Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC
CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC SINH AFLATOXIN

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311100092

: Nguyễn Trần Yến Tiên
Lớp: 13DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của
Tiến sĩ Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường
của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.
Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học
khác dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hoàn toàn
trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm toàn bộ về đồ án của mình.
Tp.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trần Yến Tiên


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành được đồ án “Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năng
ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi
kiến thức. Cũng không ít lần gặp khó khăn trắc trở nhưng nhờ sự hướng dẫn tận tình
của Cô Nguyễn Hoài Hương nay em đã hoàn thành được đồ án của mình.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của Cô Nguyễn Hoài Hương.
Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ
TPHCM. Chính nhờ Cô đã truyền tải kiến thức và những kỹ năng để em đạt được
thành quả trong đồ án mà em thực hiện hôm nay.
Chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy cô giảng viên và Ban lãnh
đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công
nghệ TPHCM đã tạo điều kiện cho em tìm hiểu tài liệu để hoàn thành được đồ án
tốt nghiệp đúng thời gian quy định.
Dù hoàn thành được đồ án nhưng cũng khó tránh khỏi những sai sót nhất
định do khả năng hiểu biết hạn hẹp và thông tin tài liệu không mấy khả quan để
phục vụ quá trình thực hiện đồ án. Kính mong có sự góp ý và hướng dẫn tận tình
của các thầy cô để em học hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học
tập rèn luyện và chuẩn bị hành trang bước sang một môi trường làm việc mới sau
này.
Kính chúc Cô Nguyễn Hoài Hương và các Thầy cô giảng viên, Ban lãnh đạo
Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ
TPHCM sức khỏe, thành công và may mắn.
Em xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trần Yến Tiên


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..........................................................................4
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................5
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH..............................7
MỞ ĐẦU

..............................................................................................................10

1. Tính cấp thiết đề tài .........................................................................................10
2. Tình hình nghiên cứu ....................................................................................11
3. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................12
4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................12
5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................12
5.1. Phương pháp luận .........................................................................................12
5.2. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................................13
6. Kết cấu đồ án .................................................................................................13
CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN ...............................................................................14

1.1. Tổng quan về nấm .........................................................................................14
1.1.1.

Giới thiệu chung ...................................................................................14

1.1.2.

Độc tố nấm ............................................................................................15

1.1.3.

Tác hại của nấm ....................................................................................17

1.1.4.

Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm .......................................18

1.1.5.

Một số phương pháp khử nhiễm độc tố ................................................19

1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic .......................................................................21
1.2.1.

Giới thiệu vi khuẩn lactic......................................................................21

1.2.2.

Phân loại ...............................................................................................22

1.2.3.

Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic. ...............................................23

1.2.4.

Đặc điểm sinh lý – sinh hóa ..................................................................25

1.2.5.

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ..............................................26

1.2.6.

Quá trình trao đổi chất .........................................................................28

1.2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn lactic .............................................................................31
1.2.8.

Ứng dụng của vi khuẩn lactic ...............................................................32
1


Đồ án tốt nghiệp

1.2.9.

Hoạt tính sinh học .................................................................................33

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................38

2.1. Địa điểm nghiên cứu .....................................................................................38
2.2. Thời gian thực hiện .......................................................................................38
2.3. Vật liệu ...........................................................................................................38
2.3.1.

Nguồn phân lập .....................................................................................38

2.3.2.

Thiết bị và dụng cụ................................................................................38

2.3.3.

Hóa chất ................................................................................................38

2.3.4.

Giống nấm.............................................................................................40

2.4. Phương pháp luận .........................................................................................40
2.5. Phương pháp thí nghiệm ..............................................................................43
2.5.1.

Thu thập mẫu ........................................................................................43

2.5.2.

Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic .................................................43

2.5.3.

Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hoá. ...................................................45

2.6. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. ....................................49
2.7. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương
pháp in vitro. .........................................................................................................49
2.7.1.

Khảo sát khả năng đối kháng nấm trực tiếp theo phương pháp in vitro.
49

2.7.2.

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào ...........................................53

2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản
hạt. 55
2.8.1.

Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: 55

2.8.2.

Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: 57

CHƯƠNG 3:

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .......................................................60

3.1. Kết quả khảo sát hình thái, sinh lý, snh hoá...............................................60
3.1.1.

Thử nghiệm Catalase ............................................................................61

3.1.2.

Nhuộm Gram.........................................................................................62

3.1.3.

Nhuộm bào tử........................................................................................63

3.1.4.

Khả năng lên men đường và khả năng sinh khí....................................64

3.1.5.

Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. ...........66
2


Đồ án tốt nghiệp

3.2. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. ....................................71
3.3. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương
phap in vitro. ........................................................................................................73
3.3.1.

Khảo sát khả năng kháng nấm trực tiếp của chủng vi khuẩn lactic. ....73

3.3.2.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào. ........................................................76

3.4. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: ...78
3.5. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: ...87
CHƯƠNG 4:

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................94

4.1 Kết luận ...........................................................................................................94
4.2 Kiến nghị .........................................................................................................94
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................95
PHỤ LỤC .................................................................................................................1

3


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales
VK

Vi khuẩn

MRS de Man, Rogosa and Sharpe

PDA Potato Detrose Agar
ĐC

Đối chứng

TN

Thí nghiệm.

4


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng của các chi vi khuẩn lactic .........................25
Bảng 1.2. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm
men (Corsetti và cộng sự, 1998) ...............................................................................34
Bảng 1.3. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh.
(Holzapfel và cộng sự, 1995) ....................................................................................35
Bảng 1.4 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB.
(Holzapfel và cộng sự, 1995) ....................................................................................37
Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập......................................................................43
Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập...............................................61
Bảng 3.2 Trình bày hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các vi khuẩn phân
lập. .............................................................................................................................67
Bảng 3.3. Trình bày tóm tắt về các chủng phân lập có đặc điểm đặc trưng cho vi
khuẩn lên men lactic..................................................................................................70
Bảng 3.4: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của 11 chủng vi .....71
khuẩn phân lập. .........................................................................................................71

Bảng 3.5: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic ......................................................72
Bảng 3.6 .Thống kê số liệu phần trăm tỉ lệ ức chế của 11 chủng vi khuẩn phân lập
được với 2 chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. ....................74
Bảng 3.7. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn ..........................76
Bảng 3.8. Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi
khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng. ...........78
Bảng 3.9. Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi
khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng. ...........82
Bảng 3.10. Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi
khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng. ...........87
Bảng 3.11. Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi
khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng. ...........89

5


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.12. Thời gian bắt đầu xuất hiện tơ nấm (ngày) của 11 chủng vi khuẩn với
mật độ cảm nhiễm 101bt/g đậu phộng và 102bt/g đậu phộng....................................90
Bảng 3.13. So sánh khả năng tăng trưởng, lên men lactic, kháng nấm in vitro và in
vivo của các chủng vi khuẩn phân lập. .....................................................................91

6


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Một số vi khuẩn lactic điển hình ..............................................................24

Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic .......................29
Hình 2.1 Sơ đồ phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic ...................................42
Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu .................................................................................44
Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc
theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. .................................................................50
Hình 2.4: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi
khuẩn .........................................................................................................................52
Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh enzyme của các chủng LAB. ................53
Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic ...........................................................60
Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic trên môi trường có chứa chất chỉ thị 61
Hình 3.3: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm
tính của chủng vi khuẩn KC1A, Đối chứng âm là nước cất, thử nghiệm dương tính
đối với Bacillus spp. ..................................................................................................62
Hình 3.4 Kết quả nhuộm gram của chủng vi khuẩn: A. Vi khuẩn Bacillus subtilis
bắt màu tím. B. Vi khuẩn E.coli bắt màu hồng. C. Vi khuẩn phân lập ...................63
Hình 3.5 Kết quả nhuộm bào tử của chủng vi khuẩn. A. Vi khuẩn Bacillus subtilis
sinh bào tử. B. Vi khuẩn E.coli không sinh bào tử. C. Vi khuẩn phân lập không sinh
bào tử .........................................................................................................................64
Hình 3.6. Thử nghiệm lên men đường. Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường. Ống
2: Vi khuẩn lên men đường có sinh khí. Ống 3: Vi khuẩn lên men đường nhưng
không sinh khí . .........................................................................................................65
Hình 3.7 Vi khuẩn lactic phân lập được có khả năng lên men đường. ....................66
Sau thử nghiệm lên men đường, thu được kết quả cho thấy trong số 11 chủng phân
lập thì có 10 chủng là vi khuẩn lên men đồng hình, 1 chủng còn lại là lên men dị
hình. Các chủng phân lập từ Kim chi đều lên men đồng hình sinh acid lactic, còn
với các chủng phân lập từ Nem chua có duy nhất 1 chủng là lên men dị hình, 4
7


Đồ án tốt nghiệp

chủng còn lại đều lên men đồng hình. Chủng lên men dị hình đó thường mang lại
cho Nem chua nhiều giá trị cảm quan hơn do hình thành sản phẩm phụ ngoài acid
lactic. .........................................................................................................................66
Hình 3.8. Kiểm tra tính di động của vi khuẩn. Ống a: Vi khuẩn có khả năng di
động. Ống b: Vi khuẩn không có khả năng di động. Ống c: Vi khuẩn phân lập được
không có khả năng di động. ......................................................................................67
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn %Acid tổng và sinh khối của 11 chủng vi khuẩn sau 24h
nuôi cấy. ....................................................................................................................72
Hình 3.10. Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của chủng vi khuẩn phân lập. .............74
Hình 3.11. Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của chủng vi khuẩn phân lập ..............74
Hình 3.12. Biểu đồ thể hiện phần trăm tỉ lệ ức chế nấm của các chủng vi khuẩn. ..75
Hình 3.13. Khả năng đối kháng CĐP1 của NC412 sau 3 ngày................................75
Hình 3.14. Khả năng đối kháng CĐP2 của KC1A sau 3 ngày. ................................75
Hình 3.15. Khả năng đối kháng CĐP1 của KC242 sau 3 ngày................................76
Hình 3.16. Khả năng phân giải Tinh bột của chủng vi khuẩn KC13 ......................77
Hình 3.17. Khả năng phân giải Protein của chủng vi khuẩn KC1B ........................77
Hình 3.18. Khả năng phân giải Chitin của chủng vi khuẩn KC1A .........................77
Hình 3.19 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ
trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước
cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A. ...........79
Hình 3.20 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ
trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK KC1B, KC13,
KC106, KC242. .........................................................................................................80
Hình 3.21 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ
trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK NC2, NC12,
NC172, NC412. .........................................................................................................81
Hình 3.22 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ
trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: ĐC (-) –

8


Đồ án tốt nghiệp

Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK
KC1A. .......................................................................................................................83
Hình 3.23 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ
trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: Chủng
VK KC1B, KC13, KC106, KC242. ..........................................................................84
Hình 3.24 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ
trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: Chủng
VK NC2, NC12, NC172, NC412. .............................................................................85
Hình 3.25. Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6
và 12 ngày. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng
Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412. .......................................................92
Hình 3.26. Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6
và 12 ngày. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng
Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412. .......................................................93

9


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết đề tài
Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì bên cạnh đó lĩnh
vực Công nghệ sinh học cũng đang dần phát triển ngày càng rộng mở.
Ngày nay con người ta đã ứng dụng các thành tựu khoa học công nghệ vào

trong cuộc sống, áp dụng trên tất cả các loại hình từ công nghiệp, nông nghiệp, an
ninh quốc phòng cho đến giải trí, v.v... Công nghệ sinh học chính là kết quả của các
quá trình nghiên cứu khoa học công nghệ.
Các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu, ứng dụng các kiến thức từ các tài liệu
trên toàn Thế Giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật để cho ra đời các giống cây
trồng, vật nuôi, vi sinh vật có tính năng ưu việt hơn các loại giống hiện có. Bên
cạnh đó còn có thể tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, chất
xét nghiệm bệnh, những mầm móng mới có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh
tế - xã hội và bảo vệ môi trường.
Đặc biệt hơn là áp dụng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm. Các nghiên cứu
Công nghệ sinh học cho ra đời các loại vi sinh vật dùng trong chế biến và bảo quản
thực phẩm, điều tiết các loại vi khuẩn, nấm mốc có trong thực phẩm. Hạn chế mầm
bệnh và sự lây lan đến môi trường sống.
Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển
đó. Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn. Thay vì sử
dụng các thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến
sẵn mà không biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học. Bản thân
thực phẩm cũng có thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch
bệnh hiện nay. Mặc dù áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ
sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP…), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật
gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Theo Besselink, et
al., 2008).
Chính vì thế, các cơ sở sản xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản
hóa học. Mặc dù, nếu chúng được sử dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất
10


Đồ án tốt nghiệp

phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng không mong muốn cho người tiêu dùng. Nhưng

còn có rất nhiều trường hợp, do lợi nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại
hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử
dụng hơn. Có thể nói: Hiện nay con người dường như đang sống cùng hóa chất và
sức khỏe con người đang đứng trước bờ vực thẳm.
Theo đó tôi đã dựa trên những nghiên cứu, những tài liệu mà các thầy cô cung
cấp, và tìm hiểu thêm trên các trang thông tin khoa học để thực hiện đề tài “Phân
lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin”. Loại vi khuẩn
này có khả năng kháng lại các loại nấm mốc dùng trong chế biến và bảo quản thực
phẩm. Đảm bảo thực phẩm đạt chất lượng dinh dưỡng hợp lý, nâng cao chất lượng
sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trên thị trường nội địa lẫn quốc tế.
Do đó, tôi đã thực hiện đề tài này nhằm phục vụ quá trình làm đồ án tốt nghiệp
cũng như là tìm tòi, học hỏi, tích lũy các kinh nghiệm thực tiễn trong quá trình tham
khảo, nghiên cứu các ứng dụng của khuẩn lên men lactic cùng với các phương pháp
xử lý nguyên liệu và chế biến hợp lý nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm, tạo ra sự
đồng nhất của sản phẩm sau khi lên men, kéo dài thời gian bảo quản góp phần vào
việc đáp ứng nhu cầu sử dụng đa dạng sản phẩm và đảm bảo hợp vệ sinh cho người
sử dụng.
2.

Tình hình nghiên cứu
Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng nấm chống bệnh

than (Asma Saleh Elmabrok et al…,2012)
Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic mới phân lập (Nora LAREF*,
Bettache GUESSAS, 2013)
Phân lập và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản sinh hợp chất
kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum (Lê Ngọc Thùy Trang và cộng sự,
2014)
Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng
Probiotic từ người (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự)

11


Đồ án tốt nghiệp

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản
thưc ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại (Đào Thị Lương
và các cộng sự, 2010)
Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus acidophilus trong chế
biến Probiotic (Trần Thị Ái Liên, 2011)
Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu khác về vi khuẩn lactic trong và
ngoài nước

3. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men
truyền thống có khả năng kháng nấm mốc gây nhiễm độc trên thực phẩm.
4. Nội dung nghiên cứu
-

Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống như kim chi và
nem chua.

-

Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic của các chủng phân lập.

-

Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin in vitro.

-

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của cac chủng phân lập.

-

Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng.

5. Phương pháp nghiên cứu
5.1. Phương pháp luận
-

Lựa chọn nguồn phân lập là các loại thực phẩm lên men truyền thống như
kim chi, nem chua, vì các nguồn này chứa các vi khuẩn sống và có tiềm năng
kháng nấm cao.

-

Phân lập vi khuẩn lên men lactic bằng môi trường chuyên biệt có bổ sung
NaN3 và khăng định khả năng sinh acid bằng chỉ thị, dựa vào khoá phân loại
của Bergey’s Manual (Theo Benson Lab Manual, 2001) và định danh sơ bộ
vi khuẩn lên men lactic.

-

Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập qua khảo sát sinh khối và acid tổng
tạo thành.
12

Đồ án tốt nghiệp

-

Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập kháng nấm in vitro của các chủng
phân lập áp dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn).

-

Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập qua kháng nấm in vivo qua thí
nghiệm bảo quản đậu phộng.

5.2. Phương pháp xử lý số liệu

6.

-

Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị

-

Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để xử lý số liệu
Kết cấu đồ án
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung

liên quan đến tài liệu nghiên cứu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập

đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả
mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được.
Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt
được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài.

13


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về nấm
1.1.1.

Giới thiệu chung

Giới Nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị
dưỡng có thành tế bào bằng chitin. Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các sợi đa
bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số nấm khác lại
phát triển dưới dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm
thường qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay quả thể. Một số loài
lại mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình
thức sinh sản sinh dưỡng.
Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả
thể). Giới Nấm là nhóm sinh vật đơn ngành (monophyletic) mà có nguồn gốc hoàn
toàn khác biệt với những sinh vật có hình thái tương tự như nấm
nhầy (myxomycetes) hay mốc nước (oomycetes). Nấm có mối quan hệ gần

với động vật hơn thực vật, cho dù thế thì môn học về nấm, hay nấm học, lại thường
được xếp vào thành một nhánh của thực vật học.
Trên Trái Đất, đa phần các nấm đều không thể nhìn thấy được bằng mắt
thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng
sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng một vai trò
quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các vật chất hữu cơ và không thể
thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. Một số loài nấm có thể
nhận thấy được khi ở dạng quả thể, như nấm lớn và nấm mốc. Nấm được ứng dụng
rất rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất. Nhiều loài được sử dụng trong công nghệ
thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc trong quá trình lên men. Nấm còn được dùng
để sản xuất chất kháng sinh, hoóc môn trong y học và nhiều loại enzyme. Tuy vậy,
nhiều loại nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotoxin
như ancaloit và polyketit-là những chất độc đối với động vật lẫn con người. Một số
loại nấm được sử dụng để kích thích hoặc dùng trong các nghi lễ truyền thống với
vai trò tác động lên trí tuệ và hành vi của con người. Vài loại nấm có thể gây ra các
14


Đồ án tốt nghiệp

chứng bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh dịch cho cây trồng, mùa
màng và có thể gây tác động lớn lên an ninh lương thực và kinh tế.
Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là tế bào
không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị dưỡng (hoại
sinh, kí sinh, cộng sinh), quá trình sinh sản có thể là vô tính nhay hữu tính.Vách tế
bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose và một số thành phần khác có
hàm lượng thấp. Nấm mốc thường thường phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi
nấm (hyphae) tạo hệ sợi (mycelium). Có 2 loại sợi: Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong
lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm. Sợi
nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử).

1.1.2.

Độc tố nấm

1.1.2.1. Các loại độc tố do nấm tiết ra
Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối
lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc
đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người.
Theo Nguyễn Thị Hiền (2009) hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát
hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở
mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi
nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm:
- Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), ochratoxin
A, stermatocystin, acid cyclopianxoic.
- Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và
axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon.
- Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin.
- Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, alternarion, methyl ether
alternarion.
- Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà
Một số độc tố gây hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu hay
hiện tượng tiêu máu rất nguy hiểm thường gặp ở động vật và người bị nhiễm độc tố.
15


Đồ án tốt nghiệp

Mycotoxin còn làm suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể. Nhiều độc tố như
aflatoxin, ochratoxin, funomisin có thể là các chất gây biến dị, ung thư, quái thai.
Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột

biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng
hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác
động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể
gây tổn thương não và chết.
Những bệnh do độc tố nấm mốc (Mycotoxin) gây nên trước tiên là biểu hiện
tổn thương ở gan và thận. Có thể quan sát được sự xuất hiện các u gan, thoái hoá tế
bào nhu mô gan, xơ hoá. Mycotoxin còn phá hủy tế bào gan và thận, ảnh hưởng
trực tiếp lên hệ miễn dịch, ăn mòn thành ruột và dạ dày. Ngoài ra còn có các dấu
hiệu tăng ure huyết, albumin niệu và viêm cầu thận.
1.1.2.2. Độc tố Aflatoxin
Độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi
nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm
trên một số hạt (như lạc). Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan. Nếu
mức độ nhiễm độc thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản
của động vật và nặng hơn sẽ gây ung thư.
Các loài sinh aflatoxin thuộc chi Aspergillus phân bố rất rộng trong tự nhiên.
Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào hạt trước khi thu hoạch và trong quá
trình bảo quản. Cây chủ rất dễ bị gây nhiễm bởi Aspergillus sau phơi nhiễm kéo dài
trong môi trường có độ ẩm cao hoặc bị tổn thương các điều kiện xấu như hạn hán.
Các môi trường sống bản địa của Aspergillus là trong đất, thực vật mục nát và
ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả các loại chất
hữu cơ mỗi khi có điều kiện được thuận lợi cho sự phát triển của nó. Điều kiện
thuận lợi bao gồm độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao.
Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa
miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị
(ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ,
16


Đồ án tốt nghiệp

dừa…Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằng
thức ăn nhiễm aflatoxin.
Ở người, aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liều
lượng cao trong thời gian ngắn. Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm:
Xuất huyết, huỷ hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong.
Trong khi đó, nếu hấp thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời gian
dài thì khó có thể nhận biết, một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hoá
thức ăn kém, sụt cân, nhưng rõ nhất chính là ngộ độc mãn tính trên gan và ung thư
gan.
Ở động vật, các triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu thông qua
các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật. Sự nhiễm độc mãn tính
aflatoxin có tính di truyền theo ba kiểu: Gây ung thư, quái thai, đột biến. Hậu quả
của việc nhiễm aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh
dưỡng và mức độ tiếp xúc. Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảm
với tác nhân càng cao.
Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium
do nấm Aspergillus tiết ra. Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm
Fusarium tiết ra. Độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết.
1.1.3.

Tác hại của nấm

1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật
Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành
nông nghiệp và lâm nghiệp. Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae) gây
bệnh cho lúa. Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago,
Alternaría và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây
trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị
ẩm mốc,...

1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật
Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm
sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là nấm mốc trong nhà hay
17


Đồ án tốt nghiệp

ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria, Aspergillus, Cladosporium,
Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium..., chỉ có vài loài là nấm đơn
bào như Candida, Rhodotorula, có một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus,
Fomes, Ganoderma...Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm
mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn. Ngộ độc do
ăn phải nấm độc, có thể từ rối loạn tiêu hoá, ảo giác, hoặc trầm trọng có thể tử vong.
Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp: Những loài có thể gây bệnh
cho người thuộc các chi như Aspergillus, Candida, Cryptococcus, Histoplasma và
Pneumocystis. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở người như nấm chân, nấm
móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,… cho đến những bệnh nguy hiểm có thể gây chết
người như viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay viêm phổi do nấm
Pneumocystis carinii.
1.1.4.

Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm

Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên hiện có 3 chủng nấm mốc chiếm
ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và
Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào khoảng thời gian
trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu,… Một trong những
nguyên nhân được nhắc đến là do con người đã ăn thực phẩm có nấm mốc chứa
aflatoxin, một độc tố vi nấm đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên

thực nghiệm.
Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính với các biểu hiện chính là suy chức năng gan
cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan. Nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung
thư gan ở người cũng còn rất nhiều tranh cãi. Tuy nhiên ở một số nghiên cứu, các
nhà khoa học đã tìm thấy có sự gắn kết của aflatoxin B1 với DNA của tế bào gan
cũng như có sự đột biến gen mà đặc biệt là gene p53 – một gene kiểm soát sự chết
tế bào, ở những bệnh nhân mắc ung thư gan.

18


Đồ án tốt nghiệp

1.1.5.

Một số phương pháp khử nhiễm độc tố

1.1.5.1. Phương pháp vật lý
Phân loại cơ học: Quá trình này loại bỏ các hạt nhiễm độc tố Mycotocxin. Giai
đoạn này rất quan trọng vì rất có thể việc loại bỏ không hết sẽ đến việc độc tố đi vào
thức ăn. Rửa bằng nước hoặc bằng dung dịch Na2CO3 cũng làm giảm nồng độ
Mycotocxin trong hạt ngũ cốc. Có thể cho hạt vào nước và loại bỏ những hạt nổi.
Phương pháp này cũng có thể loại bỏ Mycotocxin nhưng cần chú ý rằng, có một số
hạt nổi nhưng không chứa mycotocxin.
Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi qua
nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác
giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt độ
không khí nóng đưa vào là 100°C - 145°C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể
giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb. Nếu tăng nhiệt độ lên tới
165°C có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị

Ngọc Diệp, 2003).
Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt
độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy
nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo Rehana (1979)
nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở
120°C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến
68%. Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở
120°C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760ppb) được
hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin. (Theo Đậu Ngọc
Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối
với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm
khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng
đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã
thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol,
19


Đồ án tốt nghiệp

hexan-ethanol, hexan-ethanol-nước và hexan-acetone-nước. Hệ thống bao gồm 54%
acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất
được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg.
1.1.5.2. Phương pháp hóa học
Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như Natri
Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc
tính của aflatoxin. Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể
làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin. Khí ozone (O3) cũng được thử
nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có
bằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein,

vitamin.
Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của
việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin. Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt
quan tâm ứng dụng hơn cả. Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5%
và nhiệt độ bên ngoài là 25°C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb có
thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
1.1.5.3. Phương pháp sinh học
Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo
áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn là
không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm
aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm
aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương
thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp
hứa hẹn nhất.
Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định
nghĩa như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm
mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật.

20


Đồ án tốt nghiệp

1.2.

Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.2.1.

Giới thiệu vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta.
Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ
đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục
đích chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotic đã ra đời và phát triển. Đến
nay, những nghiên cứu về probiotic đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có
tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotic đối với sức khỏe con người. Bên
cạnh đó, các sản phẩm chức năng sử dụng các vi khuẩn probiotic xuất hiện ngày
càng nhiều ở Châu Âu, Nhật, Mỹ… Hiện nay, một số sản phẩm probiotic cũng được
bày bán trên thị trường Việt Nam như: sữa bột Gain IQ (Abbott Laboratories),
(Hoàng Quốc Khánh và cộng sự)
Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các
loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà,...), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc
để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên
nhà hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men
chua. Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả
hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó
(1878), Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày
nay gọi là Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi
khuẩn lactic đã được hình thành.
Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ
sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally
recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có
đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người.
Một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra
bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin,
plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển
của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Theo Batt, 1999; Dubernet et al., 2002).
21

Đồ án tốt nghiệp

Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất
ra các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất
có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn
gram (+) và vi khuẩn gram (-). Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh acid
hữu cơ, đặc biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Đối với
hydroxy peroxide thì khả năng kháng khuẩn là do việc tạo ra các chất oxy hóa
mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl.
Đối với bacteriocin, cơ chế kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được
nghiên cứu đầu tiên ở nisin, bacteriocin gram (+) (Theo Thomas L. V. et al,2002).
Dựa trên bản chất cation và tính kị nước, hầu hết các peptide hoạt động như
màng tế bào thấm. Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo
thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn
có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy
yếu thành tế bào (Theo Rattanachaikunsopon P. et al, 2010).
1.2.2.

Phân loại

Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaccae và được xếp
vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc,
Aerococcus. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau, chẳng hạn như
chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi và
cầu khuẩn (cocci). Theo bảng phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm
khoảng 20 giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc
ovan) và hình que, trong đó các giống chủ yếu nhất là: Aerococcus, Carnobacterium,
Enterococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weisslella. Việc phân loại vi khuẩn
lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con
đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid

lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm. Phân
loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành
tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong
phân loại.
22