Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn bacillus để phân giải protrin gây dị ứng trong khô dầu đậu nành với phương pháp lên men bán rắn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN BACILLUS
ĐỂ PHÂN GIẢI PROTEIN GÂY DỊ ỨNG
TRONG KHÔ DẦU ĐẬU NÀNH
VỚI PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Huỳnh Ninh
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311100732

: Lê Huỳnh Hoài Thương
Lớp: 13DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn
của TS. Phạm Huỳnh Ninh Bộ môn Dinh dưỡng và Thức ăn chăn nuôi, Phân viện chăn

nuôi Nam Bộ (IASVN).
Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt
nghiệp của người khác dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này
là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình.
TP.HCM, ngày 16 tháng 7 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Lê Huỳnh Hoài Thương

1


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gởi lời tri ân chân thành đến TS. Phạm
Huỳnh Ninh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian xây dựng đề cương
và hoàn thành đồ án. Em xin cám ơn anh Lê Quang Trí và Vũ Minh đã động viên, giúp
đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện.
Đồng thời, em cũng gởi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học
– Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian
dài học tập. Với những kiến thức mà em đã tiếp thu được không chỉ giúp cho em thực
hiện đồ án tốt nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này.
Em xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn chăm sóc, tạo điều kiện cho
em đến trường theo đuổi ước mơ và là chỗ dựa vững chắc không chỉ về tinh thần mà cả
vật chất cho em trong suốt những năm qua.
Em cũng xin gởi lời cám ơn chân thành đễn các bạn cùng thực hiện đề tài trong
phòng thí nghiệm CNSH – Phân viện chăn nuôi Nam Bộ - những người luôn động viên,
sát cánh và giúp đỡ hết mình để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng, em xin cám ơn các Thầy Cô trong hội đồng phản biện đã dành thời

gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quí Thầy Cô lời chúc sức khỏe.
TP.HCM, ngày 16 tháng 7 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Lê Huỳnh Hoài Thương

2


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC .........................................................................................................................i
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... iii
DANH MỤC ĐỒ THỊ .....................................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..........................................................................................vi
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4
1.1

Tổng quan về nghiên cứu sản xuất khô dầu đậu nành ........................................ 4

1.1.1

Lên men khô dầu đậu nành để giảm thiểu chất gây dị ứng ......................... 4

1.1.2

Vấn đề sử dụng khô dầu nành lên men ........................................................ 5

1.2

Tổng quan về Bacillus ........................................................................................ 6

1.2.1

Vi khuẩn Bacillus......................................................................................... 6

1.2.2

Vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................................ 8

1.3

Tổng quan về protease ...................................................................................... 11

1.3.1

Khái niệm ................................................................................................... 11

1.3.2

Phân loại .................................................................................................... 11

1.3.3

Hoạt tính protease ở đậu nành ................................................................... 12

1.4

Giới thiệu về lên men bán rắn .......................................................................... 13

1.4.1

Những vấn đề cơ bản của lên men bán rắn ................................................ 13

1.4.2

Những ưu điểm của lên men bán rắn ......................................................... 13

1.4.3

Sự tạp nhiễm trong lên men bán rắn .......................................................... 14

1.4.4

Các giai đoạn của lên men bán rắn ............................................................ 15

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................... 17
2.1

Vật liệu ............................................................................................................. 17

2.1.1

Nguyên vật liệu .......................................................................................... 17

2.1.2

Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 17
i


Đồ án tốt nghiệp
2.2

Môi trường nghiên cứu ..................................................................................... 17

2.2.1

Môi trường phân lập và giữ giống Bacillus ............................................... 17

2.2.2

Môi trường khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn............... 18

2.2.3

Hóa chất SDS-PAGE ................................................................................. 19

2.3

Các phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 19

2.3.1

Phương pháp phân lập, giữ giống vi khuẩn Bacillus ................................. 19

2.3.2

Phương pháp định danh ............................................................................. 22

2.3.3

Phương pháp khảo sát hoạt tính protease .................................................. 27

2.3.4

Khảo sát các điều kiện thích hợp cho lên men khô dầu đậu nành ............. 31

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 40
3.1

Phân lập và định danh các chủng Bacillus ....................................................... 40

3.2

Khảo sát hoạt tính protease của vi khuẩn ......................................................... 42

3.2.1

Xác định dựa trên vòng phân giải .............................................................. 42

3.2.2

Xác định dựa trên cơ chất khô dầu đậu nành ............................................. 44

3.3

Khảo sát các điều kiện lên men ........................................................................ 46

3.3.1

Khảo sát độ ẩm thích hợp cho lên men ...................................................... 46

3.3.2

Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho lên men................................................... 48

3.3.3

Khảo sát độ dày thích hợp cho lên men cơ chất ........................................ 50

3.3.4

Khảo sát thời gian lên men thích hợp ........................................................ 51

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 54
4.1

Kết luận............................................................................................................. 54

4.2

Kiến nghị .......................................................................................................... 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 55
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1

ii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học và axít amin của khô dầu đậu nành tách vỏ Mỹ............ 5
Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hóa của chủng Bacillus subtilis ............................................. 9
Bảng 2.1. Trình tự bổ sung hóa chất để xây dựng đường chuẩn Tyrosine ................... 29
Bảng 2.2. Các bước xác định hoạt tính enzyme protease ............................................. 30
Bảng 3.1. Kết quả các thử nghiệm sinh hóa .................................................................. 41
Bảng 3.2. Kết quả vòng phân giải gelatin ..................................................................... 42
Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme protease (U/g) .................................................................. 44
Bảng 3.4. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức độ ẩm khác
nhau ............................................................................................................................... 46
Bảng 3.5. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức nhiệt độ khác
nhau ............................................................................................................................... 48
Bảng 3.6. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức độ dày khác
nhau ............................................................................................................................... 50
Bảng 3.7. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ khác nhau..................... 52

iii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1. Biểu thị đường kính vòng phân giải gelatin ................................................ 43
Đồ thị 3.2. Biểu thị hoạt tính enzyme sau các mốc thời gian ....................................... 44

Đồ thị 3.3. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các mức độ ẩm
khác nhau....................................................................................................................... 47
Đồ thị 3.4. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các nhiệt độ khác
nhau ............................................................................................................................... 49
Đồ thị 3.5. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các độ dày khác
nhau ............................................................................................................................... 51
Đồ thị 3.6. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian khác nhau ........ 53

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ chế phẩm Natto ......................................... 40
Hình 3.2. Hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi .......................................................... 40
Hình 3.3. Đường kính vòng phân giải gelatin ............................................................... 42
Hình 3.4. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức độ ẩm
khác nhau....................................................................................................................... 47
Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức nhiệt
độ khác nhau ................................................................................................................. 49
Hình 3.6. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức độ dày
khác nhau....................................................................................................................... 51
Hình 3.7. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức thời
gian khác nhau............................................................................................................... 53

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ctv

cộng tác viên

IU

đơn vị quốc tế

rpm

vòng/phút

SCA

Simmon Citrate Agar

SDS-PAGE

sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

Std

Thang chuẩn

Đc

Đối chứng

vi


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
❖ Đặt vấn đề
Khô dầu đậu nành, sản phẩm của quá trình tách chiết dầu từ hạt đậu nành, chủ
yếu được sử dụng để chế biến thức ăn chăn nuôi gà và heo, chiếm khoảng 74% tổng sản
lượng (Chen và ctv, 2010). Khô dầu đậu nành thường được sử dụng với tỷ lệ khoảng 1020% trong khẩu cho heo và gà. Đây là nguồn cung cấp protein rất tốt cho vật nuôi do có
hàm lượng các axít amin không thay thế cao.
Tuy nhiên, việc sử dụng khô dầu đậu nành trong khẩu phần thức ăn cho gia súc,
gia cầm non (hệ tiêu hóa chưa hoàn thiện) bị hạn chế, hiệu quả không cao do khô dầu
đậu nành chứa một số protein gây dị ứng.
Hai protein gây dị ứng chủ yếu trong đậu nành là glycinin (globulin 11S) và βconglycinin (globulin 7S). Chúng chiếm hơn 50% tổng lượng protein trong hạt đậu nành
(Samoto và ctv, 2007). Glycinin là một protein với cấu trúc gồm 5 tiểu đơn vị mà mỗi
một tiểu đơn vị gồm một chuỗi polypeptide mang tính axít (khối lượng phân tử 35-40
kDa) và một chuỗi polypeptide mang tính bazơ (22 kDa) liên kết với nhau bằng liên kết
disulfua (Helm và ctv, 2000; Beardslee và ctv, 2000; Hou và ctv, 2004; Golubovic và
ctv, 2005). Tổng lượng glycinin khoảng 20-70mg/g khô dầu đậu nành và chiếm đến 40%
tổng khối lượng protein trong đậu nành (van Eys và ctv, 2004; Sun và ctv, 2008).
Glycinin có khả năng bền nhiệt và kháng hầu hết các enzyme trong hệ tiêu hóa do có
liên kết disulfua khá bền (Kuipers và ctv, 2007). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, glycinin
gây dị ứng cho người và vật nuôi non do có khả năng gắn globulin miễn dịch E (IgE)
vào chuỗi axít polypeptide của mình. Nó làm tăng hàm lượng kháng thể glycinin-IgE
trong huyết thanh và đây là nguyên nhân gây dị ứng (Sun và ctv, 2007). Mặt dù khá
nhiều nghiên cứu cho thấy glycinin liên quan đến các triệu chứng của dị ứng như biến
đổi hình dáng nhung mao, đảo lộn chức năng miễn dịch, tăng trưởng chậm và tiêu chảy.

1

Đồ án tốt nghiệp
Tuy nhiên, cơ chế tác động của glycinin như thế nào hiện vẫn chưa được sáng tỏ. Một
vài nghiên cứu đề nghị rằng các tế bào phì hay dưỡng bào (mast cells) có liên quan trực
tiếp đến tính nhạy cảm của vật nuôi đối với protein glycinin. Các dưỡng bào này nằm
trong các lông tơ của ruột non để thực hiện chức năng nhu động và các quy trình đáp
ứng miễn dịch (Schneider và ctv, 2002). Các dưỡng bào này đóng vai trò chủ đạo trong
các phản ứng nhạy cảm của cơ thể vật nuôi hay con người đối với phức hợp glycininIgE thông qua một chuỗi các hoạt động như kích thích sản xuất một lượng lớn histamine
hay các cytokine miễn dịch (van Wijk và ctv, 2007). Tóm lại, glycinin trong khô dầu đậu
nành gây kích ứng miễn dịch ở động vật con, làm tăng hàm lượng globulin miễn dịch
(IgE, IgG), giải phóng histamine, làm tăng nhu động và sự bài tiết nước của ruột non,
dẫn đến tăng tỷ lệ heo con bị tiêu chảy, giảm năng suất (Li và ctv, 1991; Zhao và ctv,
2008; Sun và ctv, 2008; Hao và ctv, 2009).
Trong khi đó β-conglycinin là phân tử protein chứa 3 tiểu đơn vị khác nhau α (72
kDa), α’ (72 kDa) và β (53 kDa) (Doyle và ctv, 1986). Khô dầu đậu nành chứa khoảng
3-40 mg/g β-conglycinin (van Eys và ctv, 2004). β-conglycinin có khả năng kháng lại
các enzyme thủy phân so với các protein khác trong đậu nành. Các tiểu đơn vị của βconglycinin có thể kết tạo khối trong ruột non, giấu vị trí hoạt động (bám) đối với enzyme
nên nó khó bị tiêu hóa trong hệ tiêu hóa (Kuipers và ctv, 2007). Tương tự như glycinin,
β-conglycinin cũng làm giảm sinh trưởng ở heo con thông qua việc làm tăng hàm lượng
globulin miễn dịch (IgE) trong huyết thanh, phá hủy tính toàn vẹn của ruột non, làm
giảm khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng (Hao và ctv, 2009; Zhao và ctv, 2010). Tóm
lại, tuy khô dầu đậu nành là nguồn protein rất tốt cho vật nuôi nhưng nó cũng chứa nhiều
chất gây dị ứng. Các chất này gây kích ứng miễn dịch, tiêu chảy, ức chế enzyme tiêu
hóa, giảm tỷ lệ tiêu hóa, do đó làm giảm tăng trọng và năng suất của vật nuôi, đặc biệt
là vật nuôi giai đoạn non. Việc loại bỏ các chất có ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe của
vật nuôi là một đòi hỏi của thực tế sản xuất nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng của nguyên
liệu, góp phần giảm chi phí thức ăn.
2

Đồ án tốt nghiệp
Từ những nhân định trên tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI
KHUẨN BACILLUS ĐỂ PHÂN GIẢI PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG KHÔ DẦU
ĐẬU NÀNH VỚI PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN”.
❖ Mục tiêu, phạm vi đề tài
Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus có khả năng ngoại
tiết protease cao và ứng dụng chủng vi khuẩn này để lên men bán rắn nhằm loại bỏ các
protein gây dị ứng trong khô dầu đậu nành (glycinin, beta-conglycinin).
❖ Ý nghĩa đề tài
Phân lập được chủng vi khuẩn có đặc tính tốt trong sản sinh protease chuyển hóa
protein đậu nành, ứng dụng trong lên men khô dầu đậu nành, phục vụ trong chăn nuôi,
tiết giảm chi phí
❖ Địa điểm nghiên cứu
Phân viện chăn nuôi Nam Bộ, khu phố Hiệp Thắng, phường Bình Thắng, Dĩ An,
Bình Dương.
❖ Thời gian nghiên cứu
Từ ngày 17/4/2017 đến 16/7/2017

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về nghiên cứu sản xuất khô dầu đậu nành
1.1.1 Lên men khô dầu đậu nành để giảm thiểu chất gây dị ứng
Có khá nhiều phương pháp để giảm thiểu tác động hay phân hủy các chất trong
khô dầu đậu nành. Trong đó, phương pháp lên men vi sinh vật (với Bacillus, Aspergillus
và Lactobacillus) nhằm loại bỏ các chất gây dị ứng trong đậu nành đã được nghiên cứu

và ứng dụng trong thực tiễn sản xuất trên thế giới. Trong quá trình lên men, vi sinh vật
phân hủy carbohydrate của khô dầu nành và sử dụng chúng để phát triển. Việc giảm
lượng vật chất khô và tăng mật độ vi sinh làm tăng lượng protein trong khô dầu đậu
nành. Thêm vào đó, các vi sinh vật dùng cho quá trình lên men còn có khả năng tiết ra
môi trường amylase, protease, cellulase có khả năng phân hủy các protein, gây dị ứng và
tăng tính dễ tiêu hóa của các chất dinh dưỡng trong khô dầu đậu nành.
Chen và ctv (2010) cũng đã tiến hành lên men bán rắn khô dầu đậu nành với
Aspergillus oryzae và lên men kết hợp Aspergillus oryzae với Lactobacillus casei. Cả 2
phương pháp lên men đều cho thấy kết quả tốt trong việc tăng cường tính hữu dụng của
protein với hàm lượng trichloroacetic cao, khả năng tiêu hóa protein in vitro cao.
Lên men bán rắn khô dầu đậu nành sử dụng vi khuẩn thuộc giống Bacillus cũng
giúp loại bỏ các chất kháng dinh dưỡng, tăng cường các hoạt chất chống oxy hóa, tăng
tỷ lệ tiêu hóa ở heo (Wongputtisin và ctv, 2007; Feng và ctv, 2007a; Hu và ctv, 2010).
Phương pháp lên men sử dụng Bacillus subtilis tỏ ra có nhiều lợi thế hơn so với lên men
bằng Aspergillus oryzae trong việc loại bỏ các protein gây dị ứng và cải thiện chất lượng
thành phần các axít amin (Frias và ctv, 2007). Bào tử hay tế bào của vi khuẩn Bacillus
trong khô dầu đậu nành lên men còn được xem như nguồn cung cấp probiotic, có lợi cho
sức khỏe đường ruột của vật nuôi.

4


Đồ án tốt nghiệp
Phương pháp lên men sử dụng vi khuẩn Bacillus, Lactobacillus tỏ ra có nhiều lợi
thế hơn so với lên men với nấm mốc do sản phẩm có lượng protein hòa tan cao hơn, khả
năng phân giải các protein gây dị ứng tốt hơn, sinh trưởng nhanh hơn (Mukherjee và ctv,
2016).
Bảng 1.1. Thành phần hóa học và axít amin của khô dầu đậu nành tách vỏ Mỹ
Stt

Thành phần

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Đạm thô
Xơ thô
Béo
Khoáng tổng số
Lysin
Methionin
Cystein
Threonine
Tryptophan
Arginin
Isoluecin

% vật chất
khô
47,8
3,1

1,5
6,4
2,99
0,68
0,73
1,85
0,65
3,43
2,1

Stt
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

Thành phần
Leucin
Valin
Histidine
Phenylalanin
Tyrosin
Glycin

Serin
Prolin
Alanin
Aspartic axít
Glutamic

% vật chất
khô
3,57
2,26
1,22
2,33
0,4
1,99
2,32
2,34
2,02
5,42
8,58

1.1.2 Vấn đề sử dụng khô dầu nành lên men
Khá nhiều nghiên cứu ở ngoài nước đã tiến hành lên men khô dầu đậu nành bằng
vi sinh vật nhằm loại bỏ các chất gây dị ứng và đã sử dụng sản phẩm sau lên men cho
nhiều đối tượng vật nuôi. Khô dầu đậu nành lên men chứng tỏ có thể giúp tăng cường
hoạt động của enzyme tiêu hóa và tăng tỷ lệ tiêu hóa protein, cải thiện tăng trọng và sức
khỏe đường ruột, giảm tỷ lệ tiêu chảy ở heo và gà, đặt biệt là heo con và gà con
(Mathivanan và ctv, 2006; Cho và ctv, 2007; Feng và ctv, 2007b; Liu và ctv, 2007; Song
và ctv, 2010; Cervantes-Pahm và Stein, 2010; Xu và ctv, 2012; Zhang và ctv, 2013; Kim
và ctv, 2014). Nghiên cứu của Gebru và ctv (2010) cho thấy, khi sử dụng 5% khô dầu
đậu nành lên men bằng Bacillus subtilis trong khẩu phần của heo con, lượng thức ăn ăn

vào và tăng trọng tương đương với heo cho ăn khẩu phần có bổ sung 100 mg/kg kháng
5


Đồ án tốt nghiệp
sinh cholotetracycline và cao hơn heo ở khẩu phần không sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên,
hầu như không có bất kỳ nghiên cứu nào liên quan đến việc sản xuất chế phẩm khô dầu
đậu nành lên men dùng cho chăn nuôi và có rất ít các nghiên cứu sử dụng sản phẩm khô
dầu đậu nành lên men giàu protein này cho chăn nuôi ở nước ta được công bố.
Hiện tại, có ít nhất 5 loại sản phẩm khô dầu đậu nành lên men đã được nhập khẩu
và phân phối đại trà tại Việt Nam (Soytide của công ty CJ-Hàn Quốc; P-up 50 và EPS
500 của Thái Lan; Supersoy và Dabomb-P của công ty Suchiang-Đài Loan) với giá bán
từ 19.000-21.000 đ/kg, so với giá khô dầu đậu nành (không lên men) chỉ khoảng 10.00011.000 đ/kg. Chúng ta thấy rằng giá bán của khô dầu đậu nành gần như tăng gấp đôi sau
khi lên men. Hiện tại có khá nhiều nhà máy chế biến thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam đã
sử dụng khô dầu đậu nành lên men trong thức ăn cho heo con như thức ăn Delice B của
Proconco, Comfeed651 của công ty Japfa, S1 primary diets của công ty spotlight và viên
sữa H-10 của công ty RTD. Với 3,9 triệu nái trong đàn lợn của Việt Nam, thì mỗi tháng
lượng tiêu thụ khô dầu nành lên men là rất lớn, khoảng 20 ngàn tấn/tháng (> 200 ngàn
tấn/năm).
Như vậy, nếu chúng ta có thể sản xuất khô dầu nành lên men từ 3 triệu tấn nguyên
liệu này và cung cấp cho thị trường trong nước thì giá trị thặng dư sẽ rất lớn. Đề tài thành
công đồng nghĩa với việc khô dầu đậu nành lên men sẽ được sản xuất tại Việt Nam với
giá cả cạnh tranh hơn sản phẩm ngoại nhập do tiết kiệm được chi phí nhập khẩu và vận
chuyển, đồng thời giảm lệ thuộc vào công nghệ của nước ngoài.
1.2 Tổng quan về Bacillus
1.2.1 Vi khuẩn Bacillus
Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli

6


Đồ án tốt nghiệp
Bộ: Bacilliales
Họ: Bacilliaceae
Chi: Bacillus
Vi khuẩn thuộc chi Bacillus là nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ,
cỏ khô. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất
hiếm.
Vi khuẩn thuộc chi Bacillus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram
(+), kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn thường có 8 –
12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ
0,8 – 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng
axít, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng
xạ, áp suất, chất sát trùng.
Các loài vi khuẩn này lên men các loại đường như: glucose, maltose, manitol,
saccharose, xylose và arabinose. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4.
Vi khuẩn Bacillus đã được ứng dụng rất nhiều trong thực tế sản xuất từ lên men sản xuất
các sản phẩm truyền thống phục vụ cho con người (đậu natto, nước mắm, cá hộp…) đến
lên men sản xuất các sản phẩm trong lĩnh vực y dược, da giày, chăn nuôi. Một ứng dụng
khác của vi khuẩn thuộc Bacillus là thành phần của thuốc trừ sâu sinh học. Chủng vi
khuẩn thường được sử dụng trong các sản phẩm dạng này là Bacillus thuringiensis.
Enzym protease tách chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus (chủ yếu từ Bacillus
subtilis và Bacillus licheniformis) được sử dụng rộng rải trong bột giặt, kem đánh răng,
giày da.
Một số các protease mạnh nhất được sản xuất từ Bacillus licheniformis, B.
subtilis, B.amyloliquefaciens và B. mojavensis. Việc sản xuất protease của vi sinh thường
chịu tác động bởi sự biến động nguồn carbon và nitơ, sự thay đổi trong tỷ lệ C/N, sự hiện

7


Đồ án tốt nghiệp
diện của một số loại đường dễ dàng chuyển hóa, chẳng hạn như glucose. Một số yếu tố
vật lý như nhiệt độ, pH… cũng có ảnh hưởng đến sản xuất protease
1.2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis
1.2.2.1 Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg
và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir
Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn
xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis.
Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học
Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức
chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần
khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng
rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử
dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn
đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…Ngày nay, Bacillus
subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả
trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…
1.2.2.2 Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ,
cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường trong đất trồng trọt có khoảng
106 – 107 CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của
chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì
(trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo,

8


Đồ án tốt nghiệp
trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về
mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học.
1.2.2.3 Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước nhỏ 3 – 5 x
0,6 µm, tế bào thường nối với nhau thành chuỗi hoặc đứng riêng rẽ, có khả năng di động,
gồm 8 – 12 lông, có bào tử hình elip nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,8 – 1,8
µm. Vị tró của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo bất cứ một nguyên tắc chặt
chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm.
Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định, mỗi tế
bào sinh dưỡng sinh ra một bào tử. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong
chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi. Bào tử là một khối
nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng
nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần
mới. Bacillus subtilis phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid,
có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ...
1.2.2.4 Đặc điểm sinh hóa
Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi
trường thiếu oxi, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37oC, pH 7 – 7,4, tối ưu ở pH 7,2, Vi khuẩn
lên men không sinh khí các loại đường: Glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose,
arabinose và một số hoạt tính khác được liệt kê trong bảng sau
Bảng1.2. Đặc điểm sinh hóa của chủng Bacillus subtilis
Phản ứng

Kết quả

Hoạt tính catalase

+

Sinh indol

-

9


Đồ án tốt nghiệp
MR

+

VP

+

Sử dụng citrate

+

Khử nitrate

+

Tan chảy Gelatine

+

Di động

+

Phân giải tinh bột

+

Arabinose

+

Xylose

+

Saccharose

+

Mannitol

+

Glucose

+

Lactose

-

Maltose

+

1.2.2.5 Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát
triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0
– 7,4.
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản:
Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa
răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn
nheo, màu hơi nâu.

10


Đồ án tốt nghiệp
Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục
môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.
Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi
lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4 cm sau 72 giờ nuôi cấy.
Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố
vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như
glucose) và nitơ (như peptone).
1.3 Tổng quan về protease
1.3.1 Khái niệm
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết

peptide (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy
phân này có thể là acid amine, các polypeptide chuỗi ngắn. Nhiều enzyme protease còn
có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester, liên kết amide và phản ứng chuyển vị
gốc acid amin.
1.3.2 Phân loại
Các nhà khoa học đã phân loại protease của vi sinh vật thành 4 nhóm sau:
Protease serin: là những protease có chứa nhóm (-OH) của serin trong trung tâm
hoạt động. Các protease serin thường hoạt động ở pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối
rộng.
Protease thiol: là những protease có chứa nhóm thiol (-SH) của axít amin cystein
trong trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều biến
đổi hóa học như: axít hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa... Các protease thiol thường hoạt
động mạnh ở pH trung tính và có tính đặc hiệu rộng.
Protease axít: là những protease chứa nhóm (-COOH) trong trung tâm hoạt động.
Các nhóm (-COOH) thuộc mặt bên của asparagin hoặc axít glutamic hay ở đầu Carbon
11


Đồ án tốt nghiệp
của mạch polypeptide. Các protease axít thường hoạt động ở vùng pH axít. Chúng có
tính đặc hiệu đối với axít amin có vòng thơm hoặc kỵ nước ở hai phía của liên kết peptide
bị phân hủy.
Metallo protease: là những protease trong trung tâm hoạt động của chúng có các
ion kim loại. Các protease kim loại thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính,
chúng có thể tác động lên các peptide chứa nhóm (-NH-) của các axít amin kỵ nước hoặc
các liên kết peptide tạo thành từ các các axít amin có phân tử thấp.
1.3.3 Hoạt tính protease ở đậu nành
Hoạt tính protease thô, ngoại tiết trong nghiên cứu của Rajes (2005) là 2,43 U/ml
ở dòng Bacillus mojavensis. Saores và ctv (2005) đã tiến hành lên men bán rắn với cơ
chất là bánh đậu nành với vi khuẩn Bacillus subtilis 22, kết quả cho thấy hoạt tính tối đa

của protease ngoại tiết lên đến 960 IU/g canh trường. Trong khi đó, Khan và ctv (2011)
xác định hoạt tính protease ở chủng Bacillus CEMB 10370 là 0,7 IU/ml. Trên loài
Bacillus subtilis, Yang và ctv (2013) đã tiến hành lên men bán rắn khô dầu đậu nành
bằng chủng Bacillus subtilis GA15 và hoạt tính protease thô trong nghiên cứu của tác
giả này lên đến 1.249 IU/g canh trường khi tiến hành với cơ chất chứa 45% ẩm, chiều
dày cơ chất là 1,5 cm và lên men trong 60 giờ. Cũng trong trời gian này, Imtoaz và ctv
cũng đã tiến hành lên men bán rắn với cơ chất chủ yếu là đậu nành với Bacillus subtilis
IH72, tuy nhiên kết quả về hoạt tính tối đa của protease chỉ đạt 126,8 IU/g canh trường.
Ở Việt Nam, hoạt tính protease ngoại tiết của các chủng vi khuẩn phân lập từ tự nhiên
thường dao động từ 0,6- 2 IU/ml (Võ Hồng Thi và ctv, 2012; Quyền Đình Thi và ctv,
2013). Trong nghiên cứu của Phượng và ctv (2012), hoạt tính của protease ngoại tiết lên
đến hơn 560 IU/g canh trường khi tiến hành lên men bán rắn trên cơ chất đậu nành với
chủng vi khuẩn Bacillus spp. NP3. Nghiên cứu của Hùng và ctv (2013) khi nuôi cấy 15
chủng Bacillus subtilis trên môi trường bán rắn cám bắp- bã đậu nành thì hoạt tính
protease chỉ đạt từ 5 đến 19,64 IU/g canh trường. Khi nuôi trên quy mô 70kg/mẻ trên
12


Đồ án tốt nghiệp
môi trường bột bắp:bã đậu nành ép dầu với tỷ lệ 8:2, pH dịch khoáng 6,8 và thời gian
nuôi cấy là 72 giờ. Hoạt tính protease đạt khoảng 15 IU/g canh trường. Trong một nghiên
cứu khác, Bacillus pumilus DBF1227 được phân lập từ mẫu đất thu tại lò giết mổ gia súc
và bãi rác bời Hà và ctv (2014) lại cho hoạt tính enzyme ngoại tiết khá thấp 3,15 IU/ml.
1.4 Giới thiệu về lên men bán rắn
1.4.1 Những vấn đề cơ bản của lên men bán rắn
Lên men trên môi trường bán rắn hay lên men trên cơ chất rắn là một quá trình
trong đó sự sinh trưởng của vi sinh vật (VSV) và sự hình thành sản phẩm diễn ra trên bề
mặt của nguyên liệu gần như không có mặt của nước tự do, cơ chất chứa ẩm dưới dạng
hấp phụ trong mạng chất rắn. Hoạt động sống của VSV diễn ra chủ yếu trên bề mặt rắn.
Sự trao đổi nhiệt và khí hầu như là trực tiếp giữa pha rắn hay pha khí không qua chất

lỏng trung gian. Các phản ứng sinh học và sự chuyển hóa thực hiện trực tiếp giữa tế bào
VSV và cơ chất tại nơi tiếp xúc.
1.4.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn
Lên men bán rắn có những ưu điểm vượt trội so với lên men trong môi trường
lỏng. Đó là việc không cần khuấy đảo hay thông khí, đặc biệt là thành phần môi trường
nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền. Chẳng hạn, các cơ chất dùng trong lên men bán rắn thường là
các phế liệu của ngành nông nghiệp hay công nghiệp thực phẩm, tất cả đều là cơ chất rẻ
tiền và ổn định nên có tiềm năng sử dụng để sản xuất enzyme ở quy mô lớn.
Những ưu điểm khác so với lên men trong môi trường lỏng là nồng độ cơ chất
cao hơn, ít bị nhiễm tạp, giảm năng lượng và lượng nước sản xuất đầu vào, lên men bán
rắn không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi,
chỉ cần giữ ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp. Do đó, việc vận hành cũng như việc đầu tư
vừa đơn giản vừa ít tốn kém. Sau quá trình nuôi cấy, canh trường nuôi cấy bề mặt dễ
dàng sấy khô, chế phẩm khô dễ bảo quản, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không

13


Đồ án tốt nghiệp
cần khâu tách và làm sạch enzyme. Lượng enzyme được tạo ra từ lên men bán rắn thường
cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy lỏng.
1.4.3 Sự tạp nhiễm trong lên men bán rắn
Có rất nhiều nguyên nhân gây ra sự tạp nhiễm trong suốt quá trình lên men bán
rắn. Sự tạp nhiễm trong lên men bán rắn có thể đến từ môi trường nuôi cấy bị nhiễm (do
không được khử trùng kỹ, quy trình vô trùng không chuẩn, phòng vô trùng không đạt
mức vệ sinh cần thiết); dụng cụ lên men không được vô trùng tốt; vô trùng không khí
không hiệu quả.
Kiểm soát sự tạp nhiễm
Trong lên men bán rắn, sự tạp nhiễm là điều không thể tránh khỏi, việc lên men
đạt được hiệu quả nếu sự tạp nhiểm có thể được kiểm soát. Các kiểm tra lý hóa truyền

thống nguyên liệu cho lên men bán rắn được thực hiện bao gồm các chỉ tiêu ẩm độ, hoạt
độ nước, hoạt độ axít, tro toàn phần, thành phầm dinh dưỡng và các chỉ tiêu quy định
khác. Ngoài ra các chỉ tiêu khác trong quá trình lên men cũng cần được xác định như
mật độ và số lượng vi sinh trong mẻ lên men, hàm lượng độc tố sản sinh ra trong quá
trình trao đổi chất của vi sinh vật (mycotoxin). Bởi vì sự không đồng nhất trong qui trình
lên men bán rắn, ngay cả khi đối với cùng một chủng vi sinh và cùng một quy trình lên
men thì chất lượng các mẻ sản phẩm cũng sẽ khác nhau vì vậy quy trình sản xuất rất
khác nhau; hoặc ngay khi trong cũng một mẻ lên men sản phẩm cũng sẽ khác nhau. Do
đó, quy trình mẫu hay việc chuẩn hóa các nguyên liệu ban đầu phải dựa trên cơ sở đặc
điểm thành phần nguyên liệu của lên men bán rắn.
Việc kiểm soát tạp nhiễm trong lên men bao gồm: (1) kiểm soát hoạt độ nước
trong chất nền; (2) tăng mật độ vi sinh cấy vào; (3) điều chỉnh giá trị pH (bằng các thêm
vào acid acetic hoặc acid lactic vào môi trường có thể làm tăng khả năng kháng khuẩn
của môi trường); (4) Việc làm lạnh cũng có thể được thực hiện (nếu vào mùa hè, nhiệt

14


Đồ án tốt nghiệp
độ cao, môi trường thường dễ bị nhiễm vi thế nhiệt độ ủ có thể điều chỉnh thấp hơn, đây
cũng là một phương pháp cho thấy hiệu quả trong việc giảm sự nhiễm khuẩn cho lên
men); (5) Bổ sung muối có thể làm tăng hiệu quả đối kháng khi muối được bổ sung ở
nồng độ cao, nhưng ở nồng độ muối cao có thể gây ra ức chế hoạt động của enzyme.
Xử lý sau lên men
Yêu cầu cuối cùng của lên men bán rắn là sản phẩm thường cần được sấy khô.
Sấy là một phương pháp lâu đời nhất để bảo quản sản phẩm và cho đến nay nó vẫn là
một phương thức quan trọng trong một vài ngành công nghiệp hiện đại. Dựa trên các sản
phẩm khác nhau, phương pháp sấy được tóm tắt như sau: (1) sấy khô tự nhiên, (2) sấy
bằng khí nóng, (3) sấy phun, (4) sấy chân không và (5) sấy đông lạnh. Trong đó có ba
nhân tố chính tác động đến tỉ lệ sấy: độ ẩm trong nguyên liệu, điều kiện sấy và thiết bị

sấy.
1.4.4 Các giai đoạn của lên men bán rắn
Quá trình lên men có thể chia thành 2 pha:
•Pha thứ 1 – pha sinh trưởng
Các tế bào vsv còn non, sinh trưởng nhanh và tăng sinh khối – là quá trình sinh
tổng hợp protein và xây dựng tế bào. Môi trường nuôi cấy trong pha này giàu nguồn
Carbon, nitơ, phosphor. Sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật ở thời kì này không có
hoặc bắt đầu tích tụ với một lượng rất nhỏ và dần dần tăng lên đồng thời với sự phát triển
của giống đến khi ổn định thì chuyển sang pha thứ 2.
•Pha thứ 2 – pha tích tụ sản phẩm trao đổi chất:
Ở giai đoạn này, các tế bào vsv đã trưởng thành, sự phát triển sinh khối chậm lại
hoặc ngừng hẳn, các sản phẩm trao đổi chất tích tụ chủ yếu trong pha này. Trong môi
trường nuôi cấy, các nguồn carbon, nitơ, phosphor còn rất ít hoặc cạn gần hết. Thời kì

15


Đồ án tốt nghiệp
đầu của pha này, tế bào vsv có khả năng tổng hợp cao, tích tụ nhiều sản phẩm trong môi
trường. Ở cuối pha, lượng sinh khối bắt đầu giảm đi do tế bào bắt đầu tự phân và quá
trình tích tụ bị chậm lại, đồng thời một số sản phẩm sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng cho
vsv. Trong thực tế sản xuất, quá trình lên men thường được kết thúc trước điểm cuối pha
thứ 2 để tránh tình trạng tự phân sẽ làm tăng độ nhớt gây khó khăn cho việc tách lọc (Võ
Thị Xuyến (2006))

16