Phân lập vi khuẩn có khả năng phân huỷ cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN
HUỶ CELLULOSE TRONG MỤN DỪA VÀ VỎ
TIÊU

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
SVTH: NGÔ HOÀNG HUY
MSSV: 0851110095

Tp. Hồ Chí Minh, năm 2012


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

1.

Đặt vấn đề................................................................................................. 1

2.

Tình hình nghiên cứu ................................................................................ 2
2.1.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...................................................... 2

2.2.

Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................... 4

3.

Mục đích nghiên cứu ................................................................................ 5

4.

Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................ 5

5.

Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 5

6.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài....................................................................... 5

7.

Kết quả đạt được ....................................................................................... 6

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 7
1.1. Hiện trạng của vỏ tiêu và mụn dừa ............................................................ 7
1.1.1. Vỏ tiêu ............................................................................................... 7

1.1.2. Mụn dừa ............................................................................................. 8
1.2. Thành phần và tính chất hóa học của mụn dừa ........................................ 13
1.2.1. Lignin .............................................................................................. 14
1.2.2. Hemicellulose .................................................................................. 16
1.2.3. Tannin .............................................................................................. 18
1.2.4. Cellululose ....................................................................................... 19
1.2.4.1 .Giới thiệu ........................................................................................... 19

Trang i


Đồ án tốt nghiệp

1.2.4.2. Enzyme phân giải cellulose (enzyme cellulase) ................................... 22
1.2.4.3. Nguồn gốc enzyme cellulase ............................................................... 26
1.2.4.4. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase

............................................................................................................ 34

1.2.4.5. Ứng dụng của enzyme cellulase ........................................................... 36
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 40
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 40
2.1.1. Thời gian .......................................................................................... 40
2.1.2. Địa điểm .......................................................................................... 40
2.2. Vật liệu ................................................................................................... 40
2.2.1. Nguồn mẫu ....................................................................................... 40
2.2.2. Hóa chất ........................................................................................... 40
2.2.3. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................... 41
2.2.3.1. Dụng cụ ............................................................................................... 41

2.2.3.2. Thiết bị ................................................................................................ 42
2.2.4. Thiết kế thí nghiệm .......................................................................... 42
2.2.4.1. Mục tiêu .............................................................................................. 42
2.2.4.2. Thiết kế thí nghiệm.............................................................................. 43
2.2.5. Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm ........................................ 47
2.3. Tiến hành thí nghiệm .............................................................................. 49
2.3.1. Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong
mụn dừa và vỏ tiêu............................................................................................... 49
Trang ii


Đồ án tốt nghiệp

2.3.1.1. Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt ............................................ 49
2.3.1.2. Thí nghiệm: Sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật bằng
phương pháp đục lỗ thạch ........................................................................................... 51
2.3.1.3. Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên
môi trường thạch chứa CMC ...................................................................................... 52
2.3.2. Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân
lập

......................................................................................................... 53

2.3.2.1. Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa
thạch chứa CMC......................................................................................................... 53
2.3.2.2. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường
thạch có chứa giấy lọc ................................................................................................ 54
2.3.3. Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc tế bào, bào tử và phản ứng
sinh hóa vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase ................................................. 56
2.3.3.1. Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc,bào tử vi khuẩn phân lập có

hoạt tính cellulase ....................................................................................................... 56
2.3.3.2. Thí nghiệm: Khảo sát một số phản ứng sinh hóa các chủng phân lập có
hoạt tính cellulase ....................................................................................................... 58
2.3.4. Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có enzyme cellulase có
tiềm năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa ............................................................ 58
2.3.4.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme CMCase
và FPase

............................................................................................................ 58
a. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở các pH khác nhau ......................... 59
b. Thí nghiệm: Định tính hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở

các pH khác nhau bằng phương pháp đục lổ thạch......................................... 60
Trang iii


Đồ án tốt nghiệp

c. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở
các pH ........................................................................................................ 61
d. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở các
pH

........................................................................................................ 64
e. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng vi

khuẩn

........................................................................................................ 67

2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme
FPase của các chủng phân lập ..................................................................................... 68
a. Thí nghiệm: Chuẩn bị môi trường tăng sinh khảo sát ảnh hưởng của
oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập...
........................................................................................................ 68
b. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các giống ở 2
chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút .......................................................... 69
c. Thí nghiệm: Xác định hoạt tính enzyme FPase của các giống ở 2 chế
độ không lắc và lắc 150 vòng/phút ................................................................ 70
2.3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng sinh enzyme tannase của các chủng vi
khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút ............................................................................. 71
a. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở pH7 .............................................. 71
b. Thí nghiệm: Định tính hoạt tính enzyme tannase trên đĩa thạch chứa
tannic acid ở điều kiện pH7 và lắc 150 vòng/phút.......................................... 72
c. Thí nghiệm: Xác định hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi
khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút ................................................................ 74
Bảng 2.8: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm
khảo sát hoạt tính enzyme tannase .............................................................................. 75

Trang iv


Đồ án tốt nghiệp

d. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng chịu tannic acid của các chủng phân
lập ở các nồng độ khác nhau 1 %, 3 %, 5 %................................................... 75
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 78
3.1. Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn
dừa và vỏ tiêu ......................................................................................................... 78
3.1.1. Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt ........................................ 78

3.1.2. Sàng lọc mẫu tăng sinh quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ
thạch

......................................................................................................... 78
3.1.3. Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên

môi trường thạch chứa CMC ................................................................................ 80
3.2. Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập ...
......................................................................................................... 83
3.2.1. Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa
thạch chứa CMC .................................................................................................. 83
3.2.2. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường
thạch có chứa giấy lọc .......................................................................................... 85
3.3. Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử và phản ứng sinh
hóa vi khuẩn (hoặc xạ khuẩn) phân lập có hoạt tính cellulase .................................. 87
3.3.1. Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử vi khuẩn
phân lập có hoạt tính cellulase ............................................................................. 87
3.3.2. Thí nghiệm: Khảo sát một số phản ứng sinh hóa các chủng phân lập
có hoạt tính cellulase............................................................................................ 92
3.4. Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có enzyme cellulase có tiềm
năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa ....................................................................... 95
Trang v


Đồ án tốt nghiệp

3.4.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme
CMCase và FPase ................................................................................................ 95
3.4.1.1. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở các pH khác nhau ............................. 95
3.4.1.2 Thí nghiệm: Định tính (bán định lượng) hoạt tính enzyme CMCase của

các chủng ở các pH khác nhau trên đĩa thạch chứa CMC ............................................ 96
3.4.1.2. Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH ........ 103
3.4.1.3. Định lượng hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở các pH ............. 107
3.4.1.4. Khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng vi khuẩn .......... 111
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oxy đến hoạt tính enzyme CMCase
và enzyme FPase của các chủng phân lập .......................................................... 113
3.4.2.1. Chuẩn bị môi trường tăng sinh khảo sát ảnh hưởng của oxy đến hoạt
tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập............................... 114
3.4.1.2. Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các giống ở 2 chế độ không
lắc và lắc 150 vòng/phút ........................................................................................... 114
3.4.1.3. Xác định hoạt tính enzyme FPase của các giống ở 2 chế độ không lắc và
lắc 150 vòng/phút ..................................................................................................... 115
3.4.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở
pH7 và lắc 150 vòng/phút .................................................................................. 116
3.4.3.1. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở pH7 ................................................ 116
3.4.3.2. Định tính hoạt tính enzyme tannase trên đĩa thạch chứa tannic acid ở
điều kiện pH7 và lắc 150 vòng/phút.......................................................................... 116
3.4.3.3. Xác định hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc
150 vòng/phút .......................................................................................................... 118

Trang vi


Đồ án tốt nghiệp

3.4.3.4. Khảo sát khả năng chịu tannic acid của các chủng phân lập ở các nồng
độ khác nhau 1 %, 3 %, 5 % ..................................................................................... 119
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 123
4.1 Kết luận ................................................................................................ 123
4.2 Kiến nghị .............................................................................................. 124

Trang vii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Diện tích và sản lượng tiêu của vùng Đông Nam Bộ và Tây Nguyên………7
Bảng 1.2: Diện tích dừa ở tỉnh Bến Tre (ha)……………………………………………9
Bảng 1.3: Diện tích, năng suất và sản lượng dừa cả nước…………………………….10
Bảng 1.4: Sản lượng dừa (đơn vị 1.000 trái) của các nước trên thế giới.......................12
Bảng 1.5: Một số ứng dụng của mụn dừa......................................................................12
Bảng 1.6: Phân loại enzyme phân cắt β-1,4-glucan.......................................................24
Bảng 1.7: Enzyme cellulase nguồn gốc từ vi sinh vật...................................................27
Bảng 1.8: Danh sách một số vi khuẩn (kể cả xạ khuẩn) phân hủy cellulose và đặc điểm
của chúng.......................................................................................................................28
Bảng 2.1: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm dựng
đường chuẩn glucose trên cơ chất là CMC....................................................................62
Bảng 2.2: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo
sát hoạt tính enzyme CMCase theo pH………………………………......................63
Bảng 2.3: Thành phần môi trường hóa chất của thí nghiệm chuẩn bị dung dịch glucose
chuẩn..............................................................................................................................64

Trang viii


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.4: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm dựng

đường chuẩn glucose trên cơ chất giấy lọc....................................................................65
Bảng 2.5: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo
sát hoạt tính enzyme FPase ở các pH.............................................................................66
Bảng 2.6: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo
sát hoạt tính CMCase ở hai chế độ không lắc và lắc...................................................70
Bảng 2.7: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo
sát hoạt tính FPase..........................................................................................................71
Bảng 2.8: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo
sát hoạt tính enzyme tannase..........................................................................................75
Bảng

3.1:

Các

chủng

thu

được

từ

mẫu

mụn

dừa

ở

Cao

Lãnh................................................................................................................................81
Bảng 3.2: Các chủng thu được từ mẫu mụn dừa ở Lai Vung......................................82
Bảng 3.3: Các chủng thu được từ mẫu vỏ tiêu ở Bà rịa Vũng Tàu.............................82
Bảng 3.4: Hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC.........83
Bảng 3.5: Quan sát hình thái khuẩn lạc..........................................................................87
Bảng 3.6: Kết quả nhuộm gram và nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn phân lập...91
Bảng 3.7: Tổng kết kết quả phân lập và test sinh hóa các chủng...............................94

Trang ix


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.8: Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi
khuẩn BHM3 ở pH khác nhau.......................................................................................97
Bảng 3.9: Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi
khuẩn BHM4 ở pH khác nhau.......................................................................................97
Bảng 3.10 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi
khuẩn BHM5 ở pH khác nhau.......................................................................................98
Bảng 3.11 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi
khuẩn BHM8 ở pH khác nhau.......................................................................................99
Bảng 3.12 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi
khuẩn BHM10 ở pH khác nhau....................................................................................100

Trang x

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Các thành phần cấu tạo lignin thực vật…………………………..............15
Hình 1.2: Cấu trúc lignin…………………………........................................................16
Hình 1.3:Một số đường monomer cấu tạo hemicellulose………………………......17
Hình 1.4: Cấu trúc hemicellulose…………………………...........................................18
Hình 1.5: Cấu trúc tannic acid…………………………...............................................19
Hình 1.6: Cấu trúc của cacboxyl methyl cellulose (CMC) …………………….......21
Hình 1.7: Công thức cấu tạo của cellulose…………………………..........................22
Hình 1.8: Cơ chế cắt cơ chất cellulose của enzyme cellulase………………….......26
Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 1…………………………...........43
Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 2…………………………...........44
Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 3…………………………...........45
Hình 2.4: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 4…………………………...........46
Hình 2.5: Các mẫu mụn dừa thu thập…………………………..................................49
Hình 2.6: Sơ đồ tăng sinh vi sinh vật chịu nhiệt…………………………..................50

Trang xi


Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.7: Sơ đồ sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật phân huỷ cellulose
……………………….............…...................................................................................51
Hình 2.8: Sơ đồ

phân lập vi sinh

vật trên môi trường thạch chứa

…………………………...............................................................................................53
Hình 2.9: Sơ đồ khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng…………...........54
Hình 2.10: Sơ đồ tiến hành khảo sát khả năng mọc trên môi trường thạch có chứa giấy
lọc…………………………..........................................................................................55
Hình 2.11: Mẫu enzyme ở các pH sau khi lọc…………………………..................59
Hình 2.12: Sơ đồ chuẩn bị môi trường lỏng ở các pH khác nhau…………….......60
Hình 2.13: Sơ đồ định tính hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác
nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch………………………….................................61
Hình 2.14: Xác định hoạt tính enzyme CMCase………………………….............64
Hình 2.15: Xác định hoạt tính enzyme FPase…………………………...................67
Hình 2.16: Sơ đồ khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng phân lập..68
Hình 2.17: Chuẩn bị môi trường khảo sát hoạt tính enzyme ở hai chế độ lắc và không
lắc………………………….........................................................................................69
Hình 2.18: Sơ đồ định tính khả năng sinh enzyme tannase của các chủng…......73
Hình 2.19: Sơ đồ khảo sát khả năng tăng sinh khối của các chủng phân lập trong tannic
acid ở các nồng độ khác nhau………………………….............................................77

Trang xii


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.1: Sàng lọc quần thể vi sinh vật tăng sinh bằng phương pháp đục lỗ
thạch……………………………………………………………………………........80
Hình 3.2: Khả năng mọc khuẩn lạc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy
lọc………………………….........................................................................................86
Hình 3.3 :Hình thành sinh khối trong các mẫu môi trường tăng sinh…….............96
Hình 3.4 : So sánh kích thước vòng halo của các chủng ở bốn pH ……...............102

Hình 3.5 : So sánh kích thước vòng halo của các chủng ở pH7……......................102
Hình

3.6:

Ảnh

hưởng

của

pH

đến

hoạt

tính

CMCase

của

chủng

BHM3…………………..............................................................................................104
Hình

3.7:

Ảnh

hưởng

của

pH

đến

hoạt

tính

CMCase

của

chủng

BHM4…...........................................................................................…………….......104
Hình

3.8:

Ảnh

hưởng

của

pH

đến

hoạt

tính

CMCase

của

chủng

BHM5……………...........................................................................................……...105
Hình

3.9:

Ảnh

hưởng

của

pH

đến

hoạt

tính

CMCase

của

chủng

BHM8……………….................................................................................................105
Hình

3.10:

Ảnh

hưởng

của

pH

đến

hoạt

tính

CMCase

của

BHM10………………..............................................................................................106
Hình

3.11:

So

sánh

hoạt

tính

enzyme

CMCase

của

các

chủng

pH7………………...........................................................................................….....106

Trang xiii

ở


Đồ án tốt nghiệp

Hình

3.12:

Ảnh

hưởng

của

pH

đến

hoạt

tính

FPase

của

chủng

BHM3…………….......................................................................................……....108

Hình

3.13:

Ảnh

hưởng

của

pH

đến

hoạt

tính

FPase

của

chủng

BHM4………………...............................................................................................108
Hình

3.14:

Ảnh

hưởng

của

pH

đến

hoạt

tính

FPase

của

chủng

BHM5…………………...........................................................................................109
Hình

3.15:

Ảnh

hưởng

của

pH

đến

hoạt

tính

FPase

của

chủng

BHM8………………...............................................................................................109
Hình

3.16:

Ảnh

hưởng

của

pH

đến

hoạt

tính

FPase

của

chủng

BHM10…………….........................................................................................…....110
Hình

3.17:

So

sánh

hoạt

tính

enzyme

FPase

của

các

chủng

ở

pH7…………….........................................................................................…….......110
Hình 3.18: Khả năng thủy phân giấy lọc sau 5 ngày…………………................112
Hình 3.19: Khả năng thủy phân giấy lọc sau 10 ngày…………………..............112
Hình 3.20: So sánh phần trăm giảm giấy lọc của các chủng sau 5và 10 ngày..112
Hình 3.21: Hoạt tính CMCase của các chủng ở hai chế độ lắc và không
lắc……......................................................................................................................114
Hình 3.22: Hoạt tính FPase của các chủng ở hai chế độ lắc và không lắc….....115
Hình 3.23: Khảo sát hoạt tính enzyme tannase trên môi trường thạch. …....…118

Trang xiv


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.24: Hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150
vòng/phút……………………………………………………………..………..…119
Hình 3.25. Sinh khối sau khi ly tâm………………………………………….….120
Hình 3.26: Sinh khối của các chủng ở nồng độ tannic acid khác nhau
……………………................................................................................................…..121

Trang xv


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1.

Đặt vấn đề
Nông nghiệp là ngành kinh tế quan trọng của Việt Nam. Hiện nay, Việt Nam vẫn

là một nước nông nghiệp. Năm 2009, giá trị sản lượng của nông nghiệp đạt 71,473
nghìn tỷ đồng (giá so sánh với năm 1994), tăng 1,32 % so với năm 2008 và chiếm
13,85 % tổng sản phẩm trong nước. Tỷ trọng của nông nghiệp trong nền kinh tế bị sụt
giảm trong những năm gần đây, trong khi các lĩnh vực kinh tế khác gia tăng. Đóng góp
của nông nghiệp vào tạo việc làm còn lớn hơn cả đóng góp của ngành này vào GDP.
Trong năm 2005, có khoảng 60 % lao động làm việc trong lĩnh vực nông, lâm nghiệp,
và thuỷ sản. Sản lượng nông nghiệp xuất khẩu chiếm khoảng 30 % trong năm 2005.
Việc tự do hóa sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản xuất lúa gạo, đã giúp Việt Nam là
nước thứ hai trên thế giới về xuất khẩu gạo và nằm trong những nước xuất khẩu các
nông sản quan trọng khác là tiêu, sợi bông, đậu phộng, cao su, đường và trà.
Tuy nhiên trong sản xuất nông nghiệp hằng năm có khoảng 232 tỷ chất hữu cơ
được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp. Trong số này có 172 tỷ tấn
được tạo thành ở trên đất liền và 60 tỷ tấn được tạo thành trong các đại dương. Trong
số này có đến 30 % là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose.
Cellulose chiếm đến 89 % trong bông là 40 - 50 % trong gỗ. Ở cấp độ sinh quyển, hàng
tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích
tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái.
Mặt khác đứng trước áp lực rút ngắn thời gian nhưng hiệu quả canh tác trên một
diện tích đất nông nghiệp phải không ngừng tăng lên người nông dân đã áp dụng các
tập quán canh tác mới như cải thiện giống, bón phân,... Hiện nay có rất nhiều loại phân
bón sử dụng trong nông nghiệp như: phân hữu cơ, phân sinh học, phân vi sinh. Tuy
nhiên việc phụ thuộc quá nhiều vào phân hóa học và loại bỏ rơm rạ, phụ phế phẩm vừa
Trang 1

Đồ án tốt nghiệp

gây ảnh hưởng đến môi trường sống vừa lãng phí một nguồn nguyên liệu sản xuất phân
bón thân thiện với môi trường. Do vậy sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh sẽ thay thế dần
việc bón phân hoá học trên đồng ruộng, đất trồng trọt mà vẫn đảm bảo được nâng cao
năng suất thu hoạch. Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh về lâu dài sẽ dần dần trả lại độ
phì nhiêu cho đất như làm tăng lượng phospho và kali dễ tan trong đất canh tác, cải tạo,
giữ độ bền của đất đối với cây trồng nhờ khả năng cung cấp hàng loạt các chuyển hoá
chất khác nhau liên tục do nhiều quần thể vi sinh vật khác nhau tạo ra. Việc sử dụng
phân bón hữu cơ vi sinh còn có ý nghĩa rất lớn là tăng cường bảo vệ môi trường sống,
giảm tính độc hại do hoá chất trong các loại nông sản thực phẩm do lạm dụng phân bón
hóa học.
Trên thế giới, có hai phương pháp phổ biến để xử lý nguồn cellulose trong tự
nhiên: thứ nhất là xử lý bằng vật lý và hóa học; thứ hai là xử lý các chất thải hữu cơ
cellulose bằng công nghệ sinh học đặc biệt là sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào
từ các nguồn vi sinh vật, phương pháp này tỏ ra hiệu quả hơn trong việc sản xuất phân
bón, chi phí phù hợp và các điều kiện thực hiện đơn giản hơn rất nhiều so với xử lý
bằng hóa học chính vì thế hiện nay có nhiều nghiên cứu tối ưu quy trình này nhằm đưa
ra sản xuất rộng rãi. Một trong những yếu tố đó là nguồn giống vi sinh, yếu tố đóng vai
trò chủ đạo để nâng cao hiệu quả sản xuất phân bón, rút ngắn thời gian ủ,...
Từ các vấn đề đặt ra ở trên tôi đi đến chọn đề tài “Phân lập vi khuẩn có khả năng
phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu”.
2.

Tình hình nghiên cứu
2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng của vi nhuẩn phân

hủy cellulose. Trong số đó có nghiên cứu về triển vọng của vi khuẩn phân hủy

cellulose sản xuất etanol nhiên liệu. Sinh khối chứa lignocellulosic là một nguồn tài

Trang 2


Đồ án tốt nghiệp

nguyên tái tạo phong phú với tiềm năng lớn cho bioconversion để gia tăng gía trị chế
phẩm sinh học.
Việc đốt cháy dầu mỏ nhiên liệu hóa thạch đã trở thành một mối quan tâm đối với
khí hậu toàn cầu. Đốt nhiên liệu hóa thạch cũng đã tạo ra một mối quan tâm đến nguồn
dầu khí không ổn định, cũng như, việc tăng chi phí nhiên liệu. Những mối quan tâm
này dẫn đến sự nỗ lực toàn cầu nghiên cứu sử dụng nguồn tài nguyên tái tạo mà vẫn
đáp ứng nhu cầu năng lượng ngày càng cao của thế giới. Tại Canada tiêu chuẩn nhiên
liệu tái tạo được nâng lên để các nhiên liệu sẽ chứa 5 % ethanol (năm 2010), còn ở Hoa
Kỳ Cơ quan Bảo vệ môi trường tăng tiêu chuẩn nhiên liệu tái tạo của họ để sản xuất
ethanol 10,21 % hỗn hợp nhiên liệu vào năm 2009, trong khi hiện tại tỷ lệ ethanol trộn
trong nhiên liệu ở Brazil là 25 % (quy định tại 2007) [2,501-507].
Sinh khối chứa lignocellulosic là một nhiều tiềm năng tài nguyên để sản xuất
nhiên liệu sinh học bởi vì nó phần lớn là dồi dào, rẻ tiền. Phế phẩm nông nghiệp là một
nguồn chứa lignocellulosic dồi dào và rẻ tiền. nguồn tài nguyên có thể thu từ: lá, thân
của một số cây nông nghiệp như: phế thải ngô, bã mía, vỏ trấu, cây thân gỗ. Ngoài ra,
một số cây chuyên dụng để sản xuất năng lượng sinh học như một số loại cỏ như: cỏ
Miscanthus, cỏ Bermuda,...
Để chuyển đổi nguồn nguyên liệu giàu của lignocellulose tới những đường dễ lên
men gồm 3 bước:
Giảm kích thước.
Phân đoạn.
Thủy phân enzyme (Pluz Wyman, 1999; Zhang và. Lynd, 2004 B).
Một trong những quan trọng nhất và khó khăn thách thức công nghệ là để khắc

phục tính bền của vật liệu tự nhiên chứa lignocelluloses, enzyme có khả năng thủy thủy
phân để sản xuất các loại đường lên men ở điều kiện thường (Chang và cộng sự, 1981;.

Trang 3


Đồ án tốt nghiệp

Demain et al, 2005;. Fan et al, 1982. Grethlein, 1984; Hsu, năm 1996; Lin và cộng sự,
1981; McMillian, năm 1994; Millett et al, 1976;. Moreira, 2005;.Mosier et al, 2005;
ngựa để cởi và cộng sự, 1993;. Weil và cộng sự, 1994. ; Wyman, năm 1999; Wyman
và cộng sự, 2005a).
Gần đây, các công ty công nghệ sinh học Genencor và Novozymes đã cho ra một
quy trình công nghệ làm giảm chi phí sản xuất enzyme cellulase từ đó làm giảm chi phí
cho quá trình lên men phế phẩm từ 5,40 USD/gallon ethanol xuống khoảng 20
cent/gallon ethanol (Moreira, 2005). Công nghệ này ngoài giảm chi phí sản xuất
cellulase còn nhằm nâng cao hiệu suất lên men và rút ngắn thời gian lên men.
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu. Ở Việt
Nam, lượng rác thải ra ngoài môi trường ngày càng lớn, nguy cơ ô nhiễm môi trường ở
nhiều nơi là rất cao. Việc sử dụng biện pháp vi sinh học trong xử lý rác thải đã và đang
mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên, việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự
nhiên để xử lý rác thải, thời gian thường kéo dài gây nên tình trạng ô nhiễm môi
trường, tốn nhiều diện tích và công sức. Để xử lý rác triệt để hơn, giảm giá thành và
thời gian xử lý, ngoài việc tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển tốt thì việc
tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh,
chịu được nhiệt độ cao để bổ sung vào các bể rác là một trong những hướng nghiên
cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm.
Năm 1999, Nguyễn Lan Hương và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn được các
chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã

rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5 - 7 ngày.
Năm 1999, Tăng Thị Chính và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện lên
men và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của
một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt được phân lập từ bể ủ rác thải.
Trang 4


Đồ án tốt nghiệp

Cũng trong năm này, Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và
tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có
khả năng phân giải cellulose mạnh.
Nghiên cứu về phân lập và định danh các dòng vi khuẩn trong dạ cỏ bò của Võ
Văn Phước Duệ và Cao Ngọc Diệp năm 2011.
Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trên
địa bang tỉnh Thừa Thiên Huế của tác giả Phạm Thị Ngọc Lan.
Ngoài ra còn có nghiên cứu khác về phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ các
nguồn giàu xơ khác như: trong trấu đang hoai mục, vỏ và bã tiêu,...
3.

Mục đích nghiên cứu
Nhằm tìm và chọn ra được chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân giải

cellulose tốt nhất để tổng hợp thành chế phẩm sinh học và sử dụng nó để sản xuất phân
compost, ứng dụng để xử lý rác thải môi trường giàu xơ.
4.

Nhiệm vụ nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ mụn dừa và vỏ tiêu
Sàng lọc và tuyển chọn các chủng làm nguồn giống cho quá trình ủ compost từ

mụn dừa.
5.

Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thực nghiệm.
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu tiến hành sử dụng phần mềm Statgraphics

plus 3.0.
6.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Trang 5


Đồ án tốt nghiệp

Ý nghĩa khoa học: việc chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose
nhằm nâng cao hiệu quả xử lý phụ phế phẩm giàu xơ, cải thiện ô nhiễm môi trường,
đồng thời sản phẩm sau quá trình ủ compost sử dụng làm phân bón phân hữu cơ vi sinh
cho quá trình bón lót nhằm cải tạo và làm tăng dinh dưỡng trong đất.
Ý nghĩa thực tiễn: ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống sản xuất, bảo vệ
môi trường và xây dựng nền nông nghiệp ngày càng phát triển bển vững.
7.

Kết quả đạt được
Thu được 5 chủng (4 chủng vi khuẩn và 1 chủng xạ khuẩn) có khả năng phân hủy

cellulose và tannic acid, và tuyển chọn các chủng có tiềm năng ủ compost mụn dừa.

Gồm 4 chương:
Chương 1: Tổng quan đề tài nghiên cứu.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
Chương 4: Kết luận và kiến nghị.

Trang 6


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Hiện trạng của vỏ tiêu và mụn dừa
1.1.1.

Vỏ tiêu

Trong những năm gần đây, Việt Nam luôn nằm trong các nhóm nước dẫn đầu về
xuất khẩu hồ tiêu trên thế giới, theo báo cáo mới công bố của Hội đồng hạt tiêu quốc tế
(IPC) ước tính lượng tiêu xuất khẩu của Việt Nam trong cả năm 2011 đạt 115.000 tấn,
và dự báo năm 2012 là 120.000 tấn. Diện tích trồng hồ tiêu trong nước chủ yếu tập
trung tại các vùng Tây Nguyên, Đông Nam Bộ (trong đó Đông Nam Bộ và Tây
Nguyên chiếm hơn 78 % diện tích trồng hồ tiêu cả nước), đảo Phú Quốc.
Bảng 1.1: Diện tích và sản lượng tiêu của vùng Đông Nam Bộ và Tây Nguyên
Năm 2011

Năm 2012

6 tỉnh

trọng

Diện

Diện

điểm

tích

tích

trồng

thu

Năng

Sản

suất

lượng

42.171 37.153

2,46

91.535

9.566

9.181

2,85

Gia Lai

5.832

4.881

Đồng Nai

7.021

6.273

Tổng
Bình
Phước

Diện

Diện

Năng

tích thu

suất

44.279

38.102

2,37

90.168

26.155

10.140

9.015

3,07

27.682

3,22

15.733

5.794

5.234

3,27

17.129

2,09

13.111

8.125

7.101

1,46

8.304

tích
trồng

Trang 7

Sản lượng


Đồ án tốt nghiệp

Đăk Nông
Bà Rịa
Vũng Tàu
Đăk Lăk

7.915

6.130

2,15

13.096

8.000

6.022

2,29

13.814

6.939

6.304

1,86

11.725

7.370

6.364

1,72

10.954

4.898

4.383

2,67

11.715

4.850

4.366

2,81

12.285

(Nguồn: theo thống kê của Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam (VPA))
Sở dĩ hồ tiêu Việt Nam có thể phát triển một cách rực rỡ như vậy là do Việt Nam
hội tụ tất cả các điều kiện thuận lợi về tự nhiên, về con người, về ứng dụng khoa học
kỹ thuật trong sản xuất và chế biến.
Tuy nhiên, song song với những phát triển về sản lượng và chất lượng, người
nông dân trồng hồ tiêu đã và đang đối mặt với tình trạng sâu hại, bất lợi về thời tiết và
đặc biệt là giá thành phân bón tăng cao. Mặc khác lượng phế phẩm từ hồ tiêu (chủ yếu
là vỏ tiêu) với số lượng lớn khoảng 16.666 tấn/năm nếu không có các biện pháp xử lý
thì chúng là nguồn gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Việc nghiên cứu phương
pháp compost để xử lý phế phẩm này vừa giải quyết được ô nhiễm vừa tạo ra giá trị
kinh tế cao. Sỡ dĩ vỏ tiêu được chọn làm nguyên liệu để ủ compost vì trong vỏ tiêu
chứa hàm lượng chất dinh dưỡng cao nên người ta có thể sử dụng bã cà phê như một
chất bón cây rất hữu hiệu. Trong thành phần của nó chứa nhiều canxi, phốt pho, nitơ

cũng như các chất khoáng khác giúp ích cho sự phát triển của cây. Khi đó giá thành
của loại phân bón hữu cơ này chỉ bằng khoảng 30 % so với các loại phân khoáng bán
trên thị trường. Hơn nữa, sử dụng các loại phân hữu cơ sinh học từ xác, bã thực vật nói
chung và vỏ quả cà phê nói riêng bón cho các loại cây trồng sẽ góp phần cân bằng hệ
sinh vật trong đất. Từ đó, cải thiện được kết cấu, độ xốp, độ phì nhiêu của đất.
1.1.2.

Mụn dừa

Trang 8


Đồ án tốt nghiệp

Bến Tre có diện tích và sản lượng dừa lớn nhất Việt Nam, với hơn 52.000 ha dừa
(chiếm 51,23 % diện tích cây lâu năm; 24,795 % đất nông nghiệp và chiếm 19,07 %
diện tích tự nhiên) chiếm 2/3 diện tích, sản lượng dừa cả nước và đứng hàng đầu về
chất lượng, sản lượng thu hoạch hàng năm đạt trên 390 triệu trái, chiếm 36 % sản
lượng cả nước là cây có diện tích lớn nhất và ổn định nhất so với các cây khác trên địa
bàn tỉnh Bến Tre. Giá trị sản xuất các sản phẩm dừa chiếm hơn 25 % tổng giá trị sản
xuất công nghiệp toàn tỉnh; kim ngạch xuất khẩu các sản phẩm từ dừa không ngừng gia
tăng, có lúc chiếm tới hơn 40 % tổng kim ngạch xuất khẩu của tỉnh, sản phẩm dừa đã
xuất khẩu đến trên 50 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới. Ngành dừa luôn đóng vai
trò quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội tỉnh.
Trái dừa ngoài đáp ứng cho nhu cầu giải khát ngày càng tăng nhất là ở các thành
phố lớn Bến Tre cung cấp khoảng 150 – 200 triệu trái/năm, hiện nay một số ngành
nông nghiệp phát triển từ nguồn nguyên liệu dừa cũng tăng theo từng năm cho ra nhiều
sản phẩm có giá trị như: cơm dừa nạo sấy, dầu dừa, kẹo dừa, thạch dừa, chỉ xơ dừa,
thảm xơ dừa, vỏ dừa cắt lát, mụn dừa, than hoạt tính và khoảng 100 sản phẩm hàng thủ
công mỹ nghệ từ cây dừa, trái dừa, gáo dừa, cọng dừa, chà dừa, nhen dừa được xuất

khẩu sang nhiều quốc gia trên thế giới.
Bảng 1.2: Diện tích dừa ở tỉnh Bến Tre (ha)
Đơn vị/năm

2005

2008

2009

2010

2011

Toàn tỉnh Bến Tre

37.595

47.569

49.920

51.560

55.870

Thành phố Bến Tre

1.336

1.492

1.500

1.528

1.869

Châu Thành

4.960

5.297

5.453

5.541

6.352

Trong đó:

Trang 9