Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số lactovacillus SPP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TRONG KHOANG MIỆNG
CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ TẠO MÀNG SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ Lactobacillus spp.

Ngành

: Công nghệ sinh học

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương
TS. Nguyễn Hoàng Dũng
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Tuấn Anh

MSSV: 1311100148 - Lớp: 13DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài:

Nguyễn Tuấn Anh

Sinh viên trường:

Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh

Khoa:

Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường

Ngành:

Công nghệ sinh học

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Lớp:

13DSH02

MSSV:

1311100148

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng
dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương và TS. Nguyễn Hoàng Dũng, thực hiện tại Viện
Sinh học Nhiệt đới và phòng thí nghiệm lầu 7 trường Đại học Công nghệ Thành phố

Hồ Chí Minh. Những số liệu và kết quả phân tính trong đề tài này hoàn toàn trung
thực, không sao chép từ bất kỳ nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình
thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu
trích dẫn được công bố công khai trên các bài báo khoa học, website, tác phẩm theo
danh mục tài liệu tham khảo của đồ án.
Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo này, người thực
hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ sinh học – Thực
phẩm – Môi trường và trươc ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ
Chí Minh.
Ngày … tháng … năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tuấn Anh

i


Đồ án tốt nghiệp
LỜI CÁM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải
không ít lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của
TS. Nguyễn Hoài Hương, cùng những kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy
mà em có thể hoàn thành được tốt đồ án tốt nghiệp lần này. Từ tận đáy con tim, em
xin chân thành cám ơn cô Hoài Hương.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Dũng đã mở
lòng nhận hướng dẫn em thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nhiệt đới
(VSHND). Đây là một cơ hội cực kỳ quý báu mà thầy đã dành cho em, em xin cám
ơn thầy Dũng rất nhiều.
Ngoài ra, trên VSHND em còn nhận không ít sự giúp đỡ từ Thạc sĩ Lê Quỳnh
Loan . Suốt thời gian làm việc và nghiên cứu tại VSHND, chị là người luôn bên cạnh

và nhắc nhở em rất nhiều những điều cần thiết khi thực hiện các thí nghiệm nghiên
cứu. Em xin cám ơn chị Loan.
Ngoài ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người
đã bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt
nghiệp.
Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới toàn thể quý thầy quý cô đang giảng
dạy, nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt Đới cũng như tại Đại học thành phố Hồ Chí
Minh, thật dồi dào sức khỏe, để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền
đạt kiến thức cho thế hệ mai sau.
TP.HCM, ngày … tháng … năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tuấn Anh

ii


Đồ án tốt nghiệp
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................... i
LỜI CÁM ƠN.................................................................................................... ii
MỤC LỤC ...................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ..................................................................... vii
MỞ ĐẦU

......................................................................................................10

CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN .............................................................................14

1.1.

SÂU RĂNG .......................................................................................14

1.1.1. Bệnh học ........................................................................................14
1.1.2. Men răng ........................................................................................20
1.2.

VI KHUẨN RĂNG MIỆNG .............................................................27

1.2.1. Streptococcus spp. ..........................................................................27
1.2.2. Lactobacillus spp............................................................................29
1.2.3. Vi khuẩn lactic ...............................................................................35
1.3.

MÀNG SINH HỌC ...........................................................................36

1.3.1. Sự hình thành .................................................................................36
1.3.2. Thành phần .....................................................................................38
1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành màng sinh học ..........40
1.3.4. Tính chất của màng sinh học .........................................................42
1.3.5. Phân bố ...........................................................................................43
1.3.6. Giả thuyết về cơ chế bảo vệ răng miệng của probiotic và LAB nói
chung
........................................................................................................45
1.4.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ............................................................47

1.4.1. Ngoài nước .....................................................................................47

1.4.2. Trong nước .....................................................................................50
CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ....................51
2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu .....................................................51

2.2.

Vật liệu nghiên cứu ...........................................................................51

iii


Đồ án tốt nghiệp
2.2.1. Dụng cụ và thiết bị .........................................................................51
2.2.2. Giống vi khuẩn ...............................................................................51
2.2.3. Hóa chất .........................................................................................51
2.2.4. Các phần mềm sử dụng ..................................................................54
2.3.

Phương pháp nghiên cứu ...................................................................55

2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ...........................................................................55
2.3.2. Thu mẫu .........................................................................................56
2.3.3. Tăng sinh ........................................................................................58
2.3.4. Chọn lọc vi khuẩn lactic.................................................................59
2.3.5. Bảo quản ........................................................................................59
2.3.6. Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh ...........59
2.3.7. Định danh các chủng BG ...............................................................60
2.3.8. Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của NBG ......................64

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .........................................................65
3.1.

Tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu............................65

3.2.

Phân lập vi khuẩn Lactic ...................................................................65

3.3.

Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh ...............67

3.4.

Định danh ..........................................................................................71

3.4.1. Ly trích, thu nhận DNA .................................................................71
3.4.2. Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR ........................................71
3.4.3. Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI.
........................................................................................................72
3.5. Khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn
NBG đối với L. fermentum ....................................................................................76
CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN .................................................................................82
4.1.

Kết luận .............................................................................................82

4.2.

Kiến nghị ...........................................................................................83

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................84
PHỤ LỤC BẢNG ...............................................................................................1
PHỤ LỤC HÌNH ẢNH ......................................................................................7

iv


Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
EPS

Extracellular polymeric substance

DT

Decayed teeth

FT

Filled teeth

MT

Missing teeth

DFMT

Decayed teeth, filled teeth, and missing teeths

HA

Hydroxyapatite

LBS

Lactobacillus Selection medium

LAB

Lactic acid batería

MRS

deMan, Rogosa and Sharpe

LBM

Lactobacillus biofilm medium

OD600

Opical density at 600 nm

BG

Biofilm group

NBG

Non-biofilm group

v


Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Lactobacillus spp. phân lập được từ người lớn mắc bệnh sâu răng
...................................................................................................................................33
Bảng 1.2. Lactobacillus spp. phân lập được từ trẻ em 4-7 tuổi mắc bệnh sâu
răng ............................................................................................................................34
Bảng 1.3. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc
bảo vệ răng miệng . ...................................................................................................48
Bảng 2.1. Thành phần môi trường LBS (g/l) ...................................................52
Bảng 2.2. Thành phần môi trường MRS (g/l) ..................................................52
Bảng 2.3. Thành phần môi trường tạo màng sinh học của Lactobacillus spp. –
Lactobacillus biofilm medium (LBM) ......................................................................52
Bảng 2.4. Thành phần môi trường thử khả năng lên men các nguồn
carbohydrates khác nhau (g/l) ...................................................................................53
Bảng 2.5. Mô tả các nghiệm thức (NT) trong thí nghiệm khảo sát khả năng ức
chế sự hình thành màng sinh học ..............................................................................64
Bảng 3.1. Thông kê khảo sát tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu .
...................................................................................................................................65
Bảng 3.2. Danh sách các chủng vi khuẩn lactic phân lập được và hình thái tế
bào của chúng ............................................................................................................66
Bảng 3.3. Kết quả định lượng khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi
khuẩn lactic ...............................................................................................................69
Bảng 3.5. So sánh kết quả thử khả năng lên men các nguồn carbonhydrates khác
nhau của 3 chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số loài Lactobacillus có trong kết quả

hiển thị khi so sánh DNA trên ngân hàng gen NCBI. ...............................................75
Bảng 3.4. So sánh độ tương đồng DNA của 3 chủng L. fermentum 1B, 12R2 và
30B2 (%) ...................................................................................................................76

vi


Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng ...............15
Hình 1.2. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng ....................16
Hình 1.3. Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng .................................17
Hình 1.4. Cấu trúc của răng người ...........................................................................20
Hình 1.5. Các cấp kết cấu của men răng ..................................................................21
Hình 1.6. Mô phỏng cột tinh thể HA ........................................................................22
Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc lục giác của HA khi nhìn dọc theo hướng trục C. ............22
Hình 1.8. Hình chụp cột tinh thể dưới kính hiển vi điện tử [37] ..............................23
Hình 1.9. Hình vẽ mô tả hướng phát triển của các rod ............................................24
Hình 1.10. Mặt cắt dọc men răng .............................................................................24
Hình 1.11. Mô tả sự hình thành lỗ khóa bởi Rod và Interrod ..................................25
Hình 1.12. Các giai đoạn cột tinh thể HA bị bào mòn bởi acid A: cột tinh thể bình
thường; B: giai đoạn đầu sự ăn mòn: C: bị ăn mòn hoàn toàn..................................26
Hình 1.13. Cơ chế bảo vệ răng của các ion F- ..........................................................26
Hình 1.14. Một số kiểu hình thái của Lactobacillus spp.. ........................................30
Hình 1.15. Tỷ lệ các Lactobacillus spp. phân lập được trong miệng của trẻ bị sâu răng
và của người mẹ. .......................................................................................................34
Hình 1.16. Sự thay đổi về cấu trúc của màng sinh học khi bước qua giai đoạn phát
tán. .............................................................................................................................37
Hình 1.17. Các giai đoạn hình thành màng sinh học. ...............................................38
Hình 1.18. Mô tả mạng lưới EPS ngoại bào và các lực tương tác giữa các

polysaccharides. ........................................................................................................39
Hình 1.19. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành
dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử ............................40
Hình 1.20. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng sinh
học .............................................................................................................................44

vii


Đồ án tốt nghiệp
Hình 1.21. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong
hồ nước nóng Mickey, Oregon .................................................................................44
Hình 1.22. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang
miệng .........................................................................................................................47
Hình 2.1. Mô tả phương pháp thu mẫu nước bọt .....................................................57
Hình 2.2. Một số vị trí lấy mẫu mảng bám răng. .....................................................58
Hình 2.3. Dùng lực chảy của dịch môi trường để tác động lên màng sinh học. ......60
Hình 2.4. Mô tả giai đoạn loại bỏ protein và tủa DNA ............................................62
Hình 2.5. Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA ........................................................63
Hình 3.1. Hình thái tế bào của một số chủng trong nhóm vi khuẩn lactic phân lập
được dưới vật kính 100x. ..........................................................................................67
Hình 3.2. Mật độ màng sinh học hình thành dưới đáy giếng của của 3 chủng 1Ba,
12R2a, 30B2b nhiều hơn so với chủng 21B2i ............................................................68
Hình 3.3. Các ống giống khảo sát khả năng hình thành màng sinh học sau 24 giờ ủ:
...................................................................................................................................70
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn. Nhìn
vệt màu kéo dài cho thấy hệ DNA của vi khuẩn đã bị gãy thành rất nhiều đoạn có
kích thước khác nhau. ...............................................................................................71
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn cho 1 vệt DNA đơn và
rõ hơn hẳn kết quả điện di sản phẩm tách DNA. ......................................................72

Hình 3.6. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA của
chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số các chủng khác trên ngân hàng gen NCBI. ...73
Hình 3.7. Hình thái tế bào của các chủng 1B, 12R2, 30B2 và L. fermentum YB5 .74
Hình 3.8. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 1B. 78
Hình 3.9. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 12R2
...................................................................................................................................78
Hình 3.10. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 30B2
...................................................................................................................................79

viii


Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.11. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên C.albicans.........79
Hình 3.12. Kết quả so sánh khả năng tạo màng sinh học của một số chủng NBG và
BG ở thí nghiệm chọn lọc vi khuẩn lactic có khả năng tạo màng sinh học. .............80
Hình 3.13. Tổng hợp khả năng kháng sự tạo thành màng sinh học của các chủng
NBG. .........................................................................................................................81

ix


Đồ án tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh sâu răng là bệnh khá phổ biến, gây hậu quả ở nhiều mức độ về sức khoẻ
răng miệng và sức khoẻ chung. Bệnh sâu răng được Tổ chức Y tế Thế giới (World
Health Organization) xếp vào loại tai họa thứ ba của loài người sau bệnh ung thư và
tim mạch. Tháng 5 năm 2007, tại hội nghị sức khỏe răng miệng thế giới lần thứ 60,
các nước thành viên của Tổ chức Y tế Thế giới đã thông qua nghị quyết, đưa xúc tiến

và phòng ngừa bệnh sâu răng vào quy hoạch phòng ngừa và điều trị tổng hợp bệnh
mãn tính. Hiện nay, sức khỏe răng miệng là một trong 10 tiêu chuẩn lớn về sức khỏe
theo xác định của Tổ chức Y tế Thế giới [1]. Vì vậy, việc chăm sóc, dự phòng bệnh
sâu răng là một vấn đề lớn được chính phủ các nước quan tâm.
Mối quan hệ giữa Lactobacillus spp. và sâu răng đã được xác định hơn một thế
kỷ qua. Một số nhà khoa học cũng đã khảo sát và nhận thấy rằng mật độ Lactobacillus
spp. trong khoan miệng sẽ tăng lên sau giai đoạn đầu của bệnh sâu răng [2]. Sigurjons
và cộng sự xác định được tỷ lệ Lactobacillus spp. trong mảng bám răng miệng chiếm
tới 62% [3]. Beighton và cộng sự cũng đã tiến hành một cuộc khảo sát răng miệng ở
trẻ từ 3 - 4 tuổi, kết quả là tỷ lệ phân lập được Lactobacillus spp. trong trẻ sâu răng
là 54%, trong khi ở trẻ không sâu răng chỉ chiếm 7% [4]. Ngoài ra Matee và cộng sự
cũng đã nhận định trong kết quả nghiên cứu của họ rằng tỷ lệ Lactobacillus spp. trong
miệng trẻ sâu răng cao gấp 100 lần trẻ không sâu răng [5]. Chủ yếu L. fermentum là
loài chiếm đa số trong miệng của trẻ lẫn người lớn đang bị sâu răng [6] [7].
Mảng bám răng là một màng sinh học hình thành trong miệng, bao gồm nhiều
loài vi sinh vật khác nhau và gắn kết với nhau bởi mạng lưới polysacchrides không
tan. Vì khả năng tạo màng sinh học là một yếu tố chính quyết định sự hình thành
mảng bám răng, nên các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu tìm ra các mối liên hệ giữa
Lactobacillus spp. và sự hình thành mảng bám răng miệng. Wilcox và cộng sự đã
phát hiện ra được 2/4 chủng L. salivarius và 2/3 chủng L. fermentum của họ có khả
năng gắn kết màng sinh học với S. salivarius, S. gordonii, S. crista, S. sanguis (một

10


Đồ án tốt nghiệp
số loài trong chi Streptococcus có khả năng gây sâu răng) [8]. Filoche và cộng sự
cũng đã phát hiện ra rằng, khả năng hình thành màng sinh học của các Lactobacillus
spp. khi nuôi cấy đơn lẻ thì rất thấp, nhưng khi đồng nuôi cấy với một số loài
Actinomyces thì lại tăng gấp 4 – 20 lần [9].

Năm 2001, Tổ chức lương nông thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO)
đã đưa ra định nghĩa cho probiotic: “Probiotic những vi sinh vật còn sống khi đưa
vào cơ thể một lượng vừa đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ”. Hầu hết các vi
khuẩn probiotic thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium, chúng đã được ứng dụng
trong gần 1 thế kỷ qua [10]. Trong những năm gần đây, ứng dụng vi khuẩn probiotic
vào công cuộc chống sâu răng đang rất được chú trọng. Một số các thử nghiệm lâm
sàng trên động vật đã khẳng định được khả năng bảo vệ răng miệng của probiotic
[11]. Các phương thức bảo vệ răng miệng của probiotic được giả định bởi: khả năng
tiết bacteriocin, cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh diện tích sống. Nhưng bản
chất đối kháng thực sự với các vi khuẩn gây hại trong khoan miệng của probiotic vẫn
chưa được thấu hiểu.
Để góp phần tìm ra các chủng vi khuẩn tìềm năng mới có thể ứng dụng để phòng
ngừa bệnh sâu răng, đồng thời khảo sát khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn chi
Lactobacillus, nhóm thực hiện đồ án sẽ bước đầu phân lập một số vi khuẩn lactic
trong khoang miệng có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các
Lactobacillus spp. có trong mảng bám răng miệng.
2. Tình hình nghiên cứu
Nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác động
của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi vi
khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ có khả năng tồn tại một thời gian
nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng
probiotic có khả năng này [12], khiến cho việc ứng dụng vi khuẩn lactic nói chung
và probiotic nói riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn.

11


Đồ án tốt nghiệp
Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei có trong
sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans

trong nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần
sử dụng [13]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên
men pho – mát, LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 có trong pho – mát có thể
giảm được tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ [14].
Tại Việt Nam, hiện tại chỉ có duy nhất TS. Nguyễn Thị Mai Phương (Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam) là đang tập trung nghiên cứu về
vấn đề bảo vệ răng miệng, nhưng chủ yếu là các hợp chất thứ cấp ức chế
Streptococcus mutans như: Alpha-mangostin ức chế sự hình thành biofilm của vi
khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans UA159; Ethyl acetate extract from
(Rhodomyrtus tomentosa (Aliton) Hassk) leaves inhibits acid production and biofilm
formation by Streptcocccus mutans; H2O2 inhibits NADH oxidase activity purified
from streptococcus mutans,... [15] [16].
3. Mục đích nghiên cứu
Phân lập các vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự hình
màng sinh học của Lactobacillus spp.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Khảo sát mức độ sâu răng ở một nhóm đối tượng

-

Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng

-

Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn lactic trong răng miệng

-

Chọn ra các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh có khả năng là tác nhân
gây sâu răng. Định danh các chủng, chọn ra chi Lactobacillus.

-

Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic lên các
Lactobacillus spp. phân lập được
5. Phương pháp nghiên cứu

-

Thu mẫu răng miệng của 30 đối tượng từ 11 hộ gia đình. Bên cạnh đó ghi nhận
tình trạng răng miệng của các đối tượng.

12


Đồ án tốt nghiệp
Phân lập vi khuẩn lactic trên môi trường LBS thông qua việc quan sát hình thái tế

-

bào, khuẩn lạc, các thử nghiệm sinh lý (khả năng di động, khả năng sinh bào tử)
và các thử nghiệm sinh hóa (catalase).
Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương

-

pháp nuôi cấy trên đĩa 96 giếng, từ đó phân loại nhóm vi khuẩn lactic có khả năng
tạo màng sinh học mạnh để chọn làm tác nhân gây sâu răng.

Tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn lactic nghi ngờ có khả năng gây sâu răng,

-

thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R.
-

Gửi mẫu giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa

-

Dựa vào hình thái kết hợp với kết quả thử nghiệm sinh hóa trước đó để định danh
chính xác các chủng này.
Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của

-

Lactobacillus spp. được thực hiện bằng phương pháp đồng nuôi cấy vi khuẩn lactic
và Lactobacillus spp. trong môi trường LBM trên đĩa giếng 96. Màng sinh học
trong các giếng sẽ được nhuộm bằng Crystal violet, và định lượng bằng phương
pháp đo mức độ hấp thụ màu tím ở bước sóng 570 nm.
6. Các kết quả đạt được
-

Từ 60 mẫu thu răng miệng đã chọn lọc ra được 30 chủng vi khuẩn lactic.

-

Chọn lọc được 3 chủng lactic có khả năng tạo màng sinh học mạnh.

-

Kết quả định danh 3 chủng 1B, 12R2, 30B2 đều thuộc loài L. fermentum.

-

Chọn ra được 11 chủng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế ít nhất 1 trong 4 vi
khuẩn gây sâu răng được khảo sát (3 chủng L. fermentum phân lập được và nấm
Candida albicans)
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị

13


Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
SÂU RĂNG

1.1.
1.1.1.

Bệnh học

1.1.1.1. Định nghĩa
Sâu răng là hiện tượng các tổ chức cứng của răng (men, ngà và cement) bị tổn

thương, đặc trưng bởi sự khử khoáng ở men răng, ngà răng tạo thành các lỗ sâu và
không hoàn nguyên được. Có nhiều định nghĩa về bệnh sâu răng, dựa trên những
nghiên cứu và nhận xét khác nhau về nguyên nhân cũng như tiến trình của bệnh, sâu
răng có thể được định nghĩa như sau:
-

Bệnh sâu răng là một quá trình động, diễn ra trong mảng bám vi khuẩn dính trên
mặt răng, đưa đến mất cân bằng giữa mô răng với chất dịch xung quanh và theo
thời gian, hậu quả là sự mất khoáng của mô răng [17].

-

Là bệnh nhiễm trùng của mô răng biểu hiện đặc trưng bởi các giai đoạn mất và
tái khoáng xen kẽ nhau [18].
1.1.1.2. Lịch sử
Sâu răng là một bệnh phổ biến trên toàn thế giới, xảy ra ở mọi lứa tuổi, giới tính,

dân tộc. Bệnh đã có từ rất lâu đời, nhưng chỉ thực sự nghiêm trọng khi đồ ngọt trở
thành thứ không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người. Trong các bệnh thường
gặp ở trẻ em, sâu răng đứng thứ hai sau bệnh hen suyễn [19]. Suốt một thể kỷ qua
người ta tin rằng mọi quần xã vi sinh vật có trong miệng đều có thể gây sâu răng và
việc chữa trị duy nhất đó là đánh răng – loại bỏ các mảng bám vi khuẩn.
Trong thế chiến thức I, II và chiến tranh Triều Tiên, lý do bị từ chối đi nghĩa vụ
quân sự nhiều nhất đó là sâu răng. Cuối thế kỷ 19, với dự đoán : nếu một người sống
đủ lâu thì sau này chắc chắn sẽ không còn răng, người ta đã phân ra nhánh mới riêng
biệt trong nền y học lúc bấy giờ - nha khoa, với mức đầu tư 34 tỷ đô la (năm 1990).
Tới những năm cuối thế kỷ 20 thì bệnh sâu răng có thể kiểm soát và phòng ngừa. Gần
50% trẻ nhỏ không bị sâu răng và tỷ lệ súng răng ở người cao tuổi giảm từ 50% xuống
còn 20% [20].

14


Đồ án tốt nghiệp
Dù không nguy hiểm đến tính mạng nhưng sự khó chịu khi sâu răng và chi phí
cho việc chữa trị/phòng ngừa là không hề nhỏ (đứng thứ 3 sau tim mạch và ung thư).
1.1.1.3. Dấu hiệu và triệu chứng
Dấu hiệu sớm nhất của bệnh là sự xuất hiện các đốm phấn trắng trên bề mặt
răng, đây là vùng men răng đang bị khử khoáng [21]. Khi các thương tổn tiếp tục diễn
ra thì lúc này vùng men sẽ chuyển sang màu nâu và bắt đầu lõm xuống, gọi là lỗ sâu.
Ở giai đoạn đốm trắng, men răng vẫn có thể tái khoáng hóa bởi các ion Ca2+ có trong
nước bọt. Ở giai đoạn hình thành lỗ sâu thì men răng hoàn toàn không có khả năng
tái khoáng hóa nhưng quá trình khử khoáng vẫn có thể bị dừng lại [22].

Hình 1.1. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng
Khi cả men răng và ngà răng đồng thời bị khử khoáng thì lỗ sâu càng dễ nhìn
thấy bằng mắt thường, và không cứng chắc như trước. Lúc này tủy răng và mạch máu
có thể bị hở ra, chịu tác động bởi lực bên ngoài nhiều hơn, dẫn đến các cảm giác đau
nhói khi nhai hoặc tiếp xúc với đồ ăn nóng/lạnh và kể cả ngọt.

15


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Giai đoạn tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng.
Răng sâu còn là một trong những nguyên nhân gây hôi miệng. Trường hợp xấu
hơn là nhiễm trùng lan sang vùng mô mềm (nướu). Biến chứng có thể xảy ra là nghẽn
mạch hang xoang, viêm họng Ludwig, … đe dọa đến tính mạng của người bệnh.
1.1.1.4. Nguyên nhân

Cần có bốn yếu tố chính đồng thời xuất hiện để gây nên triệu chứng sâu răng:
men răng hoặc ngà răng, vi khuẩn gây sâu răng, nguồn carbohydrates (thường là
sucrose) và thời gian [23]. Mức độ sâu răng thì lại phụ thuộc vào hình dáng của răng,
thói quen vệ sinh răng miệng, thành phần nước bọt, … Sự sâu răng có thể xảy ra ở
bất kỳ nơi nào trên răng. Sâu răng là do sự xuất hiện và phát triển của mảng bám
(màng sinh học) trên răng. Các vi khuẩn trong mảng bám sinh acid khi có sự hiện
diện của các nguồn carbohydrates khác nhau như sucrose, fructose và glucose.

16


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng
1.1.1.4.1. Vi khuẩn
Khoang miệng của người chứa vô số vi khuẩn, nhưng chỉ một số ít trong đó có
khả năng gây sâu răng, đáng nói đến nhất là Streptococcus mutans, Streptococcus
sobrinus và một số loài trong chi Lactobacillus.
Đặc tính để quyết định rằng vi khuẩn có khả năng gây sâu răng hay không bao
gồm: khả năng tạo nên màng sinh học trên bề mặt răng, sinh ra một lượng acid lactic
cao khi lên men đường, khả năng sinh trưởng trong môi trường pH thấp [24].
Những vi khuẩn này đa số đều có mặt trong mảng bám răng miệng, nhưng chỉ
với mật độ rất thấp, chưa đủ để gây nên sự khử khoáng men răng. Nhưng nếu không
trực tiếp vệ sinh mảng bám thường xuyên hoặc lượng đường trong miệng liên tục cao,
thì sẽ diễn ra sự mất cân bằng mật độ vi khuẩn trong mảng bám. Lúc này mật độ của
những vi khuẩn gây sâu răng sẽ tăng cao, dẫn đến sự mất cân bằng pH trong khoang
miệng và gây sâu răng. Mảng bám thường hình thành ở những nơi chịu ít tác động
của quá trình nhai nghiền thức ăn và vệ sinh răng miệng.
Những vi khuẩn gây sâu răng, thường lây từ người lớn sang trẻ nhỏ thông qua
việc bú sữa mẹ, hành động móm ăn và hôn của người chăm sóc trẻ [25].

17


Đồ án tốt nghiệp
1.1.1.4.2. Nguồn carbohydrates
Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose, fructose và nhất là sucrose
(đường ăn) thành acid (thường là acid lactic). Khi acid tiếp xúc với răng sẽ diễn ra
quá trình khử khoáng, gây sâu răng. Dù vậy nhưng acid sinh ra bởi quá trình lên men
đường của vi khuẩn có thể bị trung hòa bởi nước bọt hoặc nước súc miệng.
Đối với môi trường có 2 nguồn đường glucose và fructose thì khả năng gây sâu
răng không cao so với môi trường chỉ có một nguồn đường sucrose. Dù rằng sucrose
là đường đôi được cấu thành từ 1 đơn vị đường đơn glucose và fructose. Lý do là vì
vi khuẩn gây sâu răng cần sử dụng năng lượng của liên kết saccharide giữ glucose và
fructose trong phân tử sucrose để tạo ra một hợp chất kết dính dextran polysaccharide
bởi enzyme dextransucranase.
n sucrose  (glucose)n + n fructose
1.1.1.4.3. Thời gian
Thời gian răng bị phơi nhiễm trong môi trường acid sẽ quyết định sự sâu răng.
Sau những bữa ăn, vi khuẩn sẽ bắt đầu lên men đường và sinh acid làm giảm pH.
Trong khoảng thời gian nước bọt có thể trung hòa lại pH môi trường trong khoang
miệng, thì một lượng khoáng trên men răng đã bị trung hòa. Vì thế sự khử khoáng
gây sâu răng phụ thuộc khá nhiều vào tần suất phơi nhiễm trong môi trường pH thấp.
1.1.1.4.4. Răng
Hàm lượng khoáng chiếm đến 96% trong men răng. Sự khử khoáng bắt đầu xảy
ra khi pH môi trường đạt 5.5 [26]. Ngà và lớp cementum dễ bị tổn thương hơn vì
chúng có hàm lượng khoáng thấp hơn men răng [27].
Có một số bệnh rối loạn ở răng nhất định ảnh hưởng đến mức độ gây sâu răng
của cá thể. Bệnh hụt khoáng răng ngày càng phổ biến [28]. Nguyên nhân có thể là do
yếu tố di truyền hoặc chế độ dinh dưỡng. Ngoài ra các trường hợp khác như nồng độ

dioxins, polychlorinated biphenyl (PCB) cao trong sữa mẹ; trẻ sinh non, thiếu oxy
trong lúc sinh; các rối loạn nhất định trong 3 năm đầu đời của trẻ như bệnh quai bị,
bạch hầu, sốt xuất huyết, sởi, suy giáp, suy dinh dưỡng,… cũng ảnh hưởng đáng kể

18


Đồ án tốt nghiệp
đến mật độ khoáng của răng [29] [30]. Nhưng dù sao rối loạn do bệnh tật cũng không
phải là nguyên chính gây sâu răng.
Trường hợp thức ăn bị mắc lại trong các lỗ sâu, chân răng, kẽ răng cũng là
nguyên nhân dẫn đến gây sâu răng.
1.1.1.4.5. Yếu tố khác
Khả năng tiết nước bọt thấp sẽ tăng mức độ sâu răng, do tốc độ trung hòa pH
trong môi trường khoang miệng diễn ra chậm.
Một số hiệu thuốc lá không khói chứa hàm lượng đường cao, làm tăng khả năng
gây sâu răng [31]. Việc hút thuốc có thể dẫn đến bệnh nha chu, khiến nướu co lại, để
hở chân răng và tạo khoảng trống thuận lợi cho sự hình thành mảng bám.
1.1.1.5. Điều trị
Nên kết hợp giữa đánh răng và dùng chỉ nha khoa thường xuyên để loại bỏ triệt
để mảng bám vi khuẩn. Khám răng định kỳ mỗi 6 tháng để chuẩn đoán trạng thái của
răng vì các dấu hiệu ban đầu của bệnh sâu răng rất khó nhận thấy. Hơn nữa chỉ có
nha sĩ mới có đầy đủ phương tiện và khả năng chuyên môn để chẩn đoán, điều trị và
đưa ra những lời khuyên cần thiết cho hàm răng của bạn. Nếu đợi đến khi răng đau
rồi mới đi gặp nha sĩ thì việc điều trị sẽ trở nên phức tạp hơn, có khi phải chữa tủy
răng, mỗ nướu răng hay phải nhổ răng vì đã quá muộn.
Phương pháp phủ Sealant cũng nên được cân nhắc đến. Phương pháp này
thường dành cho trẻ em và thanh thiếu niên, những chất liệu nha khoa phủ trên bề
mặt nhai của răng che phủ đi tâm tinh thể HA, hạn chế được quá trình khử khoáng.
Những nghiên cứu khoa học cho thấy ngoài việc Florua đóng vai trò ức chế sự

khử khoáng của acid lên men răng, với một nồng độ cao nhất định Florua còn có khả
năng diệt khuẩn [32]. Do vậy, Florua trong các sản phẩm răng miệng là một vũ khí
vô cùng lợi hại trong việc phòng ngừa sâu răng.
Chỉ nên đáp ứng nhu cầu năng lượng của cơ thể bằng những nguồn
carbohydrates có trong trái cây, rau đậu, ngũ cốc, tinh bột. Hạn chế tối đa dùng những
thực phẩm được chế biến từ sucrose (bánh kẹo, syrups, nước ngọt). Ngoài ra trái cây,

19


Đồ án tốt nghiệp
rau quả còn có nhiều chất sợi (fiber) tác động làm sạch răng. Bên cạnh đó có thể dùng
đường xylitol thay thế các loại đường ăn thông thường để tăng khẩu vị trong thực
phẩm, vì vi khuẩn không thể lên men được xylitol. Tránh những thức ăn dẻo, loại
thức ăn này rất dễ bám quanh răng, tạo điều kiện cực kỳ thuận lợi cho mảng bám vi
khuẩn phát triển.
Từ bỏ thói quen ăn ngọt giữa các bữa ăn. Ăn vặt sẽ làm tăng các khoảng thời
gian mà men răng phơi nhiễm trong môi trường có pH thấp.
Nếu phải uống soda, cam chanh thì nên dùng ống hút, tránh tráng điều trong
miệng (cam chanh có tính acid sẽ khử khoáng men răng). Nên súc miệng ngay sau ăn
ngọt hoặc dùng xong các loại nước uống có tính acid.
Trong những năm gần đây, ứng dụng vi khuẩn probiotic vào công cuộc chống
sâu răng cũng đang rất được chú trọng. Một số các thử nghiệm lâm sàng trên động
vật đã khẳng định được khả năng bảo vệ răng miệng của probiotic [11]. Hứa hẹn cho
một ứng dụng mới mẻ và đầy tiềm năng của probiotic.
1.1.2.

Men răng

Men răng là một trong bốn

vùng mô chính cấu tạo nên răng ở
người và nhiều động vật khác (các
vùng mô còn lại là ngà răng,
cementum và nướu răng). Men
răng có màu trắng, bao quanh toàn
bộ thân răng, là tổ chức cứng nhất
cơ thể do sự tạo khoáng hóa cao
độ. Men răng làm lớp bảo vệ vững
chắc cho răng, nhưng vẫn có thể
bị suy thoái bởi acid thì thức
ăn/nước uống.
Hình 1.4. Cấu trúc của răng người

20


Đồ án tốt nghiệp

1.1.2.1. Kết cấu

Hình 1.5. Các cấp kết cấu của men răng
1.1.2.1.1. Cột tinh thể hydroxyapatite
Hydroxyapatite (HA) là dạng khoáng chất tự nhiên của apatite canxi với công
thức hóa học là Ca5(PO4)3(OH), tuy vậy nhưng người ta thường viết dưới dạng
Ca10(PO4)6(OH)2. Ion OH- trong cấu trúc có thể thay thế bởi nguyên tử F-, Cl- hoặc
CO32-, tạo thành fluorapatite hoặc chlorapatite. HA có tầm quan trọng đáng kể vì
ngoài việc cấu tạo nên răng, chúng còn xuất hiện trong các mô khoáng hóa trong
khung xương động vật. Trong men răng người, HA chiếm 96% khối lượng, 4% còn
lại là chất hữu cơ [33].

21


Đồ án tốt nghiệp
HA kết tinh trong hệ tinh thể lục
giác

(hình

1.2).

Mỗi

tinh

thể

hydroxyapatite là một thành phần cơ
bản gồm 18 ion (hình 1.3), hình lục
giác dẹp cạnh 0,942 nm tạo góc 120o
và 60o, chiều cao (trục c) thẳng góc với
trục a và cao 0,688 nm, các đơn vị này
liên kết trồng lên nhau tạo thành cột
tinh thể hydroxyapatite [34] [35] [36].
Hình 1.6. Mô phỏng cột tinh thể HA

Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc lục giác của HA khi nhìn dọc theo hướng trục C.

22

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.8. Hình chụp cột tinh thể dưới kính hiển vi điện tử [37]
Khoảng trống nhỏ giữa những cột tinh thể là chất hữu cơ có chức năng liên kết.
Cột tinh thể HA là đơn vị nhỏ nhất của men răng, có độ lên tới 160 nm và rộng 1520 nm. Tâm lục giác của cột là nơi dễ bị acid ăn mòn. Mặt bên và mặt chóp cũng có
thể bị phân hủy [38].
1.1.2.1.2. Rod
Khoảng 100 cột tinh thể xếp sát nhau, kết tinh hướng dần về mặt men, tạo thành
một khối lăng trụ, gọi là một đơn vị Rod, đường kính khoảng 4-8 µm. Rod chạy khắp
vùng men, bắt đầu từ đường nối men ngà đến bề mặt của men. Các Rod bắt đầu phát
triển theo hướng vetor gần như vuông góc với mặt ngà, sau đó phát triển theo kiểu
lượn sóng đến gần bề mặt ngoài của men răng và lại đi thẳng một lần nữa cho đến hết
cho đến hết. Vì thế độ dài các rod lớn hơn rất nhiều so với độ dày men. Men răng
được hình thành bởi các Rod song song với nhau, 5 triệu ở răng cửa, 12 triệu ở răng
hàm [39].

23


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.9. Hình vẽ mô tả hướng phát triển của các rod
1.1.2.1.3. Interrod
Các cột tinh thể xếp sát nhau nhưng không tụ thành từng trụ như Rod, được xem
là vùng phân cách các rod ra, gọi là Interrod. Rod và Interrod tuy có cùng đơn vị cấu
thành nhưng hướng tâm trụ thì khác nhau (tức các tinh thể phát triển theo hướng khác
nhau), vì thế ở mặt cắt dọc bề mặt men răng ta dễ dàng thấy được sự phân cách giữa
vùng Rod và Interrod. Đồng thời sự phân cách này tạo nên hình như một lỗ khóa ở
mặt cắt men răng – gọi là lỗ khóa (keyhole). Mỗi cao keyhole cao khoảng 9µm.

Trong đó phần thân là Rod và đuôi là Interrod [39].

Hình 1.10. Mặt cắt dọc men răng

24