Phân tích và đánh giá hàm lượng patulin trong các loại nước uống trái cây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (tt)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.1 MB, 12 trang )
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
NGUYỄN THỊ MINH TƢƠI
PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG PATULIN
TRONG CÁC LOẠI NƢỚC UỐNG TRÁI CÂY BẰNG
Demo Version - Select.Pdf SDK
PHƢƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
THEO ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU
THỪA THIÊN HUẾ, 2018
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
NGUYỄN THỊ MINH TƢƠI
PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG PATULIN
TRONG CÁC LOẠI NƢỚC UỐNG TRÁI CÂY BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Chuyên
ngành: HóaSDK
Phân Tích
Demo Version
- Select.Pdf
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
THEO ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. NGÔ VĂN TỨ
THỪA THIÊN HUẾ, 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết
quả nghiên cứu ghi trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép
sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Minh Tƣơi
Demo Version - Select.Pdf SDK
Lời cảm ơn
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS. Ngô Văn Tứ đã giao đề tài,
tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận
văn này, đồng thời đã bổ sung cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm
quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong khoa Hóa trường Đại học
Sư phạm và Đại học Khoa học – Đại học Huế đã giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học Cao học và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc,
Mỹ phẩm và Thực phẩm Thừa Thiên Huế đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi
thực hiện luận văn.
Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn
Demo Version - Select.Pdf SDK
bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt
nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn!
Thừa Thiên Huế, năm 2018
Nguyễn Thị Minh Tươi
MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................................... 1
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. 4
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ 6
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................. 7
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 8
NỘI DUNG ........................................................................................................................10
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN LÝ THUYẾT .................................................................10
1.1. Giới thiệu về trái cây ...................................................................................... 10
1.2. Giới thiệu về nước uống trái cây .................................................................... 11
1.3.Tổng quan về độc tố nấm mốc ......................................................................... 13
1.4. Độc tố Patulin ................................................................................................. 14
1.4.1. Lịch sử nghiên cứu patulin ....................................................................... 14
1.4.2. Giới thiệu patulin ...................................................................................... 15
1.4.3. Cấu tạo hóa học, danh pháp...................................................................... 16
Demo Version - Select.Pdf SDK
1.4.4. Nguồn phát hiện patulin ........................................................................... 16
1.4.5. Tính chất vật lý ......................................................................................... 16
1.4.6. Tính chất hóa học ..................................................................................... 17
1.4.7. Độc tố patulin ........................................................................................... 19
1.4.8 Tiêu chuẩn cho phép hàm lượng patulin ................................................... 20
1.4.9. Biện pháp kiểm soát ................................................................................. 21
1.5. Các phương pháp xác định Patulin ................................................................. 22
1.5.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng ................................................................. 22
1.5.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ ............................................................ 23
1.5.3. Phương pháp sắc ký điện di mao quản ..................................................... 23
1.5.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao .................................................. 24
1.5.5. Phát triển cảm biến sinh học alkaline phosphatase trên cơ sở biến
tính điện cực bằng ống carbon nano để xác định độc tố nấm mốc patulin ........ 24
1.6. Giới thiệu về phương pháp HPLC .................................................................. 25
1
1.6.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC ........................................................ 25
1.6.2. Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC ............................................................. 25
1.6.3. Detector UV ............................................................................................. 26
1.6.4. Cách đánh giá peak, phương pháp định lượng trong phương pháp
HPLC .................................................................................................................. 27
1.7. Kết luận chung về phần tổng quan lý thuyết .................................................. 31
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................32
2.1. Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 32
2.1.1. Lựa chọn các điều kiện sắc ký.................................................................. 32
2.1.2. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp ...................................................... 32
2.1.3. Xây dựng quy trình phân tích và áp dụng quy trình phân tích mẫu thực
tế ......................................................................................................................... 32
2.2. Dụng cụ và hóa chất ....................................................................................... 32
2.2.1. Dụng cụ .................................................................................................... 32
2.2.2. Hóa chất ................................................................................................... 33
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 33
Demopháp
Version
SDK
2.3.1. Phương
lấy mẫu- Select.Pdf
và chuẩn bị mẫu
................................................... 33
2.3.2. Chọn kỹ thuật xử lý mẫu .......................................................................... 33
2.3.3. Chuẩn bị mẫu trắng .................................................................................. 33
2.3.4. Khảo sát các điều kiện phân tích .............................................................. 34
2.3.5. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích ...................................... 34
2.3.6.Áp dụng phương pháp để định lượng patulin trong các loại nước
uống trái cây trên địa bàn thành phố Huế........................................................... 39
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................40
3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích theo phương pháp HPLC ..................... 40
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chạy sắc ký ............................................................... 40
3.1.2. Ảnh hưởng của thành phần pha động ....................................................... 41
3.1.3. Ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động ..................................................... 42
3.2. Quy trình xử lý mẫu ........................................................................................ 44
3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp HPLC xác định Patulin ..................... 45
2
3.3.1. Độ ổn định của hệ thống HPLC sử dụng detector UV ............................. 45
3.3.2. Tính đặc hiệu của phương pháp ............................................................... 46
3.3.3. Khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng ..................................... 47
3.3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ............................................... 48
3.3.5. Xác định độ lặp lại của phương pháp ....................................................... 49
3.3.6. Xác định độ đúng của phương pháp ......................................................... 51
3.4. Xây dựng quy trình phân tích ......................................................................... 52
3.5. Áp dụng quy trình định lượng Patulin trong một số mẫu nước uống trái
cây ở thành phố Huế .............................................................................................. 54
3.5.1. Mẫu phân tích ........................................................................................... 54
3.5.2. Phân tích và đánh giá hàm lượng patulin trong một số mẫu nước
uống trái cây trên địa bàn thành phố Huế........................................................... 55
3.5.3. Đánh giá kết quả phân tích hàm lượng patulin so với hàm lượng ở
bảng thành phần thực phẩm Việt Nam của Bộ Y tế ........................................... 61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................63
I. Kết luận .............................................................................................................. 63
Demo
Version - Select.Pdf SDK
II. Kiến nghị
...........................................................................................................
63
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................................65
PHỤ LỤC
3
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Stt
Ký hiệu
1
AOAC
2
Tên tiếng Anh
Association
Tên tiếng Việt
Official Hiệp hội các nhà hóa phân tích
of
Analytical Chemists
chính thức
CCD
Charge coupled device
Cảm biến CCD
3
DPA
Acid desoxypatulinic
Acid desoxypatulinic
4
DNA
Deoxyribonucleic acid
5
ĐKTN
Experimental condition
6
GC - MS
7
HPLC
8
HPLC-DAD
9
IUPAC
10
IDH
Isoepoxydon Dehydrogenase
Isoepoxydon Dehydrogenase
11
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
12
LOQ
Limit of quantitation
Giới hạn định lượng
Gas
chromatography
truyền
Điều kiện thực nghiệm
with
Mass Spectrometer Detector
High
performance
liquid
chromatography
High
performance
Sắc ký khí khối phổ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao sử
Demo Version
- Select.Pdf
SDK dụng detector mảng diode
chromatography
- diode array.
International Union Of Pure
And Applied Chemistry
Liquid
13
Phân tử mang thông tin di
chromatography-
LC-ESI-MS electrospray ionization mass
spectrometry
14
MEKC
15
16
Hiệp hội Hóa Học Quốc Tế
Đo phổ khối ion hóa sắc ký
lỏng
Micell Capillary Electro – Điện di mao quản điện động
Kinetic Electrophoreses
học Micell
PAT
Patulin
Patulin
ppm
Part per million
Phần triệu
4
17
ppb
Part per billion
Phần tỷ
18
PVPP-F
Polyvinylpolypyrrolidone-
Polyvinylpolypyrrolidone-
florisil
florisil
19
RSD
Relative standard deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
20
Rev
Recovery
Độ thu hồi
21
SPE
Solid Phase Extraction
Chiết pha rắn
22
TCVN
Viet Nam Standard
Tiêu chuẩn Việt Nam
23
TLC
Thin-layer chromatography
Sắc ký lớp mỏng
24
UV - Vis
Ultraviolet - Visible
Tử ngoại – Khả kiến
25
USDA
26
VSATTP
United States Department of
Agriculture
Hygiene and food safety
Demo Version - Select.Pdf SDK
5
Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ
Vệ sinh an toàn thực phẩm
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của SO2 đối với patulin..................................................................18
Bảng 1.2. Giới hạn an toàn cho phép đối với ô nhiễm PAT trong thực phẩm ...............21
Bảng 1.3. Diện tích peak và nồng độ ................................................................................29
Bảng 2.1. Ma trận thực nghiệm để phân tích ANOVA một yếu tố.................................38
Bảng 2.2. Bảng phân tích phương sai theo ANOVA một yếu tố ....................................39
Bảng 3.1. Kết quả hệ số đối xứng của các tỷ lệ hệ dung môi pha động .........................42
Bảng 3.2. Các thông số cơ bản ở tốc độ dòng khác nhau ................................................43
Bảng 3.3. Các thông số sắc ký của peak patulin...............................................................46
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính .................................................................48
Bảng 3.5. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ..........................49
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại ...............................................................................50
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp phân tích patulin .....................50
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng trong mẫu nước uống trái cây ...............................51
Bảng 3.9. Thông tin về các mẫu nước uống trái cây lấy đợt 1 ........................................54
Demo
Select.Pdf
Bảng 3.10. Thông
tinVersion
về các mẫu- nước
uống tráiSDK
cây lấy đợt 2 ......................................54
Bảng 3.11. Thông tin về các mẫu nước uống trái cây lấy đợt 3 ......................................55
Bảng 3.12. Kết quả phân tích hàm lượng patulin trong mẫu nước uống trái cây (đợt
1) ..........................................................................................................................................56
Bảng 3.13. Kết quả phân tích hàm lượng patulin trong mẫu nước uống trái cây (đợt
2) ..........................................................................................................................................57
Bảng 3.14. Kết quả phân tích hàm lượng patulin trong mẫu nước uống trái cây (đợt
3) ..........................................................................................................................................58
Bảng 3.15. Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố về hàm lượng PAT trong các mẫu
nước uống trái cây theo thời gian lấy mẫu ........................................................................59
Bảng 3.16. Kết quả đánh giá theo phương pháp ANOVA một yếu tố đối với các mẫu
nước uống trái cây ở những thời gian lấy mẫu khác nhau ...............................................60
Bảng 3.17.Kết quả phân tích hàm lượng Patulin trong 06 mẫu nước uống trái cây ......61
Bảng 3.18. Kết quả kiểm tra hàm lượng Patulin ..............................................................61
6
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Một số loại trái cây ..........................................................................................10
Hình 1.2. Một số loại nƣớc uống trái cây ......................................................................11
Hình 1.3. Nấm mốc A. clavatus ......................................................................................16
Hình 1.4. Cấu tạo hóa học của patulin ..........................................................................16
Hình 1.5. Các con đƣờng tổng hợp patulin ..................................................................17
Hình 1.6. Ảnh hƣởng của SO2 và nhiệt độ đối với patulin.........................................18
Hình 1.7. Phản ứng của PAT với Cysteine ...................................................................19
Hình 1.8. Cấu trúc của patulin, ( E ) - ascladiol, ( Z ) - ascladiol ..............................22
và acid desoxypatulinic (DPA). ......................................................................................22
Hình 1.9. Giới thiệu hệ thống HPLC .............................................................................26
Hình 1.10. Nguyên tắc cấu tạo detector UV .................................................................27
Hình 1.11. Chuẩn hoá một điểm ....................................................................................28
Hình 1.12. Đồ thị của phƣơng pháp đƣờng chuẩn ......................................................29
Hình 1.13. Đồ thị của phƣơng pháp thêm chuẩn đƣờng chuẩn................................30
Demo Version - Select.Pdf SDK
Hình 1.14. Phƣơng pháp chuẩn nội xác định chất phân tích ....................................30
Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động ...................................................41
Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động ...................................................43
Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu của phƣơng pháp trên mẫu trắng ......47
Hình 3.4. Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu của phƣơng pháp trên mẫu chuẩn 0,5
ppm .....................................................................................................................................47
Hình 3.5. Đƣờng hồi quy tuyến tính biểu diễn liên hệ giữa nồng độ C và diện tích
peak S .................................................................................................................................48
Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát độ đúng của phƣơng pháp khi thêm chuẩn patulin 52
Hình 3.7. Quy trình phân tích mẫu nƣớc uống trái cây theo phƣơng pháp HPLC
.............................................................................................................................................53
Hình 3.8. Biểu đồ hàm lƣợng patulin trong một số loại nƣớc uống trái cây...........62
7
MỞ ĐẦU
Độc tố nấm mốc là hợp chất độc được tạo ra do nhiều loại nấm mốc. Nhiễm
độc tố nấm mốc có thể xảy ra tại nơi sản xuất hoặc trong quá trình bảo quản. Khi
nấm gặp phải nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, chúng nhân lên và có thể sản sinh ra
mycotoxin [1].
Độc tố nấm mốc ít khi gây ngộ độc cấp tính, nó gây hại cơ thể từ từ do đó
làm người ta không để ý. Nhưng khi phát hiện ra triệu chứng thì những cơ quan, bộ
phận trong cơ thể đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Tùy theo loại nấm mốc và độc tố
của chúng mà tác động lên mỗi phần khác nhau, nếu tổng hợp chung lại thì tất cả
các độc tố nấm mốc tác động lên hầu hết các bộ phận cơ thể như tác động vào gan
và thận gây viêm, nếu kéo dài có thể gây ung thư (Aflatoxin, Ochratoxin…); tác
động vào hệ tuần hoàn gây ra xuất huyết mãn tính, ngưng kết hồng cầu, giảm lượng
kháng thể (Aflatoxin…), tác động lên hệ hô hấp (Aspergillus fumigatus)[1].
Patulin (4-hydroxy-4H-furo[3,2c]pyran-2[6H]-one) là một độc tố nấm mốc
được phân lập lần đầu tiên từ Aspergillus clavatus và được nghiên cứu vào đầu
Version
- Select.Pdf
những năm Demo
1940. Mối
quan tâm
ban đầu vàoSDK
phân tử này là do hoạt tính kháng
khuẩn của nó, và Selman Waksman, Howard Florey và Ernest Chain là những
người tiên phong trong việc thử nghiệm tác nhân kháng khuẩn này. Tuy nhiên, vào
năm 1950, người ta phát hiện ra PAT độc hại đối với thực vật và động vật. Vì vậy,
việc sử dụng nó như một loại thuốc để điều trị các bệnh do vi khuẩn đã bị loại và kể
từ đó người ta tập trung nghiên cứu vào việc làm thế nào để loại bỏ độc tố này [26].
Patulin là một độc tố nấm mốc được sản sinh bởi một số loài Penicillium,
Aspergillus và Byssochlamys. Patulin có thể phát triển trên nhiều loại thực phẩm
khác nhau bao gồm ngũ cốc, trái cây và pho mát [27].
Patulin được tìm thấy phổ biến trong các loại trái cây bị hỏng, thường trong
nước trái cây và đáng chú ý là trong nước uống táo; điều này đã dẫn đến các quy
định về mức độ chấp nhận cho phép tối đa ở hầu hết các quốc gia. Các mức này
được đặt ở mức 50 ppb tại Hoa Kỳ, nước tiêu thụ táo chính của thế giới. Mức độ
tương tự được thiết lập bởi Liên minh châu Âu, với mức tối đa là 10 ppb trong
8
