ruột non và ruột già, sản sinh độc
tố tế bào và độc tố đường tiêu hóa (EAST1). Vi khuẩn nhóm EAEC là nguyên
nhân gây tiêu chảy với đặc điểm phân lỏng như nước, sau đó phân có màng
nhày.
DAEC (Diffusely adherent Escherichia coli): các chủng DAEC có thể là
tác nhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng ở các nước phát triển có thể tìm thấy
trong ruột non, đặc biệt là ở trẻ em từ 12 tháng tuổi trở lên.
UPEC (Uropathogenic Escherichia coli) E. coli gây bệnh tiết niệu và
MNEC (Meningitis-associated Escherichia coli) E. coli gây viêm màng não ở
người và các động vật khác.
Trong sáu nhóm E. coli gây bệnh trong đường ruột EPEC, ETEC, EIEC,
EHEC, EAEC và DAEC, bốn nhóm EPEC, ETEC, EIEC và EHEC mang
những chủng E. coli liên quan đến tiêu chảy, trong đó ETEC là nguyên nhân
phổ biến gây bệnh tiêu chảy người và vật nuôi (Gyles and Fairbrother, 2010).

5


2.1.3 Đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy
Vi khuẩn E. coli là một loại trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2-3
μm x 0,6 μm. Trong cơ thể E. coli có hình cầu đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành
chuỗi ngắn. Trong các môi trường nuôi cấy khác nhau, vi khuẩn dài 4-8 μm,
những loại này thường gặp trong canh khuẩn già. Phần lớn E. coli di động do

có lông ở xung quanh thân nhưng một số không thấy di động. Vi khuẩn không
sinh nha bào, bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu
khoảng giữa nhạt hơn, có thể hình thành giáp mô khi gặp môi trường dinh
dưỡng tốt (Hirsh, 2004).
Vi khuẩn E. coli phát triển ở điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí trên môi
trường dinh dưỡng ở nhiệt độ 18-44oC, pH từ 7,2-7,4. Vi khuẩn E. coli lên
men carbohydrate và thường sinh khí. Thời gian tăng sinh và số lượng E. coli
trong thời gian phát triển có liên quan đến nhiệt độ nuôi cấy. Vi khuẩn E. coli
phát triển tốt trên các môi trường MacConkey (MC), Eosin Methylene Blue
(EMB) hình thành nên các khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt được với các
vi khuẩn khác. Trên môi trường MC vi khuẩn E. coli lên men đường lactose sẽ
hình thành khuẩn lạc màu đỏ hồng, to, tròn đều, mặt khuẩn lạc hơi lồi, không
nhầy, viền gọn được bao quanh vòng đục, kích thước từ 2-3 mm; những vi
khuẩn E. coli không lên men đường lactose sẽ hình thành khuẩn lạc có màu
nhạt. Trên môi trường EMB khuẩn lạc E. coli to, tròn, hơi lồi bóng, màu tím
sẫm, có ánh kim (Barnes et al., 2008). Ngoài ra, vi khuẩn E. coli có thể được
nuôi cấy trên môi trường Tryptone Bile X-Glucuronide (TBX) có chứa chất
BCIG (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-glucuronic acid) hay còn gọi với tên
khác là X-glucuronide, sự xuất hiện của enzyme β-D-Glucuronidase do E. coli
tạo ra sẽ cắt đứt liên kết giữa 5-bromo-4-chloro-3-indolyle (chrompohore) và
D-glucuronide. Dưới tác nhân oxy hóa, các phân tử chrompohore phản ứng
với nhau tạo thành dichloro-dibromo indigo, chính những phân tử dichlorodibromo indigo này tạo nên màu xanh lá đặc trưng của khuẩn lạc E. coli
(TCVN 7924-2:2008; ISO 16649-2:2001).
2.1.4 Đặc tính sinh hóa
E. coli được định danh dựa vào các đặc tính sinh hóa được trình bày ở
Bảng 2.1. Một số thử nghiệm sinh hóa phổ biến dùng để định danh E. coli
được thực hiện như thử nghiệm Indole (I) dương tính; Methyl Red (MR)
dương tính; Voges – Proskauer (VP) âm tính; không sử dụng citrate (Ci);
không sinh H2S, di động, lên men đường lactose, glucose, sinh khí trên môi
trường Kligler Iron Agar (Mac Faddin, 2000):

6


Thử nghiệm Indol: Những vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả
năng phân giải tryptophan trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn tạo nên các sản
phẩm chứa gốc indol. Indol khi kết hợp với paradimethylamino-benzaldehyd
có trong thuốc thử Kovac’s sẽ tạo thành hợp chất muối dimethulammonium có
màu đỏ, kết quả phản ứng Indole dương tính.
Thử nghiệm MR (Methyl Red): Các vi khuẩn đường ruột thường có khả
năng lên men đường glucose tạo thành acid pyruvic. Acid pyruvic lại tiếp tục
chuyển hóa thành nhiều loại acid hữu cơ khác như acid acetic, acid lactic, acid
succinic, làm cho pH của môi trường nuôi cấy vi khuẩn hạ thấp xuống dưới
4,5. Chất chỉ thị methyl red giúp nhận biết độ pH của môi trường nuôi cấy sau
khi vi khuẩn lên men glucose. Khi nhỏ chất chỉ thị methyl red vào môi trường
nuôi cấy vi khuẩn, chất chỉ thị methyl red vẫn giữ màu đỏ là phản ứng dương
tính, chất chỉ thị methyl red chuyển sang màu vàng là phản ứng âm tính.
Thử nghiệm VP (Voges - Proskauer): Khác với phản ứng MR do tùy loại
enzyme mà vi khuẩn có được nên một số vi khuẩn có khả năng oxy hóa đường
glucose tạo thành acid pyruvic, nhưng lại không chuyển hóa acid pyruvic
thành acid hữu cơ mà thành hợp chất acetyl methyl carbinol (acetoine).
Acetoine trong môi trường kiềm cao sẽ bị oxy hóa thành diacetyl. Diacetyl
sinh ra sẽ kết hợp với nhóm guanin của arginin có trong pepton tạo thành phức
chất có màu đỏ với thuốc thử α-naphtol và KOH 10% hoặc NaOH 40%. Đây
là cơ sở của việc đánh giá kết quả của phản ứng VP dương tính.
Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrate: Trong môi trường nuôi cấy vi
khuẩn Simmons Citrate Agar có chứa hợp chất sodium citrat (Na3C6H5O7),
nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng được citrate (là nguồn cacbon duy nhất) sẽ
làm thừa ra các gốc Na+ do đó môi trường trở nên kiềm và làm cho màu của
chất chỉ thị xanh bromothymol có trong môi trường sẽ chuyển từ xanh lá cây

sang màu xanh nước biển (blue). Đây là kết quả thử nghiệm dương tính. Nếu
môi trường không đổi màu là thử nghiệm âm tính.
Thử nghiệm trên môi trường Kligler’s Iron Agar (KIA): Môi trường KIA
có chứa đường lactose, glucose, sắt, phenol red, pepton (nguồn carbon/
nitrogen) và muối sắt thiosulfate natri. Môi trường KIA có màu đỏ hồng, để
thực hiện thử nghiệm cần chuẩn bị các ống thạch nghiêng. Môi trường KIA có
thể xảy ra ba trường hợp lên men carbohydrate: (1) Màu vàng phần thạch
đứng ở ống nghiệm và màu đỏ (kiềm) ở phần thạch nghiêng, chứng tỏ vi
khuẩn lên men đường glucose nhưng không lên men đường lactose; (2) màu
vàng phần thạch đứng ở ống nghiệm và ở phần thạch nghiêng, chứng tỏ vi
khuẩn lên men cả đường glucose và đường lactose; (3) Phần thạch đứng và

7


phần thạch nghiêng môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ hồng không chuyển
sang màu vàng, cho thấy vi khuẩn không lên men đường glucose và đường
lactose. Các sản phẩm sinh ra không phải là sản phẩm acid. Nếu sinh hơi sẽ
thấy có hơi ở phần gốc của ống môi trường, đẩy thạch lên khỏi đáy ống
nghiệm hoặc làm nứt thạch. Nếu thấy màu đen ở phần thạch đứng ở đáy ống
nghiệm chứng tỏ vi khuẩn đã sinh ra khí H2S từ thiosulfid. Nên đọc kết quả
thử nghiệm sau khi nuôi cấy từ 18 – 24 giờ, nếu đọc kết quả quá sớm, vi
khuẩn chỉ có thể lên men đường glucose, nếu đọc quá muộn, các chất gây lên
men lactose có thể dùng hết lactose và bắt đầu dị hoá pepton, phần thạch
nghiêng của môi trường sẽ trở lại màu đỏ. Thử nghiệm vi khuẩn E. coli dương
tính khi phản ứng lên men đường lactose dương tính, glucose dương tính, H2S
âm tính và có sinh khí.
2.1.5 Cấu trúc kháng nguyên
Vi khuẩn E. coli có bốn nhóm kháng nguyên chính là kháng nguyên O,
H, K và F. Kháng nguyên O và H thường được xác định trong huyết thanh học

nhưng kháng nguyên K ít được xác định hơn. Hiện nay, các nhà khoa học xác
định được 180 kháng nguyên O, 60 kháng nguyên H, 80 kháng nguyên K và
17 kháng nguyên F. Kháng nguyên F là loại kháng nguyên bề mặt được phát
hiện thêm, sự xác định chúng đã cung cấp thông tin có giá trị trong đặc điểm
của các chủng E. coli gây bệnh, đặc biệt là chủng ETEC có nguồn gốc động
vật (Barnes et al., 2008; Gyles and Fairbrother, 2010).
Kháng nguyên O (somatic antigen) còn được gọi là kháng nguyên thân.
Đây là thành phần chính của vỏ vi khuẩn và cũng được xem là một yếu tố độc
lực của vi khuẩn. Kháng nguyên O có bản chất là lipopolysaccharide được cấu
tạo gồm 3 thành phần chính và gắn với nhau theo trình tự là lipid A, nhân
oligosaccharide và chuỗi O-specific polysaccharide. Lipid A là chuỗi acid béo
nối với nhau bằng liên kết ester-amine với đường đôi là thành phần của Nacetylglucosamine phosphate. Phần nhân oligosacharide được cấu tạo bởi
ketodeoxyotonate, đường heptose, glucose, galactose và N-acetylglucosamine.
Phần O-specific polysaccharide gồm có các đường galactose, glucose,
rhamnose và mannose. Việc xác định các nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn
E. coli được dựa vào cấu trúc hóa học khác nhau của phần O-specific
polysaccharide. Sự đa dạng về cấu trúc của phần này đã hình thành nên các
nhóm kháng nguyên O khác nhau và được xác định bằng phản ứng ngưng kết
với kháng huyết thanh chuẩn. Kháng nguyên O chịu được nhiệt, không bị hủy
khi đun nóng 100oC trong 2 giờ, kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn
50o, bị hủy bởi formol 5% (Kayser et al., 2005; Madigan and Martinko, 2006;
Barnes et al., 2008). Oliveira et al. (2009) cho rằng chủng E. coli gây bệnh

8