Nghiên cứu biến đổi sinh học ghẹ (portunus) bằng công nghệ vi sinh để chế biến thực phẩm không phế thải

tên đề tài.txt
Nghiên cứu biến đổi sinh học Ghẹ (Portunus) bằng công nghệ vi sinh để chế biến
thực phẩm không phế thải
(GIảng viên hướng dẫn:Lê Chiến Phương)
SV:Nguyễn Hồng Sơn
MSSV: 107111139
Lớp: 07DSH02

Page 1


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của cá nhân tôi. Những kết quả và các số liệu
trong báo cáo thực tập được thực hiện tại Viện sinh học nhiệt đới Tp. HCM, không sao
chép bất kỳ nguồn nào khác. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời
cam đoan này.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 7 năm 2011

i


LỜI CẢM ƠN

Qua thời gian làm đồ án tại viện sinh học nhiệt đới TP. HCM, được sự hướng
dẫn nhiệt tình của thầy cô và anh chị trong viện đã giúp em hiểu sâu hơn về chuyên
nghành của mình, có them kinh nghiệm cũng như kiến thức quí báu. Em xin chân thành
gủi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo, thầy cô và anh chị ở viện đã tạo điều kiện thuận lợi
cho em tiếp cận thực tế và giúp đỡ em thu thập thông tin để hoàn thành bài báo cáo
này.

Em cảm ơn thầy Lê Chiến Phương và anh Hải, anh Dân, chị Liên là những
người trực tiếp hướng dẫn và cung cấp tài liệu tham khảo cho em trong suốt thời gian
làm việc. Em xin cám ơn Quí Thầy Cô giảng dạy tại khoa Môi Trường và Công Nghệ
Sinh Học đã truyền đạt kiến thức cho em trong sốt thời gian em học tại trường và tạo
điều kiện cho em thực tập nâng cao kinh nghiệm.

Trong thời gian làm đồ án, do kiến thức còn hạn chế nên dù có sự hướng dẫn
nhiệt tình của thầy cô và anh chị hướng dẫn nhưng cũng không tránh khỏi những hạn
chế thiếu sót. Mong các thầy cô anh chị ban lãnh đạo bỏ qua. Em rất mong được góp ý
chân thành của Quý Thầy Cô.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô và các anh chị.

Trân trọng cảm ơn
SV Nguyễn Hồng Sơn

ii


MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ......................................... 1
1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
2. Mục đích đề tài ................................................................................................. 1
3. Nội dung đề tài ................................................................................................. 1
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 2
2.1. Ghẹ ................................................................................................................ 2
2.1.1. Phân loại. .................................................................................................4
2.1.1.1.Ghẹ xanh ................................................................................................4
2.1.1.2. Ghẹ đốm (Ghẹ chấm)............................................................................7

2.1.1.3. Ghẹ 3 chấm ...........................................................................................8
2.2. Khái quát về Trichoderma harzianum sp. ..................................................... 9
2.2.1.Đặc điểm sinh học của nấm T. harzianum sp. ..........................................9
2.2.2. Các nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma ....................................11
2.3 . Tổng quan về Chitin ................................................................................... 14
2.3.1. Lịch sử nghiên cứu Chitin .....................................................................14
2.3.2. Sự tồn tại của Chitin trong tự nhiên .......................................................14
2.3.3. Cấu trúc phân tử và tính chất của Chitin ...............................................16
2.3.4. Sự tách chiết Chitin................................................................................18
2.3.5. Thành phần của Chitin trong một số loài ..............................................18
2.4. Đại cương về hệ enzyme Chitinase ............................................................. 19
2.4.1. Định nghĩa..............................................................................................19
2.4.2. Phân loại ................................................................................................19
2.4.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme Chitinase .......................................22
2.4.4. Cơ chế tác động của hệ enzyme Chitinase ............................................23

iii


2.5. Glucosamin .................................................................................................. 25
2.6. Calci ............................................................................................................. 25
2.6.1. Đặc tính vật lý ........................................................................................25
2.6.2. Calci trong cơ thể người ........................................................................25
2.6.3. Sự chuyển hóa Calci trong cơ thể ..........................................................26
2.6.4. Vai trò Calci trong cơ thể ......................................................................26
2.7. Vi khuẩn lactic [3] ....................................................................................... 27
2.7.1. Phân loại ................................................................................................27
2.7.2. Đặc điểm ................................................................................................27
2.7.3. Các con đường lên men lactic................................................................28
2.7.4. Vài đại diện của vi khuẩn lactic .............................................................29

2.7.5. Ứng dụng ...............................................................................................31
2.8. Acid acetic ................................................................................................... 31
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 34
3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 34
3.1.1. Ghẹ ........................................................................................................34
3.1.2. Nấm mốc T.harzianum ..........................................................................34
3.1.3. Vi khuẩn lactic .......................................................................................35
3.1.4. Môi trường nuôi cấy ..............................................................................36
3.1.5. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ..............................................................38
3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 39
3.2.1. Phương pháp tách chiết Chitin...............................................................39
3.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Chitinase...............................40
3.2.3. Định tính xác định hoạt độ của enzyme Chitinase
bằng đo đường kính vòng phân giải ...............................................................41
3.2.4. Phương pháp định lượng Glucosamin ( phương pháp Elson-Morgan ) 42
3.2.5. Phương pháp định lượng Calci ..............................................................44

iv


3.2.6. Phương pháp định lượng acid lactic .....................................................45
3.2.7. Phương pháp định lượng Protein (Phương pháp Bradford ) .................45
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................ 48
4.1. Thu nhận Chitin từ mai Ghẹ ........................................................................ 48
4.2. Xác định tỷ lệ Chitin tối ưu để nuôi cấy T.harzianum ................................ 49
4.3. Nuôi lắc T.harzianum trong môi trường dịch thể ........................................ 51
4.4. Định lượng Calci bằng phương pháp hóa học ............................................. 52
4.4.1. Ngâm Ghẹ trong acid acêtic 15% .........................................................52
4.4.2. Ngâm Ghẹ trong acid lactic với các nồng độ khác nhau ......................56
4.5. Xử lý Ghẹ bằng phương pháp vi sinh......................................................... 59

4.5.1. Kết quả định lượng Calcium (Ca)..........................................................61
4.5.2. Kết quả định lượng acid lactic ...............................................................62
4.5.3. Kết quả định lượng Protein ...................................................................63
4.5.3. Kết quả định lượng Glucosamin ............................................................65
4.5.4. Chế biến một số món từ Ghẹ đã biến đổi sinh học ...............................67
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 69
5.1. Kết luận ....................................................................................................... 69
5.2. Kiến nghị ..................................................................................................... 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 71

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Ghẹ .............................................................................................................................. 2
Hình 2.2. Ghẹ xanh ..................................................................................................................... 4
Hình 2.3. Ghẹ đốm ...................................................................................................................... 7
Hình 2.4. Ghẹ ba chấm ............................................................................................................... 8
Hình 2.5. Hình thái vi thể của T. harzianum............................................................................. 10
Hình 2.6. Cấu trúc Chitin .......................................................................................................... 16
Hình 2.7. Cấu trúc không gian của Chitin ................................................................................ 17
Hình 2.8. Quy trình tách chiết Chitin........................................................................................ 18
Hình 2.9. Cấu trúc không gian của Chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 ............................. 19
Hình 2.10. Cấu trúc không gian của Chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 ........................... 20
Hình 2.11. Vị trí phân cắt enzyme Chitinase ............................................................................ 22
Hình 2.12. Cơ chế hoạt động của enzyme Chitinase ở Trichoderma. ...................................... 23
Hình 3.1. Ghẹ được mua ở Vũng Tàu ....................................................................................... 34
Hình 3.2. Trichoderma harzianum sp ....................................................................................... 35
Hình 3.3. Lactobacillus sp. ....................................................................................................... 35
Hình 3.4. Quy trình thu nhận Chitin từ mai Ghẹ ...................................................................... 39

Hình 4.1. Chitin từ mai Ghẹ ..................................................................................................... 48
Hình 4.2. Hiệu suất thu nhận Chitin ......................................................................................... 49
Hình 4.3. Đường tròn phân giải Chitin 1% ............................................................................... 50
Hình 4.4. Hàm lượng Calcium có trong dịch ngâm acid acetic 15% ....................................... 53
Hình 4.5. Ghẹ ngâm trong acid acetic 15% ............................................................................. 54
Hình 4.6. Ghẹ ngâm trong các nồng độ acid lactic khác nhau ................................................ 56
Hình 4.7. Xử lý Ghẹ bằng phương pháp vi sinh ...................................................................... 60
Hình 4.8. Sự biến đổi hàm lượng acid lactic ............................................................................ 63
Hình 4.9. Đường chuẩn Protein ................................................................................................ 64
Hình 4.10. Đường chuẩn Glucosamin ...................................................................................... 65
Hình 4.11. Ghẹ xào giấm ......................................................................................................... 68

vi


DANH MỤC BẢN
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng của Ghẹ ..................................................................... 3
Bảng 2.2. Thành phần Chitin ở một số loài ................................................................... 18
Bảng 4.1. Khối lượng Chitin thu được từ mai Ghẹ ...................................................... 48
Bảng 4.2. Đường kính vòng tròn phân giải .................................................................... 50
Bảng 4.3. Hoạt tính của enzyme Chitinase theo thời gian nuôi cấy .............................. 51
Bảng 4.4. Hàm lượng Calci có trong dịch ngâm acid acetic 15% ................................. 53
Bảng 4.5. Sự biến thiên pH khi ngâm Ghẹ trong acid acetic 15%................................. 55
Bảng 4.6. Đánh giá cảm quan khi ngâm Ghẹ trong acid acetic 15% ............................. 55
Bảng 4.7. Thể tích EDTA 0.1M theo các nồng độ acid lactic ....................................... 57
Bảng 4.8. Hàm lượng Calci ở các nồng độ acid lactic khác nhau ................................. 58
Bảng 4.9. Hàm lượng Calci có trong dịch ngâm............................................................ 61
Bảng 4.10. Hàm lượng acid lactic có trong dịch ngâm .................................................. 62
Bảng 4.11. Hàm lượng Protein có trong dịch ngâm ...................................................... 63
Bảng 4.12. Hàm lượng Glucosamin có trong dịch ngâm ............................................... 65

Bảng 4.13. Đánh giá cảm quan khi ngâm Ghẹ trong dịch sinh khối T.harzianum ....... 66

vii


CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
1. Đặt vấn đề
Động vật giáp xác ở nước ta là khá phong phú, một số trở nên quen thuộc và gắn liền
với cuộc sống của chúng ta như Tôm, Ghẹ, Ghẹ, Ba khía…đây là nguồn thực phẩm
nhiều chất dinh dưỡng, cung cấp nhiều năng lượng và khoáng chất cần thiết cho cơ thể.
Tuy nhiên, do hàm lượng vỏ của nguồn nguyên liệu này là khá lớn nên khi thải ra
ngoài môi trường sẽ gây ô nhiễm môi trường do nó rất khó phân huỷ. Bên cạnh đó, qua
quá trình nghiên cứu, người ta thấy rằng trong thành phần vỏ của các loài giáp xác này
có chứa nhiều chất khoáng, protein, Chitin….mà đặc biệt là Chitin - một vật liệu rất
quý, đang được cả thế giới quan tâm và nghiên cứu.
Bởi vậy chúng ta phải góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường mà lại tận dụng được
lớp vỏ của các loài giáp xác này làm thực phẩm chức năng. Vì lí do này mà tôi được
giao nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu biến đổi sinh học Ghẹ (Portunus) bằng công nghệ
vi sinh để chế biến thực phẩm không phế thải ”.
2. Mục đích đề tài
 Nâng cao giá trị kinh tế của Ghẹ.
 Có thể ăn Ghẹ nguyên con vì lợi ích về dinh dưỡng, kinh tế và môi trường.
3. Nội dung đề tài
- Nuôi sinh khối các vi sinh vật thí nghiệm và thu nhận Chitin từ vỏ Ghẹ.
- Làm mềm vỏ Ghẹ bằng các phương pháp hóa và vi sinh vật học.
- Phân tích sinh hóa các nguyên liệu tham gia và được tạo thành trong thí nghiệm.
- Chế biến thực phẩm từ Ghẹ đã được làm mềm vỏ.
1

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Ghẹ

Hình 2.1. Ghẹ
Ghẹ là đối tượng hải sản quý, có giá trị thương mại cao và là mặt hàng xuất
khẩu quan trọng của Việt Nam. Ghẹ được phân bố ở khắp các vùng biển đến độ sâu 50
– 100m và cửa sông, đáy cát bùn từ Bắc vào Nam, nguồn lợi khá phong phú. Ban đêm
Ghẹ sống sát đáy, ngày bơi lên. Ghẹ là loài rất nhạy cảm với những thay đổi thời tiết.
Qua khai thác thử nghiệm đánh giá nguồn lợi Ghẹ theo Dự án đánh giá của nguồn lợi
sinh vật biển Việt Nam (ALMRV) từ tháng 8/1996 đến tháng 2/1997, năng suất khai
thác Ghẹ bằng lưới giã cào ở độ sâu 20-50m đạt khoảng 0,3-1,3 kg/giờ, ở độ sâu 50100m đạt khoảng 1,3-2,9 kg/giờ. Ở vùng biển phía Nam năng suất có thể tới 6,9 kg/giờ
kéo lưới.Những năm gần đây do nhu cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu tăng, nên
cùng với nghề khai thác Ghẹ tự nhiên, nghề nuôi Ghẹ đã phát triển ở nhiều địa phương

2


trong cả nước, tuy nhiên nguồn con giống chủ yếu vẫn còn phụ thuộc vào khai thác tự
nhiên. Từ năm 1998, để giải quyết vấn đề con giống cho nghề nuôi Ghẹ, Ghẹ của Việt
Nam, đã có đề tài “Sản xuất giống và nuôi thương phẩm Ghẹ xanh (Portunus
Pelagicus)” do Trung Tâm Nghiên cứu Thuỷ sản III (nay là Viện Nghiên cứu nuôi
trồng thủy sản III) thực hiện, đã đạt được một số kết quả quan trọng, tạo cơ sở để mở
rộng nghề nuôi Ghẹ ở Việt Nam.

Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thực phẩm ăn được
Thành phần chính

Năng

Nguyên

lượng

liệu

Nước Protein Lipid Glucid Tro

Kcal
Ghẹ

103

Muối khoáng

Calci Phospho

g

72.2

17.5

Sắt

mg

0.6

7.0

2.7

141

Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng của Ghẹ

3

191

3.8


2.1.1. Phân loại
2.1.1.1. Ghẹ xanh [30]

Hình 2.2. Ghẹ xanh
Đặc điểm :
Ghẹ xanh (danh pháp khoa học: Portunus pelagicus, đồng nghĩa Neptunus
pelagicus) là một loài Ghẹ lớn tìm thấy ở các cửa sông của Ấn Độ Dương và Thái Bình
Dương (phần duyên hải châu Á) cũng như vùng duyên hải trung-đông của Địa Trung
Hải. Loài Ghẹ này phân bố rộng ở miền đông châu Phi, Đông Nam Á, Nhật Bản,
Australia và New Zealand.
Ghẹ đực có vỏ màu lam sáng với các đốm trắng và các càng dài đặc trưng, trong
khi Ghẹ cái có màu nâu/lục xỉn màu hơn và mai thuôn tròn hơn. Mai của chúng có thể
rộng tới 20 cm.
Phần lớn thời gian chúng ẩn nấp dưới cát hay bùn, cụ thể là trong thời gian ban
ngày và mùa đông, điều này có thể giải thích nhờ sự chịu đựng tốt của chúng đối với
NH4+ và NH3 [1]. Chúng đi kiếm ăn khi thủy triều lên. Thức ăn của chúng khá đa dạng,

4


từ các động vật hai mảnh vỏ, cá và ít hơn là các loại tảo lớn. Chúng bơi lội rất tốt, chủ
yếu là do các cặp chân dẹp tựa như các mái chèo. Tuy nhiên, ngược lại với loài Ghẹ bể
xanh (Scylla serrata) trong cùng họ Portunidae, chúng không thể sống một thời gian
dài mà không có nước.
Ghẹ xanh là loài hải sản có tầm quan trọng thương mại trong khu vực Ấn Độ
Dương-Thái Bình Dương và nó được buôn bán dưới dạng Ghẹ mai cứng hoặc "mai
mềm", cả hai dạng này đều được coi là những đặc sản trong khu vực châu Á. Loài này
được đánh giá cao do thịt của nó ngọt như thịt Ghẹ xanh Đại Tây Dương (Callinectes
sapidus), nhưng P. pelagicus lại to hơn.
Các đặc trưng này, cùng với tộc độ lớn nhanh, nuôi dễ dàng, mắn đẻ và khả năng
kháng chịu cả nitrat [2]

[3]

lẫn amoniac [1], (cụ thể là NH3, là dạng có độc tính cao hơn

dạng ion NH4+, do nó dễ dàng khuyếch tán qua màng mang), đã làm cho loài này là
tương đối lý tưởng trong nuôi trồng thủy sản. P. pelagicus không phải là loài sinh vật
biển thật sự do nói chung nó hay tiến vào các cửa sông để kiếm thức ăn và trú ẩn.
Ngoài ra, chu trình vòng đời của nó phụ thuộc vào các cửa sông do ấu trùng và Ghẹ
non sử dụng các môi trường nước lợ cửa sông để sinh sống và phát triển. Trước khi
trứng nở, Ghẹ cái di chuyển tới các môi trường sống nông cạn ven cửa sông, đẻ trứng
và ấu trùng mới nở (ấu trùng giai đoạn I) sẽ tiến về các cửa sông. Trong khoảng thời
gian này chúng ăn các loại phiêu sinh vật nhỏ và phát triển từ giai đoạn ấu trùng I (zoea
I) tới ấu trùng giai đoạn IV (khoảng 8 ngày) và sau đó thành giai đoạn ấu trùng cuối
cùng (megalopa), kéo dài khoảng 4-6 ngày. Giai đoạn ấu trùng này có đặc trưng là có

các càng to để bắt mồi. Giai đoạn từ dạng megalopa biến hóa thành dạng Ghẹ/Ghẹ thì
chúng vẫn tiếp tục sống tại cửa sông, do môi trường vẫn phù hợp để kiếm ăn và trú ẩn.
Tuy nhiên, các chứng cứ cho thấy Ghẹ non không thể chịu được độ mặn thấp trong một
thời gian dài, có lẽ là do khả năng điều chỉnh siêu thẩm thấu quá yếu của nó [4]. Điều

5


này có thể giúp giải thích sự di cư hàng loạt của chúng từ cửa sông ra biển trong mùa
mưa.
 Đặc trưng phân bố
Ghẹ xanh xuất hiện khá phổ biển ở khắp các vùng biển của Việt Nam. Ghẹ xanh
ưa thích sống ở vùng nước có độ mặn 25-31‰ và thường sống ở độ sâu từ 4 đến 10m
nước ở những vùng biển có đáy là cát, cát bùn và cát bùn có san hô chết. Mùa sinh sản
của Ghẹ kéo dài quanh năm, nhưng thời gian Ghẹ xanh ôm trứng nhiều nhất là tháng 24 ở vùng biển miền Trung. Cũng như các loài Ghẹ biển, sau khi nở ấu trùng Ghẹ xanh
phải qua nhiều lần lột vỏ và biến thái mới trở thành Ghẹ giống. Đến màu sinh sản Ghẹ
xanh kết thành đàn ra biển, nơi có độ mặn 30 - 34‰ để đẻ trứng.
- Đặc điểm hình thái : Ghẹ thường có vỏ màu xanh, có các chấm trắng. Cỡ khai thác ở
trong
vịnh/đầm, trung bình là 80-120 g/con; Cỡ khai thác ngoài biển khoảng 150 -250g/con
- Phân bố: Khắp vùng biển Việt Nam
- Mùa vụ khai thác: tháng 5 – 2 năm sau
- Ngư cụ khai thác: Lưới Ghẹ, lưới kéo, câu, lồng bẫy
- Kích thước khai thác: 6,5-9 cm
- Khả năng nuôi: Ghẹ xanh được nuôi nhiều bằng giống tự nhiên ở khu vực phía Bắc
như Quảng
Ninh, Hải Phòng, Nam Định. Hiện nay đã có thể sản xuất được giống Ghẹ nhân tạo,
góp phần
thúc đẩy nghề nuôi Ghẹ phục vụ xuất khẩu.
- Hình thức nuôi: chủ yếu nuôi quảng canh cải tiến trong các đầm nước lợ và nuôi ghép

với các đối tượng khác trên lồng bè ở vịnh Hạ Long và vịnh Cát Bà.

6


2.1.1.2. Ghẹ đốm (Ghẹ chấm)

Hình 2.3. Ghẹ đốm
Ghẹ chấm, Ghẹ đốm hay Ghẹ cát (danh pháp khoa học: Portunus
trituberculatus) là loài Ghẹ được đánh bắt nhiều nhất trên toàn thế giới, với trên
300.000 tấn đánh bắt mỗi năm, 98% trong số này đánh bắt ngoài khơi của Trung
Quốc[1].
P. trituberculatus được tìm thấy trong vùng biển từ Hokkaidō tới miền nam Ấn Độ,
xuyên qua khu vực quần đảo Mã Lai và xa về phía nam tới Australia. Nó sống trên nền
đáy nông nhiều cát hay bùn, với độ sâu nhỏ hơn 50 mét, thức ăn chủ yếu của nó là các
loại rong biển và cả các loài cá nhỏ, giun và động vật hai mảnh vỏ.
Mai của nó có thể rộng tới 15 cm (6 inch) và 7 cm (2,75 inch) tính từ phần trước ra
phần sau của lưng. P. trituberculatus có thể phân biệt với loài Ghẹ xanh có họ hàng
gần (và cũng được đánh bắt nhiều) P. pelagicus bằng một loạt các khía răng cưa rộng
trên phần trước của mai (3 ở P. trituberculatus, 4 ở P. pelagicus) và trên mép trong của

7


còng (4 ở P. trituberculatus, 3 ở P. pelagicus)[1]. Các loài Ghẹ khác có họ hàng gần còn
có P. sanguinolentus và các loài nhỏ hơn như P. haani và P. nipponensis.
 Phân bố:
- Phân bố: Vịnh Bắc Bộ, ven biển miền Trung
- Mùa vụ khai thác: Tháng 5 – 3 năm sau
- Ngư cụ khai thác: Lưới kéo

- Kích thước khai thác: 7,5 – 14 cm
- Khả năng nuôi: Có thể nuôi
2.1.1.3. Ghẹ ba chấm [31]

Hình 2.4. Ghẹ ba chấm
Tên tiếng Anh: Three spots swimming crab
Tên khoa học: Portunus sanguinolentus (Herbst, 1796)
- Phân bố: Vịnh Bắc Bộ và ven biển miền Trung
- Mùa vụ khai thác: Tháng 7 – 3 năm sau
- Ngư cụ khai thác: Lưới Ghẹ hoặc lưói kéo, lồng bẫy, câu

8


- Kích thước khai thác: 7 – 14,5 cm
- Khả năng nuôi: Có thể nuôi
2.2. Khái quát về Trichoderma harzianum sp.
2.2.1.Đặc điểm sinh học của nấm T. harzianum sp.
2.2.1.1. Vị trí phân loại [12,15]
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong việc phân
loại do các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ.
Theo hai nhà khoa học Elisa Espossito và Manuela da Silva, Trichoderma thuộc loại
họ Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes, được phân làm năm nhóm: Trichoderma,
Longibrachiatum, Satutnisporum, Pachybarium và Hypocreanum.
Theo Rifai (1969), Barnett và Hunter (1972), Trichoderma được phân loại như sau:
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Lớp: Deuteromycetes
Bộ: Moniliales
Họ: Moniliceae

Giống: Trichoderma
Một số tài liệu phân loại giống Trichoderma thuộc họ Moniliacae, bộ Moniliales, lớp
nấm, nấm bất toàn ( Fungi imperfecti ).
T. harzianum được phân thành hai nhóm nhỏ qua việc phân tích chuỗi DNA và hình
thái ngoài: T. harzianum1 và T. harzianum 2.
Hai nhóm nhỏ này khác nhau ở khả năng tạo ra chất kháng nấm bệnh.

9


2.2.1.2. Đặc điểm hình thái [1, 11]
Khuẩn lạc T.harzianum ban đầu có màu lục trắng, sau lục tươi, lục sẫm. Mặt dưới
khuẩn lạc không màu. Bào tử áo ở giữa sợi nấm hoặc đính ở các nhánh, hình cầu, nhẵn,
không màu, đường kính 6-12 m.
Giá bào tử trần ngăn vách, phân nhánh 2-3 lần, đường kính 4 - 5 m, dài tới 250 m.
Thể bình có kích thước 3-4 x 5-7m, thường thành 2-5 cái ở đỉnh nhánh tận cùng, ở
dọc các nhánh thường đơn độc. Thể bình ở giữa thường dài tới 17 m và có đường
kính nhỏ hơn, phần rộng nhất khoảng 2-3 m. Bào tử trần hình gần cầu, hình trứng,
phần gốc hơi bẹt, nhẵn, màu lục nhạt, không vách ngăn, kích thước 2 - 3 x 3 - 3,5 m,
nhày ở thể bình.

Bào tử T.harzianum

Hệ sợi T.harzianum

Hình 2.5. Hình thái vi thể của T. Harzianum

10

2.2.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của T.harzianum [15]
T.harzianum được tìm thấy ở những vùng ấm áp. Theo nghiên cứu của Domsch và
cộng sự (1980), nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của T.harzianum vào
khoảng 30 C, tối đa khoảng 36 C.
T.harzianum cũng có thể phát triển ở nhiệt độ khoảng 5 C, những sinh trưởng rất
chậm và yếu .
Giá trị aw nhỏ nhất là 0,91 ở 25 C.
T.harzianum tổng hợp enzyme Chitinase và các chất kháng sinh (Trichodermin,
glyotosin…).
Vấn đề độc tố của T.harzianum chưa được biết đến.

2.2.2. Các nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma
2.2.2.1. Bảo vệ thực vật [12]
Một trong những nghiên cứu ứng dụng T.harzianum được quan tâm nhiều nhất đó là
khả năng kiểm soát sinh học và khả năng kháng một số nấm gây bệnh quan trọng ở
thực vật. Giống Trichoderma này tấn công các nấm bệnh bằng cách tiết ra các enzyme
phân giải Chitin. Các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra những kết quả thuyết
phục về hoạt động kháng nấm Sclerotium rolfsii (nấm bệnh ký sinh trên cây thuốc lá)
của T.harzianum qua việc tổng hợp các enzyme Chitinase.
Bên cạnh tác dụng kháng nấm, T.harzianum còn có khả năng ức chế các tác nhân gây
bệnh trên cây trồng. Trichoderma là một thành phần đặc hiệu trong Trochodex – một
chế phẩm dùng để chống lại sự mục rữa của táo sau thu hoạch. Mặt khác,
T.harzianum còn được kết hợp với polysporum trong việc sản xuất Binabt - chế phẩm
được dùng trong chữa trị các vết thương bị nhiễm trùng và thối rữa ở rễ.

11


Backman, Redriguer - Kaban (1975) sử dụng bào tử nấm T.harzianum ngăn chặn
bệnh do nấm Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia, Pythium sp. ,bảo vệ cây họ đậu và củ cải

tránh được bệnh chết ẻo. Theo Emxep V.T (1989) nấm Trichoderma không chỉ tiêu
diệt nhiều loài nấm gây bệnh cây trồng trong đất mà còn có tác dụng cải thiện cấu trúc
và thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển của các vi khuẩn nốt sần cố
định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây trồng. Một số
chủng nấm T.harzianum còn có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống
chịu bệnh của cây trồng.
2.2.2.2. Cải thiện năng suất cây trồng [7, 26]
Cũng như thuốc trừ sâu, phân bón hóa học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị thoái
hóa, chai sạn, làm các loài giun đất không thể phát triển được, hạn chế sự phát triển
của đất, độ thông khí cần thiết cho rễ cây cũng thiếu hụt. Vì vậy các nước có nền nông
nghiệp phát triển trên thế giới có khuynh hướng sử dụng các phân bón hữu cơ sinh
học thế hệ mới, thực chất là một sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu
sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học. Các loại phân bón hữu cơ vi sinh này có
tác dụng sau:
Phòng ngừa các nấm gây bệnh thối mốc, héo rũ… và hạn chế các tác hại nguy hiểm
do các nấm gây mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme của các nấm gây bệnh, đồng
thời bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng đục phá thân.
Phân giải từ từ cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường dinh
dưỡng và kích thích cây sinh trưởng của cây.
Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa. Đã có nhiều
công trình khoa học chứng minh rằng T. harzianum và T. koningii kích thích sự nẩy
mầm và tăng trưởng của cây. Đối với các loài được trồng trong nhà kính, T.harzianum
đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng hoa.

12


Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo ra hệ rễ
cứng cáp hơn. Một nghiên cứu gần đây còn cho biết nếu bắp có T. harzianum T-22 hỗ
sinh ở rễ thì cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có T-22.

Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vật nốt
sần cố định nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trong đất,
bảo toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng.
Như vậy, các chủng nấm Trichoderma sp. trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh
không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế
các bệnh gây hại cây trồng và tạo được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự
nhiên.
2.2.2.3.Trong lĩnh vực xử lý môi trường [12]
T.harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng.
T.harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất tự do 2,4,6 –
Trichlorophenol ; 4,5 – dichloroguaiacol và cả AOX trong môi trường có chứa muối
khoáng. Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiacol tự do
trong môi trường khoáng mặn.
T.harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng trên ciliatin,
glycophosphate, và amino methylphosphonic ( 3-methoxyphenyl).
T.harzianum 2023 (khoa sinh lý thực vật trường Đại học California) có thể phân giải
DDT , endosulfan, pentachloronitrophenol và pentachlorophenol.
T.harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24 giờ,
đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong đất và trong
đầm lầy.

13


2.2.2.4. Trong các lĩnh vực khác [14, 28 ]
Trichoderma sp. là nguồn sản xuất hiệu quả các hệ enzyme cellulase ngoại bào. Các
enzyme này được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp dệt, do chúng có thể làm cho
vải bông mềm và trắng hơn.
L.Grange và cộng sự đã biểu hiện gen - xylanase ( XYN 2) của T.reesei ở
Saccharomyces cerevisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm, tăng khả năng tiêu hóa

hemicellululose trong lúa mạch và các cây lương thực khác.
2.3 . Tổng quan về Chitin
2.3.1. Lịch sử nghiên cứu Chitin [11]
Năm 1811 Chitin được mô tả lần đầu tiên bởi Braconnot. Trong quá trình nghiên cứu
trên một loài nấm Agaricus volvaceus và một vài loài nấm khác với dung dịch kiềm ,
ông thu được sản phẩm và đặt tên là Chitin (Chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp là
“tunnic” nghĩa là lớp vỏ bọc).
Hai năm sau Odier bắt đầu chú ý đến bản chất, cấu trúc của Chitin. Năm 1843
Lassaige chứng minh rằng trong Chitin có mặt của Nitrogen.
2.3.2. Sự tồn tại của Chitin trong tự nhiên [8, 27]
Chitin là một Polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một Polyme sinh học được
tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng Chitin được sản xuất hàng năm trên thế
giới chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm /1m2 bề
mặt trái đất. Trong tự nhiên Chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật.
Trong giới động vật, Chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ của một
số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn.
Trong giới thực vật, Chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae .

14


Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được
nối với nhau bằng các mối nối hydro và tạo thành một hệ thống sợi. Trong tự nhiên,
Chitin hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do mà gần như luôn luôn liên kết dưới dạng
phức hợp Chitin- protein. Điều này dẫn đến sự đề kháng với các hóa chất và các men
thủy phân gây nhiều khó khăn cho việc chiết tách, tinh chế chúng. Tùy thuộc vào các
đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài có thể
thấy sự thay đổi về lượng và chất của Chitin.
Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, Ghẹ Ghẹ, mai mực, hàm lượng
Chitin chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, Ghẹ, Ghẹ,

mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất Chitin – Chitosan và các sản phẩm từ
chúng.
Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau :

`

Dán

35%

Bọ cánh cứng

37%

Nhện

38%

Bò cạp

30%

Sâu

20-38%

Nấm

5-20%

Tôm

33%

Ghẹ/ Ghẹ

70%

Mực

3-20%

15


2.3.3. Cấu trúc phân tử và tính chất của Chitin


Cấu trúc phân tử: [25, 29]

Qua nghiên cứu về sự thủy phân Chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì người ta
thấy rằng Chitin là một Polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-(-DGlucosamin liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 glucoside).

Hình 2.6. Cấu trúc Chitin

Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ , sự khác nhau này thể hiện ở sự
sắp xếp các chuỗi . Ở chuỗi α – Chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau. Tuy
nhiên, chúng có một cặp xếp cùng chiều. Ở chuỗi β – Chitin các chuỗi sắp xếp theo
một chiều nhất định, còn ở chuỗi γ – Chitin có các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với
một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc.

16


Hình 2.7. Cấu trúc không gian của Chitin


Tính chất của Chitin [8 ]

Chitin ở thể rắn có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch.
Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trong cồn và trong
các dung môi thông thường. Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đặc ( HCl,
H2SO4, H3PO4…)
Khi đun nóng trong môi trường kiềm đặc, Chitin bị khử gốc acetyl tạo thành Chitosan.
Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại ở bước sóng 884- 890 nm

17