Nghiên cứu thu nhận n acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ penicillium oxalicum 20b định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN N-ACETYLGLUCOSAMINE (NAG)
BẰNG CHITINASE TỪ PENICILLIUM OXALICUM 20B
ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHÂM

Hà Nội - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết
quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc các tác giả khác công bố.
Hà Nội, ngày ….. tháng ….. năm 2017

Đặng Thị Hường

i


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS Lê Thanh
Hà và PGS. TS Phạm Thu Thủy - Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học
và Công nghệ thực phẩm - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn, dìu
dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi cũng xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành
và sâu sắc tới các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình giảng dạy, hƣớng dẫn tôi trong suốt thời

gian học tập và nghiên cứu vừa qua.
Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cám ơn PGS. TS Nguyễn Tiến Thành - Trƣờng
phòng Thu Hồi Sản phẩm, va các cán bộ nghiên cứu ở Trung tâm Nghiên Cứu và Phát
Triển Công Nghệ Sinh Học đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình
học tập và nghiên cứu khoa học.
Cuối cùng, tôi xin cám ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Cộng đồng Hà tây cùng
gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học
tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày ….. tháng ….. năm 2017
Nghiên cứu sinh

Đặng Thị Hường

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................. ii
MỤC LỤC .................................................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT........................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................................viii
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................................... x
MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3
1.1. N- ACETYLGLUCOSAMINE ........................................................................................... 3
1.1.1. Các đặc tính của N- acetylglucosamine ............................................................................ 3
1.1.2. Thực phẩm chức năng ...................................................................................................... 3

1.1.3. Vai trò N- acetylglucosamine trong sản xuất thực phẩm chức năng ................................ 4
1.1.4. Các phƣơng pháp sản xuất N- acetylglucosamine ............................................................ 6
1.1.4.1. Phƣơng pháp hóa học .................................................................................................... 6
1.1.4.2. Phƣơng pháp chuyển hóa sinh học ................................................................................ 6
1.1.4.3. Phƣơng pháp enzym ...................................................................................................... 7
1.2.. CHITIN ............................................................................................................................... 8
1.2.1. Cấu tạo hóa học và tính chất lý hóa của chitin ................................................................. 8
1.2.2. Nguồn thu nhận chitin .................................................................................................... 10
1.3. CHITINASE ...................................................................................................................... 11
1.3.1. Hệ chitinase .................................................................................................................... 11
1.3.2. Đặc tính sinh hóa ............................................................................................................ 11
1.3.3. Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG ......................................................... 13
1.3.4. Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG............................................ 15
1.3.4.1. Các giải pháp tiền xử lý chitin ..................................................................................... 15
1.3.4.2. Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase ....................................... 17
1.4. SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT ....................................................... 20
1.4.1. Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase ..................................................................... 20
1.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase ............................................. 21
1.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn và nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase ............................... 22
1.4.4. Ảnh hƣởng của nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase ...................................... 23
1.4.5. Ảnh hƣởng của pH tới sinh tổng hợp chitinase .............................................................. 24
1.4.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase ...................................................... 25
1.4.7. Ảnh hƣởng của thời gian tới sinh tổng hợp chitinase ..................................................... 25
1.4.8. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc và cƣờng độ khuấy tới sinh tổng hợp chitinase ........................... 26
1.5. PHƢƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE TỪ VI SINH VẬT .................................... 27
iii


1.5.1. Phân tách tạp chất rắn thu dịch chiết enzym ................................................................. 27
1.5.2. Cô đặc dịch chiết enzym ................................................................................................ 28

1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP TINH SẠCH NAG TỪ DỊCH THỦY PHÂN CHITIN ................................. 28
1.6.1. Ly tâm, siêu lọc loại tạp chất .......................................................................................... 28
1.6.2. Cô đặc…………………………………………………………………………………..28
1.6.3. Kết tinh ........................................................................................................................... 29
1.6.4. Tinh sạch NAG bằng dung môi ...................................................................................... 30
1.6.5. Qui trình tinh sạch để thu nhận NAG ............................................................................ 30
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 32
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU..................................................... 32
2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................................... 32
2.1.2. Chủng vi sinh vật ............................................................................................................ 32
2.1.3. Hóa chất .......................................................................................................................... 33
2.1.4. Thiết bị…........................................................................................................................ 33
2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ................................................................................ 33
2.2.1. Phƣơng pháp xác định sinh khối nấm mốc..................................................................... 33
2.2.2. Phƣơng pháp phân tích hóa lý ........................................................................................ 33
2.2.2.1. Phƣơng pháp xác định độ ẩm ...................................................................................... 33
2.2.2.2. Phƣơng pháp định lƣợng (NAG)i ................................................................................ 34
2.2.2.3. Phƣơng pháp xác định Nitơ tổng số của mẫu chitin .................................................... 35
2.2.2.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein của mẫu chitin .......................................... 35
2.2.2.5. Cách tính hàm lƣợng chitin ......................................................................................... 35
2.2.3. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzym ............................................................................ 36
2.2.3.1. Hoạt độ chitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp Binod cải tiến ............................ 36
2.2.3.2. Hoạt độ endochitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp Yabuki cải tiến ....................... 36
2.2.3.3. Hoạt độ -N-acetyl-D-hexosaminidase ....................................................................... 36
2.2.3.4. Hoạt độ chitobiosidase................................................................................................. 37
2.2.4. Phƣơng pháp xác định cấu trúc bề mặt của chitin, NAG ............................................... 37
2.2.5. Phƣơng pháp xác định đặc tính vật lý của chitin, NAG ................................................. 37
2.2.6. Phƣơng pháp xác định cấu trúc của chitin, NAG ........................................................... 38
2.2.7. Phƣơng pháp xác định sai số trung bình ......................................................................... 38
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 38

2.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng sinh tổng hợp chitinase ............................................ 38
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitinase kỹ thuật.................................... 38
2.3.3. Khảo sát đặc tính cơ bản của chế phẩm chitinase kỹ thuật ............................................ 39
2.3.4. Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật ............................................. 40
2.3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu thủy phân chitin ..................................................................... 40
iv


2.3.5.1. Phƣơng pháp tiền xử lý chitin ..................................................................................... 40
2.3.5.2. Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện phản ứng thủy phân chitin .................................. 43
2.3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu thu nhận N-Acetylglucosamine tinh sạch .............................. 43
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 47
3.1. NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ P. OXALICUM 20B ............................. 47
3.1.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên men ............................................................................... 47
3.1.1.1. Ảnh hƣởng của dạng chitin tới sinh tổng hợp chitinase .............................................. 47
3.1.1.2. Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng chitin tới sinh tổng hợp chitinase ......................... 47
3.1.1.3. Ảnh hƣờng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp chitinase ............................................... 49
3.1.1.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng cao nấm men tới sinh tổng hợp chitinase ........................ 50
3.1.2. Ảnh hƣởng điều kiện lên men ........................................................................................ 50
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng lên men tới sinh tổng hợp chitinase .......................... 50
3.1.2.2. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase ................................................ 51
3.1.3. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển và sinh tổng hợp chitinase............................... 52
3.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM CHITINASE
KỸ THUẬT……………… ...................................................................................................... 55
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi .......................................... 55
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ NAHase/Endochitinase tới khả năng tạo NAG ........................ 56
3.2.3. Lựa chọn điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật ............................................ 58
3.2.4. Xác định đặc tính sinh học của chế phẩm chitinase kỹ thuật ......................................... 59
3.2.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzym .............................................................. 59
3.2.4.2. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzym ...................................................................... 61

3.3. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT THỦY PHÂN CHITIN.......................... 63
3.3.1. Khảo sát lựa chọn chitin phế liệu thủy sản ..................................................................... 63
3.3.2. Lựa chọn phƣơng pháp tiền xử lý chitin tôm mũ ni ........................................................... 64
3.3.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ nghiền đến khả năng thủy phân chitin......................... 64
3.3.2.2. Ảnh hƣởng xử lý phối hợp nghiền bi và siêu âm tới khả năng thủy phân chitin .............. 65
2.3.2.3. Ảnh hƣởng các giải pháp xử lý chitin tới cơ cấu sản phẩm nhận đƣợc sau thủy phân ................. 67
3.3.2.4. Ảnh hƣởng của tác động nhiệt độ cao và áp suất ........................................................ 70
3.3.2.5. Ảnh hƣởng của tác động xử lý hóa học và vật lý ........................................................ 71
3.3.2.6. Ảnh hƣởng của trạng thái chitin tới quá trình thủy phân ra NAG ............................... 75
3.3.3. Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin ........................................................................... 77
3.3.3.1. Ảnh hƣởng nhiệt độ ..................................................................................................... 77
3.3.3.2. Ảnh hƣởng pH ............................................................................................................. 78
3.3.3.3. Ảnh hƣởng nồng độ gel chitin ..................................................................................... 78
3.3.3.4. Ảnh hƣởng nồng độ enzym ......................................................................................... 79
3.4. NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM NAG ............................................................. 82
3.4.1. Ảnh hƣởng mức độ cô đặc dịch sau thủy phân tới quá trình kết tinh lần 1 ......................... 82
3.4.2. Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/ dịch thủy phân cô đặc tới quá trình kết tủa cồn ....................... 83
3.4.3. Ảnh hƣởng mức độ cô đặc và tỷ lệ EtOH/ dịch thủy phân cô đặc tới hiệu suất thu hồi
v


và độ tinh sạch chế phẩm NAG ................................................................................................ 84
3.4.4. Đề xuất và ứng dụng qui trình thu nhận NAG .................................................................... 87
3.4.4.1. Đề xuất qui trình thu nhận NAG ................................................................................. 87
3.4.4.2. Ứng dụng qui trình thu nhận NAG với qui mô 5 lit dịch thủy phân ........................... 87
3.5. XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM NAG .................................................................... 91
3.5.1. Xác định vi sinh vật ........................................................................................................ 91
3.5.2. Xác định kim loại nặng ................................................................................................... 91
3.5.3. Xác định liều độc LD50 ................................................................................................... 91
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 93

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN .................................... 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 95
PHỤ LỤC ............................................................................................................................... 107
Phụ lục 1. Mẫu nguyên liệu chitin .......................................................................................... 107
Phụ lục 2. Thành phần môi trƣờng tuyển chọn và nuôi cấy P. oxalicum 20B ....................... 107
Phụ lục 3. Đồ thị đƣờng chuẩn NAG bằng phƣơng pháp DNS.............................................. 108
Phụ lục 4. Đồ thị đƣờng chuẩn BSA để xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp
Lowry………… ..................................................................................................................... 108
Phụ lục 5. Đồ thị đƣờng chuẩn p-nitrophenyl N-axetyl-β-D glucosaminidase (pNP-NAG) . 108
Phụ lục 6. Đặc tính các phân đoạn enzym sau cô đặc 2, 3, 4 lần ........................................... 109
Phụ lục 7. Ảnh hƣởng của mức độ cô đặc dịch thủy phân đến HSTH NAG ......................... 109
Phụ lục 8. Thủy phân gel chitin 40% ra dịch NAG với Bx = 2,2% ....................................... 110
Phụ lục 9. Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới
NAG thất thoát vào kết tủa bởi EtOH .................................................................................... 111
Phụ lục 10. Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới
HSTH NAG và Độ tinh sạch NAG ........................................................................................ 112
Phụ lục 11. Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới
NAG thất thoát vào dịch không kết tich ................................................................................. 112
Phụ lục 12. Kết quả phân tích chỉ tiêu E. coli, Salmonella và Pb, Hg, Cd ............................. 112
Phụ lục 13. Kết quả xác định LD50 ......................................................................................... 112
Phụ lục 14. Kết quả phân tích hàm lƣợng NAG bằng HPLC ................................................. 112

vi


DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
TT

Các từ hoặc
thuật ngữ viết tắt

Giải thích các từ hoặc thuật ngữ viết tắt

1

CK

2

CNM

Cao nấm men

3

CFU

Số đơn vị hình thành khuẩn lạc

4

CPE

Chế phẩm enzyme

5

DSC

Phân tích nhiệt vi sai

6

DNS

Acid dinitro salicylic

7

Endo

Éndochitinase

8

E/ S

Tỷ lệ Enzyme / cơ chất (v/v)

9

FTIR

Phân tích quang phổ hồng ngoại (Fourier Transform
Infared)

10

h

11

H/ E

12

HSTH

Hiệu suất thu hồi

13

HSTP

Hiệu suất thủy phân

14

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chất khô

Giờ
Tỷ lệ NAHase / Endochitinase

Chromatography)
Không phát hiện

15

KPH

16

KT

Kích thƣớc

17

M

Mực

18

MN

Mũ ni

19

NAG (hay GlcNAc)

20

(NAG)2

Diacetyl-chitobiose

21

(NAG)3

Triacetyl-chitotriose

22

NAHase (hay Hexo)

23

S

24

SA

25

SEM

Vi điển tử quét (Scanning Electron Microscopy)

26

pNP

p-nitrophenol

27

TLC

Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography)

28

v/p

N-acetylglucosamine hay N-acetyl-D-glucosamine

N-acetylglucosaminidase
acetylhexosaminidase

hay

Sú
Siêu âm

Vòng/phút

vii

β-N-


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Ứng dụng và lợi ích của NAG ................................................................................... 6
Bảng 2.1. Thành phần hóa học nguyên liệu chitin (% chất khô) .............................................. 32
Bảng 2.2. Sử dụng chất phụ gia bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật ở 4oC ........................ 40
Bảng 2.3. Xử lý nhiệt, áp suất lên nguyên liệu chitin............................................................... 40
Bảng 2.4. Các phân đoạn kích thƣớc nguyên liệu chitin .......................................................... 41
Bảng 3.1. Động thái sinh tổng hợp chitinase, endochitinase, NAHase
của Penicillium oxalicum 20B .................................................................................................. 53
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới hoạt độ chitinase và tỷ lệ chitinase, tỷ lệ NAHase
và endochitinase trong các phân đoạn ...................................................................................... 56
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu nhận chitinase, NAHase và
endochitinase trong các phân đoạn ........................................................................................... 56
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của mức độ cô đặc tới cơ cấu enzym chitinase và khả năng thủy phân
chitin………. ........................................................................................................................... 58
Bảng 3.5. Hàm lƣợng chitin của các loại nguyên liệu .............................................................. 63
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng mức độ nghiền bi tới tính chất các phân đoạn bột nghiền .................... 64
Bảng 3.7. Hàm lƣợng (NAG)i (với i từ 1 – 3) trong dịch thủy phân chitin tôm mũ ni (đƣợc
tiền xử lý bằng các phƣơng pháp khác nhau) bởi chế phẩm enzym kỹ thuật trong thời gian
120 h…………… ..................................................................................................................... 67
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ, áp suất xử lý chitin tôm mũ ni kích thƣớc 600 µm <
MN < 2 mm tới hiệu suất thủy phân (%) .................................................................................. 70
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của vi sóng xử lý chitin tôm mũ ni kích thƣớc 600 µm < MN < 2 mm
tới hiệu suất thủy phân (%) ....................................................................................................... 70
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 1500 C kết hợp với áp suất 2 psi; SA gián đoạn 3 lần
(mỗi lần 20 phút) có mặt enzym lên chitin tôm mũ ni kích thƣớc 425 µm tới hiệu suất thủy phân (%) ....................................................................................................... 71
Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp xử lý hóa học và vật lý lên chitin tôm mũ ni
thô tới hiệu suất thủy phân (%) ................................................................................................ 72
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp xử lý hóa học và vật lý lên chitin tôm mũ ni
kích thƣớc 425 µm Bảng 3.13. Ảnh hƣởng xử lý vật lý lên gel chitin tới hiệu suất thủy phân (%) ........................ 74

Bảng 3.14. Ảnh hƣởng xử lý hóa chất lên gel chitin tới hiệu suất thủy phân (%) ................... 74
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng hóa chất lên gel chitin (qua rửa) tới hiệu suất thủy phân (%) ............. 74
Bảng 3.16. Khảo sát NAG tạo thành khi thủy phân gel chitin MN và bột chitin MN < 63
μm……………. ........................................................................................................................ 75
Bảng 3.17. Ảnh hƣởng tỷ lệ giữa nồng độ enzym so với nồng độ chitin lên hiệu suất thủy
phân ra NAG sau 48h thủy phân (khi dịch enzym/dịch chitin là 1/1 (v/v)) ............................. 81
viii


Bảng 3.18. Hiệu suất thu hồi NAG sau lọc dòng ngang ........................................................... 82
Bảng 3.19. Ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch chế phẩm NAG. 84
Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc tới
HSTH và độ tinh sạch chế phẩm NAG..................................................................................... 87
Bảng 3.21. Kết quả tinh sạch chế phẩm NAG .......................................................................... 89
Bảng 3.22. Qui mô thí nghiệm ảnh hƣởng tới HSTH và độ tinh sach chế phẩm NAG ........... 89
Bảng 3.23. Đặc điểm của sản phẩm NAG ................................................................................ 92

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo NAG ............................................................................................. 3
Hình 1.2. Sản xuất NAG bằng chuyển hóa sinh học. ................................................................. 7
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan, cellulose ......................................................... 9
Hình 1.4. Liên kết hydro nội phân tử chitin. .............................................................................. 9
Hình 1.5. Dạng cấu hình α, β, γ- chitin. ................................................................................... 10
Hình 1.6. Minh họa cơ chế hoạt động của chitinase................................................................. 14
Hình 2.1. Khuẩn lạc chủng 20B trên môi trƣờng MS-chitosan (A), ảnh bào tử (B) và cuống
sinh bào tử trần (C) ................................................................................................................... 32
Hình 2.2. Quy trình thu nhận N-Acetylglucosamine ................................................................ 44

Hình 3.1. Ảnh hƣởng dạng chitin tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên men ................ 47
Hình 3.2. Ảnh hƣởng nồng độ chitin thô tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên men ..... 48
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên men .... 49
Hình 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ cao nấm men tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên
men………………… ............................................................................................................... 50
Hình 3.5. Ảnh hƣởng pH môi trƣờng tới sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên
men……………. ...................................................................................................................... 51
Hình 3.6. Ảnh hƣởng tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men ............. 51
Hình 3.7. Động thái sinh trƣởng phát triển và sinh tổng hợp chitinase của P. oxalicum 20B
theo thời gian lên men .............................................................................................................. 53
Hình 3.8. Khả năng thủy phân dịch gel chitin 50% thành đƣờng khử bằng dịch lên men
chứa chitinase lấy ở các thời điểm lên men khác nhau (dịch lên men pha loãng 02 lần)......... 54
Hình 3.9. Sắc ký bản mỏng của các sản phẩm thủy phân từ gel chitin 50% bởi dịch lên men
đƣợc pha loãng 2 lần trong điều kiện 35ºC, pH 5, thời gian 24 h. (1) NAG chuẩn nồng độ
20 mg/ml (dùng 2,5 µl); (2) Đối chứng;( 3), (4), (5), (6), (7), (8) tƣơng ứng thời gian lấy
mẫu dịch lên men 72 h; 96 h; 108 h; 120 h; 132 h; 144 h (dùng 2,5 µl) .................................. 55
Hình 3.10. Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân gel chitin 10% bởi phân đoạn cô đặc 4 lần trên
màng và dƣới màng (cùng hoạt độ 0,0024 U/ml chitinase) ở điều kiện pH 5 và nhiệt độ
35oC………….. ........................................................................................................................ 57
Hình 3.11. Ảnh hƣởng các giải pháp bảo quản chế phẩm enzym kỹ thuật tới hoạt tính chitinase ...... 59
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ tƣơng đối: chitinase (A),
endochitinase (C), NAHase (E) và tới hoạt độ tƣơng đối theo thời gian lƣu giữ tại 30ºC
(); 35ºC (); 40ºC (), 45ºC () và 50ºC (): chitinase (B), endochitinase (D),
NAHase (F). ............................................................................................................................. 60
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt độ tƣơng đối: chitinase (A), endochitinase
(C), NAHase (E) và tới độ bền chitinase (C), endochitinase (E), NAHase (F) theo thời gian
lƣu giữ ở pH 3 (), pH 4 (), pH 5 (), pH 6 (), pH 7 ()……………….. ............................ 62
x

Hình 3.14. HSTP tƣơng đối chitin tôm S, chitin tôm MN và chitin M; phối trộn dịch chitin
9 mg/ml và dịch chitinase 0,02 U/ml với tỷ lệ 1:1 (v/v)........................................................... 64
Hình 3.15. Ảnh hƣởng kích thƣớc các phần tử chitin MN sau nghiền tới đƣờng khử tạo
thành……………… ................................................................................................................. 65
Hình 3.16. Ảnh hƣởng xử lý siêu âm chitin MN sau nghiền bi tới đƣờng khử tạo thành. ....... 65
Hình 3.17. Ảnh hƣởng phƣơng thức xử lý chitin từ vỏ tôm mũ ni tới
đƣờng khử tạo thành sau 120 h thủy phân ................................................................................ 66
Hình 3.18. Sắc ký đồ HPLC của dịch thủy phân chitin tôm mũ ni (đƣợc tiền xử lý bằng các
phƣơng pháp khác nhau) bởi chế phẩm enzym kỹ thuật trong thời gian 120 h, pic NAG
xuất hiện tại thời gian 13,688 phút ........................................................................................... 68
Hình 3.19. Ảnh hiển vi điển tử quét của các loại nguyên liệu chứa chitin.A. Chitin tôm mũ
ni thô (MN thô); B. 425 μm < MN < 600 μm; C. MN < 63 μm; D. 425 μm < MN < 600 μm
+ SA; E. Chitin mực thô (M thô); K. Chitin tôm sú thô (S thô). .............................................. 68
Hình 3.20. Các đƣờng cong phân tích nhiệt vi sai (DSC) đối với chitin MN, ở điều kiện
không khí, tốc độ gia nhiệt mẫu 20ºC / phút ............................................................................. 69
Hình 3.21. A. Các đƣờng cong phân tích nhiệt vi sai (DSC) ở điều kiện không khí, tốc độ
gia nhiệt mẫu 20ºC / phút. M3_DSC:12,10 mg chitin MN < 63 μm; M5_DSC:21,3 mg gel
chitin MN. B. Phổ FTIR của chitin MN < 63 μm (M3_FTIR) và gel chitin MN
(M5_FTIR). …… ..................................................................................................................... 76
Hình 3.22. (A) Ảnh hƣởng của nhiệt độ 45ºC (), 30ºC (), 35ºC (), 40ºC () tới quá
trình thủy phân chitin. (B) Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sản phẩm nhận đƣợc sau 36 h thủy
phân gel chitin: (1) Chất NAG chuẩn; (2) 45ºC; (3) 40ºC; (4) 35ºC; (5) dịch enzym; (6) gel
chitin…… ................................................................................................................................. 77
Hình 3.23. (A) Ảnh hƣởng pH tới quá trình thủy phân chitin. (B) Ảnh hƣởng của pH tới
sản phẩm nhận đƣợc sau 24 h thủy phân gel chitin: (1) Chất NAG chuẩn; (2) pH 3; (3) pH
4 (4) pH 5; (5) pH 6; (6) pH 7; (7) dịch enzym; (8) gel chitin……………… ......................... 78
Hình 3.24. Ảnh hƣởng của nồng độ gel chitin tới khả năng thủy phân chitin thành NAG
(phối trộn dịch enzym 3,867 mU/ml chitinase và gel chitin 40% với tỷ lệ 1/1 (v/v) và thủy
phân ở pH 5, 40ºC. (A) NAG tạo thành trong dịch thủy phân (mg/ml); (B) Hiệu suất thủy
phân tƣơng đối (%) ……………… .......................................................................................... 79

Hình 3.25. Ảnh hƣởng của nồng độ chitinase tới khả năng thủy phân gel chitin. (nồng độ
gel chitin 40%, pH 5, 40ºC). ..................................................................................................... 80
Hình 3.26. Ảnh hƣởng nồng độ enzym tới khả năng thủy phân cơ chất 40% gel chitin lên
NAG tạo thành trong 24 h ở pH 5, 40ºC., tỷ lệ dịch enzym/dich gel chitin là 1/1 (v/v) .......... 81
Hình 3.27. Ảnh hƣởng mức độ cô đặc dịch thủy phân tới lƣợng tinh thể kết tinh lần 1 và
lƣợng NAG thất thoát vào tinh thể kết tinh lần 1 (%) .............................................................. 82
Hình 3.28. Ảnh hƣởng của tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc tới NAG thất thoát vào kết
tủa và lƣợng cặn kết tủa thu đƣợc. ............................................................................................ 83
xi


Hình 3.29. Sắc ký đồ HPLC. A. (NAG)i chuẩn với i =1-3; B. Dịch thủy phân gel chitin
40% với Bx = 2,2%; C. Chế phẩm NAG kết tinh từ dịch thủy phân Bx = 29,3%. Ký hiệu
3NAG là mẫu chuẩn của đƣờng triacetyl-chitotriose ((NAG)3), mẫu 2NAG là mẫu chuẩn
của diacetyl-chitobiose ((NAG)2), mẫu NAG là mẫu chuẩn của N-acetyl-D- glucosamine
(NAG)…… ............................................................................................................................... 85
Hình 3.30. Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc tới khả năng thu hồi NAG,
NAG thất thoát vào kết tủa bởi EtOH và vào dịch không kết tinh. .......................................... 86
Hình 3.31. Kết quả phân tích HPLC trong mẫu chứa NAG. A. Mẫu hỗn hợp chất chuẩn
1NAG, 2NAG, 3NAG; B. Mẫu sản phẩm sau tinh sạch; C. Mẫu kết tủa EtOH; D. Mẫu dịch
không kết tinh. .......................................................................................................................... 88
Hình 3.32. A. Các đƣờng cong phân tích nhiệt vi sai (DSC) ở điều kiện không khí, tốc độ
gia nhiệt mẫu 20ºC/ phút, M6_DSC: 9,0 mg sản phẩm NAG sau tinh sạch, M7_DSC: 11,21
mg NAG của hãng Sigma. B. Phổ FTIR của sản phẩm NAG sau tinh sạch (M6_FTIR) và
NAG hãng Sigma (M7_FTIR) ................................................................................................... 90

xii


MỞ ĐẦU

Ở nước ta, trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng
tăng; đến năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt trên 692000 ha với sản lượng trên
596000 tấn, kim ngạch xuất khẩu khoảng 3 tỷ USD. Tuy nhiên ngành sản xuất này hàng
năm cũng thải ra một lượng lớn phụ phẩm giáp xác (khoảng 70000 tấn) gây ô nhiễm mạnh
mẽ tới môi trường. Do vậy, để nâng cao lợi ích kinh tế và giảm thiểu ô nhiễm môi trường,
cần khai thác tận thu những thành phần có lợi từ phế liệu như chitin, protein, astaxantin.
Chitin đại diện cho polymer sinh học tự nhiên và đứng thứ hai sau cellulose, có mặt
trong vỏ xương ngoài loại giáp xác: vỏ cua, vỏ tôm,… Chitin không được sử dụng nhiều
do tính không tan trong nước.
Một trong những sản phẩm được tạo ra từ chitin là N- acetylglucosamine (N-acetylD-glucosamine, hay GlcNAc, hay NAG). NAG có tiềm năng chữa bệnh như viêm khớp,
viêm dạ dày,... Ngoài ra NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị
bệnh tự miễn dịch [73].
Đa số NAG được sản xuất bằng thủy phân hóa học HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao. Xử
lý hóa học gây nhiều bất lợi như lượng phế thải acid, hiệu suất tạo NAG thấp (dưới 65%)
và giá thành cao. Thêm nữa, NAG có vị mặn và hơi đắng bởi các hợp chất còn dư lại. Do
vậy, nhiều nghiên cứu đã tập trung thủy phân chitin sản xuất NAG bởi chitinase. Công bố
sản xuất NAG từ chitin bởi chitinase thô từ vi sinh vật còn khiêm tốn. Xuất phát từ nhu cầu
thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Nacetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hướng
ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”.
* Mục tiêu nghiên cứu:
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ Penicillium oxalicum 20B.
- Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật
* Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B.
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật.
- Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật nhận
được.
- Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh sạch hướng tới ứng dụng vào thực phẩm
chức năng.
* Những đóng góp mới của luận án:

1


- Là công trình công bố đầu tiên một cách hệ thống về đặc tính enzym và điều kiện lên
men sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B.
- Đã tạo ra chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P. oxalicum 20B và xác định các đặc tính
của chế phẩm, ứng dụng để thủy phân chitin thu N-acetylglucosamine. Đặc biệt ảnh hưởng
của từng cấu tử endochitinase và N-acetylhexosaminidase trong hỗn hợp chế phẩm chitinase
kỹ thuật đến hiệu suất tạo N-acetylglucosamine đã được xem xét.
- Đã đưa ra qui trình thu nhận và tinh sạch N-acetylglucosamine từ dịch thủy phân
gel chitin và xác định các đặc tính của chế phẩm N-acetylglucosamine để sử dụng làm
nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. N- ACETYLGLUCOSAMINE
1.1.1. Các đặc tính của N- acetylglucosamine
N-Acetylglucosamine là dẫn xuất của đường
glucoza, có nhóm amit liên kết giữa glucosamine
và axit axetic. Công thức phân tử C8H15NO6, khối
lượng phân tử là 221,21 g/mol.
NAG có dạng bột màu trắng, vị ngọt nhẹ,
nóng chảy ở 221oC, khả năng hoà tan của NAG là
25% trong nước. NAG hiếm khi tồn tại ở dạng tự
do, ngoại trừ trong sữa người (khoảng 600 - 1500
mg/ml).

Hình 1.1. Công thức cấu tạo NAG

NAG là thành phần cấu trúc chính của polysaccharide như chitin. Ngoài ra nó có
trong thành tế bào vi khuẩn (trong các đơn phân murein) và lipopolysaccharide của màng
ngoài. Ở vi khuẩn, khi murein phân hủy thì NAG lại hình thành liên quan đến sự
phosphoryl hóa, vì GlcNAc-6-phosphate (GlcNAc-6-P) được sử dụng để tổng hợp murein
hay lipopolysaccharide hoặc có thể được chuyển hóa bằng con đường đường phân.
1.1.2. Thực phẩm chức năng
Khái niệm chung:
Thuật ngữ Dược phẩm dinh dưỡng (Nutraceuticals) do TS Y khoa Stephen DeFelice
(người sáng lập ra “Quỹ cải tiến y học”) đặt ra vào năm 1980. Đây là loại thực phẩm có lợi
cho sức khỏe bằng cách bổ sung những hoạt chất hay thành phần thiên nhiên đem lại sức
khỏe hoặc tăng cường sức khỏe cho cơ thể con người. Và cũng vào năm 1980, lần đầu tiên
khái niệm thực phẩm chức năng được phát triển ở Nhật Bản khi đất nước này phải đối mặt
với chi phí leo thang chăm sóc sức khỏe. Bộ Y tế và Phúc lợi nước Nhật đã khởi xướng
một hệ thống quản lý phê duyệt thực phẩm nhất định vì lợi ích sức khỏe với hy vọng cải
thiện sức khỏe của các quốc gia dân số già [14]. Năm 1994 ở nước Mỹ, Viện Hàn Lâm
Khoa Học Thực phẩm và Dinh dưỡng định nghĩa thực phẩm chức năng là “bất kỳ thực
phẩm biến đổi hoặc nguyên liệu thực phẩm có thể đem lại lợi ích cho sức khỏe ngoài các
chất dinh dưỡng truyền thống” [162]. Viện Khoa học Đời sống quốc tế định nghĩa thực
phẩm chức năng là loại thực phẩm mà nhờ sự hiện diện các thành phần sinh lý có lợi cho
sức khỏe ngoài chế độ dinh dưỡng cơ bản [59]. Năm 1999, Hiệp hội Dinh dưỡng Mỹ
định nghĩa thực phẩm chức năng như là thực phẩm “toàn bộ, vững chắc, làm giàu hoặc
tăng cường” nhưng quan trọng hơn thực phẩm đó phải được tiêu thụ như “…phần trong
chế độ ăn uống thường xuyên và đa dạng, các cấp độ hiệu quả” cho người tiêu dùng có
sức khỏe tốt [10].
3


Tại Việt Nam, thông tư 08 (năm 2004) của Bộ Y tế định nghĩa: "Thực phẩm chức

năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh
dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh".
Do đó, thực phẩm chức năng khác với thực phẩm thông thường ở chỗ được sản xuất,
chế biến theo công thức: bổ sung một số thành phần có lợi hoặc loại bỏ một số thành phần
bất lợi của thực phẩm. Việc bổ sung hay loại bớt phải được chứng minh và cân nhắc một
cách khoa học và được cơ quan nhà nước có thẩm quyền cho phép.
Thực phẩm chức năng có tác dụng với sức khỏe nhiều hơn các chất dinh dưỡng
thông thường và liều sử dụng thường nhỏ, thậm chí được tính bằng miligram hoặc gram.
Các tiêu chuẩn về nguyên liệu sử dụng cho thực phẩm chức năng Việt Nam:
Thông tư số 02/2011/TT-BYT của Bộ trưởng Bộ Y tế đưa ra: các sản phẩm sữa dạng bột,
giới hạn ô nhiễm đối với Cd là 1,0 mg/kg, Pb là 0,02 mg/kg, Hg là 0,05 mg/kg; đặc biệt thực
phẩm bổ sung thì giới hạn ô nhiễm đối với Cd là 1 mg/kg, Pb là 3,0 mg/kg, Hg là 0,1 mg/kg.
Thông tư số 03/2012/TT-BYT của Bộ trưởng Bộ Y tế đưa ra: Chỉ tiêu vi sinh vật gây
bệnh như E. coli, Samonella là đều không phát hiện (KPH) trong các sản phẩm sữa dạng
bột,..
1.1.3. Vai trò N- acetylglucosamine trong sản xuất thực phẩm chức năng
NAG đã được ứng dụng rộng trong cung cấp dinh dưỡng sử dụng điều trị tổn thương
xương khớp, để cải thiện các triệu chứng do thoái hóa khớp, tăng cường khả năng tái tạo
sụn khớp, điều trị tận gốc nguyên nhân gây bệnh về khớp. NAG được dùng để phục hồi lớp
sụn nối, hỗ trợ chữa bệnh viêm khớp mãn tính [56].
Ở người cao tuổi khả năng tổng hợp NAG của cơ thể bị giảm sút dễ mắc bệnh viêm
xương khớp, vì thế mà người ta phải đưa từ bên ngoài vào cơ thể dưới dạng thuốc, có tác
dụng chống viêm và kích thích sản xuất sụn.
Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện điều trị cho bệnh nhân rối loạn khớp
bao gồm các bệnh: viêm khớp, viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương sụn,
tổn thương khớp, thoái hóa khớp. Kết quả nghiên cứu cho thấy NAG có vai trò quan trọng
trong việc phòng chống tổn thương khớp, chống viêm xương khớp mãn, viêm khớp mãn
tính và bệnh tổn thương sụn xương [29].
Bên cạnh đó NAG được dùng như tác nhân chống viêm chữa nhiều bệnh: nhiễm vi
khuẩn mãn tính, viêm ruột và dạ dày. NAG còn có khả năng tăng cường giải phóng

mucopolysaccharide acid nguyên bào sợi, hình thành cấu trúc bảo vệ đường tiêu hóa do
vậy làm tăng tính đàn hồi các mô xung quanh mạch và hoạt động như một tác nhân bảo vệ,
khôi phục sự toàn vẹn và chức năng bình thường niêm mạc ruột ở người.

4


Một thử nghiệm thí điểm lâm sàng để xác định hiệu quả điều trị của NAG trên bệnh
viêm ruột. Trẻ em bị bệnh Crohn đã cho thấy sự cải thiện rõ ràng sau khi được dùng NAG
đường uống hay đường hậu môn. Thực tế, trong thử nghiệm này, 8 trong số 12 trẻ em cho
thấy cải thiện rõ rệt khi được cho uống NAG như là một liệu pháp song song với liệu pháp
hiện hành, trong khi 4 trường hợp còn lại không thấy chuyển biến. Ngoài ra, 7 trẻ bị bệnh
viêm ruột khác cũng được dùng NAG đường hậu môn như là một liệu pháp duy nhất đã cho
thấy cải thiện rõ rệt ở 5 em và 2 em còn lại không đáp ứng liệu pháp. Đáng lưu ý là 2 em
không đáp ứng với NAG đường hậu môn trước đó đã đề kháng lại các liệu pháp khác [130].
Do đó, NAG hứa hẹn là một phương pháp điều trị rẻ tiền và không độc hại đối với bệnh
viêm ruột mãn tính. Gần đây, thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III vừa được hoàn thành [91].
Da người gồm ba lớp là lớp biểu bì (lớp ngoài cùng), lớp trung bì và lớp hạ bì (lớp
bên trong cùng) để bảo vệ cơ thể khỏi các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như thời
tiết khô, tia cực tím… Lớp biểu bì đóng vai trò quan trọng trong việc tái tạo tế bào da, duy
trì độ ẩm, độ săn chắc cho da. Lớp trung bì bao gồm collagen, elastin… được tạo ra bởi các
nguyên bào sợi giúp làm tăng khả năng phục hồi, độ bền, độ đàn hồi, săn chắc giúp cho làn
da luôn khỏe mạnh. Một trong những nhóm carbonhydrate phức tạp như acid hyaluronic
(HA) và proteoglycan có khả năng giữ nước cao và là thành phần quan trọng trong việc
duy trì độ ẩm cho da. Lượng cabonhydrate giảm dần theo lứa tuổi, khả năng giữ nước và
phục hồi của da giảm và do đó làm cho da khô, xuất hiện các nếp nhăn. Bổ sung NAG giúp
tăng cường sự phát triển và biểu hiện collagen của nguyên bào sợi, thúc đẩy sự gia tăng
của tế bào sừng có tác dụng giữ ẩm, giảm sự xuất hiện các sắc tố da trên khuôn mặt, cải
thiện nếp nhăn trên da [31].
NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị bệnh tự miễn dịch

[73]. Ngoài ra, dùng NAG trong mỹ phẩm, băng bó vết thương, và như phụ gia thực phẩm
sữa. Lợi ích và ứng dụng NAG thể hiện trên Bảng 1.1.
N-acetyl glucosamine được sử dụng qua đường ăn uống được thẩm thấu qua thành
ruột và giúp cơ thể người sản sinh chodroitin và axit hyaluronic. Axit hyaluronic là thành
phần cần thiết cho độ giữ nước và độ đàn hồi trong cơ thể, là phần không thể thiếu trong
chống lão hóa làn da và khớp [135]. Trên mô hình thực nghiệm viêm xương khớp, tiêm
NAG vào nội khớp đã bảo vệ được sụn [110, 140].
Bổ sung NAG qua đường nước uống đã cải thiện các triệu chứng của những bệnh
nhân bị viêm khớp gối có thể là do tăng loại tổng hợp II collagen [69].
Con người sử dụng NAG qua đường thực phẩm ở liều lượng 1000 mg/ ngày giúp cơ
thể bảo vệ sụn khớp là do tăng sự tổng hợp collagen loại II và giảm được sự suy thoái
collagen loại II [164].
Bissett và cs (2007), Chen và cs (2010) công bố nghiên cứu lâm sàng về NAG lên
người bệnh khi uống như: sự hấp thụ, phân phối và đào thải khi uống nó [17]. Nghiên cứu
5


của Chen và cs (2010) đã chỉ ra tỷ lệ hấp thụ đạt 98% và mỗi khi NAG được hấp thụ, nó sẽ
phân phối chính vào tế bào khớp nhằm kết nối chặt chẽ thành ma trận tế bào khớp nối của
sụn, dây chằng, gân [29].
Trong cơ thể người, NAG giữ nguyên dạng glucoprotein, như chất kích hoạt hàng
loạt các chất trong huyết tương có thể hoạt hóa thành plasma [149].
Chế phẩm chứa NAG được sử dụng bằng đường tiêm, uống. Một liều lượng lớn
NAG (20 g) tiêm tĩnh mạch không hề độc tính và không thay đổi nồng độ glucose
trongmáu [138]. Người ta cũng đã chứng minh rằng: 54% NAG cung cấp được bài
tiết qua đường nước tiểu trong 1 ngày, điều đó chỉ rõ trong chuỗi các phản ứng sinh
hóa của NAG.
Bảng 1.1. Ứng dụng và lợi ích của NAG

Chức năng

Đối tượng

Thử nghiệm

Tài liệu
tham khảo

Điều trị bệnh

Ung thư và di căn
Bệnh đường ruột
Bệnh rối loạn đường ruột
Tổn thương khớp

Động vật, con người
Con người
Con người
Con người

[184]
[185]
[159]
[94]

Phòng ngừa
bệnh

Ngộ độc thuốc và chất hóa học
Thuốc kháng sinh

Tác dụng phụ của điều trị hóa
trị và điều trị sóng vô tuyến
Say tàu xe

Tế bào vi sinh vật,
động vật
Vi khuẩn
Con người
Con người

[186]

Bệnh ngoài da

Vệ sinh da

Con người

[180]

Thực phẩm bổ
sung

Phụ gia trong sữa
Phụ gia trong đồ uống thể thao

Động vật, con người
Động vật, con người

[181]

[175]

[183]
[184]
[182]

Giữ độ ẩm cho da
Con người
[29]
Tăng tính đàn hồi và màu sắc
Con người
[135]
Giảm sản xuất melanin
Con người
[17]
Các phép thử độc tố cho thấy NAG không độc. Ngoài ra NAG được tạo ra bởi enzym
có vị ngọt và bền nhiệt. Chính vì vậy, gần đây NAG và dẫn xuất từ NAG đã được sử dụng
để bổ sung vào chế độ ăn uống, phát triển rộng trong chữa bệnh cho con người [7].
Làm mỹ phẩm

1.1.4. Các phương pháp sản xuất N- acetylglucosamine
1.1.4.1. Phương pháp hóa học
Theo phương pháp hóa học, NAG được sản xuất bằng cách dùng axit HCl đậm đặc để thủy
phân chitin ở nhiệt độ cao. Nhiệt độ và nồng độ axit cần phải kiểm soát một cách chặt chẽ, đủ cao
để thủy phân chitin và tránh phân hủy NAG. Thường quá trình thủy phân diễn ra ở nhiệt độ khoảng
từ 40 - 80ºC và nồng độ HCl từ 15 - 36%. Sản lượng NAG có thể đạt 6,42 g/l trong 1 h [24].
Phương pháp này thường đạt hiệu suất thủy phân thấp (dưới 65%), giá thành cao và thải ra một
6

lượng lớn axit gây ô nhiễm môi trường xung quanh, sản phẩm cuối có vị mặn và có tác dụng phụ
do quá trình hóa học [133]. Đặc biệt nhóm axetyl bị mất đi nên lại phải axetyl hóa trở lại khá phức
tạp. Do vậy sản phẩm không được coi là tự nhiên bởi sự có mặt các chất hóa học (như O-axetyl,
diaxetyl, dung môi) trong sản phẩm đã gây vị đắng [75].
1.1.4.2. Phương pháp chuyển hóa sinh học
Sản xuất NAG qua quá trình chuyển hóa trực tiếp chitin bởi vi sinh vật tổng hợp chitinase
không thông qua giai đoạn thu các chế phẩm trung gian. Phương pháp này có ưu điểm là ít
công đoạn nhưng quá trình khó kiểm soát do sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất khác ngoài NAG.
Theo Li và cs (2005) nếu dùng 2% gel chitin làm cơ chất nuôi cấy vi khuẩn Aeromonas
caviae DYU-BT4 từ mẫu đất ở Taiwan có thể thu NAG với hàm lượng 7,8 g/l [87].
Theo nghiên cứu khác của Chen và cs (2011), Chitinibacter tainanensis phân lập từ
đất phía Nam Taiwan thủy phân cơ chất -chitin và ß-chitin cho hiệu suất thu hồi NAG lần
lượt là 76% và 98%. Kết tinh dịch lên men thu NAG với độ tinh sạch trên 99% [32]. Các
nhân tố phân giải chitin (CDFs) có thể thủy phân chitin và được tạo ra trong suốt thời kỳ
phát triển của C. tainanensis khi có mặt chitin. Hoạt tính NAHase và endochitinase được
tìm thấy trong vi khuẩn sống và phần tế bào chết. Hoạt độ riêng NAHase cao hơn nhiều so với
endochitinase. Cơ chế hoạt động các nhân tố phân giải chitin được minh họa trên Hình 1.2.

Hình 1.2. Sản xuất NAG bằng chuyển hóa sinh học [75].

Ngoài ra NAG được sản xuất thông qua chủng biến đổi di truyền sử dụng glucose
làm cơ chất. Các đường hướng chuyển hóa D-glucosamin và tổng hợp NAG có thể thay
đổi bằng kỹ thuật di truyền nhằm tăng hoạt tính enzym, giảm các sản phẩm kìm hãm và
tăng ái lực với cơ chất, nên có thể tạo ra sản phẩm nồng độ cao. Dùng vi sinh vật biến đổi
gen và không tận dụng được nguồn chitin là nhược điểm của phương pháp.
1.1.4.3. Phương pháp enzym
7


Chitinase là hệ enzym thủy phân chitin để thu nhận NAG bằng phương pháp enzym.

Ở qui mô công nghiệp lớn, có thể sản xuất NAG bằng chitinase tinh sạch. Tuy nhiên
chitinase tinh sạch rất đắt kể cả từ các chủng biến đổi gen. Nên trong thực tế hay dùng
enzym thô thu nhận NAG.
Phân giải chitin thành NAG bởi chitinase diễn ra theo hai giai đoạn. Đầu tiên endochitinase
(EC 3.2.1.14) phân giải chitin thành các oligomer, sau đó các oligomer bị phân giải thành các
monomer bởi NAHase (EC 3.2.1.96) [132]. Sáng chế của Haynes và cs (1999) tại nước Mỹ đã thu
nhận NAG bằng chitinase (bao gồm chitinase và chitobiosidase) thủy phân vỏ loài giáp xác [53].
Pichyangkura và cs (2002) đã dùng chitinase thô từ Burkholderia cepacia TU09 và
Bacillus licheniformis SK-1 thủy phân bột mịn α-chitin, β-chitin tạo NAG. Chitinase từ B.
cepacia TU09 thủy phân β-chitin trong 1 ngày và α-chitin trong 7 ngày đều có hiệu suất
thu nhận NAG hơn 85%. Chitinase từ B. licheniformis SK-1 thủy phân β-chitin trong 6
ngày cho hiệu suất thu nhận NAG khoảng 75%. Ngoài ra, hiệu suất thu nhận NAG đạt
41% khi thủy phân α-chitin bằng B. licheniformis SK-1 [115].
Bohlmann và cs (2004) đã đưa ra sáng chế: NAG thu được với độ tinh sạch cao bằng
cách thủy phân chitin bởi sinh khối nấm sợi [24].
Aiba (2005) đã dùng dịch enzym thô (gồm NAHase và chitinase) từ Aeromonas
hydrophila H-2330 để sản xuất NAG với quy mô lớn [7].
Jung và cs (2007) công bố sản xuất NAG và N-acetylchitooligosaccharide bởi dịch
enzym thô từ Paenibacillus illinoisensis KJA-424 [63].
Sau thời gian 48h thủy phân β – chitin bằng chitinase từ nấm Aspergillus sp, hiệu
suất thủy phân (HSTP) NAG đạt 65%. Pha trộn hai enzym thô từ Trichoderma viride và
Acremonium cellulolyticus thủy phân tốt β - chitin dạng bột [60, 137].
Hiện nay, tiềm năng sản xuất NAG là sử dụng hệ enzym tái tổ hợp chitinase được
nhân lên trong E.coli [80].
So với phương pháp hóa học, phương pháp thủy phân chitin bằng enzym diễn ra
trong điều kiện nhẹ nhàng, không gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm NAG có thể tinh
sạch gần 100% nên được ưa thích hơn [78].
Đối với phương pháp thủy phân chitin bằng enzym thì phần chitin vô định hình thủy phân
một cách dễ dàng, còn chitin liên kết chặt chẽ được thủy phân từ từ. Hỗn hợp endochitinase,
exochitinase (chitobiosidase và NAHase) là cần thiết cho sự thủy phân hoàn toàn chitin, khi hàm

lượng NAHase cao thì NAG tạo ra có độ tinh khiết cao. Do vậy, cấu trúc tinh thể chitin và thành
phần enzym là hai yếu tố quan trọng trong sản xuất NAG bằng phương pháp enzym [29].

1.2. CHITIN
1.2.1. Cấu tạo hóa học và tính chất lý hóa của chitin
8


Chitin là 1 polysaccharide mạch thẳng gồm các β-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucose. Hay
nói cách khác: Chitin được cấu tạo từ các đơn phân là NAG liên kết bởi liên kết 1,4- β-glycoside và
hình thành một mạng lưới các sợi có tổ chức. Cấu trúc hóa học chitin giống với cấu trúc hóa học
cellulose, chitosan. Chúng chỉ khác nhau bởi các nhóm -OH, -NH2, -NHCOCH3 (Hình 1.3).
Chitin có màu trắng, cứng, không đàn hồi, không tan trong nước và các dung môi
hữu cơ thông thường nhưng có thể được hòa tan trong các dung môi như hexafluoro-2propanol, N,N-dimethylacetamid, hexafluroacetone, lithium thiocyanate. Ngoài ra, chitin
có thể tan trong acid trichloroacetic (TCA), acid dichloroacetic (DCA). Muối LiCNS, Ca
(CNS)2…có khả năng hydrat hóa mạnh mẽ để phân giải chitin [117].

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan, cellulose [74]

Khi ở trong dung dịch HCl đậm đặc, chitin bị phân hủy hoàn toàn thành 88,5% DGlucosamine và 11,5% axit acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở mối nối glycoside,
sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3).

Đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc sẽ tạo thành chitosan vì chitin bị
mất gốc acetyl: Chitin + n NaOH (đậm đặc)
Chitosan + n CH3COONa
Trong cấu trúc tinh thể chitin, các chuỗi chitin tạo thành các tấm qua liên kết hydro. Cấu trúc
tinh thể chitin ổn định là do liên kết hydro, tương tác kỵ nước trong phân tử và giữa các phân tử.
Mỗi một chuỗi có nhiều liên kết hydro giữa các phân tử đường lân cận gọi là liên kết nội phân tử
gồm liên kết hydro giữa nhóm cacbonyl với nhóm hydroxyl ở vị trí cacbon - 6 và một liên kết
hydro thứ hai giữa nhóm OH ở cacbon - 3 và vòng oxi, tương tự như liên kết hydro trong chuỗi

cellulose. Ngoài ra, các chuỗi còn được giữ vững bởi liên kết hydro mạnh giữa C = O và N – H
[101]. Liên kết hydro lớn làm tăng cường độ cứng chuỗi tinh thể chitin.
9


Hình 1.4. Liên kết hydro nội phân tử chitin [101].

Chitin có trình tự sắp xếp cao, cấu trúc tinh thể. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X
[101], người ta đã chứng minh chitin tồn tại ba dạng cấu hình: α-chitin, β-chitin và γ-chitin
[47], các dạng này khác nhau về trình tự sắp xếp chuỗi trong vùng tinh thể. Dạng chitin khác
nhau chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (NAG) trong mạch thể hiện
Hình 1.5. Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu mũi tên chỉ nhóm
–CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ- chitin được mô tả sau:

Hình 1.5. Dạng cấu hình α, β, γ- chitin [47].

Ba dạng đa hình chitin khác nhau về mức độ hydrat hóa, kích thước và số chuỗi
chitin trong một đơn vị tế bào.
-chitin (có nhiều trong vỏ tôm, cua) được phân bố rộng rãi nhất, là dạng rắn chắc và
kết tinh nhất, các chuỗi được sắp xếp kiểu đối song song đều đặn [28], nên ngoài liên kết
hydro trong một lớp và hệ chuỗi, còn có liên kết hydro giữa các lớp kề nhau. Do vậy làm
đặc tính -chitin rất bền vững, cứng và không tan trong nước.
Cấu trúc -chitin có thêm các liên kết hydro (được tạo bởi các nhóm hydroxymethyl
(CH2OH) của các chuỗi liền kề nhau), trong khi đó không tìm thấy liên kết này ở cấu trúc β
– chitin [104].
β-chitin (có nhiều trong mai mực) gồm các chuỗi song song, trong khi γ-chitin (nhiều
trong nấm và nấm men) có hai chuỗi song song theo một hướng kết hợp chuỗi thứ ba với
hướng đối diện song song, giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Loại γ-chitin rất ít nghiên
cứu vì nó được cho là cấu trúc lỗi của một trong hai dạng α hoặc β – chitin chứ không phải là
một dạng cấu trúc thứ ba của chitin hoặc có thể coi nó là biến thể của α-chitin [15].

Sự phân bổ các dạng này không liên quan tới nguyên tắc phân loại vì các dạng khác
nhau có thể xuất hiện trong một cơ thể, mặc dù đặc tính chức năng khác nhau: α-chitin là
dạng đầy đủ nhất, rất cứng [126]. So sánh -chitin với ß-chitin, ß-chitin dễ bị thủy phân
bởi enzym hơn nhưng -chitin tồn tại trong tự nhiên phổ biến hơn. β-chitin và γ-chitin có
tính bền, mềm dẻo và nhiều chức năng sinh lý hơn. Dạng β có thể chuyển đổi sang dạng α
10


bằng xử lý với kiềm nhưng không thể chuyển ngược lại và dạng γ-chitin có thể chuyển đổi
sang α-chitin bằng cách xử lý với lithium thiocyanate [103].
1.2.2. Nguồn thu nhận chitin
Chitin được tách lần đầu tiên từ nấm vào năm 1811 [25]. Chitin là hợp chất polimer có mặt
từ nhiều nguồn khác nhau. Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật
không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Ở động vật bậc cao, chitin
là thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp sự tái tạo và gắn liền các vết trên da. Ở thực vật,
chitin có trong thành tế bào nấm họ Zygenmyctes, sinh khối nấm mốc, một số loại tảo…
Các nguồn chitin từ công nghiệp thủy sản bao gồm vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực ống và
mực nang. Nhìn chung, hàm lượng chitin trong phế liệu giáp xác chiếm khoảng 10 – 60%
so với trọng lượng khô [154].
Hiện nay chitin được tách chiết từ vỏ giáp xác chủ yếu là bằng các phương pháp hóa
học; ứng dụng công nghệ điện hóa để tách chiết và tinh chế chitin từ vỏ đầu tôm [6]; trong
thời gian gần đây các phương pháp sinh học đã bắt đầu nghiên cứu sử dụng sản xuất chitin
[16]. Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản chiếm 30 – 35% tổng lượng nguyên liệu ở
Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông
lạnh giáp xác chiếm 70 - 80% công suất chế biến.
Các nhà máy chế biến thủy sản tiêu thụ lượng lớn nguyên liệu nên đã thải ra lượng đáng kể
phế liệu trong đó phế liệu vỏ - đầu tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ là chủ yếu. Ở Việt Nam, hàng năm các
nhà máy chế biến đã thải bỏ lượng phụ phẩm giáp xác khá lớn khoảng 70000 tấn. Riêng tỉnh
Khánh Hòa, lượng phế liệu này khoảng 2257 tấn/ năm. Phế liệu này thải trực tiếp ra môi trường
và gây ô nhiễm lớn, nếu đem xử lý chất thải thì chi phí rất lớn. Chính vì vậy, phế liệu ngành thủy

sản Việt Nam (vỏ tôm, ghẹ,..) cần được tận dụng nhằm nâng cao lợi ích kinh tế, đồng thời giải
quyết bài toán ô nhiễm môi trường do ngành chế biến thủy sản mang lại.

1.3. CHITINASE
1.3.1. Hệ chitinase
Hệ thống chitinase thủy phân chitin gồm: Endochitinase (E.C 3.2.1.14), exochitinase
(EC 3.2.1.52) gồm 1,4-β-chitobiosidase (E.C. 3.2.1.30) và β-N-acetylhexosaminidase
(EC 3.2.1.96).
1.3.2. Đặc tính sinh hóa
Chitinase từ các nguồn khác nhau có đặc tính sinh hóa tương đối khác nhau.
Chitinase (E.C 3.2.1.14) có khối lượng phân tử khoảng 20 kDa đến 90 kDa. Khối
lượng phân tử chitinase vi khuẩn từ 20 kDa đến 60 kDa, nhỏ hơn chitinase côn trùng (khối
lượng phân tử từ 40 - 85 kDa); khối lượng phân tử chitinase thực vật giống khối lượng
phân tử chitinase côn trùng (khoảng 40 kDa đến 85 kDa) [18]. Khối lượng phân tử
11


chitinase từ nấm mốc khoảng 27 kDa đến 190 kDa. Chẳng hạn: khối lượng phân tử
chitinase từ Aspergillus sp và Coccidioides immitis khoảng 83 đến 97 kDa. Hầu hết chế
phẩm chitinase từ nấm cho nhiều hơn 1 loại enzym như: 7 loại enzym gồm 1,4-βchitobiosidase (40 kDa) [52], hai loại NAHase (102 và 73 kDa) bốn loại endochitinases
(52, 42, 33 và 31 kDa) trong dịch chitinase từ Trichoderma harzianum [51]; ít nhất hai
loại enzym từ Talaromyces flavus [85]; hai loại exochitinase và một endochitinase từ nấm
ký sinh loại lớn Stachybotrys [161]. Chế phẩm chitinase chứa ít nhất sáu enzym khác nhau
từ nấm Metarhizium anisopliae [64]. Endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô
từ Aeromonas sp. PTCC 1691 [60]. Dịch chitinase từ Penicillium oxalicum chứa NAHase
(132 kDa) [121] và endochitinase (54,9 kDa) [123].
Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Streptomyces sp. M-20 là 30ºC [70]; từ
Streptomyces rimosus là khoảng 40 - 45ºC [26]; từ Sanguibacter là 37ºC [188]; từ
Penicillium ochrochloron MTCC 517 là 40oC [113]; từ Aspergillus sp là 40ºC [137],...
Hoạt độ chitinase từ Aspergillus sp khi để nhiệt độ ở 45ºC và 50ºC trong 63 h còn tương

ứng lần lượt 90%, 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [137].
Hoạt độ tương đối của chitinase tinh sạch từ Lactobacillus plantarum WCFS1 đạt
cao nhất ở khoảng nhiệt độ 35ºC - 40ºC trong thời gian 30 phút, nhưng giảm mạnh khi
nhiệt độ trên 55ºC; ở nhiệt độ 37ºC và 50ºC, hoạt tính enzym còn lại lần lượt 82% và 58%
sau thời gian 168 h; ở nhiệt độ lần lượt 37ºC và 50ºC, hoạt tính enzym còn lại ½ sau thời
gian tương ứng 20 ngày và 8,4 ngày [13]. Chitinase tinh sạch từ Vibrio alginolyticus TK-22
hoạt động tối ưu ở 45ºC và ổn định ở 40ºC trong 30 phút [108]; chitinase tinh sạch từ Vibrio
sp. P-6-1 ổn định ở 40ºC mất hoàn toàn hoạt tính ở 55ºC trong thời gian 30 phút [157].
Nhiệt độ tối ưu của hầu hết chitinase từ nấm mốc khoảng 20 - 40ºC [52, 81, 85, 86,
116, 167]. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu của chitinase chịu nhiệt trong khoảng 45ºC đến 80ºC
như: Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Stenotrophomonas maltophilia là 45ºC [168]; từ
Serratia marcescens là 50ºC [191]; từ Thermomyces lanuginosus là 55ºC, từ Aspergillus
protuberus là 55ºC [50]; từ Talaromyces emersonii là 65ºC [97], hoạt độ chitinase từ
Talaromyces emersonii khi để nhiệt độ 70ºC trong 20 phút hoặc để nhiệt độ 65ºC trong 25 phút
đều còn 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [85]. Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ
Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 là 80ºC [165]. Endochitinase và β-Nacetylhexosaminidase từ Aspergillus flavus và Fusarium oxysporum đều có nhiệt độ tối ưu 62ºC,
nhưng các enzym này từ Penicillium monoverticillium hoạt động tốt nhất tại 52ºC [153].
Chitinase từ Penicillium thường hoạt động ổn định ở nhiệt độ khá cao tới 45ºC;
chitinase từ P. aculeatum hoạt động ổn định ở 50ºC [22].
Rodriguez và cs (1993) khẳng định nhiệt độ tối ưu đối với chitobiosidase và chitinase
từ Penicillium oxalicum lần lượt là 45ºC và 50ºC. Cả chitobiosidase và chitinase đều bền ở
45ºC trong thời gian 20 h [122]. Rodriguez và cs (1995) cho rằng chitinase tinh sạch từ P.
12