Xác định amlodipin besilat và perindopril tert butylamin bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

TRẦN NGỌC HẰNG

XÁC ĐỊNH AMLODIPIN BESILAT VÀ PERINDOPRIL TERT-BUTYLAMIN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

TRẦN NGỌC HẰNG

XÁC ĐỊNH AMLODIPIN BESILAT VÀ PERINDOPRIL TERT-BUTYLAMIN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. LÊ ĐÌNH CHI
PGS.TS. PHẠM THỊ NGỌC MAI

Hà Nội – 2018


LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Đình Chi và PGS.TS Phạm Thị Ngọc
Mai đã giao đề tài, nhiệt tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng đã tận tình chỉ
bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới công ty 3S Analysis đã thiết kế lắp đặt và
hỗ trợ các trang thiết bị trong quá trình thực hiện nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích nói riêng
và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian
học tập tại trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên bộ
môn Hóa phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày 30 tháng 01 năm 2018
Học viên

Trần Ngọc Hằng


MỤC LỤC
MỤC LỤC .........................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC BẢNG..............................................................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ...............................................................................................vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... viii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1. Giới thiệu chung .................................................................................................... 3
1.1.1. Thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin ............. 3
1.1.2. Tính chất vật lý, vai trò và tác dụng phụ ......................................................... 4
1.2. Các phƣơng pháp xác định .................................................................................... 7
1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký......................................................................................... 7
1.2.2. Phƣơng pháp quang phổ .................................................................................. 9
1.2.3. Phƣơng pháp điện hóa ................................................................................... 10
1.2.4. Các phƣơng pháp điện di mao quản (CE) ..................................................... 11
1.3. Phƣơng pháp điện di mao quản ........................................................................... 13
1.3.1. Độ điện di, tốc độ điện di và thời gian điện di .............................................. 14
1.3.2. Mao quản ....................................................................................................... 15
1.3.3. Dòng điện di thẩm thấu (EOF) ...................................................................... 16
1.3.4. Dung dịch đệm pH và pha động trong phƣơng pháp điện di mao quản ....... 19
1.3.5. Kỹ thuật bơm mẫu trong phƣơng pháp điện di mao quản ............................. 19
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ..................................................................................... 21
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu ...................................................... 21
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu ................................................................ 21
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 22
2.2.1. Phƣơng pháp khảo sát xác định các điều kiện thích hợp .............................. 22

i


2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu................................................................................. 23
2.3. Hóa chất và thiết bị .............................................................................................. 25
2.3.1. Hóa chất ......................................................................................................... 25
2.3.2. Thiết bị dụng cụ ............................................................................................. 26
2.4. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích ............................ 28

2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp
phân tích. ................................................................................................................. 28
2.4.2. Độ chụm (độ lặp lại) của phƣơng pháp ......................................................... 29
2.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của phƣơng pháp......................................................... 29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 31
3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện xác định amlodipin bessilat và perindopril
tert-butylamin bằng phƣơng pháp điện di mao quản CE-C4D ................................... 31
3.1.1. Khảo sát ảnh hƣởng của hệ đệm.................................................................... 31
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu ............ 38
3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn cho các chất phân tích và đánh giá phƣơng pháp phân
tích .............................................................................................................................. 41
3.2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn ................................................................................. 41
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp43
3.2.3. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi) ................................ 44
3.3. Phân tích mẫu thuốc............................................................................................. 47
3.3.1. Mẫu dƣợc phẩm Coveram chứa Amlodipin besilat và Perindopril tertbutylamin ................................................................................................................. 48
3.3.2. Mẫu thuốc Coversyl ...................................................................................... 49
3.3.3. Mẫu dƣợc phẩm Ambelin và Amlodipin ...................................................... 51
3.4. Xây dựng quy trình chiết pha lỏng Amlodipin besilat trong mẫu nƣớc tiểu nhằm
xác định bằng phƣơng pháp CE – C4D. ...................................................................... 53
3.4.1. Khảo sát lựa chọn dung môi .......................................................................... 53

ii


3.4.2. Khảo sát lựa chọn pH chiết ........................................................................... 55
3.4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích dung môi ................................................... 56
3.4.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian lắc ........................................................... 58
3.4.5. Đánh giá phƣơng pháp phân tích Amlodipin besilat trong mẫu nƣớc tiểu
bằng phƣơng pháp CE – C4D kết hợp xử lý mẫu phân tích bằng chiết lỏng – lỏng59

3.4.6. Phân tích mẫu nƣớc tiểu thực tế .................................................................... 61
KẾT LUẬN .................................................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.

Thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin........... 3

Bảng 1.2.

Các chất thƣờng dung làm pha động trong CE và giá trị pK của chúng .... 19

Bảng 2.1.

Thông tin và đặc điểm của từng loại mẫu dƣợc phẩm ............................... 23

Bảng 3.1.

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng pH đến diện tích pic (Spic) và thời gian di
chuyển (tdc) của Am, Per ............................................................................ 32

Bảng 3.2.

Kết quả khảo sát sự phụ thuộc diện tích pic của Am và Per vào thành phần
hệ đệm điện di ............................................................................................ 35

Bảng 3.3.

Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) và thời gian di
chuyển (tdc) của Am và Per vào nồng độ dung dịch đệm điện di ............... 37

Bảng 3.4.

Kết quả sự phụ thuộc diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của
Am và Per vào thời gian bơm mẫu ............................................................. 39

Bảng 3.5.

Kết quả sự phụ thuộc diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của
Am và Per vào chiều cao bơm mẫu. ........................................................... 39

Bảng 3.6.

Điều kiện tối ƣu cho phân tích hỗn hợp Am và Per bằng phƣơng pháp CE
– C4D .......................................................................................................... 41

Bảng 3.7.

Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Am và Per ................................... 42

Bảng 3.8:

Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Am và Per ................................................ 43

Bảng 3.9.

Giới hạn phát hiện Am và Per bằng phƣơng pháp điện di mao quản CEC4D ............................................................................................................. 44

Bảng 3.10. Giá trị khoảng tuyến tính, LOD và LOQ của chất phân tích Am và Per ... 44
Bảng 3.11. Kết quả xác định độ lặp lại của phƣơng pháp CE-C4D trong định lƣợng
Am .............................................................................................................. 45
Bảng 3.12. Kết quả xác định độ lặp lại của phƣơng pháp CE-C4D trong định lƣợng Per
.................................................................................................................... 45
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp dựa trên thêm chuẩn Am ...... 47

iv


Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp dựa trên thêm chuẩn Per ...... 47
Bảng 3.15. Kết quả xác định nồng độ Am và Per trong mẫu thuốc Coveram .............. 49
Bảng 3.16. Kết quả xác định nồng độ Per trong mẫu dƣợc phẩm Coversyl ................. 50
Bảng 3.17. Kết quả xác định nồng độ Am trong mẫu dƣợc phẩm Amlodipin ............. 52
Bảng 3.18. Kết quả xác định nồng độ Am trong mẫu dƣợc phẩm Ambelin ................ 53
Bảng 3.19. Độ lặp lại của phƣơng páp CE – C4D xác định Am kết hợp xử lý mẫu nƣớc
tiểu bằng chiết lỏng – lỏng ......................................................................... 60
Bảng 3.20. Độ thu hồi của phƣơng pháp CE – C4D xác định Am kết hợp xử lý mẫu
nƣớc tiểu bằng chiết lỏng – lỏng ................................................................ 61
Bảng 3.21. Hàm lƣợng Am trong mẫu nƣớc tiểu M1, M2 và M3 ................................ 63

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1

Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản ......................................................... 14

Hình 1.2:

Mặt cắt ngang của mao quản ...................................................................... 15

Hình 1.3:

Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản .................................................... 16

Hình 1.4:

Ảnh hƣởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di 16

Hình 1.5:

Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc ................... 18

Hình 1.6:

Các kĩ thuật bơm mẫu trong phƣơng pháp điện di mao quản .................... 20

Hình 2.1:

Ảnh chụp thiết bị CEC4D triển khai tại Việt Nam ..................................... 27

Hình 3.1a. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hƣởng của pH đến sự phân tách của Am ........ 33
Hình 3.1b. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hƣởng của pH đến sự phân tách của Per ......... 33
Hình 3.2.

Điện di đồ khảo sát sự ảnh hƣởng của thành phần hệ đệm đến sự phân tách
của Am, Per ................................................................................................ 36

Hình 3.3.

Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch đệm điện di đến quá
trình phân tách các chất Am và Per. ........................................................... 37

Hình 3.4.

Điện di đồ khảo sát sự ảnh hƣởng của thời gian bơm mẫu. ....................... 39

Hình 3.5.

Điện di đồ khảo sát sự ảnh hƣởng của chiều cao bơm mẫu. ...................... 40

Hình 3.6.

Đƣờng chuẩn của Am theo diện tích .......................................................... 42

Hình 3.7.

Đƣờng chuẩn của Per theo diện tích ........................................................... 43

Hình 3.8.

Điện di đồ xác định Am và Per sau khi thêm chuẩn Am và Per ở các nồng
độ khác nhau. .............................................................................................. 48

Hình 3.9.

Điện di đồ xác định Per sau khi thêm chuẩn Per ở các nồng độ khác nhau.
.................................................................................................................... 50

Hình 3.10. Điện di đồ xác định Am trong mẫu dƣợc phẩm Amlodipin sau khi thêm
chuẩn Am ở các nồng độ khác nhau. .......................................................... 51
Hình 3.11. Điện di đồ xác định Am trong mẫu dƣợc phẩm Ambelin sau khi thêm
chuẩn Am ở các nồng độ khác nhau. .......................................................... 52

vi


Hình 3.12. Điện di đồ xác định Am trong mẫu nƣớc tiểu với các dung môi chiết khác
nhau. ............................................................................................................ 54
Hình 3.13. Hiệu suất thu hồi xác định Am với các dung môi chiết khác nhau ........... 54
Hình 3.14. Điện di đồ xác định Am tại các pH chiết khác nhau. ................................. 55
Hình 3.15. Biểu đồ sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào pH .................................. 56
Hình 3.16. Điện di đồ xác định Am với các thể tích dung môi chiết khác nhau.......... 57
Hình 3.17. Biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào thể tích dung môi
chiết ........................................................................................................... 57
Hình 3.18. Điện di đồ xác định Am tại thời gian lắc khác nhau. ................................. 58
Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào thời gian lắc.......... 59
Hình 3.20. Điện di đồ phân tích mẫu nƣớc tiểu thực tế M1sau 10h uống thuốc.......... 61
Hình 3.21. Điện di đồ phân tích mẫu nƣớc tiểu thực tế M1 sau 12h uống thuốc......... 62
Hình 3.22. Điện di đồ phân tích mẫu nƣớc tiểu thực tế M1 sau 14h uống thuốc......... 62

vii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt

Tên đầy đủ

Ace

Acetic

Am

Amlodipin besilat

Arg

L- arginin

Asc

Ascobic

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích

C4D

Detector độ dẫn kết nối kiểu tụ điện

CE

Phƣơng pháp điện di mao quản

EOF

Dòng điện di thẩm thấu

His

Histidin

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Leff

Chiều dài hiệu dụng của mao quản

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lƣợng

Ltot

Tổng chiều dài mao quản

MDL

Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp

MQL

Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp

MEKC

Điện di mao quản điện động học Mixen

MeOH

Methanol

Per

Perindopril tert-butyl amin

Ppm

Phần triệu

SD

Độ lệch chuẩn

Tris

2 – Amino – 2 – hydroxymethyl – propan – 1,3 – diol

HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

%RSD

% độ lệch chuẩn tƣơng đối

DMSO

Dimethylsulfoxit

viii


MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội hiện đại, chất lƣợng cuộc sống
và sức khỏe con ngƣời đƣợc quan tâm nhiều hơn. Tỉ lệ những ngƣời mắc bệnh tăng
huyết áp, suy tim, đau tim ngày càng cao do các thói quen sinh hoạt, chế độ ăn uống
không hợp lí hoặc do yếu tố di truyền và tuổi tác.... Theo số liệu thống kê của Tổ chức
Y tế Thế giới, tăng huyết áp ảnh hƣởng đến sức khỏe của hơn 1 tỷ ngƣời trên toàn thế
giới và là yếu tố nguy cơ tim mạch quan trọng nhất liên quan đến bệnh mạch vành, suy
tim, bệnh mạch máu não và bệnh thận mãn tính. Năm 2015, trong số 17,7 triệu ngƣời
tử vong do các bệnh tim mạch, chiếm 31% tổng số ca tử vong toàn cầu, ƣớc tính tăng
huyết áp là nguyên nhân trực tiếp gây tử vong của 7,1 triệu ngƣời [17]. Nếu điều trị tốt
bệnh tăng huyết áp có thể làm giảm đến 50% nguy cơ mắc suy tim ở ngƣời bệnh. Năm
2015 Hội tim mạch học Việt Nam đã nghiên cứu và thống kê đƣợc 5.454 trƣờng hợp

trong tổng số 44 triệu ngƣời ở 8 tỉnh thành của Việt Nam mắc bệnh cao huyết áp, tƣơng
đƣơng với 47,3% dân số.
Amlodipin besilat kết hợp perindopril tert-butylamin là một trong những thuốc
đƣợc sử dụng phổ biến trong việc điều trị, kiểm soát, phòng chống và cải thiện những
bệnh, hội chứng nhƣ cao huyết áp, mãn cơn đau thắt ngực ổn định, suy tim, đau tim.
Tuy nhiên hiện nay nhiều doanh nghiệp sản xuất thuốc vì lợi ích kinh tế đã sản xuất ra
những sản phẩm kém chất lƣợng, không đạt hàm lƣợng hay không có hoạt chất nhƣ
trên bao bì làm ảnh hƣởng đến khả năng điều trị bệnh cũng nhƣ sức khỏe của con
ngƣời. Vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng một quy trình định lƣợng amlodipin besilat
và perindopril tert-butylamin đơn giản, dễ thực hiện và có độ chính xác cao là hết sức
cần thiết.
Phƣơng pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CEC4D) đƣợc biết đến là một phƣơng pháp phân tích mới tại Việt Nam, với trang bị nhỏ
gọn, có thể tự động hóa và triển khai tại hiện trƣờng với lƣợng nhỏ mẫu và hóa chất,

1


chi phí phân tích thấp. Phƣơng pháp cho thấy tiềm năng sử dụng với các ứng dụng thiết
thực tại Việt Nam, trong đó có việc phân tích hàm lƣợng các chất trong mẫu dƣợc
phẩm. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Xác định amlodipin besilat và
perindopril tert-butylamin bằng phƣơng pháp điện di mao quản”, hy vọng sẽ góp
một phần nhỏ bé vào việc phát triển các quy trình phân tích kiểm tra hàm lƣơ ̣ng các
chấ t trong dƣơ ̣c phẩ m và mẫu sinh học.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung
Amlodipin besilat là muối besilat của amlodipin, một dẫn xuất của

dihydropyridin tổng hợp. Amlodipin nằm trong một nhóm thuốc gọi là thuốc chẹn kênh
canxi có tác dụng chẹn canxi qua màng tế bào, chống cao huyết áp và điều trị đau thắt
ngực [9, 14, 20, 32].
Perindopril tert-butylamin là muối tert-butylmin của perindopril, là một thuốc
ức chế men chuyển angiotensine (ACE) [20, 27, 30].
1.1.1. Thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin
Một số thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin nhƣ
công thức phân tử, cấu tạo phân tử và khối lƣợng phân tử đƣợc đƣa ra trong bảng 1.1
Bảng 1.1. Thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin [7, 8,
14, 20, 21, 27]
Tên chất

Tên hóa học

Công thức phân tử

Amlodipin besilat
2-[(2-Aminoethoxy)
methyl]-4-(2–chlorophenyl)1,4–dihydro–6–methyl–3,5–
pyridinedicarboxylic acid 3–
ethyl 5–methyl ester

C26H31CIN2O8S

3

Perindopril tert-butylamin
(2S, 3αS, 7αS)-1-[(S)-N [(S)-1-carboxy-butyl] alanyl]
hexahydro-2indolinecarboxylic acid, 1ethylester, kết hợp với tertbutylamine (1: 1).

C23H33N3O5


Công thức
cấu tạo

Khối lƣợng phân
tử (g.mol-1)

567,05

441,69

pKa

8,60

5,70; 3,00

1.1.2. Tính chất vật lý, vai trò và tác dụng phụ
1.1.2.1. Amlodipin besilat
- Tính chất: Amlodipin besilat dạng bột tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt,
không có mùi, tan trong nƣớc và methanol [12].
• Nhiệt độ nóng chảy: 199-201ºC
• Khối lƣợng riêng: 1,227 g/cm3
• Nhiệt độ sôi: 527,2ºC ở 760 mmHg
- Vai trò: Amlodipin besilat đƣợc sử dụng để điều trị cao huyết áp, giúp ngăn
ngừa đột quỵ và các vấn đề về thận. Amlodipin besilat cũng đƣợc sử dụng để phòng
ngừa đau thắt ngực, nó có thể giúp tăng khả năng co bóp của tim và giảm tần suất các
cơn đau thắt ngực [9, 15].

- Cơ chế hoạt động: Amlodipin besilat ức chế sự xâm nhập của ion canxi đi qua
màng vào tế bào cơ tim và các mô cơ trơn của thành mạch máu bằng cách ngăn chặn
những kênh canxi chậm của màng tế bào. Ức chế sự gia tăng canxi ban đầu làm giảm

4


hoạt động co bóp của các tế bào động cơ trơn do đó ngăn ngừa sự co mạch và cơ tim co
lại. Điều này dẫn đến sự giãn nở các động mạch vành chính cả vùng bình thƣờng lẫn
vùng thiếu máu, giảm sự co bóp cơ tim, tăng lƣu lƣợng máu và cung cấp oxy đến mô
cơ tim và giảm tổng kháng ngoại vi, kéo theo hạ huyết áp và chống đau thắt ngực [9].
- Amlodipin besilat đƣợc hấp thụ tốt sau khi uống nên sự phân phối thuốc rất
rộng trong cơ thể, tuy nhiên thuốc hấp thu chậm và gần nhƣ hoàn toàn ở đƣờng tiêu
hóa, sự hấp thu không bị ảnh hƣởng bởi thức ăn. Nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng đạt
đƣợc từ 6-12 giờ sau khi uống, sinh khả dụng từ 64 – 80%, thể tích phân khối khoảng
20 l/kg. Trong gan thuốc đƣợc chuyển hóa chủ yếu thành những chất chuyển hóa bất
hoạt, 10% thuốc chƣa chuyển hóa và 60% chất chuyển hóa đƣợc bài tiết theo nƣớc tiểu.
Thuốc thải trừ theo hai pha, thời gian bán thải cuối cùng trung bình là 35 – 50 giờ.
Thuốc không có tác dụng chuyển hóa có hại, không ảnh hƣởng đến lipid huyết tƣơng.
Ở những ngƣời bệnh cao huyết áp liều một lần/ngày làm giảm huyết áp tới mức độ có ý
nghĩa lâm sàng hơn 24 giờ ở tƣ thế nằm lẫn đứng.
- Tác dụng phụ: Trong những nghiên cứu lâm sàng có kiểm chứng thu nhận từ
ngƣời bệnh cho thấy những tác dụng phụ thƣờng gặp nhất của amlodipin besilat là phù,
nề, sƣng bàn tay, bàn chân, mắt cá chân, nhức đầu, mệt mỏi, buồn nôn, đau bụng hồi
hộp, choáng váng. Ngoài ra còn có các tác dụng phụ khác là thay đổi hoạt động tiêu
hóa, đau khớp, suy nhƣợc, khó tiêu, tăng sản lợi, nổi mẩn, loạn thị giác...[9].
1.1.2.2. Perindopril tert-butylamin
- Tính chất: Perindopril tert-butylamin là chất rắn màu trắng, tan trong nƣớc và
metanol.
• Khối lƣợng riêng: 1,15 g/cm3

• Nhiệt độ nóng chảy: 126-128ºC
• Nhiệt độ sôi: 537ºC ở 760 mmHg

5


- Vai trò: Perindopril đƣợc sử dụng để điều trị cao huyết áp, giảm nguy cơ đau
tim hoặc tử vong do các vấn đề về tim ở bệnh nhân có bệnh về động mạch vành [27, 33].
- Cơ chế hoạt động: Perindopril ổn định dƣới dạng muối perindopril tertbutylamin đƣợc thủy phân thành perindoprilat, một chất ức chế chuyên biệt enzym
chuyển đổi angiotensine ở ngƣời và động vật. Enzym chuyển đổi angiotensine kích
thích sự chuyển đổi enzym chuyển đổi angiotensine I thành enzym chuyển đổi
angiotensine II. Enzym chuyển đổi angiotensine II là một chất gây co mạch ngoại vi
mạnh đồng thời kích thích bài tiết aldosteron từ vỏ thƣợng thận. Kết quả là giảm bài
tiết aldosteron, tăng hoạt tính của renin trong huyết tƣơng, aldosteron không còn đóng
vai trò hồi tác âm, giảm tổng kháng ngoại biên với tác động ƣu tiên trên cơ và thận, do
đó làm giãn tĩnh mạch, khôi phục tính đàn hồi của động mạch lớn, giảm áp lực đổ đầy
vào thất trái và phải, tăng lƣu lƣợng máu đến cơ.
- Perindopril dùng theo đƣờng uống, đƣợc hấp thu nhanh, tỉ lệ hấp thu chiếm
65-70 % liều dùng. Thức ăn có thể làm thay đổi lƣợng perindoprilat hình thành sau khi
chuyển hóa từ perindopril. Đỉnh hấp thu của perindoprilat trong huyết tƣơng đạt đƣợc
sau 3 đến 4 giờ. Thời gian bán hủy của perindoprilat khoảng 24 giờ. Các nồng độ của
perindoprilat trong huyết tƣơng tăng đáng kể ở bệnh nhân có thanh thải creatinine dƣới
60 ml/phút.
- Tác dụng phụ về phƣơng diện lâm sàng khi sử dụng perindopril tert-butylamin:
Ho khan, phù mạch, nhức đầu, suy nhƣợc, buồn nôn, thay đổi vị giác chóng mặt, rối
loạn tính khí, rối loạn giấc ngủ, phát ban ngoài da, đau bao tử…Về phƣơng diện sinh
học: tăng vừa phải ure, creatinin và kali huyết, thiếu máu [27].
1.1.2.3. Kết hợp amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin
Perindopril tert-butylamin là một chất ức chế men chuyển angiotensin.
Amlodipin besilat là một chất đối kháng canxi. Perindopril và amlodipin hoạt động kết

6


hợp để làm giãn và nới lỏng các mạch máu, điều này dẫn đến hạ huyết áp. Máu có thể
lƣu thông dễ dàng hơn trong cơ thể và tim không cần phải hoạt động nhiều.
Một số thuốc đã kết hợp cả hai hoạt chất này nhƣ Coveram sản xuất bởi Servier
Ireland Industries Ltd, Ireland), Beatil (sản xuất bởi Gedeon Richer Polska, Poland)…
1.2. Các phƣơng pháp xác định
1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký
Một trong các phƣơng pháp phổ biến để xác định amlopidin và perindoprin là
phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector UV dựa trên khả
năng hấp thụ quang của chúng tại vùng bƣớc sóng tử ngoại. Bên cạnh đó phƣơng pháp
sắc kí bản mỏng hiệu năng cao cũng là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng tƣơng đối phổ
biến.
Trong công trình nghiên cứu của tác giả A.Zarghi và các cộng sự [8] đã sử dụng
phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lƣợng amlodipin trong huyết
tƣơng. Amlodipin sau khi đƣợc tách ra khỏi nền mẫu đƣợc làm khô bằng khí nitơ, cặn
đƣợc hòa tan trong 100 µl pha động là hỗn hợp của dung dịch natri dihydrogen
phosphat 0,01 M và acetonitril (63:37, v/v) điều chỉnh tới pH 3,5 và bơm 50 µl vào
thiết bị phân tích, sử dụng cột Nucleosil C8 (125 x 4,6 mm) với tốc độ dòng chảy là 1,5
ml/phút, bƣớc sóng đƣợc đặt ở 239 nm. Bằng cách này các tác giả đã xây dựng đƣờng
chuẩn với khoảng tuyến tính trong phạm vi nồng độ 0,5-16 ng/ml. Giới hạn phát hiện
của phƣơng pháp là 0,2 ng/ml. Phƣơng pháp đơn giản và đạt hiệu suất thu hồi cao 97 %.
Trong một bài báo khác, tác giả Prameela Rani và các cộng sự [28] đã phát triển
phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) để xác định hàm lƣợng
perindopril tert-butylamin trong viên nén với detector DAD. Quá trình tách chất đƣợc
thực hiện trên cột YMC-Pack C18 (250 mm × 4,6 mm, kích thƣớc hạt là 5 mm) ở nhiệt
độ cột là 50oC. Pha động là hỗn hợp của đệm acetonitril và kali photphat (0,05 M)

7


(37:63, v/v) (pH= 2,5) pH của pha động đã đƣợc điều chỉnh với acid ortophosphoric.
Hỗn hợp acetonitril-nƣớc (40 : 60, v/v) đƣợc sử dụng làm dung môi. Thể tích bơm mẫu
vào là 50 μl, tốc độ dòng chảy là 1,7 ml/phút, detector 215 nm. Giới hạn phát hiện và
giới hạn định lƣợng tƣơng ứng là 2 μg/ml và 7 mg/ml. Hiệu suất thu hồi nằm trong
khoảng từ 99 – 100,5%, độ chính xác (RSD) là 0,865%. Phƣơng pháp đã đƣợc chứng
minh là phù hợp việc xác định đồng thời perindopril tert-butylamin cũng nhƣ các tạp
chất của nó trong dƣợc phẩm.
Trong công trình nghiên cứu của mình tác giả Barole và cộng sự [13] đã phát
triển một phƣơng pháp sắc ký lỏng bản mỏng hiệu năng cao đơn giản (HPTLC) để tách
và phân tích định lƣợng amlodipin besilat và perindopril erbumin với số lƣợng lớn
trong dƣợc phẩm. Sau khi hòa tan trong methanol, mẫu và các dung dịch chuẩn đƣợc
chạy trên các bản silica gel sạch với dung môi axit axetic (8,5: 1,5: 0,1ml v/v/v) làm
pha động. Các mẫu thu đƣợc quét ở bƣớc sóng 238 nm. Các giá trị Rf cho amlodipin
besilat và perindopril erbumin lần lƣợt là 0,20 ± 0,02 và 0,89 ± 0,02. Các đồ thị đƣờng
chuẩn cho khoảng tuyến tính từ 500 – 2500 ng/vết cho amlodipin besilat và 600018000 ng/vết cho perindopril erbumin. Các hệ số tƣơng quan (R2) lần lƣợt là 0,995 và
0,995. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ cho amlodipin besilat là
10,31 và 32,10 ng/vết và đối với perindopril erbumin lần lƣợt là 179 và 544 ng/vết.
Phƣơng pháp này phù hợp để định lƣợng các hợp chất theo các yêu cầu của tiêu chuẩn
quy định dƣợc phẩm.
Tác giả Mohit và cộng sự [21] đã xác định đồng thời cả perindopril và
indapamid ở dạng dƣợc phẩm bằng phƣơng pháp HPTLC. Phƣơng pháp này dựa trên
việc tách hai thuốc trên các bản mỏng đƣợc phủ silica gel 60F. Sử dụng pha động là
dichloromethan: methanol: acid acetic băng với tỷ lệ 9,5: 0,5: 0,1 v/v/v. Cả hai loại
thuốc đều hấp thụ tốt ở 215 nm. Phƣơng pháp có khoảng tuyến tính trong khoảng nồng

8

độ từ 1-5 μg/vết và 100 – 500 ng/vết tƣơng ứng cho perindopril và indapamid. Phƣơng
pháp này đã đƣợc áp dụng thành công để xác định hàm lƣợng thuốc trong các viên nén.
1.2.2. Phƣơng pháp quang phổ
Các phƣơng pháp xác định amlopidin và perindopril thƣờng dựa trên việc tạo
phức màu giữa các chất này với các thuốc thử tƣơng ứng cho các sản phẩm màu có khả
năng hấp thụ quang trong vùng bƣớc sóng nhìn thấy. Nếu đo trực tiếp độ hấp thụ quang
của các chất này tại vùng bƣớc sóng UV cần phải kết hợp với thuật toán đa biến để có
thể tách đƣợc chúng ra khỏi các tạp chất có trong mẫu.
Tác giả Nina Alizadeh, Fatimeh Hemati [27] đã phát triển hai phƣơng pháp
quang phổ đơn giản, nhanh chóng và độ nhạy cao để xác định amlodipin besilat ở dạng
tinh khiết và trong dƣợc phẩm. Phƣơng pháp này dựa trên khả năng tạo phức màu giữa
chất phân tích với thuốc thử 7,7,8,8 tetracyanoquinodimethane (TCNQ) và
tetracyanoethylene (TCNE). Các phản ứng này cho các sản phẩm phức màu có nồng độ
hấp thụ tối đa là 745 nm và 396 nm tƣơng với TCNQ và TCNE. Khoảng nồng độ làm
việc của amlodipin besilat trong phạm vi từ 20-110 µg/ml; 5-35 µg/ml và độ lệch tiêu
chuẩn tƣơng đối (RSD) khi sử dụng TCNQ và TCNE lần lƣợt là 0,94 % và 0,73 %.
Nafisur Rahman và các cộng sự [23] đã sử dụng phƣơng pháp quang phổ để xác
định perindopril trong dƣợc phẩm. Phƣơng pháp dựa trên phản ứng của nhóm thuốc
amin với 2,4 dinitrofluorobenzene trong dimethylsulfoxide (DMSO) tạo thành sản
phẩm màu vàng, hấp thụ tối đa ở 410 nm và đƣợc đo ở nhiệt độ phòng (30 ± 1°C).
Theo định luật Beer, khoảng tuyến tính nằm trong khoảng nồng độ từ 2,5 – 25 g/ml với
hệ số hấp thụ mol là 6,71.10-3 l/mol/cm. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của
phƣơng pháp tƣơng ứng là 0,17 và 0,52 μg/ml. Các thông số hoạt hóa nhƣ Ea, ΔH*,
ΔS* và ΔG* cho phản ứng này là 27,31 kJ/mol; 24,69 kJ/mol; -138,84 kJ/mol và 61,50
kJ/mol. Phƣơng pháp đã đƣợc thực hiện thành công để xác định perindopril ở dạng
thƣơng mại với sai số chấp nhận đƣợc trong phạm vi ±2%.

9

Trong một nghiên cứu khác, Nafisur Rahman và các cộng sự [22] cũng xác định
perindopril bằng phƣơng pháp quang phổ động học. Nghiên cứu này dựa trên phản ứng
của thuốc với dung dịch kali penmanganat trong môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ phòng (30
± 1oC). Theo dõi phản ứng bằng cách đo độ tăng độ hấp thụ quang theo thời gian ở
bƣớc sóng 603 nm với phƣơng pháp tốc độ ban đầu, thời gian cố định 8 phút và thời
gian cân bằng 90 phút. Tất cả các đƣờng chuẩn đều tuyến tính trong khoảng nồng độ từ
5 – 500 mg/ml. Các giới hạn phát hiện cho phƣơng pháp tốc độ ban đầu, thời gian cố
định và thời gian cân bằng tƣơng ứng là 0,752, 0,882 và 1,091 mg/ml. So sánh kết quả
phân tích của phƣơng pháp đề xuất và các phƣơng pháp tham khảo cho thấy không có
sự khác biệt đáng kể về độ chính xác.
Tác giả MahaA.Hegazy và các cộng sự [20] đã kết hợp các thuật toán đa biến
với phép đo quang phổ để xác định đồng thời perindopril arginin và amlodipin besilat.
Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu bao gồm phƣơng pháp hệ số hấp thụ
(AFM - absorptivity factor method) và phƣơng pháp hiệu chỉnh hấp thụ (ACM absorption correction method). Trong cả hai phƣơng pháp, amlodipin đƣợc xác định
trực tiếp ở bƣớc sóng 360 nm với nồng độ từ 8 – 28 μg/ml, còn perindopril đƣợc xác
định bằng phƣơng pháp AFM và phƣơng pháp ACM ở bƣớc sóng 222 nm và 208 nm
tƣơng ứng, với nồng độ trong khoảng từ 10 – 70 μg/ml.
1.2.3. Phương pháp điện hóa
Tác giả Azza Abdel Kader Gazy [11] đã nghiên cứu tính chất hấp phụ và điện
hóa của amlodipin besilat trên điện cực cacbon thủy tinh (glassy carbon electrode GCE) với dung dịch đệm Britton-Robinson bằng cách sử dụng phƣơng pháp von-ampe
vòng và von-ampe sóng vuông. Các nghiên cứu về phƣơng pháp von-ampe vòng cho
thấy sự oxy hóa amlodipin besilat trên bề mặt điện cực cacbon thủy tinh là bất thuận
nghịch và bị kiểm soát bởi sự hấp phụ trên điện cực. Các điều kiện đo và các thông số
thiết bị đã đƣợc tối ƣu hóa cho việc xác định thuốc bằng phƣơng pháp đo von-ampe

10


hòa tan hấp phụ sóng vuông. Pic oxy hóa của amlodipin besilat hấp phụ ở 0,510 V (so

với Ag/AgCl). Khoảng nồng độ xác định pic oxy hóa của amlodipin besilat trong phạm
vi từ 4,0 x 10-8 đến 2,0 x 10-6 M và giới hạn phát hiện là 1,4 x 10-8 M. Quy trình này đã
đƣợc áp dụng thành công để xác định amlodipin besilat trong viên nén (Norvasc). Hiệu
suất thu hồi đạt từ 96,31 ± 1,18 đến 96,98 ± 1,17%. Phƣơng pháp đề xuất đƣợc sử dụng
cho việc xác định lâm sàng thuốc trong nƣớc tiểu và huyết thanh ngƣời.
1.2.4. Các phƣơng pháp điện di mao quản (CE)
Gần đây, phƣơng pháp CE đƣợc sử dụng rộng rãi do tính chất ƣu việt về hiệu
quả tách cao, thời gian tách ngắn, lƣợng mẫu tiêu tốn ít. Phƣơng pháp đã đƣợc ứng
dụng để tách và xác định amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin trong nhiều
đối tƣợng mẫu khác nhau.
Sự có mặt amlodipin besilat trong mẫu huyết tƣơng ở chuột đã đƣợc Yanfen
Wei và các cộng sự [32] nghiên cứu và phát triển bằng cách sử dụng một bộ cảm biến
điện quang mới (ECL - electrochemiluminescence) dựa trên hỗn hợp graphene oxideđồng sunfua (rGO-CuS) kết hợp với điện di mao quản (CE) để phát hiện amlodipin
besilat (AML) ở chuột. Trong nghiên cứu này, hỗn hợp rGO-CuS đƣợc tổng hợp bằng
phƣơng pháp thủy nhiệt và đƣợc sử dụng để cải tiến điện cực. Cảm biến ECL đƣợc kết
hợp với CE để cải thiện tính chọn lọc và các thông số CE-ECL ảnh hƣởng đến sự phân
tách và phát hiện đƣợc tối ƣu. Điều kiện điện di thực hiện với mao quản silica đƣờng
kính 75 μm, chiều dài hiệu dụng 40 cm, dung dịch đệm photphat tại pH= 8, điện thế 15
kV, thời gian bơm mẫu 10s, thời gian điện di 252s. Với các điều kiện tối ƣu trên xác
định đƣợc khoảng nồng độ tuyến tính của amlodipin besilat từ 0,008 – 5 μg/ml, giới
hạn phát hiện là 2,8 ng/ml (S / N = 3) với phƣơng trình hồi quy y = 1988x + 76.53 (R2
= 0.9988) và giá trị RSD từ 2,5-2,9%. Nghiên cứu cho thấy phƣơng pháp này có độ
nhạy cao, độ chọn lọc tốt, phạm vi tuyến tính rộng, giới hạn phát hiện thấp và khả năng
lặp lại tốt và có tiềm năng rất lớn trong lĩnh vực phân tích dƣợc phẩm.

11


Samia M. El-Gizawy và cộng sự [31] đã phát triển điện di mao quản (CE) sử
dụng detector diode-array để xác định 2 đồng phân S và R-perindopril tert-butylamin.

Tất cả các yếu tố ảnh hƣởng đến sự phân tách đã đƣợc nghiên cứu và tối ƣu hóa. Trong
nghiên cứu này các tác giả đã sử dụng đệm phosphat (100 mM, pH= 7,0) và 2hydroxylpropyl-b-cyclodextrin (10 mM) với thế áp vào hai đầu mao quản là 15 kV,
thời gian bơm mẫu là 10 s. Nồng độ tuyến tính trong khoảng từ 25 – 800 mg/ml với
giới hạn phát hiện và 14,7 mg/ml. Phƣơng pháp có độ chính xác khá tốt với giá trị RSD
< 2,0% và hiệu suất thu hồi trung bình trong các mẫu là 95,29%. Phƣơng pháp đƣợc đề
xuất đã đƣợc áp dụng cho việc xác định S-perindopril trong các viên dƣợc phẩm
thƣơng mại có chứa perindopril.
Từ các công trình nghiên cứu ở trên cho thấy rằng có rất nhiều phƣơng pháp xác
định amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin trong mẫu dƣợc phẩm và mẫu sinh
học, mỗi phƣơng pháp nghiên cứu với các điều kiện khác nhau đều có các ƣu, nhƣợc
điểm khác nhau. Tuy nhiên lại có rất ít phƣơng pháp xác định đồng thời cả 2 chất
amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin. Phƣơng pháp phổ biến nhất đƣợc sử
dụng là phƣơng pháp sắc kí lỏng nhƣng với điều kiện thực hiện phải sử dụng một
lƣợng dung môi hữu cơ tƣơng đối lớn và giá thành phân tích khá cao.Ở Việt Nam,
phƣơng pháp điện di mao quản tích hợp detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối theo
kiểu tụ điện (CE-C4D) là một phƣơng pháp khá mới với các ƣu điểm của detector vạn
năng với thời gian phân tích nhanh, giá thành rẻ, thiết bị nhỏ gọn di chuyển dễ dàng,
đặc biệt chƣa có nghiên cứu nào sử dụng phƣơng pháp này phân tích đồng thời cả hai
chất. Vì vậy trong luận văn này sẽ tập trung vào nghiên cứu xây dựng quy trình phân
tích đồng thời 2 hợp chất amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin bằng phƣơng
pháp CE-C4D.

12


1.3. Phƣơng pháp điện di mao quản
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau
của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly
có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trƣờng (E) nhất định do thế (V) đặt vào hai
đầu mao quản sinh ra. Cấu tạo của hệ điện di đƣợc cho trong hình 1.1 [1].

Tùy theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xảy ra trong ống
mao quản mà có thể phân chia thành các loại hay các kiểu điện di với các tên gọi riêng
khác nhau. Cụ thể nhƣ sau:
1. Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis: CE),
2. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE),
3. Sắc ký điện di mao quản điện động học Mixen (Micellary Capillary ElectroKinetic Chromatography: MEKC hay MCEKC),
4. Sắc ký điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis Chromatography:
Gel-CEC),
5. Sắc ký điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing
Chromatography: CIEFC),
6. Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ (CapillaryIso-Tacho-Phoresis
Chromatography: CITPC).

13


Hình 1.1: Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản
1.3.1. Độ điện di, tốc độ điện di và thời gian điện di
Trong điện di, tốc độ di chuyển của các hạt tích điện (v) tỉ lệ thuận với cƣờng độ
điện trƣờng (E):
v = μ. E
Trong đó:

(1.1)

v: tốc độ di chuyển của ion
μ: là độ diện di
E: là điện trƣờng ngoài

Trong điều kiện tốc độ của dòng ổn định, lực tác động lên các tiểu phân tích

điện từ phía điện trƣờng ngoài và lực ma sát sẽ cân bằng:
q.E= fe.v
Trong đó: q: là điện tích hạt nhân

14

(1.2)